一种癸氧喹酯纳米制剂及其制备方法与应用
一种癸氧喹酯纳米制剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种癸氧喹酯纳米制剂及其制备方法与应 用。
【背景技术】
[0002] 疟疾是经按蚊叮咬进行传播的由疟原虫引起的疾病。疟原虫通过蚊虫叮咬到达人 体后，首先在肝脏由子孢子发育成裂殖子，然后感染红细胞。疟原虫感染红细胞后，引起症 状如发烧，头痛，疲劳和呕吐等。这些症状通常在蚊子叮咬后10天到15天出现。患者通常 需要及时治疗，否则会损坏病人的重要器官甚至威胁到病人的生命安全。据世界卫生组织 2013年统计的数字，世界上还有97个国家近34亿人口处于罹患疟疾的危险，其中12亿处 在高风险中。每年大约有62万人死于疟疾，其中70%以上是5岁以下的儿童。但是疟疾是 可以预防和治愈的，因此这种状况并非不可避免。
[0003] 目前与疟疾抗争的方法有防止蚊虫叮咬、发展预防性疫苗以及寻找和研制有效的 抗疟疾药物。迄今为止，还没有预防疟疾的疫苗诞生。全球范围内已出现疟原虫广泛对氯 喹和磺胺类耐药。我国科技工作者发明的青蒿素是当前最主要的抗疟疾药。但是东南亚一 带也出现了青蒿素耐药虫株。为避免青蒿素耐药，世界卫生组织已限制青蒿素单独使用，而 必须联合用药。另外，全球青蒿素生产能力有限（黄蒿种植量有限）。伯氨喹类是较新的 用于肝期的抗疟疾药物。但是这类药有很强的副作用，它不仅可引起部分疟疾病人的急性 溶血性贫血，而且对恶性疟红细胞内期则完全无效，不能作为控制症状的药物应用。而以阿 托伐醌/氯胍组成的复方马拉隆则因为价格高而使低收入人群经济负担过重。因而开发廉 价、高效、低毒并可以大量生产的新药和新的复方制剂势在必行。
[0004] 近年来，本专利发明人和不少其他作者在研宄中发现一种球虫抑制药物癸氧喹酯 (CAS号为18507-89-6)在体外实验中有很强的抑制和杀灭疟原虫的作用。其在体外试验的 药效不仅远远超过氯喹，而且丝毫也不逊色于青蒿素。这是经过从上百万个化合物筛选比 较而得出来的结论（Science2011 ;334:1372-7)。新近的实验证明癸氧喹酯通过抑制疟原 虫线粒体的细胞色素bcl复合物，可以非常有效地在体外和体内杀灭疟原虫。虽然它与临 床上现有的阿托伐醌的药理作用相似，但是与其并不具交叉抗药性。有文献报道，对有1个 突变位点的疟原虫产生的抗药性，癸氧喹酯的药效失去2倍，而阿托伐醌的药效失去20倍； 对有3个基因突变位点的疟原虫产生的抗药性，癸氧喹酯的药效失去5倍，而阿托伐醌的药 效失去 1000 倍（ACSChem.Biol. 2011，6, 1214 - 1222)。
[0005] 癸氧喹酯，由化学合成，其命名为4-羟基喹啉（乙基-6-癸氧基-7-乙氧基-4-羟 基喹啉-3-羧酸酯），CAS号18507-89-6,分子量418,分子式C25H35NO5。据EFSA杂志 (2003) 17,1-40的有关癸氧喹酯专题的综合报道，癸氧喹酯的水溶解度非常低（纯净水中 〇? 06毫克/升，在一般pH值为4-9的水中〈0? 01毫克/升），呈高亲脂性（logKow值为 5. 2-5. 5)，该化合物在其它溶剂中的溶解度也非常低。
[0006] 癸氧喹酯作为抗球虫病的兽药，在全球范围内（包括我国）使用已有多年的历史， 没有发现有明显的副作用，其主要的作用部位为家禽和马，羊等牲口的肠道，用于抗球虫感 染，因此不需要经肠道吸收入体内而发挥药效。因为癸氧喹酯水溶性极差，所以阻碍其从肠 道有效吸收到体内，这就限制了该化合物用于人体作为抗疟疾药使用。
[0007] 癸氧喹酯在药效和安全性方面较其它现有的抗疟药有明显的优势。口服剂型仍然 是最方便可行的用药方式。癸氧喹酯能不能成为口服抗疟疾药，关键是要解决其在肠道吸 收的问题。药物颗粒粒径在微米以上的混悬液是癸氧喹酯常见的用药方式。而以这种方式 给药不可能达到体内的有效浓度，也就不可能起到预防或治疗疟疾的效果。
[0008] 曾经有报道，癸氧喹醋可增强二氯二甲P比啶酷（meticlorpindol，3, 5-Dichloro_2 ,6-dimethyl_4-pyridinol)在哺乳动物内的抗疱原虫的效果[见U.SPat.No. 4, 031, 220和 U.S.Pat.No. 4, 195, 089].二篇报道均是以癸氧喹酯1份和二氯二甲吡啶酚60份的比例混 合，然后再掺入乳糖和淀粉，进一步与溶于水相中的聚乙烯吡咯烷酮制粒。然而，这些报道 完全没有提供关于药物颗粒大小的信息，也没有提供任何有关于抗疟疾药效的实验资料。
[0009] 在测试癸氧喹酯抗疟疾药效的动物实验中，需要选择合适的溶剂给药。有的用 玉米油乳剂[Tae-gyuNametal(2011),ACSChemicalBiolog(Il) :1214 - 1222]，还 有的用大豆油乳剂[Filipa.P.daCruz,etal(2012),JournalofInfectiousDisease 205 (8) : 1278-86]。由于实验本身会产生一定的误差，再加上所选择的溶剂不同，所得出的 药效差异竟然超出10倍以上。因此，能不能把癸氧喹酯发展成为抗疟疾药，就在于能不能 研制出有效的溶剂给药。
[0010] 用于抗球虫的商品化的兽药制剂中含癸氧喹酯的量一般都在6 %。其中有 国外的产品[DeccOX? (Rhone-Poulenc)，U.S.Pat.No. 3, 485, 845, 1969;USPat-No. 35446861970]， 也有国内 的产品[Wuetal.CN101606908 (A) ,2009;Lietal.CN 101590055 (A)，2009)。在这些含癸氧喹酯的兽药产品中，所用药物载体有多种多样，制剂制 作的方式也各不相同。但是所有这些用于兽药的制剂并无有关颗粒大小的实验资料。有的 剂型所含有制剂颗粒达到毫米[Lietal.CN102228438A，2011].这些制剂可能在某种程 度上增加了癸氧喹酯的溶解度，但是没有证据证明它们可以作为抗疟疾的医疗药品。
[0011] 对于在体外有高度生物活性的难溶化合物，可以通过增强溶解度，提高体内药物 的释放以及药效，将其转变为有用的药品。提高化合物溶解度通常所用的办法，是将其制成 盐或者是通过制剂的方法以增强其溶解度。后者涉及到用高分子载体，增溶剂或表面活性 剂。在试图将癸氧喹酯转化为抗疟疾药的尝试中，还没有成功运用上述方法的报道。目前 还没有任何一个以癸氧喹酯作为活性成份的用于防治疟疾的产品问世。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的之一在于提供一种癸氧喹酯纳米制剂，其粒径不大于300nm，提高了 癸氧喹酯的溶出率、生物利用度及抗疟疾药效。
[0013] 本发明的目的之二在于提供一种上述癸氧喹酯纳米制剂的制备方法，制得的癸氧 喹醋纳米制剂的粒径不大于300nm。
[0014] 本发明的目的之三在于提供一种上述癸氧喹酯纳米制剂在抗疟疾方面的应用。
[0015] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0016] -种癸氧喹酯纳米制剂，包括癸氧喹酯、两亲性表面活性剂，所述两亲性表面活性 剂为L-a磷脂酰胆碱。
[0017] 癸氧喹酯为癸氧喹酯纳米制剂的活性成分，其化学结构式如式（1)所示：
[0018]
[0019] 市售的癸氧喹酯由于其在肠道的溶出率太低，只能用于抗球虫病。当晶体药物 从10微米降到100纳米时，比表面积提高100倍，[ElaineM.Merisko-Liversidge(2008) DrugNanoparticles:FormulatingPoorlyWater-SolubleCompounds,Toxicologic Pathology，36:43-48]。含药颗粒表面积的增大对于药物的溶出率和药物分子在肠道的吸 收具根本性的改变，而溶出率的增加可明显加强难溶化合物的药效。本发明的癸氧喹酯纳 米制剂由于其比表面积比常规的癸氧喹酯微米制剂的比表面积大很多，有利于增加癸氧喹 酯纳米制剂中癸氧喹酯的溶出率及癸氧喹酯在肠道的吸收，使其有效用于抗疟疾。
[0020] 本发明所述的两亲性表面活性剂的HLB值不小于10,所述的两亲性表面活性剂指 的是既可在pH为中性的溶剂中溶解，又可在酸性条件下溶解；本发明的两亲性表面活性剂 为L-a磷脂酰胆碱，在中性条件下，两亲性表面活性剂带有电荷，呈二亲性；而在酸性环境 中，两亲性表面活性剂则可以接受一个质子，并且形成相对稳定的中性分子，两亲性表面活 性剂有助于提高癸氧喹酯的溶解度，这在肠道吸收时尤为重要。
[0021] 本发明所述L-a磷脂酰胆碱选自蛋黄L-a磷脂酰胆碱和/或植物L-a磷脂酰 胆碱，植物L-a磷脂酰胆碱通常指的是大豆L-a磷脂酰胆碱；其中，所述蛋黄L-a磷脂酰 胆碱从蛋黄中提取，大豆L-a磷脂酰胆碱从大豆中提取。
[0022] 优选地，所述两亲性表面活性剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~5:1，例如1:1、 2:1、3:1、4:1、5:1 〇
[0023] 所述癸氧喹酯纳米制剂还包括非离子表面活性剂；所述非离子表面活性剂是指在 水溶液中不产生离子的表面活性剂。非离子表面活性剂在水中的溶度是由于分子中具有强 亲水性的官能团。非离子表面活性剂溶于水时不发生解离，其分子中的亲油基团与离子型 表面活性剂的亲油基团大致相同，其亲水基团主要是由具有一定数量的含氧基团（如羟基 和聚氧乙烯链）构成。由于非离子表面活性剂在溶液中不是以离子状态存在，所以它的稳 定性高，不易受强电解质存在的影响，也不易受酸、碱的影响，与其他类型表面活性剂能混 合使用，相容性好，在各种溶剂中均有良好的溶解性，在固体表面上不发生强烈吸附。
[0024] 本发明中，非离子表面活性剂的引入可使两亲性表面活性剂的作用更佳，还可 使所形成的纳米颗粒不会发生再聚合。优选地，本发明所述非离子表面活性剂为聚山梨 醇酯和/或KolliphorHS15;本发明所述的聚山梨醇酯为司盘（Span，山梨醇脂肪酸 酯）和环氧 乙烷的缩合物，其化学名为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，又简称聚山梨酯 (Polysorbate);吐温80(Tween80,MW: 1301)，其分子式为C24H44O6，是一种粘稠的液体，其 性质是非离子型的表面活性剂，聚山梨醇酯的分子含有较多的亲水性基团一聚氧乙烯基， 故亲水性强，它可通过抑制药物由肠道外流而起到增强许多药物的渗性的作用[Journal ofPharmaceuticalSciences, 90(11)，1776-1786]。本发明中，它不仅可增强癸氧喹醋 的溶解度，而且可起到稳定水相中的制剂复合物的作用。本发明中非离子表面活性剂KolliphorHS15是一种难溶药制剂专用非离子型表面活性剂，可以替代山梨醇吐温80。癸 氧喹酯、二亲性表面活性剂和非离子型表面活性剂形成的复合物在水相中各组分之间形成 氢键或范德华力，以此增加难溶或不溶化合物的亲水性。这种复合物的形成有利于增加活 性成份的生物利用度和药效，但不改变活性成份的分子结构。
[0025] 优选地，所述非离子表面活性剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~6:2,例如1:2、 1:1、3:2、2:1、5:2、3:1〇
[0026] 上述癸氧喹酯纳米制剂中，形成的复合物的热动力学的稳定性通常是通过吸收到 难溶于水的化合物表面的稳定剂来驱动的。而高分子化合物与癸氧喹酯形成复合物的先决 条件是表面活性剂的存在。没有适宜的表面活性剂，不可能很好地形成复合物，所形成的复 合物也不可能在水相中稳定地存在。
[0027] 作为本发明优选的技术方案，所述癸氧喹酯纳米制剂还包括高分子载体；高分 子载体是用以结合药物，有使药物分子易于湿化的容量，可提高药物的溶出度（USPat. No. 5, 262, 171，1993)。癸氧喹酯是高度疏水的非离子型化合物，其结构中仅有一个游离羟 基，因此对与其结合的高分子化合物的选择比较严格。
[0028] 优选地，所述高分子载体为聚乙烯吡咯烷酮；其中，聚乙烯吡咯烷酮结构中靠近 氮、氧、碳和氢等原子的电荷成不对称的分布，犹如蛋白样网状结构。因此，它可使水相中的 物质维持比较均一的状态，而不影响纳米化过程。本发明所选用的聚乙烯吡咯烷酮是线状 的，而不是交联状的。后者会对滥用药物的病人产生肺血管损伤。而测试过的一些其它的 高分子载体，如聚乙二醇，多糖类如纤维素，则不能与癸氧喹酯在纳米化的过程中维持在较 好的复合物状态。
[0029] 优选地，所述高分子载体与所述癸氧喹酯的质量比为1~5:1，例如I:I、2:1、3:1、 4:1、5:1〇
[0030] 癸氧喹酯、高分子化合物和非离子型表面活性剂新形成的复合物的热动力学的稳 定性通常是通过吸收到难溶于水的化合物表面的稳定剂来驱动的。而高分子化合物与癸氧 喹酯形成复合物的先决条件是表面活性剂的存在。没有适宜的表面活性剂，不可能很好地 形成复合物，所形成的复合物也不可能在水相中稳定地存在。而两亲性表明活性剂的加入 可以有效解决上述技术问题，使癸氧喹酯、高分子化合物、两亲性表面活性剂和非离子型表 面活性剂形成稳定的复合物。
[0031] 所述癸氧喹酯纳米制剂还包括磷脂、胆固醇、植物留醇中的任意一种或至少两种， 所述磷脂为磷脂酰甘油和/或磷脂酰乙醇胺；上述两亲性表面活性剂可以单独使用，也可 以与磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、植物留醇中的一种或者几种联用，联用的时候磷 脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、植物留醇主要起助表面活性剂的作用。胆固醇与L-a磷 脂酰胆碱合用可促进脂质复合物的形成，有利于增加癸氧喹酯的在水相中的分散性。制作 口服制剂时可用植物留醇替代胆固醇，以降低成本。
[0032] 优选地，上述癸氧喹酯纳米制剂中包括的磷脂、胆固醇、植物留醇中的任意一种或 至少两种与所述癸氧喹酯的质量比为1~10:1，例如1:1、2:1、3:1、4 :1、5:1、6:1、7:1、8:1、 9:1,10:1 ；
[0033] 优选地，所述癸氧喹醋纳米制剂的粒径为100~300nm，100~300nm范围内的癸 氧喹酯纳米制剂可增加抗疟疾活性成分癸氧喹酯在肠道的吸收，本发明中的癸氧喹酯纳米 制剂的粒径进一步优选为150~300nm〇
[0034] 本发明还提供一种上述癸氧喹酯纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0035] (1)提供至少以所述癸氧喹酯与所述两亲性表面活性剂为分散相、有机溶剂为分 散介质的分散体系，将有机溶剂去除后得到固体分散体；
[0036] (2)所述固体分散体加水后进行分散处理，制得粒径不大于300nm的癸氧喹酯纳 米制剂。
[0037] 上述制备方法中，必须加入所述两亲性表面活性剂，才能通过分散处理制得颗粒 粒径不大于300nm的癸氧喹酯纳米制剂。
[0038] 固体分散是指包括胶体物，微晶体，或无定型物质在内的难溶或不溶于水的药物 分子在水化之前，分散在其它水溶性物质中。本发明所述的固体分散体加水后采用超声 法或者高压匀浆法进行分散处理，可以将微米癸氧喹酯制剂的颗粒分散成纳米癸氧喹酯制 剂；经分散处理后，固体分散体形成又一个分散相，而其中的水即为水相，作为分散介质。
[0039] 上述步骤（1)中的分散介质必须包含癸氧喹酯、两亲性表面活性剂，还包含非离 子表面活性剂，也可以包含高分子载体。该分散体系可以通过加热溶解的方法制备，对于不 含有高分子载体的分散体系也可以通过超声分散的方法制备。
[0040] 优选地，所述固体分散体加水混匀，混匀后的分散体系的pH值为5. 5~7,有利于 固体分散体在水相中扩散均匀，扩散均匀后再采用超声法或者高压匀浆法进行分散处理；
[0041] 优选地，所述超声法中超声仪的频率为30~50KHZ，进一步优选为40KHZ;超声仪 的超声频率设定为40KHz可以将位于超声仪中的颗粒击碎，变成更小的颗粒，超声分散一 端时间后，使固体分散体均匀地分散成符合要求的纳米颗粒。
[0042] 优选地，所述步骤（2)的水为去离子水、纯净水或者含有0.9%氯化钠的生理盐 水；
[0043] 优选地，所述步骤（2)的水的用量为0. 05~0. 3ml/mg癸氧喹酯，进一步优选为 0?lml/mg癸氧喹酯，即每IOmg癸氧喹酯添加Iml水；
[0044] 优选地，所述步骤（2)的水中还加有增溶剂，以增加固体分散体在水中的溶解性；
[0045] 优选地，所述增溶剂为葡萄糖；
[0046] 优选地，所述增溶剂与所述癸氧喹酯的质量比为2:1。
[0047] 所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、氯丁烷、异丙醇中的任意一种或者至少两种。
[0048] 采用喷雾干燥法、旋转蒸馏法或者氮气吹干法去除有机溶剂；采用喷雾干燥法、旋 转蒸馏法或者氮气吹干法去除有机溶剂后，还需置于室温环境中让有机溶剂自然挥发，使 有机溶剂完全挥发干净。此过程应尽可能将有机溶剂清除干净，以免残留的有机溶剂在药 剂中产生不应有的副作用。
[0049] 优选地，在所述步骤（2)中，所述固体分散体加水分散处理后还需进行冷冻干燥， 制得不大于300nm的癸氧喹酯纳米制剂；冷冻干燥后的样品可储存备用或直接使用。
[0050] 优选地，所述癸氧喹酯纳米制剂为粉末状固体或者半固体，可将所述癸氧喹酯纳 米制剂制成片剂、冲剂或者胶囊。本发明不含有高分子载体的癸氧喹酯纳米制剂为半固体 状，只能用于灌胶囊，不能制成片剂。
[0051] 本发明还提供一种上述癸氧喹酯纳米制剂在抗疟疾方面的应用，所述抗疟疾指预 防疟疾和治疗疟疾；
[0052] 优选地，所述疟疾包括间日疟、恶性疟、三日疟、卵形疟和诺氏疟。
[0053] 于本发明中，需要说明的的是，上述"二亲性"即本发明所述的"两亲性"，"二亲性 表面活性剂"即本发明所述的"两亲性表面活性剂"。
[0054] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：一种癸氧喹酯纳米制剂，包括癸氧喹酯、 两亲性表面活性剂，所述两亲性表面活性剂为L-a磷脂酰胆碱，所述癸氧喹酯纳米制剂的 粒径不大于300nm。两亲性表面活性剂的引入增加了活性成分癸氧喹酯的溶出率，粒径不大 于300nm的癸氧喹酯纳米制剂的比表面积增大，提高了癸氧喹酯的溶出率，有效增加肠道 的吸收。总的来说，本发明的癸氧喹酯纳米制剂中的癸氧喹酯的溶出率、生物利用度及抗疟 疾药效均远远高于微米癸氧喹酯制剂。此外，本发明还提供了癸氧喹酯纳米制剂的制备方 法，通过引入两亲性表面活性剂和超声或高压匀浆法，实现将微米癸氧喹酯制剂分散成癸 氧喹酯纳米制剂。本发明的癸氧喹酯纳米制剂可作为抗疟疾的医药用品。
【附图说明】
[0055] 图1为本发明实施例5的癸氧喹醋纳米制剂与常用抗疱疾药对疱原虫Plasmodium falciparum(3D7)抑制效果。
[0056] 图2为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂与常用抗疟疾药对疟原虫Plasmodium falciparum(Dd2)的抑制效果。
[0057] 图3为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂的粒径分布。
[0058] 图4为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂放置6个月后的粒径分布。
[0059] 图5为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂的高压液相图谱。
[0060] 图6为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂放置6个月后的高压液相图谱。
【具体实施方式】
[0061] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0062] 如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本领域的常规方法制备 得到。
[0063] 实施例1
[0064] 组成成份：
[0065] 癸氧喹酯（美国 Sigma, St. Louis, MO. USA) 200mg
[0066] 蛋黄 L- a -磷脂酰胆碱（PC)(美国 Sigma, St. Louis, MO. USA) 334mg
[0067] 吐温 80 (Tween 80)(美国 Sigma, St. Louis, MO. USA) 200mg
[0068] 按上述质量称取各组份，加入乙醇（加入的量视样品量而定），加热至65°C，直至 各组份完全溶解，用旋转蒸发仪去除乙醇，将样品转移至玻璃器皿，使乙醇进一步挥发。收 集粉末状的样品，加水20ml(葡萄糖质量为400mg)。样品经过功率为500W、频率为40KHz 的超声仪（广东固特超声实业有限公司GT-2227QTS超声仪）在室温下超声3h，样品中颗粒 减小至300nm以下，样品冷冻干燥后，制得癸氧喹酯纳米制剂。
[0069] 实施例2
[0070] 组成成份：
[0085] 癸氧喹酯纳米制剂的制备过程与实施例1相同。
[0086] 对比例1
[0087] 除了不加两亲性表面活性剂PC之外，其他组分、癸氧喹酯纳米制剂的制备过程均 与实施例5相同。
[0088] 实施例6
[0095] 按上述质量称取各组份，加入乙醇（加入的量视样品量而定），加热至65°C，直至 各组份完全溶解，用旋转蒸发仪去除乙醇，将样品转移至玻璃器皿，使乙醇进一步挥发。收 集呈半固体状的样品，加水20ml(葡萄糖质量为400mg)。样品经过功率为500W、频率为 40KHz的超声仪（广东固特超声实业有限公司GT-2227QTS超声仪）超声3h，样品中颗粒减 小至300nm以下，样品冷冻干燥后，制得癸氧喹酯纳米制剂。
[0096] 实施例8
[0097] 组成成份：
[0098]
[0099] 癸氧喹酯纳米制剂的制备过程与实施例7相同。
[0100] 1、粒径及稳定性测试：
[0101] 采用HORIBA LB500动态光散射粒度仪测定实施例1~8中样品的颗粒粒径，各纳 米制剂组成及超声前后的粒径测试结果见表1。
[0102] 表1.各纳米制剂组成及超声前后的粒径
[0103]
[0104] 表 1 中的缩写（Abbreviation):
[0105] DQ = Decoquinate (癸氧喹醋）；
[0106] PVPlO = Polyvinylpyrrolidone 10 (聚乙稀P比略焼酮 10);
[0107] T80 = Tween 80or polysorbate (吐温 80 或聚山梨醇醋）；
[0108] PC = egg L-a-Phosphatidylcholine (蛋黄 L-a-磷脂酰胆喊）；
[0109] DSPG = 1，2-Distearoyl-sn-glycero_3-phosphoglycerol (磷脂酰甘油）；
[0110] Chol = cholesterol (胆固醇）；
[0111] PS = Plant sterol (植物甾醇）；
[0112] HS15 =KolliphorHS15 (15-羟基硬脂酸乙二醇酯）。
[0113] 从表1可知，超声前的样品的颗粒粒径均为微米级，而采用本发明的方法超声处 理后），制备的样品的粒径达到纳米级别。
[0114] 两亲性表面活性剂的影响：
[0115] 以实施例5为例，测试癸氧喹酯纳米制剂样品颗粒粒径随超声时间的变化，结果 见表2A，超声后，样品颗粒粒径由微米级变成纳米级，超声3h后，样品的粒径变化很小。
[0116] 表2A.癸氧喹酯纳米制剂的颗粒粒径随超声时间的变化
[0117]
[0118] 实施例5的癸氧喹酯纳米制剂样品在液态、4°C条件下储存，分别测试癸氧喹酯纳 米制剂储存1天时间和储存6个月时的粒径分布（图3、图4)(采用HORIBALB500动态光 散射粒度仪测定）和高压液相谱图（图5、图6)(采用高压液相仪HPLCAgilent1200测 定），癸氧喹酯纳米制剂储存1天、4个月、5个月、6个月时的平均粒径及药物（癸氧喹酯） 含量见表2B。对比图3、图4可知，癸氧喹酯纳米制剂储存1天和储存6个月时的颗粒粒径 分布变化很小；对比图5、图6可知，癸氧喹酯纳米制剂储存1天和储存6个月时的癸氧喹 酯含量没有发生任何变化。从表2B可知，含两亲性表面活性剂的癸氧喹酯纳米制剂在液态 4°C条件下保存6个月后，样品颗粒的粒径及癸氧喹酯的含量基本保持不变，可见其稳定性 极好，保质期长。
[0119] 表2B.含两亲性表面活性剂的癸氧喹酯纳米制剂的稳定性
[0120]
[0121] 以对比例1为例，测试样品颗粒粒径随超声时间的变化，结果见表2C。
[0122] 表2C.不含两亲性表面活性剂的癸氧喹酯制剂的颗粒粒径随超声时间的变化
[0123]
[0125] 与表2A对比发现，没有加两亲性表面活性剂时的样品的粒径大于加了两亲性表 面活性剂的样品粒径，而且，没有加两亲性表面活性剂的样品超声前后的样品粒径均保持 在微米级。
[0126] 综上所述，两亲性表面活性剂是样品颗粒通过超声法由微米级转变为纳米级不可 缺少的，而且含有两亲性表面活性剂的癸氧喹酯纳米制剂储存稳定性好。
[0127] 高分子载体的影响：
[0128] 实施例8为不加高分子载体制备的癸氧喹酯纳米制剂，以实施例8为例，测试样品 颗粒粒径随超声时间的变化，测试结果见表3。样品经超声后颗粒粒径由大变小，说明纳米 癸氧喹酯制剂的制作，无需高分子载体也可以实现。实施例1的样品超声前后颗粒粒径的 测试结果与实施例8非常接近。
[0129] 表3.不含高分子载体的癸氧喹酯纳米制剂的颗粒粒径随超声时间的变化
[0130]
[0131] 2、药效测试：
[0132] 本发明中，采用高压液相仪（HPLC，Agilent1200)测定样品中癸氧喹酯浓度，并 以此为计算单位，测试癸氧喹酯的抗疟疾效果。药效实验分为两个部分：(A)体外药效实 验用感染人的疱原虫Plasmodiumfalciparum(Pf)感染体外人的红细胞，测试癸氧喹醋抑 制疟原虫生长达到50%时所需的药物浓度，即IC50 ; (B)体内药效实验用感染啮齿动物的 疟原虫Plasmodiumberghei(Pb)感染C57BL/6小鼠，经灌胃给药，测试虫血率和动物存活 率。所有疟原虫感染株均由世界疟疾研宄和参照试剂资源中心（MalariaResearchand ReferenceReagentResourceCenter，MM)提供。
[0133] ⑷体外药效实验：
[0134] 体外培养人疱原虫：采用的疱原虫是感染人的Plasmodiumfalciparum(Pf)。 本发明所用Pf又分为氯喹敏感株（3D7)和氯喹耐药株（2Dd)。Pf培养基的配制如 下，取 1640 干粉（GIBC0,31800022) 10.43 克，H印es5.96 克，NaHC032 克，L-谷氨酰胺 (L-Glutamine) 0? 292克，葡萄糖3. 96克，次黄嗓呤（Hypoxanthine) 50微克，庆大霉素 (Gentamycinsulfate) 2. 5毫克，用高压过的双蒸水（用前平衡到室温）定容至1升，用 0. 22ym滤器过滤除菌，-20 °C保存（常用的4°C保存），此为不完全培养基。完全培养基的 配制与不完全培养基的配制不同的是，次黄嘌呤（Hypoxanthine)为27. 22毫克，庆大霉素 (Gentamycinsulfate)为 10 毫克，另外加AlbumaxI/II(GIBC0，A1049101)5 克，其余成 份的含量与不完全培养基相同，配制方法亦相同。完全培养（内含albumax)基用来培养疟 原虫，而不完全培养基是用来保存红细胞（不含albumax)。人红细胞保存方法为，用医用 采血针和抗EDTA采血管采血50ml，2500转/分钟（不能超3000转/分钟），离心5-10分 钟，吸走血浆和白细胞层，用无血清培养基洗涤两次。加入培养基，按体积配平，2500-3000 转/分钟离心5-10分钟，吸走上清及中间层的白细胞，重复此步骤两次。红细胞直接使用 时，按1:1体积比往1份红细胞压积里加入1份无血清培养基，在4°C保存下使用7天。
[0135] 将化合物进行梯度稀释后与疟原虫共孵育，72h后加入核酸染料在酶标仪上检测， 得到数据后导入软件计算IC50值，IC50是指抗疟药物对Pf疟原虫的抑制率达到50 %时候 的浓度。
[0136] 具体方法是：原料药癸氧喹酯用DMSO配制成0.5毫摩尔储存液，氯喹（美国 Sigma，St.Louis，MO.USA)采用PBS配制，青蒿素（成都华高药业有限公司）采用DMSO溶 解，再加PBS稀释。纳米癸氧喹酯和微米癸氧喹酯按实施例5的方法制备。二者的组成成份 完全一样，所不同的是，微米癸氧喹酯不经过超声处理减小其颗粒粒径。纳米癸氧喹酯和微 米癸氧喹酯直接用完全培养基稀释。首次实验，待测药物的贮存液先按照10倍梯度稀释， 再按照2倍梯度稀释，共稀释10个浓度梯度。根据首次试验的结果，再根据不同测试的对 象的药效，对药物的稀释作调整，以便使测试的药物浓度梯度在一个适当的范围内。在最终 的检测体系中，总体积100微升，其中药物为10微升，虫血为90微升。如用DMSO配制的样 品，DMSO占终体积的量不超过0. 1 %。
[0137] 加入的虫血标准为0. 5%的感染率，2%的红细胞压积，100微升培养体系。红细胞 和培养基体积比（v/v)为1:1，涂片计算感染率，Pf?疟原虫体外培养控制在6%。例如：Pf 3D7感染率6 %，96孔的板共6板，10个药物浓度梯度，所需的虫血为6毫升/板。6板所 需虫血为36毫升。由于加样的时候会有损失，一般会配40毫升虫血。所需虫血：40x2% (2 %的红细胞压积）=0.8毫升。每个板0. 13毫升。在每孔10微升药物中加入90微升虫 血后，在37°C，5%C02条件下培养，72小时后检测。配制LysisBuffer与Sybrgre el的混 合检测液，按照0. 2微升/毫升LysisBuffer配制检测液。按100微升/孔，在37°C培养 lh，将红细胞完全裂解，（对光目测培养板底部无细胞附着，液体变得很澄清，如果尚有未裂 解的红细胞，可在涡旋震荡仪上轻轻震荡）。红细胞裂解后在酶标仪检测，激发光497nM，发 射光为520nM。
[0138] 用感染人的疱原虫Plasmodiumfalciparum(3D7)感染人的红血细胞，然后检测微 米癸氧喹酯、纳米癸氧喹酯、以DMSO配制的癸氧喹酯、氯喹以及青蒿素对Pf疟原虫的抑制 效果，计算抗疟药物对Pf疟原虫的抑制率达到50%时候的浓度IC50,测试结果见图1。
[0139] 用感染人的疱原虫Plasmodiumfalciparum(Dd2)感染人的红血细胞，然后检测微 米癸氧喹酯、纳米癸氧喹酯、以及氯喹对Pf疟原虫的抑制效果，计算抗疟药物对Pf疟原虫 的抑制率达到50%时候的浓度，即IC50,测试结果见图2。
[0140] 通过对比各药物的IC50,可知各个药物药效的强弱。图1、图2中具体的测试数据 见表4,其中nM表示纳摩尔浓度。
[0141] 表4.各抗疱疾药物对血期疱原虫（Plasmodiumfalciparum)的抑制效果
[0142]
[0143]注：n/d(not detectable),表示无法测到粒径；n/a(not applicable)，表示粒径 测定不适用于此。
[0144] 从表4可知，采用本发明的方法制备的纳米癸氧喹酯制剂的IC50值是微米癸氧喹 酯制剂的4. 63分之一，是以DMSO配制的癸氧喹酯的5. 25分之一，约为氯喹的33. 45分之 一，是青蒿素的23. 16分之一。由于Dd2是氯喹耐药株，因此氯喹的IC50值远大于在氯喹 敏感株3d7测试的值。
[0145] (B)体内药效实验：
[0146] 用于实验的雄性小鼠（C57BL/6albinomice)，在到达后，至少要养7天。开始 给药时，小鼠的年龄为7周，每个笼子只养一只小鼠。室温为18°C_26°C，相对湿度为 34~68%，12小时的灯光和黑暗交替周转。试验前和试验中的食物为标准的喂养食品（ad libitum)。此实验是严格按照有关动物实验法规所进行的（GuidefortheCareandUse ofLaboratoryAnimals,NRCpublication, 2011edition)。动物实验中所用的微米癸氧喹 醋混悬液是用含有HECT(0. 5%hydroxyethylcellulose[w/v]and0? 2%Tween_80[v/v]) 的去离子水混匀，再用超声仪超声5分钟所配制的。纳米癸氧喹酯制剂是完全按实施例5 的制备过程制备。载体对照是指除活性成份癸氧喹酯以外的相对应的制剂成份。其它所用 药物或制剂与体外实验所用的药物或制剂的配制完全相同。阳性对照是用作用于肝期疟原 虫的抗疟药伯氨奎宁。
[0147] 测试上述微米癸氧喹酯制剂、纳米癸氧喹酯以及伯氨奎宁对小鼠体内疟原虫 (ANKAstrainofP.berghei)生长的抑制效果。每次动物实验至少重复三次，每次每组5 只小鼠，因此每组至少测试15只小鼠。雄性小鼠（maleC57BL/6albino)的疟原虫感染的 方法是每只小鼠尾静脉注射5万个伯氏疟原虫（P.bergheiANKA)的子孢子。口服给药共 分为三次，即疟原虫感染的前一天，当天和后一天。虫血率的检测的方法是按常规红细胞计 数每mm3血液的红细胞数，并制薄血膜，3%Giemsa染色20分钟，油镜下计数每1000个红细 胞中感染红细胞数，得红细胞感染率（erythrocyteinfectedrate,EIR, %。）。生存率的计 算是小鼠在感染疟原虫后的第15天进行统计。每只动物按体重（给药时称动物体重）灌 胃给药，具体测试结果见表5。
[0148] 表5.各抗疟疾药物对小鼠体内疟原虫（ANKAstrainofP.berghei)生长的抑制 效果
[0149]
[0150] 由表5可知，使用微米癸氧喹醋制剂时，癸氧喹醋的浓度达到40mg/kg才可达到对 疟原虫的完全抑制，小鼠才能完全存活；而使用纳米癸氧喹酯制剂时，癸氧喹酯的浓度只需 5mg/kg就可达到对疟原虫的完全抑制，小鼠的生存率达到100 %。
[0151] 本发明中，将微米癸氧喹酯制剂通过超声方法制备成纳米癸氧喹酯制剂，提高了 含有癸氧喹酯的颗粒的比表面积，颗粒比表面积增大对于癸氧喹酯的溶出率和癸氧喹酯在 肠道的吸收具有根本性的改变，增强了难溶癸氧喹酯的药效。本发明解决了癸氧喹酯由于 水溶性差而导致其不能在人体内有效地发挥抗疟疾作用的问题，较之现有的临床抗疟疾药 物具有明显的优势。
[0152] 上述实施例1~4、6~8所制得的癸氧喹酯纳米制剂的粒径分布、稳定性及抗疟 疾药效与实施例5的抗疟疾药效非常接近，在此不再赘述。
[0153] 需要说明的是，本发明的纳米癸氧喹酯制剂与癸氧喹酯纳米制剂为同一种制剂， 没有任何不同；本发明的微米癸氧喹酯制剂与癸氧喹酯微米制剂为同一种制剂，没有任何 不同。
[0154] 以上实施例仅用来说明本发明的详细方法，本发明并不局限于上述详细方法，即 不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对 本发明的任何改进，对于本发明中所采用的基本步骤和同类非活性成份的不同选择用以制 备癸氧喹酯的抗疟疾的制剂，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，包括癸氧喹酯、两亲性表面活性剂，所述两亲 性表面活性剂为L-a磷脂酰胆碱，所述癸氧喹酯纳米制剂的粒径不大于300nm。2. 根据权利要求1所述的癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，所述L-a磷脂酰胆碱选自 蛋黄L-a磷脂酰胆碱和/或植物L-a磷脂酰胆碱； 优选地，所述两亲性表面活性剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~5:1。3. 根据权利要求1所述的癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，所述癸氧喹酯纳米制剂还 包括非离子表面活性剂； 优选地，所述非离子表面活性剂为聚山梨醇酯和/或KolliphorHS15,所述聚山梨醇 酯优选为吐温-80 ; 优选地，所述非离子表面活性剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~6:2。4. 根据权利要求3所述的癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，所述癸氧喹酯纳米制剂还 包括高分子载体； 优选地，所述高分子载体为聚乙烯吡咯烷酮； 优选地，所述高分子载体与所述癸氧喹酯的质量比为1~5:1。5. 根据权利要求3所述的癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，所述癸氧喹酯纳米制剂还 包括磷脂、胆固醇、植物留醇中的任意一种或至少两种，所述磷脂为磷脂酰甘油和/或磷脂 酰乙醇胺； 优选地，所述磷脂、胆固醇、植物留醇中的任意一种或至少两种与所述癸氧喹酯的质量 比为1~10:1 ; 优选地，所述癸氧喹醋纳米制剂的粒径为100~300nm，进一步优选为150~300nm〇6. -种权利要求1~5任一项所述的癸氧喹酯纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1) 提供至少以癸氧喹酯、两亲性表面活性剂为分散相、有机溶剂为分散介质的分散体 系，将有机溶剂去除后得到固体分散体； (2) 所述固体分散体加水后进行分散处理，制得粒径不大于300nm的癸氧喹酯纳米制 剂。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述固体分散体加水后采用超声法 或者高压匀浆法进行分散处理； 优选地，所述固体分散体加水混匀后再采用超声法或者高压匀浆法进行分散处理； 优选地，所述超声法中超声仪的频率为30~50KHz，进一步优选为40KHz; 优选地，所述步骤（2)的水为去离子水、纯净水或者含有0.9%氯化钠的生理盐水； 优选地，所述步骤（2)的水的用量为0. 05~0. 3ml/mg癸氧喹醋，进一步优选为0.Iml/mg癸氧喹酯； 优选地，所述步骤（2)的水中还加有增溶剂，进一步优选地，所述增溶剂为葡萄糖； 优选地，所述增溶剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~3:1，进一步优选为2:1。8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、氯丁 烷、异丙醇中的任意一种或者至少两种。9. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，采用喷雾干燥法、旋转蒸馏法或者氮 气吹干法去除有机溶剂； 优选地，在所述步骤（2)中，所述固体分散体加水分散处理后还需进行冷冻干燥，制得 不大于300nm的癸氧喹酯纳米制剂； 优选地，所述癸氧喹酯纳米制剂为粉末状固体或者半固体，将所述癸氧喹酯纳米制剂 制成片剂、冲剂或者胶囊。10. -种权利要求1~5任一项所述的癸氧喹酯纳米制剂在抗疟疾方面的应用，所述抗 疟疾包括预防疟疾和治疗疟疾； 优选地，所述疟疾包括间日疟、恶性疟、三日疟、卵形疟和诺氏疟。
【专利摘要】本发明公开了一种癸氧喹酯纳米制剂，包括癸氧喹酯、两亲性表面活性剂，所述两亲性表面活性剂为L-α磷脂酰胆碱，所述癸氧喹酯纳米制剂的粒径不大于300nm。两亲性表面活性剂的引入增加了活性成分癸氧喹酯的溶出率，粒径不大于300nm的癸氧喹酯纳米制剂的比表面积增大，提高了癸氧喹酯的溶出率，有效增加肠道的吸收。总的来说，本发明的癸氧喹酯纳米制剂中的癸氧喹酯的溶出率、生物利用度及抗疟疾药效均远远高于微米癸氧喹酯制剂。此外，本发明还提供了癸氧喹酯纳米制剂的制备方法，通过引入两亲性表面活性剂和超声或高压匀浆法，实现将微米癸氧喹酯制剂分散成癸氧喹酯纳米制剂。
【IPC分类】A61K9/16, A61K9/20, A61K9/14, A61K47/24, A61P33/06, A61K31/47, A61K9/48
【公开号】CN104906044
【申请号】CN201510266332
【发明人】王洪星, 陈雪清, 范银洲, 覃丽梅, 许婉婉, 秦莉, 赵思婷, 陈小平
【申请人】广州中科蓝华生物科技有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种癸氧喹酯纳米制剂及其制备方法与应 用。
【背景技术】
[0002] 疟疾是经按蚊叮咬进行传播的由疟原虫引起的疾病。疟原虫通过蚊虫叮咬到达人 体后，首先在肝脏由子孢子发育成裂殖子，然后感染红细胞。疟原虫感染红细胞后，引起症 状如发烧，头痛，疲劳和呕吐等。这些症状通常在蚊子叮咬后10天到15天出现。患者通常 需要及时治疗，否则会损坏病人的重要器官甚至威胁到病人的生命安全。据世界卫生组织 2013年统计的数字，世界上还有97个国家近34亿人口处于罹患疟疾的危险，其中12亿处 在高风险中。每年大约有62万人死于疟疾，其中70%以上是5岁以下的儿童。但是疟疾是 可以预防和治愈的，因此这种状况并非不可避免。
[0003] 目前与疟疾抗争的方法有防止蚊虫叮咬、发展预防性疫苗以及寻找和研制有效的 抗疟疾药物。迄今为止，还没有预防疟疾的疫苗诞生。全球范围内已出现疟原虫广泛对氯 喹和磺胺类耐药。我国科技工作者发明的青蒿素是当前最主要的抗疟疾药。但是东南亚一 带也出现了青蒿素耐药虫株。为避免青蒿素耐药，世界卫生组织已限制青蒿素单独使用，而 必须联合用药。另外，全球青蒿素生产能力有限（黄蒿种植量有限）。伯氨喹类是较新的 用于肝期的抗疟疾药物。但是这类药有很强的副作用，它不仅可引起部分疟疾病人的急性 溶血性贫血，而且对恶性疟红细胞内期则完全无效，不能作为控制症状的药物应用。而以阿 托伐醌/氯胍组成的复方马拉隆则因为价格高而使低收入人群经济负担过重。因而开发廉 价、高效、低毒并可以大量生产的新药和新的复方制剂势在必行。
[0004] 近年来，本专利发明人和不少其他作者在研宄中发现一种球虫抑制药物癸氧喹酯 (CAS号为18507-89-6)在体外实验中有很强的抑制和杀灭疟原虫的作用。其在体外试验的 药效不仅远远超过氯喹，而且丝毫也不逊色于青蒿素。这是经过从上百万个化合物筛选比 较而得出来的结论（Science2011 ;334:1372-7)。新近的实验证明癸氧喹酯通过抑制疟原 虫线粒体的细胞色素bcl复合物，可以非常有效地在体外和体内杀灭疟原虫。虽然它与临 床上现有的阿托伐醌的药理作用相似，但是与其并不具交叉抗药性。有文献报道，对有1个 突变位点的疟原虫产生的抗药性，癸氧喹酯的药效失去2倍，而阿托伐醌的药效失去20倍； 对有3个基因突变位点的疟原虫产生的抗药性，癸氧喹酯的药效失去5倍，而阿托伐醌的药 效失去 1000 倍（ACSChem.Biol. 2011，6, 1214 - 1222)。
[0005] 癸氧喹酯，由化学合成，其命名为4-羟基喹啉（乙基-6-癸氧基-7-乙氧基-4-羟 基喹啉-3-羧酸酯），CAS号18507-89-6,分子量418,分子式C25H35NO5。据EFSA杂志 (2003) 17,1-40的有关癸氧喹酯专题的综合报道，癸氧喹酯的水溶解度非常低（纯净水中 〇? 06毫克/升，在一般pH值为4-9的水中〈0? 01毫克/升），呈高亲脂性（logKow值为 5. 2-5. 5)，该化合物在其它溶剂中的溶解度也非常低。
[0006] 癸氧喹酯作为抗球虫病的兽药，在全球范围内（包括我国）使用已有多年的历史， 没有发现有明显的副作用，其主要的作用部位为家禽和马，羊等牲口的肠道，用于抗球虫感 染，因此不需要经肠道吸收入体内而发挥药效。因为癸氧喹酯水溶性极差，所以阻碍其从肠 道有效吸收到体内，这就限制了该化合物用于人体作为抗疟疾药使用。
[0007] 癸氧喹酯在药效和安全性方面较其它现有的抗疟药有明显的优势。口服剂型仍然 是最方便可行的用药方式。癸氧喹酯能不能成为口服抗疟疾药，关键是要解决其在肠道吸 收的问题。药物颗粒粒径在微米以上的混悬液是癸氧喹酯常见的用药方式。而以这种方式 给药不可能达到体内的有效浓度，也就不可能起到预防或治疗疟疾的效果。
[0008] 曾经有报道，癸氧喹醋可增强二氯二甲P比啶酷（meticlorpindol，3, 5-Dichloro_2 ,6-dimethyl_4-pyridinol)在哺乳动物内的抗疱原虫的效果[见U.SPat.No. 4, 031, 220和 U.S.Pat.No. 4, 195, 089].二篇报道均是以癸氧喹酯1份和二氯二甲吡啶酚60份的比例混 合，然后再掺入乳糖和淀粉，进一步与溶于水相中的聚乙烯吡咯烷酮制粒。然而，这些报道 完全没有提供关于药物颗粒大小的信息，也没有提供任何有关于抗疟疾药效的实验资料。
[0009] 在测试癸氧喹酯抗疟疾药效的动物实验中，需要选择合适的溶剂给药。有的用 玉米油乳剂[Tae-gyuNametal(2011),ACSChemicalBiolog(Il) :1214 - 1222]，还 有的用大豆油乳剂[Filipa.P.daCruz,etal(2012),JournalofInfectiousDisease 205 (8) : 1278-86]。由于实验本身会产生一定的误差，再加上所选择的溶剂不同，所得出的 药效差异竟然超出10倍以上。因此，能不能把癸氧喹酯发展成为抗疟疾药，就在于能不能 研制出有效的溶剂给药。
[0010] 用于抗球虫的商品化的兽药制剂中含癸氧喹酯的量一般都在6 %。其中有 国外的产品[DeccOX? (Rhone-Poulenc)，U.S.Pat.No. 3, 485, 845, 1969;USPat-No. 35446861970]， 也有国内 的产品[Wuetal.CN101606908 (A) ,2009;Lietal.CN 101590055 (A)，2009)。在这些含癸氧喹酯的兽药产品中，所用药物载体有多种多样，制剂制 作的方式也各不相同。但是所有这些用于兽药的制剂并无有关颗粒大小的实验资料。有的 剂型所含有制剂颗粒达到毫米[Lietal.CN102228438A，2011].这些制剂可能在某种程 度上增加了癸氧喹酯的溶解度，但是没有证据证明它们可以作为抗疟疾的医疗药品。
[0011] 对于在体外有高度生物活性的难溶化合物，可以通过增强溶解度，提高体内药物 的释放以及药效，将其转变为有用的药品。提高化合物溶解度通常所用的办法，是将其制成 盐或者是通过制剂的方法以增强其溶解度。后者涉及到用高分子载体，增溶剂或表面活性 剂。在试图将癸氧喹酯转化为抗疟疾药的尝试中，还没有成功运用上述方法的报道。目前 还没有任何一个以癸氧喹酯作为活性成份的用于防治疟疾的产品问世。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的之一在于提供一种癸氧喹酯纳米制剂，其粒径不大于300nm，提高了 癸氧喹酯的溶出率、生物利用度及抗疟疾药效。
[0013] 本发明的目的之二在于提供一种上述癸氧喹酯纳米制剂的制备方法，制得的癸氧 喹醋纳米制剂的粒径不大于300nm。
[0014] 本发明的目的之三在于提供一种上述癸氧喹酯纳米制剂在抗疟疾方面的应用。
[0015] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0016] -种癸氧喹酯纳米制剂，包括癸氧喹酯、两亲性表面活性剂，所述两亲性表面活性 剂为L-a磷脂酰胆碱。
[0017] 癸氧喹酯为癸氧喹酯纳米制剂的活性成分，其化学结构式如式（1)所示：
[0018]
[0019] 市售的癸氧喹酯由于其在肠道的溶出率太低，只能用于抗球虫病。当晶体药物 从10微米降到100纳米时，比表面积提高100倍，[ElaineM.Merisko-Liversidge(2008) DrugNanoparticles:FormulatingPoorlyWater-SolubleCompounds,Toxicologic Pathology，36:43-48]。含药颗粒表面积的增大对于药物的溶出率和药物分子在肠道的吸 收具根本性的改变，而溶出率的增加可明显加强难溶化合物的药效。本发明的癸氧喹酯纳 米制剂由于其比表面积比常规的癸氧喹酯微米制剂的比表面积大很多，有利于增加癸氧喹 酯纳米制剂中癸氧喹酯的溶出率及癸氧喹酯在肠道的吸收，使其有效用于抗疟疾。
[0020] 本发明所述的两亲性表面活性剂的HLB值不小于10,所述的两亲性表面活性剂指 的是既可在pH为中性的溶剂中溶解，又可在酸性条件下溶解；本发明的两亲性表面活性剂 为L-a磷脂酰胆碱，在中性条件下，两亲性表面活性剂带有电荷，呈二亲性；而在酸性环境 中，两亲性表面活性剂则可以接受一个质子，并且形成相对稳定的中性分子，两亲性表面活 性剂有助于提高癸氧喹酯的溶解度，这在肠道吸收时尤为重要。
[0021] 本发明所述L-a磷脂酰胆碱选自蛋黄L-a磷脂酰胆碱和/或植物L-a磷脂酰 胆碱，植物L-a磷脂酰胆碱通常指的是大豆L-a磷脂酰胆碱；其中，所述蛋黄L-a磷脂酰 胆碱从蛋黄中提取，大豆L-a磷脂酰胆碱从大豆中提取。
[0022] 优选地，所述两亲性表面活性剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~5:1，例如1:1、 2:1、3:1、4:1、5:1 〇
[0023] 所述癸氧喹酯纳米制剂还包括非离子表面活性剂；所述非离子表面活性剂是指在 水溶液中不产生离子的表面活性剂。非离子表面活性剂在水中的溶度是由于分子中具有强 亲水性的官能团。非离子表面活性剂溶于水时不发生解离，其分子中的亲油基团与离子型 表面活性剂的亲油基团大致相同，其亲水基团主要是由具有一定数量的含氧基团（如羟基 和聚氧乙烯链）构成。由于非离子表面活性剂在溶液中不是以离子状态存在，所以它的稳 定性高，不易受强电解质存在的影响，也不易受酸、碱的影响，与其他类型表面活性剂能混 合使用，相容性好，在各种溶剂中均有良好的溶解性，在固体表面上不发生强烈吸附。
[0024] 本发明中，非离子表面活性剂的引入可使两亲性表面活性剂的作用更佳，还可 使所形成的纳米颗粒不会发生再聚合。优选地，本发明所述非离子表面活性剂为聚山梨 醇酯和/或KolliphorHS15;本发明所述的聚山梨醇酯为司盘（Span，山梨醇脂肪酸 酯）和环氧 乙烷的缩合物，其化学名为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，又简称聚山梨酯 (Polysorbate);吐温80(Tween80,MW: 1301)，其分子式为C24H44O6，是一种粘稠的液体，其 性质是非离子型的表面活性剂，聚山梨醇酯的分子含有较多的亲水性基团一聚氧乙烯基， 故亲水性强，它可通过抑制药物由肠道外流而起到增强许多药物的渗性的作用[Journal ofPharmaceuticalSciences, 90(11)，1776-1786]。本发明中，它不仅可增强癸氧喹醋 的溶解度，而且可起到稳定水相中的制剂复合物的作用。本发明中非离子表面活性剂KolliphorHS15是一种难溶药制剂专用非离子型表面活性剂，可以替代山梨醇吐温80。癸 氧喹酯、二亲性表面活性剂和非离子型表面活性剂形成的复合物在水相中各组分之间形成 氢键或范德华力，以此增加难溶或不溶化合物的亲水性。这种复合物的形成有利于增加活 性成份的生物利用度和药效，但不改变活性成份的分子结构。
[0025] 优选地，所述非离子表面活性剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~6:2,例如1:2、 1:1、3:2、2:1、5:2、3:1〇
[0026] 上述癸氧喹酯纳米制剂中，形成的复合物的热动力学的稳定性通常是通过吸收到 难溶于水的化合物表面的稳定剂来驱动的。而高分子化合物与癸氧喹酯形成复合物的先决 条件是表面活性剂的存在。没有适宜的表面活性剂，不可能很好地形成复合物，所形成的复 合物也不可能在水相中稳定地存在。
[0027] 作为本发明优选的技术方案，所述癸氧喹酯纳米制剂还包括高分子载体；高分 子载体是用以结合药物，有使药物分子易于湿化的容量，可提高药物的溶出度（USPat. No. 5, 262, 171，1993)。癸氧喹酯是高度疏水的非离子型化合物，其结构中仅有一个游离羟 基，因此对与其结合的高分子化合物的选择比较严格。
[0028] 优选地，所述高分子载体为聚乙烯吡咯烷酮；其中，聚乙烯吡咯烷酮结构中靠近 氮、氧、碳和氢等原子的电荷成不对称的分布，犹如蛋白样网状结构。因此，它可使水相中的 物质维持比较均一的状态，而不影响纳米化过程。本发明所选用的聚乙烯吡咯烷酮是线状 的，而不是交联状的。后者会对滥用药物的病人产生肺血管损伤。而测试过的一些其它的 高分子载体，如聚乙二醇，多糖类如纤维素，则不能与癸氧喹酯在纳米化的过程中维持在较 好的复合物状态。
[0029] 优选地，所述高分子载体与所述癸氧喹酯的质量比为1~5:1，例如I:I、2:1、3:1、 4:1、5:1〇
[0030] 癸氧喹酯、高分子化合物和非离子型表面活性剂新形成的复合物的热动力学的稳 定性通常是通过吸收到难溶于水的化合物表面的稳定剂来驱动的。而高分子化合物与癸氧 喹酯形成复合物的先决条件是表面活性剂的存在。没有适宜的表面活性剂，不可能很好地 形成复合物，所形成的复合物也不可能在水相中稳定地存在。而两亲性表明活性剂的加入 可以有效解决上述技术问题，使癸氧喹酯、高分子化合物、两亲性表面活性剂和非离子型表 面活性剂形成稳定的复合物。
[0031] 所述癸氧喹酯纳米制剂还包括磷脂、胆固醇、植物留醇中的任意一种或至少两种， 所述磷脂为磷脂酰甘油和/或磷脂酰乙醇胺；上述两亲性表面活性剂可以单独使用，也可 以与磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、植物留醇中的一种或者几种联用，联用的时候磷 脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、植物留醇主要起助表面活性剂的作用。胆固醇与L-a磷 脂酰胆碱合用可促进脂质复合物的形成，有利于增加癸氧喹酯的在水相中的分散性。制作 口服制剂时可用植物留醇替代胆固醇，以降低成本。
[0032] 优选地，上述癸氧喹酯纳米制剂中包括的磷脂、胆固醇、植物留醇中的任意一种或 至少两种与所述癸氧喹酯的质量比为1~10:1，例如1:1、2:1、3:1、4 :1、5:1、6:1、7:1、8:1、 9:1,10:1 ；
[0033] 优选地，所述癸氧喹醋纳米制剂的粒径为100~300nm，100~300nm范围内的癸 氧喹酯纳米制剂可增加抗疟疾活性成分癸氧喹酯在肠道的吸收，本发明中的癸氧喹酯纳米 制剂的粒径进一步优选为150~300nm〇
[0034] 本发明还提供一种上述癸氧喹酯纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0035] (1)提供至少以所述癸氧喹酯与所述两亲性表面活性剂为分散相、有机溶剂为分 散介质的分散体系，将有机溶剂去除后得到固体分散体；
[0036] (2)所述固体分散体加水后进行分散处理，制得粒径不大于300nm的癸氧喹酯纳 米制剂。
[0037] 上述制备方法中，必须加入所述两亲性表面活性剂，才能通过分散处理制得颗粒 粒径不大于300nm的癸氧喹酯纳米制剂。
[0038] 固体分散是指包括胶体物，微晶体，或无定型物质在内的难溶或不溶于水的药物 分子在水化之前，分散在其它水溶性物质中。本发明所述的固体分散体加水后采用超声 法或者高压匀浆法进行分散处理，可以将微米癸氧喹酯制剂的颗粒分散成纳米癸氧喹酯制 剂；经分散处理后，固体分散体形成又一个分散相，而其中的水即为水相，作为分散介质。
[0039] 上述步骤（1)中的分散介质必须包含癸氧喹酯、两亲性表面活性剂，还包含非离 子表面活性剂，也可以包含高分子载体。该分散体系可以通过加热溶解的方法制备，对于不 含有高分子载体的分散体系也可以通过超声分散的方法制备。
[0040] 优选地，所述固体分散体加水混匀，混匀后的分散体系的pH值为5. 5~7,有利于 固体分散体在水相中扩散均匀，扩散均匀后再采用超声法或者高压匀浆法进行分散处理；
[0041] 优选地，所述超声法中超声仪的频率为30~50KHZ，进一步优选为40KHZ;超声仪 的超声频率设定为40KHz可以将位于超声仪中的颗粒击碎，变成更小的颗粒，超声分散一 端时间后，使固体分散体均匀地分散成符合要求的纳米颗粒。
[0042] 优选地，所述步骤（2)的水为去离子水、纯净水或者含有0.9%氯化钠的生理盐 水；
[0043] 优选地，所述步骤（2)的水的用量为0. 05~0. 3ml/mg癸氧喹酯，进一步优选为 0?lml/mg癸氧喹酯，即每IOmg癸氧喹酯添加Iml水；
[0044] 优选地，所述步骤（2)的水中还加有增溶剂，以增加固体分散体在水中的溶解性；
[0045] 优选地，所述增溶剂为葡萄糖；
[0046] 优选地，所述增溶剂与所述癸氧喹酯的质量比为2:1。
[0047] 所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、氯丁烷、异丙醇中的任意一种或者至少两种。
[0048] 采用喷雾干燥法、旋转蒸馏法或者氮气吹干法去除有机溶剂；采用喷雾干燥法、旋 转蒸馏法或者氮气吹干法去除有机溶剂后，还需置于室温环境中让有机溶剂自然挥发，使 有机溶剂完全挥发干净。此过程应尽可能将有机溶剂清除干净，以免残留的有机溶剂在药 剂中产生不应有的副作用。
[0049] 优选地，在所述步骤（2)中，所述固体分散体加水分散处理后还需进行冷冻干燥， 制得不大于300nm的癸氧喹酯纳米制剂；冷冻干燥后的样品可储存备用或直接使用。
[0050] 优选地，所述癸氧喹酯纳米制剂为粉末状固体或者半固体，可将所述癸氧喹酯纳 米制剂制成片剂、冲剂或者胶囊。本发明不含有高分子载体的癸氧喹酯纳米制剂为半固体 状，只能用于灌胶囊，不能制成片剂。
[0051] 本发明还提供一种上述癸氧喹酯纳米制剂在抗疟疾方面的应用，所述抗疟疾指预 防疟疾和治疗疟疾；
[0052] 优选地，所述疟疾包括间日疟、恶性疟、三日疟、卵形疟和诺氏疟。
[0053] 于本发明中，需要说明的的是，上述"二亲性"即本发明所述的"两亲性"，"二亲性 表面活性剂"即本发明所述的"两亲性表面活性剂"。
[0054] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：一种癸氧喹酯纳米制剂，包括癸氧喹酯、 两亲性表面活性剂，所述两亲性表面活性剂为L-a磷脂酰胆碱，所述癸氧喹酯纳米制剂的 粒径不大于300nm。两亲性表面活性剂的引入增加了活性成分癸氧喹酯的溶出率，粒径不大 于300nm的癸氧喹酯纳米制剂的比表面积增大，提高了癸氧喹酯的溶出率，有效增加肠道 的吸收。总的来说，本发明的癸氧喹酯纳米制剂中的癸氧喹酯的溶出率、生物利用度及抗疟 疾药效均远远高于微米癸氧喹酯制剂。此外，本发明还提供了癸氧喹酯纳米制剂的制备方 法，通过引入两亲性表面活性剂和超声或高压匀浆法，实现将微米癸氧喹酯制剂分散成癸 氧喹酯纳米制剂。本发明的癸氧喹酯纳米制剂可作为抗疟疾的医药用品。
【附图说明】
[0055] 图1为本发明实施例5的癸氧喹醋纳米制剂与常用抗疱疾药对疱原虫Plasmodium falciparum(3D7)抑制效果。
[0056] 图2为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂与常用抗疟疾药对疟原虫Plasmodium falciparum(Dd2)的抑制效果。
[0057] 图3为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂的粒径分布。
[0058] 图4为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂放置6个月后的粒径分布。
[0059] 图5为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂的高压液相图谱。
[0060] 图6为本发明实施例5的癸氧喹酯纳米制剂放置6个月后的高压液相图谱。
【具体实施方式】
[0061] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0062] 如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本领域的常规方法制备 得到。
[0063] 实施例1
[0064] 组成成份：
[0065] 癸氧喹酯（美国 Sigma, St. Louis, MO. USA) 200mg
[0066] 蛋黄 L- a -磷脂酰胆碱（PC)(美国 Sigma, St. Louis, MO. USA) 334mg
[0067] 吐温 80 (Tween 80)(美国 Sigma, St. Louis, MO. USA) 200mg
[0068] 按上述质量称取各组份，加入乙醇（加入的量视样品量而定），加热至65°C，直至 各组份完全溶解，用旋转蒸发仪去除乙醇，将样品转移至玻璃器皿，使乙醇进一步挥发。收 集粉末状的样品，加水20ml(葡萄糖质量为400mg)。样品经过功率为500W、频率为40KHz 的超声仪（广东固特超声实业有限公司GT-2227QTS超声仪）在室温下超声3h，样品中颗粒 减小至300nm以下，样品冷冻干燥后，制得癸氧喹酯纳米制剂。
[0069] 实施例2
[0070] 组成成份：
[0085] 癸氧喹酯纳米制剂的制备过程与实施例1相同。
[0086] 对比例1
[0087] 除了不加两亲性表面活性剂PC之外，其他组分、癸氧喹酯纳米制剂的制备过程均 与实施例5相同。
[0088] 实施例6
[0095] 按上述质量称取各组份，加入乙醇（加入的量视样品量而定），加热至65°C，直至 各组份完全溶解，用旋转蒸发仪去除乙醇，将样品转移至玻璃器皿，使乙醇进一步挥发。收 集呈半固体状的样品，加水20ml(葡萄糖质量为400mg)。样品经过功率为500W、频率为 40KHz的超声仪（广东固特超声实业有限公司GT-2227QTS超声仪）超声3h，样品中颗粒减 小至300nm以下，样品冷冻干燥后，制得癸氧喹酯纳米制剂。
[0096] 实施例8
[0097] 组成成份：
[0098]
[0099] 癸氧喹酯纳米制剂的制备过程与实施例7相同。
[0100] 1、粒径及稳定性测试：
[0101] 采用HORIBA LB500动态光散射粒度仪测定实施例1~8中样品的颗粒粒径，各纳 米制剂组成及超声前后的粒径测试结果见表1。
[0102] 表1.各纳米制剂组成及超声前后的粒径
[0103]
[0104] 表 1 中的缩写（Abbreviation):
[0105] DQ = Decoquinate (癸氧喹醋）；
[0106] PVPlO = Polyvinylpyrrolidone 10 (聚乙稀P比略焼酮 10);
[0107] T80 = Tween 80or polysorbate (吐温 80 或聚山梨醇醋）；
[0108] PC = egg L-a-Phosphatidylcholine (蛋黄 L-a-磷脂酰胆喊）；
[0109] DSPG = 1，2-Distearoyl-sn-glycero_3-phosphoglycerol (磷脂酰甘油）；
[0110] Chol = cholesterol (胆固醇）；
[0111] PS = Plant sterol (植物甾醇）；
[0112] HS15 =KolliphorHS15 (15-羟基硬脂酸乙二醇酯）。
[0113] 从表1可知，超声前的样品的颗粒粒径均为微米级，而采用本发明的方法超声处 理后），制备的样品的粒径达到纳米级别。
[0114] 两亲性表面活性剂的影响：
[0115] 以实施例5为例，测试癸氧喹酯纳米制剂样品颗粒粒径随超声时间的变化，结果 见表2A，超声后，样品颗粒粒径由微米级变成纳米级，超声3h后，样品的粒径变化很小。
[0116] 表2A.癸氧喹酯纳米制剂的颗粒粒径随超声时间的变化
[0117]
[0118] 实施例5的癸氧喹酯纳米制剂样品在液态、4°C条件下储存，分别测试癸氧喹酯纳 米制剂储存1天时间和储存6个月时的粒径分布（图3、图4)(采用HORIBALB500动态光 散射粒度仪测定）和高压液相谱图（图5、图6)(采用高压液相仪HPLCAgilent1200测 定），癸氧喹酯纳米制剂储存1天、4个月、5个月、6个月时的平均粒径及药物（癸氧喹酯） 含量见表2B。对比图3、图4可知，癸氧喹酯纳米制剂储存1天和储存6个月时的颗粒粒径 分布变化很小；对比图5、图6可知，癸氧喹酯纳米制剂储存1天和储存6个月时的癸氧喹 酯含量没有发生任何变化。从表2B可知，含两亲性表面活性剂的癸氧喹酯纳米制剂在液态 4°C条件下保存6个月后，样品颗粒的粒径及癸氧喹酯的含量基本保持不变，可见其稳定性 极好，保质期长。
[0119] 表2B.含两亲性表面活性剂的癸氧喹酯纳米制剂的稳定性
[0120]
[0121] 以对比例1为例，测试样品颗粒粒径随超声时间的变化，结果见表2C。
[0122] 表2C.不含两亲性表面活性剂的癸氧喹酯制剂的颗粒粒径随超声时间的变化
[0123]
[0125] 与表2A对比发现，没有加两亲性表面活性剂时的样品的粒径大于加了两亲性表 面活性剂的样品粒径，而且，没有加两亲性表面活性剂的样品超声前后的样品粒径均保持 在微米级。
[0126] 综上所述，两亲性表面活性剂是样品颗粒通过超声法由微米级转变为纳米级不可 缺少的，而且含有两亲性表面活性剂的癸氧喹酯纳米制剂储存稳定性好。
[0127] 高分子载体的影响：
[0128] 实施例8为不加高分子载体制备的癸氧喹酯纳米制剂，以实施例8为例，测试样品 颗粒粒径随超声时间的变化，测试结果见表3。样品经超声后颗粒粒径由大变小，说明纳米 癸氧喹酯制剂的制作，无需高分子载体也可以实现。实施例1的样品超声前后颗粒粒径的 测试结果与实施例8非常接近。
[0129] 表3.不含高分子载体的癸氧喹酯纳米制剂的颗粒粒径随超声时间的变化
[0130]
[0131] 2、药效测试：
[0132] 本发明中，采用高压液相仪（HPLC，Agilent1200)测定样品中癸氧喹酯浓度，并 以此为计算单位，测试癸氧喹酯的抗疟疾效果。药效实验分为两个部分：(A)体外药效实 验用感染人的疱原虫Plasmodiumfalciparum(Pf)感染体外人的红细胞，测试癸氧喹醋抑 制疟原虫生长达到50%时所需的药物浓度，即IC50 ; (B)体内药效实验用感染啮齿动物的 疟原虫Plasmodiumberghei(Pb)感染C57BL/6小鼠，经灌胃给药，测试虫血率和动物存活 率。所有疟原虫感染株均由世界疟疾研宄和参照试剂资源中心（MalariaResearchand ReferenceReagentResourceCenter，MM)提供。
[0133] ⑷体外药效实验：
[0134] 体外培养人疱原虫：采用的疱原虫是感染人的Plasmodiumfalciparum(Pf)。 本发明所用Pf又分为氯喹敏感株（3D7)和氯喹耐药株（2Dd)。Pf培养基的配制如 下，取 1640 干粉（GIBC0,31800022) 10.43 克，H印es5.96 克，NaHC032 克，L-谷氨酰胺 (L-Glutamine) 0? 292克，葡萄糖3. 96克，次黄嗓呤（Hypoxanthine) 50微克，庆大霉素 (Gentamycinsulfate) 2. 5毫克，用高压过的双蒸水（用前平衡到室温）定容至1升，用 0. 22ym滤器过滤除菌，-20 °C保存（常用的4°C保存），此为不完全培养基。完全培养基的 配制与不完全培养基的配制不同的是，次黄嘌呤（Hypoxanthine)为27. 22毫克，庆大霉素 (Gentamycinsulfate)为 10 毫克，另外加AlbumaxI/II(GIBC0，A1049101)5 克，其余成 份的含量与不完全培养基相同，配制方法亦相同。完全培养（内含albumax)基用来培养疟 原虫，而不完全培养基是用来保存红细胞（不含albumax)。人红细胞保存方法为，用医用 采血针和抗EDTA采血管采血50ml，2500转/分钟（不能超3000转/分钟），离心5-10分 钟，吸走血浆和白细胞层，用无血清培养基洗涤两次。加入培养基，按体积配平，2500-3000 转/分钟离心5-10分钟，吸走上清及中间层的白细胞，重复此步骤两次。红细胞直接使用 时，按1:1体积比往1份红细胞压积里加入1份无血清培养基，在4°C保存下使用7天。
[0135] 将化合物进行梯度稀释后与疟原虫共孵育，72h后加入核酸染料在酶标仪上检测， 得到数据后导入软件计算IC50值，IC50是指抗疟药物对Pf疟原虫的抑制率达到50 %时候 的浓度。
[0136] 具体方法是：原料药癸氧喹酯用DMSO配制成0.5毫摩尔储存液，氯喹（美国 Sigma，St.Louis，MO.USA)采用PBS配制，青蒿素（成都华高药业有限公司）采用DMSO溶 解，再加PBS稀释。纳米癸氧喹酯和微米癸氧喹酯按实施例5的方法制备。二者的组成成份 完全一样，所不同的是，微米癸氧喹酯不经过超声处理减小其颗粒粒径。纳米癸氧喹酯和微 米癸氧喹酯直接用完全培养基稀释。首次实验，待测药物的贮存液先按照10倍梯度稀释， 再按照2倍梯度稀释，共稀释10个浓度梯度。根据首次试验的结果，再根据不同测试的对 象的药效，对药物的稀释作调整，以便使测试的药物浓度梯度在一个适当的范围内。在最终 的检测体系中，总体积100微升，其中药物为10微升，虫血为90微升。如用DMSO配制的样 品，DMSO占终体积的量不超过0. 1 %。
[0137] 加入的虫血标准为0. 5%的感染率，2%的红细胞压积，100微升培养体系。红细胞 和培养基体积比（v/v)为1:1，涂片计算感染率，Pf?疟原虫体外培养控制在6%。例如：Pf 3D7感染率6 %，96孔的板共6板，10个药物浓度梯度，所需的虫血为6毫升/板。6板所 需虫血为36毫升。由于加样的时候会有损失，一般会配40毫升虫血。所需虫血：40x2% (2 %的红细胞压积）=0.8毫升。每个板0. 13毫升。在每孔10微升药物中加入90微升虫 血后，在37°C，5%C02条件下培养，72小时后检测。配制LysisBuffer与Sybrgre el的混 合检测液，按照0. 2微升/毫升LysisBuffer配制检测液。按100微升/孔，在37°C培养 lh，将红细胞完全裂解，（对光目测培养板底部无细胞附着，液体变得很澄清，如果尚有未裂 解的红细胞，可在涡旋震荡仪上轻轻震荡）。红细胞裂解后在酶标仪检测，激发光497nM，发 射光为520nM。
[0138] 用感染人的疱原虫Plasmodiumfalciparum(3D7)感染人的红血细胞，然后检测微 米癸氧喹酯、纳米癸氧喹酯、以DMSO配制的癸氧喹酯、氯喹以及青蒿素对Pf疟原虫的抑制 效果，计算抗疟药物对Pf疟原虫的抑制率达到50%时候的浓度IC50,测试结果见图1。
[0139] 用感染人的疱原虫Plasmodiumfalciparum(Dd2)感染人的红血细胞，然后检测微 米癸氧喹酯、纳米癸氧喹酯、以及氯喹对Pf疟原虫的抑制效果，计算抗疟药物对Pf疟原虫 的抑制率达到50%时候的浓度，即IC50,测试结果见图2。
[0140] 通过对比各药物的IC50,可知各个药物药效的强弱。图1、图2中具体的测试数据 见表4,其中nM表示纳摩尔浓度。
[0141] 表4.各抗疱疾药物对血期疱原虫（Plasmodiumfalciparum)的抑制效果
[0142]
[0143]注：n/d(not detectable),表示无法测到粒径；n/a(not applicable)，表示粒径 测定不适用于此。
[0144] 从表4可知，采用本发明的方法制备的纳米癸氧喹酯制剂的IC50值是微米癸氧喹 酯制剂的4. 63分之一，是以DMSO配制的癸氧喹酯的5. 25分之一，约为氯喹的33. 45分之 一，是青蒿素的23. 16分之一。由于Dd2是氯喹耐药株，因此氯喹的IC50值远大于在氯喹 敏感株3d7测试的值。
[0145] (B)体内药效实验：
[0146] 用于实验的雄性小鼠（C57BL/6albinomice)，在到达后，至少要养7天。开始 给药时，小鼠的年龄为7周，每个笼子只养一只小鼠。室温为18°C_26°C，相对湿度为 34~68%，12小时的灯光和黑暗交替周转。试验前和试验中的食物为标准的喂养食品（ad libitum)。此实验是严格按照有关动物实验法规所进行的（GuidefortheCareandUse ofLaboratoryAnimals,NRCpublication, 2011edition)。动物实验中所用的微米癸氧喹 醋混悬液是用含有HECT(0. 5%hydroxyethylcellulose[w/v]and0? 2%Tween_80[v/v]) 的去离子水混匀，再用超声仪超声5分钟所配制的。纳米癸氧喹酯制剂是完全按实施例5 的制备过程制备。载体对照是指除活性成份癸氧喹酯以外的相对应的制剂成份。其它所用 药物或制剂与体外实验所用的药物或制剂的配制完全相同。阳性对照是用作用于肝期疟原 虫的抗疟药伯氨奎宁。
[0147] 测试上述微米癸氧喹酯制剂、纳米癸氧喹酯以及伯氨奎宁对小鼠体内疟原虫 (ANKAstrainofP.berghei)生长的抑制效果。每次动物实验至少重复三次，每次每组5 只小鼠，因此每组至少测试15只小鼠。雄性小鼠（maleC57BL/6albino)的疟原虫感染的 方法是每只小鼠尾静脉注射5万个伯氏疟原虫（P.bergheiANKA)的子孢子。口服给药共 分为三次，即疟原虫感染的前一天，当天和后一天。虫血率的检测的方法是按常规红细胞计 数每mm3血液的红细胞数，并制薄血膜，3%Giemsa染色20分钟，油镜下计数每1000个红细 胞中感染红细胞数，得红细胞感染率（erythrocyteinfectedrate,EIR, %。）。生存率的计 算是小鼠在感染疟原虫后的第15天进行统计。每只动物按体重（给药时称动物体重）灌 胃给药，具体测试结果见表5。
[0148] 表5.各抗疟疾药物对小鼠体内疟原虫（ANKAstrainofP.berghei)生长的抑制 效果
[0149]
[0150] 由表5可知，使用微米癸氧喹醋制剂时，癸氧喹醋的浓度达到40mg/kg才可达到对 疟原虫的完全抑制，小鼠才能完全存活；而使用纳米癸氧喹酯制剂时，癸氧喹酯的浓度只需 5mg/kg就可达到对疟原虫的完全抑制，小鼠的生存率达到100 %。
[0151] 本发明中，将微米癸氧喹酯制剂通过超声方法制备成纳米癸氧喹酯制剂，提高了 含有癸氧喹酯的颗粒的比表面积，颗粒比表面积增大对于癸氧喹酯的溶出率和癸氧喹酯在 肠道的吸收具有根本性的改变，增强了难溶癸氧喹酯的药效。本发明解决了癸氧喹酯由于 水溶性差而导致其不能在人体内有效地发挥抗疟疾作用的问题，较之现有的临床抗疟疾药 物具有明显的优势。
[0152] 上述实施例1~4、6~8所制得的癸氧喹酯纳米制剂的粒径分布、稳定性及抗疟 疾药效与实施例5的抗疟疾药效非常接近，在此不再赘述。
[0153] 需要说明的是，本发明的纳米癸氧喹酯制剂与癸氧喹酯纳米制剂为同一种制剂， 没有任何不同；本发明的微米癸氧喹酯制剂与癸氧喹酯微米制剂为同一种制剂，没有任何 不同。
[0154] 以上实施例仅用来说明本发明的详细方法，本发明并不局限于上述详细方法，即 不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对 本发明的任何改进，对于本发明中所采用的基本步骤和同类非活性成份的不同选择用以制 备癸氧喹酯的抗疟疾的制剂，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，包括癸氧喹酯、两亲性表面活性剂，所述两亲 性表面活性剂为L-a磷脂酰胆碱，所述癸氧喹酯纳米制剂的粒径不大于300nm。2. 根据权利要求1所述的癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，所述L-a磷脂酰胆碱选自 蛋黄L-a磷脂酰胆碱和/或植物L-a磷脂酰胆碱； 优选地，所述两亲性表面活性剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~5:1。3. 根据权利要求1所述的癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，所述癸氧喹酯纳米制剂还 包括非离子表面活性剂； 优选地，所述非离子表面活性剂为聚山梨醇酯和/或KolliphorHS15,所述聚山梨醇 酯优选为吐温-80 ; 优选地，所述非离子表面活性剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~6:2。4. 根据权利要求3所述的癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，所述癸氧喹酯纳米制剂还 包括高分子载体； 优选地，所述高分子载体为聚乙烯吡咯烷酮； 优选地，所述高分子载体与所述癸氧喹酯的质量比为1~5:1。5. 根据权利要求3所述的癸氧喹酯纳米制剂，其特征在于，所述癸氧喹酯纳米制剂还 包括磷脂、胆固醇、植物留醇中的任意一种或至少两种，所述磷脂为磷脂酰甘油和/或磷脂 酰乙醇胺； 优选地，所述磷脂、胆固醇、植物留醇中的任意一种或至少两种与所述癸氧喹酯的质量 比为1~10:1 ; 优选地，所述癸氧喹醋纳米制剂的粒径为100~300nm，进一步优选为150~300nm〇6. -种权利要求1~5任一项所述的癸氧喹酯纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1) 提供至少以癸氧喹酯、两亲性表面活性剂为分散相、有机溶剂为分散介质的分散体 系，将有机溶剂去除后得到固体分散体； (2) 所述固体分散体加水后进行分散处理，制得粒径不大于300nm的癸氧喹酯纳米制 剂。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述固体分散体加水后采用超声法 或者高压匀浆法进行分散处理； 优选地，所述固体分散体加水混匀后再采用超声法或者高压匀浆法进行分散处理； 优选地，所述超声法中超声仪的频率为30~50KHz，进一步优选为40KHz; 优选地，所述步骤（2)的水为去离子水、纯净水或者含有0.9%氯化钠的生理盐水； 优选地，所述步骤（2)的水的用量为0. 05~0. 3ml/mg癸氧喹醋，进一步优选为0.Iml/mg癸氧喹酯； 优选地，所述步骤（2)的水中还加有增溶剂，进一步优选地，所述增溶剂为葡萄糖； 优选地，所述增溶剂与所述癸氧喹酯的质量比为1~3:1，进一步优选为2:1。8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、氯丁 烷、异丙醇中的任意一种或者至少两种。9. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，采用喷雾干燥法、旋转蒸馏法或者氮 气吹干法去除有机溶剂； 优选地，在所述步骤（2)中，所述固体分散体加水分散处理后还需进行冷冻干燥，制得 不大于300nm的癸氧喹酯纳米制剂； 优选地，所述癸氧喹酯纳米制剂为粉末状固体或者半固体，将所述癸氧喹酯纳米制剂 制成片剂、冲剂或者胶囊。10. -种权利要求1~5任一项所述的癸氧喹酯纳米制剂在抗疟疾方面的应用，所述抗 疟疾包括预防疟疾和治疗疟疾； 优选地，所述疟疾包括间日疟、恶性疟、三日疟、卵形疟和诺氏疟。
【专利摘要】本发明公开了一种癸氧喹酯纳米制剂，包括癸氧喹酯、两亲性表面活性剂，所述两亲性表面活性剂为L-α磷脂酰胆碱，所述癸氧喹酯纳米制剂的粒径不大于300nm。两亲性表面活性剂的引入增加了活性成分癸氧喹酯的溶出率，粒径不大于300nm的癸氧喹酯纳米制剂的比表面积增大，提高了癸氧喹酯的溶出率，有效增加肠道的吸收。总的来说，本发明的癸氧喹酯纳米制剂中的癸氧喹酯的溶出率、生物利用度及抗疟疾药效均远远高于微米癸氧喹酯制剂。此外，本发明还提供了癸氧喹酯纳米制剂的制备方法，通过引入两亲性表面活性剂和超声或高压匀浆法，实现将微米癸氧喹酯制剂分散成癸氧喹酯纳米制剂。
【IPC分类】A61K9/16, A61K9/20, A61K9/14, A61K47/24, A61P33/06, A61K31/47, A61K9/48
【公开号】CN104906044
【申请号】CN201510266332
【发明人】王洪星, 陈雪清, 范银洲, 覃丽梅, 许婉婉, 秦莉, 赵思婷, 陈小平
【申请人】广州中科蓝华生物科技有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月22日
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