一种低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用
一种低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，涉及一种低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]我国已经步入人口老龄化社会，老年人口数量逐渐增多。在老年人群体中，血栓类疾病是最为常见的疾病之一，发病率高，患者群广，血栓形成的后遗症严重影响病人的工作能力，甚至致残。
[0003]在抗血栓类治疗药物中，肝素类药物因其源自生命体内的生物成分，具有治疗效果好、生物相容性、安全等优点而备受关注。在肝素类药物中，低分子肝素(LMWH)具有抗凝血、抗血栓、调血脂等作用，临床上主要用于治疗和防治深部静脉血栓、肺栓塞、播散性血管内凝血等疾病，已广泛用于心血管疾病防治领域。LMWH是由普通未分级肝素(UFH)经化学或酶解聚的方法得到的低分子量(Mw)的肝素片段，或经分级法得到的低Mw的肝素组分，其Mw范围一般为3000?8000Da，平均Mw为5000Da左右。
[0004]与UHl相比，LMWH具有皮下注射吸收好，半衰期长，生物利用度高，与血浆、血小板亲和力小等优点。但LMWH存在体内半衰期短及其溶液剂静脉注射时大出血副作用较为严重的不足，且需要频繁给药，大大降低了药物的治疗功效、用药的安全性以及患者的顺应性，因此研宄其缓释注射剂具有重要的临床意义。
[0005]CN101024086 A公开了壳聚糖及其衍生物与低分子量肝素形成的复合物及制剂与制备方法，该发明利用壳聚糖及其衍生物与低分子量肝素形成的纳米/微米复合物作为载体来增加细胞对低分子肝素的摄取，利用壳聚糖及其衍生物的生物黏附性和短暂打开细胞间的紧密连接的特性进一步增加低分子肝素透过生物膜的量，通过复合物的形成提高低分子肝素的稳定性，从而提高用药的生物利用度。但壳聚糖只有在强酸性条件下溶解、生理条件下溶解度低，同时壳聚糖具有较高的毒性和较差生物相容性，这些缺陷严重限制其在生物体内的应用。另外，壳聚糖及其衍生物与低分子量肝素形成的复合物及制剂未采用交联手段将纳米颗粒固化，颗粒在生理介质的干预下，容易导致低分子量肝素快速大量释放，容易影响制剂的体内稳定性和治疗效率。
[0006]因此，在本领域，期望得到一种能够缓慢释放LMWH，有效延长LMWH的体内半衰期，降低LMWH使用时大出血的风险，避免血药浓度“峰谷”波动较大，使释药平稳，降低药物的毒副作用，改善患者的顺应性，提高对疾病的治疗效率的低分子量肝素制剂。
【发明内容】
[0007]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用。
[0008]为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]一方面，本发明提供了一种低分子量肝素制剂，所述低分子量肝素缓释制剂包含由多肽和低分子量肝素形成的纳米颗粒，所述多肽之间通过化学键进行交联。
[0010]本发明的低分子量肝素缓释制剂包含多肽和低分子量肝素，二者通过静电作用形成纳米颗粒，基于多肽分子之间的交联使低分子量肝素具有缓释功效，有效延长其血液半衰期，避免药物“峰谷波动”，有效平稳释药，降低其溶液剂大剂量使用时大出血的风险，降低药物的毒副作用，改善患者的顺应性，提高对疾病的治疗效率。
[0011]现报道的肝素制剂均未采用交联手段，形成的纳米颗粒仅基于静电力的相互作用，稳定性差，在生理介质(如磷酸盐缓冲液)的干预下容易导致肝素的突释，无法有效保证用药安全。本发明使用的多肽由生物体内的氨基酸构成，具有生物可降解、生物相容性好，生理条件下溶解度高等优势，其安全性更好。同时本发明通过化学键如共价键、离子键、氢键等共同作用将多肽交联，通过多肽的缓慢降解达到缓慢释放肝素的效果，降低肝素的副作用，降低LMWH使用时大出血的风险，减少了给药频率，改善患者的顺应性，制剂的体内稳定性更优，保证临床的用药安全及提高了对疾病的治疗效率。
[0012]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述多肽与低分子量肝素的质量比为 1:100 ?100:1，例如 1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:10、1:5、1:3、1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、15:1、18:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 或 100: 1，优选 1:20 ?1:100，进一步优选 1:20 ?1:50，在所选的优选比例下，颗粒的粒径更加均匀，更容易控制在10nm以下，而且电位更加可控，工艺的重现性好。
[0013]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述多肽的分子量为500?50000Da，例如 500Da、lOOODa、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、4000Da、6000Da、8000Da、lOOOODa、15000Da、20000Da、25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da 或 50000Da，优选 1000 ?30000Dao
[0014]优选地，所述多肽为由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸或亮氨酸中的任意一种或至少两种形成的多肽。
[0015]优选地，所述化学键为二硫键、离子键或氢键中的任意一种或至少两种。
[0016]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述低分子量肝素的分子量< 8000Da,例如 7500Da、7000Da、6500Da、6000Da、5500Da、5000Da、4500Da、4000Da、3500Da或 3000Da，优选 3000 ?7000Da。
[0017]优选地，所述低分子量肝素为肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙、磺达肝素钠或依诺肝素钠中的任意一种或至少两种的组合。
[0018]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述纳米颗粒的平均粒径为50?200nm，例如 50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、llOnm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm 或 200nm，优选 60 ?150nm。
[0019]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述纳米颗粒的表面电位为-20?20mV，例如-20mV、_18mV、-15mV、_13mV、_10mV、_8mV、-5mV、0mV、5mV、8mV、10mV、13mV、15mV、18mV、20mV，优选-20 ?_5mV。
[0020]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述低分子量肝素缓释制剂为冻干粉针剂、无菌粉针剂或纳米溶液剂中的任意一种。
[0021]另一方面，本发明提供了如第一方面所述的低分子量肝素缓释制剂的制备方法，所述制备方法采用自组装技术、冷冻干燥技术、均质技术、乳化技术、包埋技术或喷雾干燥技术中的任意一种或至少两种的组合，优选自组装技术、均质技术和冷冻干燥技术的组合。
[0022]自主装技术可有效调控颗粒的粒径大小，具有颗粒粒径可控、工艺稳定、易于生产的优势；通过均质技术可更进一步的有效控制制剂的粒径分布，排除大颗粒对制剂安全性的影响；通过冷冻干燥技术，有效降低药物和辅料的降解速率(如水解和氧化等)，提高制剂的长期稳定性。通过以上多重技术的控制，期待得到粒径均匀、稳定性好、疗效确切的缓释纳米制剂。
[0023]作为优选技术方案，本发明所述的低分子量肝素缓释制剂的制备方法包括以下步骤:
[0024](I)将多肽加入葡萄糖溶液中，形成多肽溶液，而后加入Traut’ s试剂，搅拌反应制得巯基化多肽；
[0025](2)向巯基化多肽中加入葡萄糖 溶液，而后加入低分子量肝素溶液，混匀，均质，老化，冷冻干燥制成所述低分子量肝素缓释制剂。
[0026]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂的制备方法中，步骤⑴和步骤(2)所述葡萄糖溶液为5%的葡萄糖溶液。
[0027]优选地，相对于10mg多肽，步骤⑴所述葡萄糖溶液的加入量为5?100mL，例如 5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mT,.11mT,.12mL、14mL、16mL、18mL、20mL、25mL、28mL、30mL、35mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL 或 10mL。
[0028]优选地，步骤(I)所述多肽溶液的浓度为lmg/mL?20mg/mL，例如lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、1mg/mL、Ilmg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL 或 20mg/mL，优选为 5mg/mL ?15mg/mL。
[0029]优选地，步骤(I)所述Traut，s试剂的浓度为0.1?50mg/mL，例如0.lmg/mL、
0.5mg/mL、0.8mg/mL、lmg/mL、3mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、28mg/mL、30mg/mL、32mg/mL、35mg/mL、38mg/mL、40mg/mL、43mg/mL、45mg/mL、48mg/mL 或 50mg/mL，优选为 0.1 ?30mg/mLo
[0030]优选地，相对于ImL多肽溶液，步骤⑴所述Traut’s试剂的加入量为O?10mL，例如 OmL、lmL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL 或 10mT,η 当多肽中含有疏基时，则可以不加入Traut’ s试剂，即不进行巯基化步骤，而依靠多肽本身含有的巯基完成多肽之间的交联。当多肽中不含有巯基时需要加入Traut’ s试剂进行巯基化，以便实现多肽之间的交联。
[0031]优选地，相对于ImL多肽溶液，步骤⑵所述葡萄糖溶液的加入量为2mL?100mL，例如 2mL、5mL、10mT,.15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL 或 10OmT,,优选为 10mT,?40mL。
[0032]优选地，步骤(2)所述低分子量肝素溶液为将低分子量肝素溶于5%的葡萄糖溶液中形成的低分子量肝素溶液。
[0033]优选地，步骤⑵所述低分子量肝素溶液浓度为lmg/mL?30mg/mL，例如lmg/mL、3mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、1mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、20mg/mL、2 2mg/mL、24mg/mL、26mg/mL、28mg/mL 或 30mg/mL，优选 5mg/mL ?20mg/mLo
[0034]优选地，步骤⑴所述多肽与步骤(2)所述低分子量肝素的质量比为1:100?100:1，例如 1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:10、1:5、1:3、1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、15:1、18:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 或 100:1，优选 1:20 ?1:100，进一步优选 1:20 ?1:50。
[0035]在本发明的制备方法中，使用葡萄糖溶液的目的是保持制备过程中渗透压的平衡，避免由于渗透压的改变而造成低分子量肝素的释放。
[0036]另一方面，本发明提供了如第一方面所述的低分子量肝素缓释制剂在制备抗血栓药物中的应用。
[0037]本发明所制成的缓释制剂可有效延长低分子量肝素的血液半衰期，避免药物“峰谷波动”，降低其溶液剂大剂量使用时大出血的风险，有效平稳释药，具有疗效高，稳定性好、副作用小的优势，易于工业化生产；其制备的缓释纳米制剂可用于血栓类疾病的预防与治疗，具有很好的治疗效果。
[0038]相对于现有技术，本发明具有以下有益效果:
[0039]本发明利用多肽和低分子量肝素形成纳米颗粒，使得低分子量肝素具有缓释功效，本发明的低分子量肝素缓释制剂在500小时内的释放率仅为20%左右，能够有效延长其血液半衰期，避免药物“峰谷波动”，有效平稳释药，降低低分子量肝素溶液剂大剂量使用时大出血的风险，降低药物的毒副作用，改善患者的顺应性，提高对疾病的治疗效率，可用于血栓类疾病的预防与治疗。本发明低分子量肝素缓释制剂的制备方法简单，易于操作，制备过程中无有机溶剂的加入，属于节能环保绿色生产，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0040]图1为本发明实施例1制备的低分子量肝素缓释制剂的扫描电镜图；
[0041]图2A为本发明实施例2制备的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图；
[0042]图2B本发明实施例2制备的低分子量肝素缓释制剂的表面电位图；
[0043]图3A为在不同肝素钠浓度下制备的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图；
[0044]图3B为在不同肝素钠浓度下制备的低分子量肝素缓释制剂的电位变化曲线图；
[0045]图3C为不同巯基化程度的多肽制备得到的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图；
[0046]图3D为不同巯基化程度的多肽制备得到的低分子量肝素缓释制剂的电位变化曲线图；
[0047]图4为本发明的低分子量肝素缓释制剂的体外释药曲线图；
[0048]图5为本发明的低分子量肝素缓释制剂在细胞水平的安全性评价结果图；
[0049]图6为本发明的低分子量肝素缓释制剂的动物体内抗凝血疗效评价结果图。
【具体实施方式】
[0050]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0051]实施例1
[0052]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0053]称取10mg聚赖氨酸(PLL，Mff= 13000Da)于离心管中，加入5mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL 15mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入6mg/mL Traut’ s试剂5mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的PLL(PLL-SH)溶液；向巯基化的PLL(PLL-SH)溶液中，加入60mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入10mL 20mg/mL肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，复溶后的制剂溶液用于后续的表征。
[0054]对本实施例制备得到的纳米颗粒进行扫描电镜(SEM)表征，结果如图1所示，平均粒径约120nm，颗粒表面光滑圆整。
[0055]实施例2
[0056]在本实施例与实施例1的区别仅在于调整PLL与低分子量肝素的质量比为5:6，其余制备方法和条件均与实施例1相同，将制备得到的低分子量肝素缓释制剂纳米颗粒通过动态光散射技术(DLS)测定纳米颗粒的粒径和电位。
[0057]结果如图2所示，其中图2A为低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图，由图可知，平均粒径约为105nm ;图2B为低分子量肝素缓释制剂的表面电位图；如图所示，表面电位约为-16mVo
[0058]实施例3
[0059]在本 实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0060]称取10mg聚组氨酸(Mw= 100Da)于离心管中，加入5mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL 20mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入0.lmg/mL Traut’ s试剂10mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的聚组氨酸溶液；向巯基化的聚组氨酸溶液中，加入50mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入5mL 30mg/mL达肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0061 ] 经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为llOnm，表面电位为_20mV，颗粒表面光滑圆整。
[0062]实施例4
[0063]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0064]称取10mg聚赖氨酸(PLL，Mff= 30000Da)于离心管中，加入10mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL lmg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入lmg/mL Traut’s试剂5mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的PLL(PLL-SH)溶液；向PLL-SH溶液中加入200mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入200mL lmg/mL磺达肝素(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0065]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为130nm，表面电位为_15mV，颗粒表面光滑圆整。
[0066]实施例5
[0067]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0068]称取10mg聚精氨酸(Mw= 500Da)于离心管中，加入50mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL 2mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入50mg/mL Traut’s试剂ImLdP入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的聚精氨酸溶液；向巯基化的聚精氨酸溶液中加入500mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入400mL 5mg/mL那曲肝素钙(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0069]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为60nm，表面电位为_8mV，颗粒表面光滑圆整。
[0070]实施例6
[0071]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0072]称取10mg聚赖氨酸(PLL，MW= 50000Da)于离心管中，加入20mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取6mL 5mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入30mg/mL Traut’ s试剂6mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的PLL (PLL-SH)溶液；向PLL-SH溶液中加入250mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入500mL 10mg/mL那曲肝素钙(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0073]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为50nm，表面电位为_20mV，颗粒表面光滑圆整。
[0074]实施例7
[0075]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0076]称取10mg聚甘氨酸-聚精氨酸(Mw= 13000Da)于离心管中，加入40mL的5%葡萄糖溶液，超声混匀；量取5mL 2.5mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入30mg/mL Traut’s试剂10mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的聚甘氨酸-聚精氨酸溶液；巯基化的聚甘氨酸-聚精氨酸溶液中，加入50mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入ImL lmg/mL依诺肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0077]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为150nm，表面电位为10mV，颗粒表面光滑圆整。
[0078]实施例8
[0079]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0080]称取10mg聚半胱氨酸(MW = 13000Da)于离心管中，加入1mL的5%葡萄糖溶液，超声混匀；量取5mL 10mg/mL的PLL溶液于烧杯中，加入1mL 5 %葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入ImL 5mg/mL依诺肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。[0081 ] 经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为130nm，表面电位为_5mV，颗粒表面光滑圆整。
[0082]实施例9
[0083]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0084]称取1.2mg聚赖氨酸(PLL，Mff= 13000Da)于离心管中，加入ImL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL 1.2mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入0.lmg/mL Traut’s试剂50mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的PLL(PLL-SH)溶液；向PLL-SH溶液中加入1mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入120mL lmg/mL依诺肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0085]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为200nm，表面电位为20mV，颗粒表面光滑圆整。
[0086]实施例10
[0087]在本实施例中，对低分子量肝素缓释制剂纳米颗粒的制备工艺稳定性进行考察，方法如下:按照实施例所述的方法制备巯基化程度为10%的PLL-SH溶液，将10%巯基化的PLL-SH溶液与LMWH溶液保持6:5的质量比制备LMWH终浓度为0.5mg/mL，0.6mg/mL，0.7mg/mL, 0.8mg/mL, 0.9mg/mL, 1.0mg/mL的纳米颗粒，老化24h后待纳米颗粒稳定，冻干。类似地，调整巯基化程度为5%?30%，分别制备纳米制剂。复溶后通过动态光散射技术测定所有样品的粒径和电位。
[0088]结果如图3所示，其中，图3A为在不同肝素钠浓度下制备的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图，由图可见，在0.5-1.0mg/mL的肝素钠浓度下，低分子量肝素缓释制剂的粒径变化不明显，粒径分散性(roi)均保持在较小数值，证明颗粒分散性好，颗粒较稳定；图3B为在不同肝素钠浓度下制备的低分子量肝素缓释制剂的电位变化曲线图，由图可见，在0.5-1.0mg/mL的肝素钠浓度下，低分子量肝素缓释制剂的电位无显著性变化；图3C为不同巯基化程度的多肽制备得到的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图，由图可见，在多肽巯基化程度为5%?30%时，低分子量肝素缓释制剂的粒径变化不明显，粒径分散性(PDI)均保持在较小数值，分散性好，颗粒较稳定；图3D为不同巯基化程度的多肽制备得到的低分子量肝素缓释制剂的电位变化曲线图，由图可见，在多肽巯基化程度为5%?30%时，低分子量肝素缓释制剂的电 位无显著性变化。因此，随着巯基化程度以及LMWH浓度的变化，纳米颗粒的粒径和电位均无显著性变化，呈现出良好的工艺稳定性。
[0089]实施例11
[0090]在本实施例中，对低分子量肝素缓释制剂纳米颗粒的纳米颗粒的体外释药曲线进行测定，方法如下:
[0091 ] 分别将加入4mg/mL游离的肝素钠溶液500 μ L (肝素钠溶液剂)与4mg/mL的PLL-SH(巯基化比例10% )与LMWH形成的纳米颗粒(缓释纳米制剂)500 μ L加入透析袋，封口 ；将每组3个样品分别放入盛有20mL PBS的50mL离心管中，向每个离心管中加入磁子，置于控温搅拌器(37°C)上搅拌，在不同的时间点分别进行取样，并取样后加入等量的PBS补液；利用甲苯胺蓝分光光度法对样品进行LMWH释放度的测定，并绘制体外释放曲线。
[0092]本实施例测定的体外释药曲线如图4所示，由图可以看出，本发明制备的制备的低分子量肝素缓释制剂在500小时内缓慢释放肝素钠，在500小时内本发明的低分子量肝素缓释制剂的释放率仅为20%左右，具有良好的缓释效果。
[0093]实施例12
[0094]在本实施例中，对低分子量肝素缓释制剂的安全性进行评价，方法如下:
[0095]人脐静脉血管内皮HUVEC细胞以5000个每孔的密度接种于96孔板，培养箱内培养24小时后，弃去培养基，PBS清洗，加入180 μ L新鲜的培养基，再分别加入20 μ L具有浓度梯度(终浓度20 μ g/mL、200 μ g/mL、400 μ g/mL)的实施例1制备的肝素钠制剂，每个浓度设置6个复孔，培养48h后，MTT法测定细胞的存活率。
[0096]本实施例测定结果如图5所示，结果表明肝素钠缓释制剂安全性良好，与肝素钠溶液剂在安全性方面无显著差异。
[0097]实施例13
[0098]在本实施例中，对低分子量肝素缓释制剂纳米颗粒的体内抗凝血疗效进行评价，方法如下:
[0099]实验前一天将SD大鼠进行分组，分为游离的LMWH溶液组(游离LMWH组)和实施例I制备的低分子量肝素缓释制剂(缓释纳米制剂组)，每组6只，实验前12h禁食。游离LMWH组及缓释纳米制剂组分别尾部静脉注射适量药物，按照设定的时间间隔取血，3000rpm，15min离心处理血样，取上清取出放入离心管中，分装后_20 V保存，样品避免反复冻融。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒对所有的样品的抗Xa因子活性进行检测。
[0100]本实施的体内抗凝血疗效评价结果如图6所示，由图可知，本发明制备的的低分子量肝素缓释制剂组(缓释纳米制剂组)抗Xa因子活性显著高于游离的肝素钠溶液剂，这表明本发明的低分子量肝素缓释制剂在动物体内抗血栓疗效优于肝素钠溶液剂。
[0101]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述低分子量肝素缓释制剂包含由多肽和低分子量肝素形成的纳米颗粒，所述多肽之间通过化学键进行交联。2.根据权利要求1所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述多肽与低分子量肝素的质量比为1:100?100:1，优选1:20?1:100，进一步优选1:20?1:50。3.根据权利要求1或2所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述多肽的分子量为 500 ?50000Da，优选 1000 ?30000Da ； 优选地，所述多肽为由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸或亮氨酸中的任意一种或至少两种形成的多肽； 优选地，所述化学键为二硫键、离子键或氢键中的任意一种或至少两种。4.根据权利要求1-3中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述低分子量肝素的分子量< 8000Da，优选3000?7000Da ； 优选地，所述低分子量肝素为肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙、磺达肝素钠或依诺肝素钠中的任意一种或至少两种的组合。5.根据权利要求1-4中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述纳米颗粒的平均粒径为50?200nm，优选60?150nm ； 优选地，所述纳米颗粒的表面电位为-20?20mV，优选-20?_5mV。6.根据权利要求1-5中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述低分子量肝素缓释制剂为冻干粉针剂、无菌粉针剂或纳米溶液剂中的任意一种。7.根据权利要求1-6中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法采用自组装技术、均质技术、冷冻干燥技术、乳化技术、包埋技术或喷雾干燥技术中的任意一种或至少两种的组合，优选自组装技术、均质技术和冷冻干燥技术的组入口 ο8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将多肽加入葡萄糖溶液中，形成多肽溶液，而后加入Traut’s试剂，搅拌反应制得疏基化多狀； (2)向巯基化多肽中加入葡萄糖溶液，而后加入低分子量肝素溶液，混匀，均质，老化，冷冻干燥制成所述低分子量肝素缓释制剂。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤⑴和步骤⑵所述葡萄糖溶液为5%的葡萄糖溶液； 优选地，相对于10mg多肽，步骤⑴所述葡萄糖溶液的加入量为5?10mL ； 优选地，步骤⑴所述多肽溶液的浓度为lmg/mL?20mg/mL，优选为5mg/mL?15mg/mL ； 优选地，步骤(I)所述Traut’ s试剂的浓度为0.1?50mg/mL，优选为0.1?30mg/mL ；优选地，相对于ImL多肽溶液，步骤⑴所述Traut’ s试剂的加入量为O?1mL ；优选地，相对于ImL多肽溶液，步骤(2)所述葡萄糖溶液的加入量为2mL?100mL，优选10mT,?40mL ； 优选地，步骤(2)所述低分子量肝素溶液为将低分子量肝素溶于5%的葡萄糖溶液中形成的低分子量肝素溶液； 优选地，步骤(2)所述低分子量肝素溶液浓度为lmg/mL?30mg/mL，优选5mg/mL?20mg/mL ； 优选地，步骤(I)所述多肽与步骤(2)所述低分子量肝素的质量比为1:100?100:1，优选1:20?1:100，进一步优选1:20?1:50。10.根据权利要求1-6中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂在制备抗血栓药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用，所述低分子量肝素缓释制剂包含由多肽和低分子量肝素形成的纳米颗粒，所述多肽之间通过化学键进行交联。本发明采用自组装技术、冷冻干燥技术、均质技术、乳化技术、包埋技术或喷雾干燥技术中的任意一种或至少两种的组合来制备低分子量肝素缓释制剂。本发明低分子量肝素缓释制剂在体外条件下500小时内释放率仅为20％左右，具有缓释功效，能够有效延长其血液半衰期，避免药物“峰谷波动”，降低低分子量肝素溶液剂大剂量使用时大出血的风险，降低药物的毒副作用，改善患者的顺应性，提高对疾病的治疗效率，可用于血栓类疾病的预防与治疗，本发明制备方法简单，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61P7/02, A61K31/727, A61K9/14, A61K47/42
【公开号】CN104906045
【申请号】CN201510359524
【发明人】闫学海, 陈成军, 李淑坤, 张宁, 马光辉
【申请人】中国科学院过程工程研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月25日
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，涉及一种低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]我国已经步入人口老龄化社会，老年人口数量逐渐增多。在老年人群体中，血栓类疾病是最为常见的疾病之一，发病率高，患者群广，血栓形成的后遗症严重影响病人的工作能力，甚至致残。
[0003]在抗血栓类治疗药物中，肝素类药物因其源自生命体内的生物成分，具有治疗效果好、生物相容性、安全等优点而备受关注。在肝素类药物中，低分子肝素(LMWH)具有抗凝血、抗血栓、调血脂等作用，临床上主要用于治疗和防治深部静脉血栓、肺栓塞、播散性血管内凝血等疾病，已广泛用于心血管疾病防治领域。LMWH是由普通未分级肝素(UFH)经化学或酶解聚的方法得到的低分子量(Mw)的肝素片段，或经分级法得到的低Mw的肝素组分，其Mw范围一般为3000?8000Da，平均Mw为5000Da左右。
[0004]与UHl相比，LMWH具有皮下注射吸收好，半衰期长，生物利用度高，与血浆、血小板亲和力小等优点。但LMWH存在体内半衰期短及其溶液剂静脉注射时大出血副作用较为严重的不足，且需要频繁给药，大大降低了药物的治疗功效、用药的安全性以及患者的顺应性，因此研宄其缓释注射剂具有重要的临床意义。
[0005]CN101024086 A公开了壳聚糖及其衍生物与低分子量肝素形成的复合物及制剂与制备方法，该发明利用壳聚糖及其衍生物与低分子量肝素形成的纳米/微米复合物作为载体来增加细胞对低分子肝素的摄取，利用壳聚糖及其衍生物的生物黏附性和短暂打开细胞间的紧密连接的特性进一步增加低分子肝素透过生物膜的量，通过复合物的形成提高低分子肝素的稳定性，从而提高用药的生物利用度。但壳聚糖只有在强酸性条件下溶解、生理条件下溶解度低，同时壳聚糖具有较高的毒性和较差生物相容性，这些缺陷严重限制其在生物体内的应用。另外，壳聚糖及其衍生物与低分子量肝素形成的复合物及制剂未采用交联手段将纳米颗粒固化，颗粒在生理介质的干预下，容易导致低分子量肝素快速大量释放，容易影响制剂的体内稳定性和治疗效率。
[0006]因此，在本领域，期望得到一种能够缓慢释放LMWH，有效延长LMWH的体内半衰期，降低LMWH使用时大出血的风险，避免血药浓度“峰谷”波动较大，使释药平稳，降低药物的毒副作用，改善患者的顺应性，提高对疾病的治疗效率的低分子量肝素制剂。
【发明内容】
[0007]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用。
[0008]为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]一方面，本发明提供了一种低分子量肝素制剂，所述低分子量肝素缓释制剂包含由多肽和低分子量肝素形成的纳米颗粒，所述多肽之间通过化学键进行交联。
[0010]本发明的低分子量肝素缓释制剂包含多肽和低分子量肝素，二者通过静电作用形成纳米颗粒，基于多肽分子之间的交联使低分子量肝素具有缓释功效，有效延长其血液半衰期，避免药物“峰谷波动”，有效平稳释药，降低其溶液剂大剂量使用时大出血的风险，降低药物的毒副作用，改善患者的顺应性，提高对疾病的治疗效率。
[0011]现报道的肝素制剂均未采用交联手段，形成的纳米颗粒仅基于静电力的相互作用，稳定性差，在生理介质(如磷酸盐缓冲液)的干预下容易导致肝素的突释，无法有效保证用药安全。本发明使用的多肽由生物体内的氨基酸构成，具有生物可降解、生物相容性好，生理条件下溶解度高等优势，其安全性更好。同时本发明通过化学键如共价键、离子键、氢键等共同作用将多肽交联，通过多肽的缓慢降解达到缓慢释放肝素的效果，降低肝素的副作用，降低LMWH使用时大出血的风险，减少了给药频率，改善患者的顺应性，制剂的体内稳定性更优，保证临床的用药安全及提高了对疾病的治疗效率。
[0012]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述多肽与低分子量肝素的质量比为 1:100 ?100:1，例如 1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:10、1:5、1:3、1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、15:1、18:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 或 100: 1，优选 1:20 ?1:100，进一步优选 1:20 ?1:50，在所选的优选比例下，颗粒的粒径更加均匀，更容易控制在10nm以下，而且电位更加可控，工艺的重现性好。
[0013]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述多肽的分子量为500?50000Da，例如 500Da、lOOODa、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、4000Da、6000Da、8000Da、lOOOODa、15000Da、20000Da、25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da 或 50000Da，优选 1000 ?30000Dao
[0014]优选地，所述多肽为由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸或亮氨酸中的任意一种或至少两种形成的多肽。
[0015]优选地，所述化学键为二硫键、离子键或氢键中的任意一种或至少两种。
[0016]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述低分子量肝素的分子量< 8000Da,例如 7500Da、7000Da、6500Da、6000Da、5500Da、5000Da、4500Da、4000Da、3500Da或 3000Da，优选 3000 ?7000Da。
[0017]优选地，所述低分子量肝素为肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙、磺达肝素钠或依诺肝素钠中的任意一种或至少两种的组合。
[0018]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述纳米颗粒的平均粒径为50?200nm，例如 50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、llOnm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm 或 200nm，优选 60 ?150nm。
[0019]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述纳米颗粒的表面电位为-20?20mV，例如-20mV、_18mV、-15mV、_13mV、_10mV、_8mV、-5mV、0mV、5mV、8mV、10mV、13mV、15mV、18mV、20mV，优选-20 ?_5mV。
[0020]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂中，所述低分子量肝素缓释制剂为冻干粉针剂、无菌粉针剂或纳米溶液剂中的任意一种。
[0021]另一方面，本发明提供了如第一方面所述的低分子量肝素缓释制剂的制备方法，所述制备方法采用自组装技术、冷冻干燥技术、均质技术、乳化技术、包埋技术或喷雾干燥技术中的任意一种或至少两种的组合，优选自组装技术、均质技术和冷冻干燥技术的组合。
[0022]自主装技术可有效调控颗粒的粒径大小，具有颗粒粒径可控、工艺稳定、易于生产的优势；通过均质技术可更进一步的有效控制制剂的粒径分布，排除大颗粒对制剂安全性的影响；通过冷冻干燥技术，有效降低药物和辅料的降解速率(如水解和氧化等)，提高制剂的长期稳定性。通过以上多重技术的控制，期待得到粒径均匀、稳定性好、疗效确切的缓释纳米制剂。
[0023]作为优选技术方案，本发明所述的低分子量肝素缓释制剂的制备方法包括以下步骤:
[0024](I)将多肽加入葡萄糖溶液中，形成多肽溶液，而后加入Traut’ s试剂，搅拌反应制得巯基化多肽；
[0025](2)向巯基化多肽中加入葡萄糖 溶液，而后加入低分子量肝素溶液，混匀，均质，老化，冷冻干燥制成所述低分子量肝素缓释制剂。
[0026]在本发明所述的低分子量肝素缓释制剂的制备方法中，步骤⑴和步骤(2)所述葡萄糖溶液为5%的葡萄糖溶液。
[0027]优选地，相对于10mg多肽，步骤⑴所述葡萄糖溶液的加入量为5?100mL，例如 5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mT,.11mT,.12mL、14mL、16mL、18mL、20mL、25mL、28mL、30mL、35mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL 或 10mL。
[0028]优选地，步骤(I)所述多肽溶液的浓度为lmg/mL?20mg/mL，例如lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、1mg/mL、Ilmg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL 或 20mg/mL，优选为 5mg/mL ?15mg/mL。
[0029]优选地，步骤(I)所述Traut，s试剂的浓度为0.1?50mg/mL，例如0.lmg/mL、
0.5mg/mL、0.8mg/mL、lmg/mL、3mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、28mg/mL、30mg/mL、32mg/mL、35mg/mL、38mg/mL、40mg/mL、43mg/mL、45mg/mL、48mg/mL 或 50mg/mL，优选为 0.1 ?30mg/mLo
[0030]优选地，相对于ImL多肽溶液，步骤⑴所述Traut’s试剂的加入量为O?10mL，例如 OmL、lmL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL 或 10mT,η 当多肽中含有疏基时，则可以不加入Traut’ s试剂，即不进行巯基化步骤，而依靠多肽本身含有的巯基完成多肽之间的交联。当多肽中不含有巯基时需要加入Traut’ s试剂进行巯基化，以便实现多肽之间的交联。
[0031]优选地，相对于ImL多肽溶液，步骤⑵所述葡萄糖溶液的加入量为2mL?100mL，例如 2mL、5mL、10mT,.15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL 或 10OmT,,优选为 10mT,?40mL。
[0032]优选地，步骤(2)所述低分子量肝素溶液为将低分子量肝素溶于5%的葡萄糖溶液中形成的低分子量肝素溶液。
[0033]优选地，步骤⑵所述低分子量肝素溶液浓度为lmg/mL?30mg/mL，例如lmg/mL、3mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、1mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、20mg/mL、2 2mg/mL、24mg/mL、26mg/mL、28mg/mL 或 30mg/mL，优选 5mg/mL ?20mg/mLo
[0034]优选地，步骤⑴所述多肽与步骤(2)所述低分子量肝素的质量比为1:100?100:1，例如 1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:10、1:5、1:3、1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、15:1、18:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 或 100:1，优选 1:20 ?1:100，进一步优选 1:20 ?1:50。
[0035]在本发明的制备方法中，使用葡萄糖溶液的目的是保持制备过程中渗透压的平衡，避免由于渗透压的改变而造成低分子量肝素的释放。
[0036]另一方面，本发明提供了如第一方面所述的低分子量肝素缓释制剂在制备抗血栓药物中的应用。
[0037]本发明所制成的缓释制剂可有效延长低分子量肝素的血液半衰期，避免药物“峰谷波动”，降低其溶液剂大剂量使用时大出血的风险，有效平稳释药，具有疗效高，稳定性好、副作用小的优势，易于工业化生产；其制备的缓释纳米制剂可用于血栓类疾病的预防与治疗，具有很好的治疗效果。
[0038]相对于现有技术，本发明具有以下有益效果:
[0039]本发明利用多肽和低分子量肝素形成纳米颗粒，使得低分子量肝素具有缓释功效，本发明的低分子量肝素缓释制剂在500小时内的释放率仅为20%左右，能够有效延长其血液半衰期，避免药物“峰谷波动”，有效平稳释药，降低低分子量肝素溶液剂大剂量使用时大出血的风险，降低药物的毒副作用，改善患者的顺应性，提高对疾病的治疗效率，可用于血栓类疾病的预防与治疗。本发明低分子量肝素缓释制剂的制备方法简单，易于操作，制备过程中无有机溶剂的加入，属于节能环保绿色生产，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0040]图1为本发明实施例1制备的低分子量肝素缓释制剂的扫描电镜图；
[0041]图2A为本发明实施例2制备的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图；
[0042]图2B本发明实施例2制备的低分子量肝素缓释制剂的表面电位图；
[0043]图3A为在不同肝素钠浓度下制备的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图；
[0044]图3B为在不同肝素钠浓度下制备的低分子量肝素缓释制剂的电位变化曲线图；
[0045]图3C为不同巯基化程度的多肽制备得到的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图；
[0046]图3D为不同巯基化程度的多肽制备得到的低分子量肝素缓释制剂的电位变化曲线图；
[0047]图4为本发明的低分子量肝素缓释制剂的体外释药曲线图；
[0048]图5为本发明的低分子量肝素缓释制剂在细胞水平的安全性评价结果图；
[0049]图6为本发明的低分子量肝素缓释制剂的动物体内抗凝血疗效评价结果图。
【具体实施方式】
[0050]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0051]实施例1
[0052]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0053]称取10mg聚赖氨酸(PLL，Mff= 13000Da)于离心管中，加入5mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL 15mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入6mg/mL Traut’ s试剂5mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的PLL(PLL-SH)溶液；向巯基化的PLL(PLL-SH)溶液中，加入60mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入10mL 20mg/mL肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，复溶后的制剂溶液用于后续的表征。
[0054]对本实施例制备得到的纳米颗粒进行扫描电镜(SEM)表征，结果如图1所示，平均粒径约120nm，颗粒表面光滑圆整。
[0055]实施例2
[0056]在本实施例与实施例1的区别仅在于调整PLL与低分子量肝素的质量比为5:6，其余制备方法和条件均与实施例1相同，将制备得到的低分子量肝素缓释制剂纳米颗粒通过动态光散射技术(DLS)测定纳米颗粒的粒径和电位。
[0057]结果如图2所示，其中图2A为低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图，由图可知，平均粒径约为105nm ;图2B为低分子量肝素缓释制剂的表面电位图；如图所示，表面电位约为-16mVo
[0058]实施例3
[0059]在本 实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0060]称取10mg聚组氨酸(Mw= 100Da)于离心管中，加入5mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL 20mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入0.lmg/mL Traut’ s试剂10mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的聚组氨酸溶液；向巯基化的聚组氨酸溶液中，加入50mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入5mL 30mg/mL达肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0061 ] 经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为llOnm，表面电位为_20mV，颗粒表面光滑圆整。
[0062]实施例4
[0063]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0064]称取10mg聚赖氨酸(PLL，Mff= 30000Da)于离心管中，加入10mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL lmg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入lmg/mL Traut’s试剂5mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的PLL(PLL-SH)溶液；向PLL-SH溶液中加入200mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入200mL lmg/mL磺达肝素(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0065]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为130nm，表面电位为_15mV，颗粒表面光滑圆整。
[0066]实施例5
[0067]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0068]称取10mg聚精氨酸(Mw= 500Da)于离心管中，加入50mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL 2mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入50mg/mL Traut’s试剂ImLdP入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的聚精氨酸溶液；向巯基化的聚精氨酸溶液中加入500mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入400mL 5mg/mL那曲肝素钙(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0069]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为60nm，表面电位为_8mV，颗粒表面光滑圆整。
[0070]实施例6
[0071]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0072]称取10mg聚赖氨酸(PLL，MW= 50000Da)于离心管中，加入20mL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取6mL 5mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入30mg/mL Traut’ s试剂6mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的PLL (PLL-SH)溶液；向PLL-SH溶液中加入250mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入500mL 10mg/mL那曲肝素钙(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0073]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为50nm，表面电位为_20mV，颗粒表面光滑圆整。
[0074]实施例7
[0075]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0076]称取10mg聚甘氨酸-聚精氨酸(Mw= 13000Da)于离心管中，加入40mL的5%葡萄糖溶液，超声混匀；量取5mL 2.5mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入30mg/mL Traut’s试剂10mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的聚甘氨酸-聚精氨酸溶液；巯基化的聚甘氨酸-聚精氨酸溶液中，加入50mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入ImL lmg/mL依诺肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0077]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为150nm，表面电位为10mV，颗粒表面光滑圆整。
[0078]实施例8
[0079]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0080]称取10mg聚半胱氨酸(MW = 13000Da)于离心管中，加入1mL的5%葡萄糖溶液，超声混匀；量取5mL 10mg/mL的PLL溶液于烧杯中，加入1mL 5 %葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入ImL 5mg/mL依诺肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。[0081 ] 经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为130nm，表面电位为_5mV，颗粒表面光滑圆整。
[0082]实施例9
[0083]在本实施例中，通过以下方法制备低分子量肝素缓释制剂，所述方法包括以下步骤:
[0084]称取1.2mg聚赖氨酸(PLL，Mff= 13000Da)于离心管中，加入ImL的5%葡萄糖溶液，超声混勾；量取5mL 1.2mg/mL的PLL溶液于离心管中，然后加入0.lmg/mL Traut’s试剂50mL，加入磁子，置于磁力搅拌器上搅拌2h进行巯基化，制得巯基化的PLL(PLL-SH)溶液；向PLL-SH溶液中加入1mL 5%葡萄糖溶液混匀，向该混合溶液中快速加入120mL lmg/mL依诺肝素钠(LMWH)溶液，混匀后均质，老化24h以待纳米颗粒稳定，冻干，制备得到低分子量肝素缓释制剂。
[0085]经扫描电镜和动态光散射表征，本实施例制备的低分子量肝素缓释制剂的平均粒径为200nm，表面电位为20mV，颗粒表面光滑圆整。
[0086]实施例10
[0087]在本实施例中，对低分子量肝素缓释制剂纳米颗粒的制备工艺稳定性进行考察，方法如下:按照实施例所述的方法制备巯基化程度为10%的PLL-SH溶液，将10%巯基化的PLL-SH溶液与LMWH溶液保持6:5的质量比制备LMWH终浓度为0.5mg/mL，0.6mg/mL，0.7mg/mL, 0.8mg/mL, 0.9mg/mL, 1.0mg/mL的纳米颗粒，老化24h后待纳米颗粒稳定，冻干。类似地，调整巯基化程度为5%?30%，分别制备纳米制剂。复溶后通过动态光散射技术测定所有样品的粒径和电位。
[0088]结果如图3所示，其中，图3A为在不同肝素钠浓度下制备的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图，由图可见，在0.5-1.0mg/mL的肝素钠浓度下，低分子量肝素缓释制剂的粒径变化不明显，粒径分散性(roi)均保持在较小数值，证明颗粒分散性好，颗粒较稳定；图3B为在不同肝素钠浓度下制备的低分子量肝素缓释制剂的电位变化曲线图，由图可见，在0.5-1.0mg/mL的肝素钠浓度下，低分子量肝素缓释制剂的电位无显著性变化；图3C为不同巯基化程度的多肽制备得到的低分子量肝素缓释制剂的粒径分布图，由图可见，在多肽巯基化程度为5%?30%时，低分子量肝素缓释制剂的粒径变化不明显，粒径分散性(PDI)均保持在较小数值，分散性好，颗粒较稳定；图3D为不同巯基化程度的多肽制备得到的低分子量肝素缓释制剂的电位变化曲线图，由图可见，在多肽巯基化程度为5%?30%时，低分子量肝素缓释制剂的电 位无显著性变化。因此，随着巯基化程度以及LMWH浓度的变化，纳米颗粒的粒径和电位均无显著性变化，呈现出良好的工艺稳定性。
[0089]实施例11
[0090]在本实施例中，对低分子量肝素缓释制剂纳米颗粒的纳米颗粒的体外释药曲线进行测定，方法如下:
[0091 ] 分别将加入4mg/mL游离的肝素钠溶液500 μ L (肝素钠溶液剂)与4mg/mL的PLL-SH(巯基化比例10% )与LMWH形成的纳米颗粒(缓释纳米制剂)500 μ L加入透析袋，封口 ；将每组3个样品分别放入盛有20mL PBS的50mL离心管中，向每个离心管中加入磁子，置于控温搅拌器(37°C)上搅拌，在不同的时间点分别进行取样，并取样后加入等量的PBS补液；利用甲苯胺蓝分光光度法对样品进行LMWH释放度的测定，并绘制体外释放曲线。
[0092]本实施例测定的体外释药曲线如图4所示，由图可以看出，本发明制备的制备的低分子量肝素缓释制剂在500小时内缓慢释放肝素钠，在500小时内本发明的低分子量肝素缓释制剂的释放率仅为20%左右，具有良好的缓释效果。
[0093]实施例12
[0094]在本实施例中，对低分子量肝素缓释制剂的安全性进行评价，方法如下:
[0095]人脐静脉血管内皮HUVEC细胞以5000个每孔的密度接种于96孔板，培养箱内培养24小时后，弃去培养基，PBS清洗，加入180 μ L新鲜的培养基，再分别加入20 μ L具有浓度梯度(终浓度20 μ g/mL、200 μ g/mL、400 μ g/mL)的实施例1制备的肝素钠制剂，每个浓度设置6个复孔，培养48h后，MTT法测定细胞的存活率。
[0096]本实施例测定结果如图5所示，结果表明肝素钠缓释制剂安全性良好，与肝素钠溶液剂在安全性方面无显著差异。
[0097]实施例13
[0098]在本实施例中，对低分子量肝素缓释制剂纳米颗粒的体内抗凝血疗效进行评价，方法如下:
[0099]实验前一天将SD大鼠进行分组，分为游离的LMWH溶液组(游离LMWH组)和实施例I制备的低分子量肝素缓释制剂(缓释纳米制剂组)，每组6只，实验前12h禁食。游离LMWH组及缓释纳米制剂组分别尾部静脉注射适量药物，按照设定的时间间隔取血，3000rpm，15min离心处理血样，取上清取出放入离心管中，分装后_20 V保存，样品避免反复冻融。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒对所有的样品的抗Xa因子活性进行检测。
[0100]本实施的体内抗凝血疗效评价结果如图6所示，由图可知，本发明制备的的低分子量肝素缓释制剂组(缓释纳米制剂组)抗Xa因子活性显著高于游离的肝素钠溶液剂，这表明本发明的低分子量肝素缓释制剂在动物体内抗血栓疗效优于肝素钠溶液剂。
[0101]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述低分子量肝素缓释制剂包含由多肽和低分子量肝素形成的纳米颗粒，所述多肽之间通过化学键进行交联。2.根据权利要求1所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述多肽与低分子量肝素的质量比为1:100?100:1，优选1:20?1:100，进一步优选1:20?1:50。3.根据权利要求1或2所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述多肽的分子量为 500 ?50000Da，优选 1000 ?30000Da ； 优选地，所述多肽为由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸或亮氨酸中的任意一种或至少两种形成的多肽； 优选地，所述化学键为二硫键、离子键或氢键中的任意一种或至少两种。4.根据权利要求1-3中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述低分子量肝素的分子量< 8000Da，优选3000?7000Da ； 优选地，所述低分子量肝素为肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙、磺达肝素钠或依诺肝素钠中的任意一种或至少两种的组合。5.根据权利要求1-4中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述纳米颗粒的平均粒径为50?200nm，优选60?150nm ； 优选地，所述纳米颗粒的表面电位为-20?20mV，优选-20?_5mV。6.根据权利要求1-5中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂，其特征在于，所述低分子量肝素缓释制剂为冻干粉针剂、无菌粉针剂或纳米溶液剂中的任意一种。7.根据权利要求1-6中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法采用自组装技术、均质技术、冷冻干燥技术、乳化技术、包埋技术或喷雾干燥技术中的任意一种或至少两种的组合，优选自组装技术、均质技术和冷冻干燥技术的组入口 ο8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将多肽加入葡萄糖溶液中，形成多肽溶液，而后加入Traut’s试剂，搅拌反应制得疏基化多狀； (2)向巯基化多肽中加入葡萄糖溶液，而后加入低分子量肝素溶液，混匀，均质，老化，冷冻干燥制成所述低分子量肝素缓释制剂。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤⑴和步骤⑵所述葡萄糖溶液为5%的葡萄糖溶液； 优选地，相对于10mg多肽，步骤⑴所述葡萄糖溶液的加入量为5?10mL ； 优选地，步骤⑴所述多肽溶液的浓度为lmg/mL?20mg/mL，优选为5mg/mL?15mg/mL ； 优选地，步骤(I)所述Traut’ s试剂的浓度为0.1?50mg/mL，优选为0.1?30mg/mL ；优选地，相对于ImL多肽溶液，步骤⑴所述Traut’ s试剂的加入量为O?1mL ；优选地，相对于ImL多肽溶液，步骤(2)所述葡萄糖溶液的加入量为2mL?100mL，优选10mT,?40mL ； 优选地，步骤(2)所述低分子量肝素溶液为将低分子量肝素溶于5%的葡萄糖溶液中形成的低分子量肝素溶液； 优选地，步骤(2)所述低分子量肝素溶液浓度为lmg/mL?30mg/mL，优选5mg/mL?20mg/mL ； 优选地，步骤(I)所述多肽与步骤(2)所述低分子量肝素的质量比为1:100?100:1，优选1:20?1:100，进一步优选1:20?1:50。10.根据权利要求1-6中任一项所述的低分子量肝素缓释制剂在制备抗血栓药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种低分子量肝素缓释制剂及其制备方法和应用，所述低分子量肝素缓释制剂包含由多肽和低分子量肝素形成的纳米颗粒，所述多肽之间通过化学键进行交联。本发明采用自组装技术、冷冻干燥技术、均质技术、乳化技术、包埋技术或喷雾干燥技术中的任意一种或至少两种的组合来制备低分子量肝素缓释制剂。本发明低分子量肝素缓释制剂在体外条件下500小时内释放率仅为20％左右，具有缓释功效，能够有效延长其血液半衰期，避免药物“峰谷波动”，降低低分子量肝素溶液剂大剂量使用时大出血的风险，降低药物的毒副作用，改善患者的顺应性，提高对疾病的治疗效率，可用于血栓类疾病的预防与治疗，本发明制备方法简单，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61P7/02, A61K31/727, A61K9/14, A61K47/42
【公开号】CN104906045
【申请号】CN201510359524
【发明人】闫学海, 陈成军, 李淑坤, 张宁, 马光辉
【申请人】中国科学院过程工程研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月25日
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