一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法
一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法
【专利说明】一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法
[0001] 【技术领域】 本发明涉及富血小板血浆的制备和长期保存技术，具体地说，是一种自体来源富血小 板血浆冻干粉的制备方法。
[0002] 【【背景技术】】 富血小板血浆（Plateletrichplasma，PRP)含有大量的具有生物活性的血小板，在一 定条件下，这些血小板通过激活、聚集、脱颗粒等过程将贮存在其中的多种细胞因子释放到 周围环境中，促进细胞增殖、分化及组织重建修复。PRP在口腔颌面外科、骨科及整形外科等 临床学科有着广泛的应用。
[0003]目前PRP的制备方法并没有统一的标准，不同方法所得血小板含量差别较大。另 外，临床上PRP的长期保存仍然存在问题。通常人血小板制品保存在血库22°C环境中的 时间只有3-7天，冷藏（4°C)或者是低温冻存（-80°C或-196°C)虽然在一定程度上减 少了血小板制品的污染机会，但是会导致血小板冷损伤，缩短血小板的寿命。也有用醛类对 血小板固定后再冻干的保存技术，但是这样会损害到血小板功能。
[0004] 离心分离常用于各种血液制品的制备。血液中各种血细胞的比重不同，在一定离 心力作用下，具有不同的沉降系数。通过第一步低速离心，以沉降血液中比重大的的红细胞 和白细胞，从而将比重小的血小板进行分离。第二步高速离心可沉降血小板，达到富集浓缩 的目的。其中离心重力及时间均会影响所得血液制品中的物质含量。
[0005] 冻干技术在医药工业、食品工业、科研和其他部门均得到广泛的应用。冷冻干燥就 是把含有大量水分的物质预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升 华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变。但是冷冻和干燥的过 程操作不当则可能会损伤生物制品的活性。
[0006] 综上所述，亟需一种能减少血小板损伤和尽量保存其生物活性，适用于临床应用 的血小板制品的制备方法及长期保存方法。
[0007]【
【发明内容】
】 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种富血小板血浆冻干粉的制备方法。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供一种富血小板血浆的保存方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是： 一种富血小板血浆冻干粉的制备方法，它包括以下步骤： a) 高浓度PRP的制备； b) PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后 用含有33~37mM海藻糖的溶液36~37°C温育3. 5~4. 5h，然后用冻干缓冲液重悬后放入 超低温冰箱，以-0. 9'1. 1°C/min速率降温到-75'85°C，维持12h以上，液氮浴Ih以 上；再放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01~0.03Torr并维持140~160min后，以 0.9~1.1°(：/111111速率上升到-8~-12°(：，真空度0~0.2 1'〇1^维持140~160 111111，最后升温 到21~23°C，真空度(TO. 2Torr至少维持24h; c) PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心 分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述 上清放入超低温冰箱，直接降温至-75~-85°C，保持12h以上，然后液氮浴Ih以上；再 将所述血浆或所述上清放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01、. 03Torr并维持 140~160 1^11，然后温度以0.9~1.1°(：/1^11速率上升到-8~-12°(：，真空度0~0.2 1'〇1^维 持140~160min，最后升温到21~23 °C，真空度(TO. 2Torr至少维持24h。
[0010] 优选地，所述的海藻糖浓度为35mM。
[0011] 优选地，所述的制备方法包括以下步骤： a) 高浓度PRP的制备； b) PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后 用含有35mM海藻糖的bufferA溶液37°C温育4h，再用冻干缓冲液重悬后放入超低 温冰箱，以-rC/min速率降温到-80°C，维持12h，液氮浴Ih以上；再放入冻干机，升温 至-35°C，真空度0.02Torr并维持150min，然后温度以1°C/min速率上升到-10°C， 真空度0.ITorr维持150min，最后升温到22°C，真空度0.ITorr至少维持24h; c) PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心 分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述 上清放入超低温冰箱，直接降温至-80°C，保持12h，液氮浴Ih以上；再将所述血浆或所 述上清放入冻干机，升温至-35°C，真空度0.02 Torr并维持150min，然后温度以1°C/ min速率上升到-10°C，真空度0.1 Torr，维持150min，最后升温到22°C，真空度0.1 Torr，至少维持24h。
[0012] 作为本发明的一种实施方式，所述的步骤a)具体是：将外周血在200Xg下离心10 min,保留上层血楽，再1390Xg离心15min,保留沉淀和上层部分血楽。
[0013] 作为本发明的一种实施方式，所述的"用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP"具体 是将质量分数10%的氯化钙溶液与步骤a)制备的PRP混合后在21~23 °C静置Ih以上。
[0014] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是： 一种富血小板血浆的保存方法，它是按照如上任一所述的方法制备得到富血小板血浆 冻干粉，然后真空密封保存。
[0015] 本发明优点在于： 本发明可制备获得高浓度富血小板血浆，再采用海藻糖作为血小板的负载保护剂，对 细胞膜在降温和干燥过程中进行保护，防止血小板聚集和激活，并通过冷冻、真空干燥等步 骤进一步制备获得PRP血小板部分冻干粉、PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉， 该制备方法经济有效、容易开展，冻干粉制品储存条件方便(室温下即可，无需冷藏）并可长 期保存，6个月仍然具备高浓度的血小板及细胞因子，同时该冻干粉制品的使用方法简单， 直接复水即可，无需再次激活。本发明的技术使得病人抽一次血就可以多次使用自体来源 的PRP及细胞因子冻干粉，有利于提高治疗效果，安全性更高，在临床上具有广阔的应用前 旦 -5^ 〇
[0016]【【具体实施方式】】 下面对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0017] 本发明的基本技术路线是： 1、高浓度PRP的制备及激活 将抗凝全血通过两步离心法分离制备高浓度PRP。将部分PRP用氯化钙溶液进行激活， 激活后Ih至24h内分离上清和沉淀，离心后弃去沉淀，保留上清并进行冻干；未激活的 PRP直接尚心法分尚血小板及血楽，分别冻干。
[0018] 2、冷冻干燥 冻干过程主要分为冷冻过程和低温真空干燥过程，以下分别介绍： ①PRP血小板部分的冷冻干燥 将血小板沉淀用缓冲液A (buffer A)和冻干缓冲液（lyophilization buffer)进行 预处理。然后进行程序冷冻。冷冻结束后，样品放入冻干机按照一定预设程序进行低温真 空干燥。
[0019] ②PRP血浆部分及PRP激活后上清的冷冻干燥 将PRP血浆部分或PRP激活后上清进行程序冷冻。冷冻结束后，样品放入冻干机按照 一定预设程序进行低温真空干燥。
[0020] ③所有冻干后的样品于室温下真空保存。
[0021] 实施例IPRP冻干粉的制备(一） 1、高浓度PRP的制备及激活 ①抽取一定量的外周抗凝静脉血至无菌离心管，记录初始体积（V〇 mL)。采用两步离心 法制备PRP。第一次采用离心力200Xg，离心10 min。小心吸取上层血浆至另一离心管，弃 去下层红细胞。第二次离心采用离心力1390Xg，离心15 min。按照保留初始体积1/10计 算需要保存PRP体积（PRP体积为1/10 Vtl mL)。弃去上层多余血浆，将下层血小板沉淀吹 匀，获得高浓度PRP。
[0022] ②取全血和步骤①制备的少量PRP用全自动血液体液分析仪（HST-N system， Sysmex, TOA Medical Electronics Co.，Kobe, Japan)进行血小板计数。当 PRP 血小板 数目是全血4倍或以上，并且计数高于1，000, 000/yL时可用于后续激活及冻干。
[0023] ③取部分PRP用于激活，具体方法是每1.2mLPRP加入50iiL质量分数10%的氯 化钙（CaCl2)溶液，室温（22° C)静置Ih以上。激活后的PRP会形成纤维蛋白凝胶（fibrin glue/ gel),可先用无菌针头破坏胶体，然后进行高速离心，离心力21，000Xg，离心5 min。 弃去沉淀，保留上清，记录上层清液体积（V2mL)。
[0024] 需要说明的是，以上所有技术操作均在室温（22°C)和无菌环境中进行。
[0025] 2、冷冻干燥 2.1PRP血小板部分的冷冻干燥 ①将新鲜分离制备的PRP通过离心力12, 000Xg，离心1秒，分离血小板及上层血浆。记 录血楽部分体积（V1 mL)。然后将下层血小板沉淀用buffer A (100mMNaCl, 10mMKC1, 1〇1111￡614，1〇1111;[1111(132016，101111。1'08七381311(1;[11-￡1，。116.8)溶液重悬和洗漆2次。 每次离心方法同前。第二次重悬后进行血小板计数，用含有35mM海藻糖（trehalose)的 buffer A溶液调整血小板浓度在（1-2) XlO9 /mL，37°C温育4 h。 温育结束后，12, OOOXg 离心Isec，吸去上层血浆，保存该部分血浆于无菌冻存管中用于后续冻干。用冻干缓冲液 (lyophilization buffer，包含9. 5mMHEPES，142.5mMNaCl, 4.8mMKC1,ImMMgCl2, 30mMtrehalose, 1%人血清白蛋白）重悬血小板沉淀，获得含有血小板的冻存液。
[0026] ②用与相应实验室冻干机（VirTis?Advantage?,SPIndustries,NY)配套的无 菌冻存管分装含有血小板的冻存液，每支冻存管样品体积不超过1/2。然后将冻存管放入程 序降温盒（Nalgene?)进行程序降温，程序降温盒放入-80° C冰箱内，降温程序为：从室温 开始，降温速率_l°C/min，温度降低到-80°C，维持时间12 h。然后迅速取出冻存管，放入 液氮（-196° C) I h以上。
[0027] ③在完成冷冻过程后，将冻干机冷凝器和隔板的温度调整到-45° C，同时设定温 控程序。从液氮中取出样本，迅速放入冻干机隔板上，进行真空冻干过程。当样本液氮浴去 除后，温度上升到-35° C，真空度0.02Torr，在这一条件下维持150min。然后温度以1° C/ min速率上升到-10° C，真空度O.lTorr，维持150min。最后温度上升到室温（22° C)，速 率不要求，真空度O.lTorr，维持24h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0028] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 ①将PRP离心后的血浆部分直接程序降温至-80°C，保持12h。然后放入液氮 (-196°C)Ih〇
[0029] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.02Torr在这一条件下维持150min。然 后温度以1°C/min速率上升到-10°C，真空度0.ITorr，维持150min。最后温度上升到 室温（22°C)，速率不要求，真空度O.lTorr，至少维持24h。然后用氮气压瓶塞，真空密封 样本。
[0030] 2.3激活后PRP上清部分的冷冻干燥 ①将激活后PRP上清部分直接程序降温至-80°C，保持12h。然后放入液氮 (-196°C)Ih以上。
[0031] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.02Torr，在这一条件下维持150min。 然后温度以1°C/min速率上升到-10°C，真空度0.1Torr，维持150min。最后温度上 升到室温（22°C)，速率不要求，真空度0.1Torr，至少维持24h。然后用氮气压瓶塞，真 空密封样本。
[0032] 实施例2PRP冻干粉的制备(二） 1、高浓度PRP的制备及激活 具体操作同实施例1。
[0033] 2、冷冻干燥 2.1PRP血小板部分的冷冻干燥 ①将新鲜分离制备的PRP通过离心力12, 000X g，离心1秒，分离血小板及上层血浆。记 录血楽部分体积（V1 mL)。然后将下层血小板沉淀用buffer A (100 mM NaCl, 10 mM KC1, 10 mM EGTA, 10 mM imidazole, 10 mM prostaglandin-El, pH 6. 8)溶液重悬和洗漆 2 次。每次离心方法同前。第二次重悬后进行血小板计数，用含有33 mM海藻糖（trehalose) 的buffer A溶液调整血小板浓度在IXlO9 /mL，36° C温育4. 5h。温育结束后，12, OOOXg 离心 I sec，用冻干缓冲液（lyophilization buffer，包含9.5 mM HEPES, 142.5 mM NaCl, 4. 8 mM KC1, I mM MgCl2, 30 mM trehalose, 1%人血清白蛋白）重悬，获得含有血小板的 冻存液。
[0034] ②用与相应实验室冻干机（VirTis?Advantage?,SPIndustries,NY)配套的 无菌冻存管分装含有血小板的冻存液，每支冻存管样品体积不超过1/2。然后将冻存管放 入程序降温盒（Nalgene?)进行程序降温，程序降温盒放入-80°C冰箱内，降温程序为：降 温速率-〇.9°C/min，温度降低到-75°C，维持时间15h。然后迅速取出冻存管，放入液氮 (-196°C)8h〇
[0035] ③在完成冷冻过程后，将冻干机冷凝器和隔板的温度调整到-45°C，同时设定温 控程序。从液氮中取出样本，迅速放入冻干机隔板上，进行真空冻干过程。当样本液氮浴去 除后，温度上升到_35°C，真空度0.03Torr在这一条件维持160min。然后温度以0.9°C/ min速率上升到-12°C，真空度0Torr维持140min。最后温度上升到23°C，真空度0 Torr速率不要求，维持48h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0036] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 ①将PRP离心后的血浆部分直接程序降温至-75°C，保持15h。然后放入液氮 (-196°C)8h〇
[0037] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.03Torr，在这一条件维持160min。然 后温度以0.9°C/min速率上升到-12°C，真空度0Torr，维持140min。最后温度上升 到23°C，真空度0Torr，速率不要求，维持48h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0038] 2.3激活后PRP上清部分的冷冻干燥 ①将激活后PRP上清部分直接程序降温至-75°C，保持15h。然后放入液氮（-196°C) 8h〇
[0039] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.03Torr，在这一条件维持160min。然 后温度以0.9°C/min速率上升到-12°C，真空度0Torr，维持140min。最后温度上升 到23°C，真空度0Torr，速率不要求，维持48h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0040] 实施例3PRP冻干粉的制备(三） 1、高浓度PRP的制备及激活 具体操作同实施例1。
[0041] 2、冷冻干燥 2.1PRP血小板部分的冷冻干燥 ①将新鲜分离制备的PRP通过离心力12,OOOXg，离心1秒，分离血小板及上层血浆。记 录血楽部分体积（V1mL)。然后将下层血小板沉淀用bufferA(100mMNaCl, 10mMKC1, 10mMEGTA, 10mMimidazole, 10mMprostaglandin-El,pH6. 8)溶液重悬和洗漆 2 次。每次离心方法同前。第二次重悬后进行血小板计数，用含有37mM海藻糖（trehalose) 的bufferA溶液调整血小板浓度在2X109/mL，38°C温育3.5h。温育结束后，12,000Xg 离心Isec，用冻干缓冲液（lyophilizationbuffer，包含9.5mMHEPES, 142.5mMNaCl, 4. 8mMKC1,ImMMgCl2, 30mMtrehalose, 1%人血清白蛋白）重悬，获得含有血小板的 冻存液。
[0042] ②用与相应实验室冻干机（VirTis?Advantage?,SPIndustries,NY)配套的无 菌冻存管分装含有血小板的冻存液，每支冻存管样品体积不超过1/2。然后将冻存管放入程 序降温盒（Nalgene?)进行程序降温，程序降温盒放入-80°C冰箱内，降温程序为：降温速 率-I. 1°C/min，温度降低到-85°c，时间14h。然后迅速取出冻存管，放入液氮（-196°C) 10h〇
[0043] ③在完成冷冻过程后，将冻干机冷凝器和隔板的温度调整到-45°C，同时设定 温控程序。从液氮中取出样本，迅速放入冻干机隔板上，进行真空冻干过程。当样本液氮 浴去除后，温度上升到-38°C，真空度0.01Torr，在这一温度维持140min。然后温度以 1.1°C/min速率上升到-8°C，真空度0.2Torr，维持160min。最后温度上升到21°C， 速率不要求，真空度0.2Torr，维持80h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0044] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 ①将PRP离心后的血浆部分直接程序降温至-85°C，保持14h。然后放入液氮 (-196°OlOh0
[0045] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-38°C，真空度0.01Torr，在这一温度维持140min。然 后温度以1. 1°C/min速率上升到-8°C，真空度0. 2Torr，维持160min。最后温度上升 到21°C，速率不要求，真空度0.2Torr，维持80h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0046] 2.3激活后PRP上清部分的冷冻干燥 ①将激活后PRP上清部分直接程序降温-85°C，保持14h。然后放入液氮（-196°C) 10h〇
[0047] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-38°C，真空度0.01Torr，在这一温度维持140min。然 后温度以1. 1°C/min速率上升到-8°C，真空度0. 2Torr，维持160min。最后温度上升 到21°C，速率不要求，真空度0.2Torr，维持80h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0048] 对比例1 1、高浓度PRP的制备及激活 具体操作同实施例2。
[0049] 2 、冷冻干燥 2.1 PRP血小板部分的冷冻干燥 具体操作同实施例2,不同之处仅在于所用的bufferA溶液中海藻糖浓度为32mM。
[0050] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 具体操作同实施例2。
[0051] 对比例2 1、高浓度PRP的制备及激活 具体操作同实施例3。
[0052] 2、冷冻干燥 2.1 PRP血小板部分的冷冻干燥 具体操作同实施例3,不同之处仅在于步骤②的降温速率为-I. 15°C/min。
[0053] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 具体操作同实施例3,不同之处仅在于步骤②中温度上升到21°C后，控制真空度为 0? 3Torr，维持 80h。
[0054] 2. 3激活后PRP上清部分的冷冻干燥 具体操作同实施例3,不同之处仅在于步骤②中是以1.15°C/min速率上升到-8°C。
[0055] 实施例4稳定性实验 1方法与材料 ①将实施例1-3及对比例1-2的所有冻干样本室温真空避光保存，分别设保存1个月 和6个月两个处理。
[0056] ②保存到期后将样本进行复水。Ca-FDPRP(激活后PRP上清部分)直接加入同体 积（V2mL)无菌生理盐水，并取少量样本检测其中的细胞因子含量。对于FDPRP(冻干富 血小板血浆)，先用同体积生理盐水复水血浆冻干粉，然后将复水后血浆和血小板冻干粉混 合均匀，取少量复水后FDPRP样本，检测血小板含量，离心去除血小板后检测其中细胞因子 含量。
[0057] ③通过酶联免疫吸附试验（ELISA)检测全血及PRP(未激活)、Ca-FDPRP、复水后 FDPRP中的转化生长因子（Transforminggrowthfactor-0 1，TGF_0 1)、血小板来源生 长因子-AB(Platelet-derivedgrowthfactor-AB，F1DGF-AB)和血管内皮细胞生长因子 (Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的含量。
[0058] ④数据统计：统计结果采用均数土标准差，在统计方法上，同种细胞因子在不同 处理组的比较采用非配对样本Students't-test。数据处理及分析采用SPSS19. 0软件包 进行相关分析。P〈〇. 05认为有统计学显著性差异。
[0059] 2 结果 2. 1血小板计数 各处理血小板计数结果见表1。表中数据表明，在室温保存1个月后，实施例1-3的FD PRP复水后仍然保持较高血小板含量，尤其实施例1在保存6个月后血小板含量仍然高达 (1059±167) X 106/mL。新鲜分离PRP血小板计数比较全血血小板计数具有显著性差异： p〈0. 05 ;各实施例及对比例复水后FD PRP血小板计数比较全血血小板计数均具有显著性 差异：p〈0. 05 ;实施例1-3复水后FD PRP血小板计数比较对比例1复水后FD PRP血小板计 数具有显著性差异：P〈〇. 05 ;实施例1-3复水后FD PRP血小板计数比较对比例2复水后FD PRP血小板计数具有显著性差异：p〈0. 05。
[0060] 表1血小板计数
注：PRP表示富血小板血浆；FDPRP表示冻干富血小板血浆；Ca-FDPRP表示氯化钙激 活1小时后进行冻干的富血小板血浆。血小板计数结果用均数土标准差。
[0061] 2. 2细胞因子含量测定 细胞因子含量测定结果见表2和表3。表中数据表明，在TGF-PUTOGF-AB和VEGF含 量方面，Ca-FDPRP分别比较FDPRP和新鲜分离PRP均具有显著性差异，p〈0. 05;而FDPRP 和新鲜分离PRP比较P> 〇. 05,无明显统计学差异。保存1个月后，在TGF-0 1、TOGF-AB 和VEGF含量方面，实施例1-3复水后FDPRP比较对比例2均具有显著性差异：p〈0. 05 ;实 施例1-3复水后Ca-FDPRP比较对比例2均具有显著性差异：p〈0. 05。保存6个月后，在 TGF-P1、I3DGF-AB和VEGF含量方面，实施例1-3复水后FDPRP比较对比例2均具有显著 性差异：P〈〇.05 ;实施例1-3复水后Ca-FDPRP比较对比例2均具有显著性差异：p〈0. 05。 实施例1-3的TGF-P1、TOGF-AB和VEGF含量在保存1个月及6个月后比较均无显著性差 异：P> 0? 05。
[0062] 表2细胞因子含量测定结果（1个月）
注：PRP表示富血小板血浆；FDPRP表示冻干富血小板血浆；Ca-FDPRP表示氯化钙激 活1小时后进行冻干的富血小板血浆。细胞因子含量以均数土标准差表示。
[0063] 表3细胞因子含量测定结果（6个月）
注：PRP表示富血小板血浆；FDPRP表示冻干富血小板血浆；Ca-FDPRP表示氯化钙激 活1小时后进行冻干的富血小板血浆。细胞因子含量以均数土标准差表示。
[0064] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种富血小板血浆冻干粉的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤： a) 高浓度PRP的制备； b) PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后 用含有33~37mM海藻糖的溶液36~37°C温育3. 5~4. 5h，然后用冻干缓冲液重悬后放入 超低温冰箱，以-0. 9'1. 1°C/min速率降温到-75'85°C，维持12h以上，液氮浴Ih以 上；再放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01~0.03Torr并维持140~160min后，以 0.9~1.1°(：/111111速率上升到-8~-12°(：，真空度0~0.2 1'〇1^维持140~160 111111，最后升温 到21~23°C，真空度(TO. 2Torr至少维持24h; c) PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心 分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述 上清放入超低温冰箱，直接降温至-75~-85°C，保持12h以上，然后液氮浴Ih以上；再 将所述血浆或所述上清放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01、. 03Torr并维持 140~160 1^11，然后温度以0.9~1.1°(：/1^11速率上升到-8~-12°(：，真空度0~0.2 1'〇1^维 持140~160min，最后升温到21~23 °C，真空度(TO. 2Torr至少维持24h。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的海藻糖浓度为35mM。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤： a) 高浓度PRP的制备； b) PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后 用含有35mM海藻糖的bufferA溶液37°C温育4h，再用冻干缓冲液重悬后放入超低 温冰箱，以_l°C/min速率降温到-80°C，维持12h，液氮浴Ih以上；再放入冻干机，升温 至-35°C，真空度0.02Torr并维持150min，然后温度以1°C/min速率上升到-10°C， 真空度0.ITorr维持150min，最后升温到22°C，真空度0.ITorr至少维持24h; c) PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心 分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述 上清放入超低温冰箱，直接降温至-80°C，保持12h，液氮浴Ih以上；再将所述血浆或所 述上清放入冻干机，升温至-35°C，真空度0.02Torr并维持150min，然后温度以1°C/ min速率上升到-10°C，真空度0.1Torr，维持150min，最后升温到22°C，真空度0.1 Torr，至少维持24h。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤a)具体是：将外周血在 200Xg下离心10min,保留上层血楽，再1390Xg离心15min,保留沉淀和上层部分血楽。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的"用氯化钙溶液处理步骤a)制 备的PRP"具体是将质量分数10%的氯化钙溶液与步骤a)制备的PRP混合后在21~23 °C 静置Ih以上。6. -种富血小板血楽的保存方法，其特征在于，它是按照权利要求1-5任一所述的方 法制备得到富血小板血浆冻干粉，然后真空密封保存。
【专利摘要】本发明涉及一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法：首先制备高浓度PRP；然后离心PRP获得血小板和血浆，血小板负载海藻糖后以-0.9~-1.1℃/min速率降温到-75~-85℃，维持12h以上，液氮浴1h以上冷冻，同时将血浆直接降温至-75~-85°C，保持12h以上，液氮浴1h以上；另外取部分PRP激活后冷冻；最后所有样品均升温至-35~-38°C，0.01~0.03Torr下维持140~160min，再以0.9~1.1°C/min速率升温到-8~-12°C，0~0.2Torr下维持140~160min，最后升温到21~23°C，0~0.2Torr下至少维持24h，获得冻干粉。本发明制备的冻干粉储存条件方便并可长期保存，且使用方法简便。
【IPC分类】A61K47/26, A61K9/19, A61K35/19, A61K35/16
【公开号】CN104906052
【申请号】CN201410093843
【发明人】徐剑炜, 潘龙
【申请人】复旦大学附属中山医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月14日
【专利说明】一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法
[0001] 【技术领域】 本发明涉及富血小板血浆的制备和长期保存技术，具体地说，是一种自体来源富血小 板血浆冻干粉的制备方法。
[0002] 【【背景技术】】 富血小板血浆（Plateletrichplasma，PRP)含有大量的具有生物活性的血小板，在一 定条件下，这些血小板通过激活、聚集、脱颗粒等过程将贮存在其中的多种细胞因子释放到 周围环境中，促进细胞增殖、分化及组织重建修复。PRP在口腔颌面外科、骨科及整形外科等 临床学科有着广泛的应用。
[0003]目前PRP的制备方法并没有统一的标准，不同方法所得血小板含量差别较大。另 外，临床上PRP的长期保存仍然存在问题。通常人血小板制品保存在血库22°C环境中的 时间只有3-7天，冷藏（4°C)或者是低温冻存（-80°C或-196°C)虽然在一定程度上减 少了血小板制品的污染机会，但是会导致血小板冷损伤，缩短血小板的寿命。也有用醛类对 血小板固定后再冻干的保存技术，但是这样会损害到血小板功能。
[0004] 离心分离常用于各种血液制品的制备。血液中各种血细胞的比重不同，在一定离 心力作用下，具有不同的沉降系数。通过第一步低速离心，以沉降血液中比重大的的红细胞 和白细胞，从而将比重小的血小板进行分离。第二步高速离心可沉降血小板，达到富集浓缩 的目的。其中离心重力及时间均会影响所得血液制品中的物质含量。
[0005] 冻干技术在医药工业、食品工业、科研和其他部门均得到广泛的应用。冷冻干燥就 是把含有大量水分的物质预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升 华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变。但是冷冻和干燥的过 程操作不当则可能会损伤生物制品的活性。
[0006] 综上所述，亟需一种能减少血小板损伤和尽量保存其生物活性，适用于临床应用 的血小板制品的制备方法及长期保存方法。
[0007]【
【发明内容】
】 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种富血小板血浆冻干粉的制备方法。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供一种富血小板血浆的保存方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是： 一种富血小板血浆冻干粉的制备方法，它包括以下步骤： a) 高浓度PRP的制备； b) PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后 用含有33~37mM海藻糖的溶液36~37°C温育3. 5~4. 5h，然后用冻干缓冲液重悬后放入 超低温冰箱，以-0. 9'1. 1°C/min速率降温到-75'85°C，维持12h以上，液氮浴Ih以 上；再放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01~0.03Torr并维持140~160min后，以 0.9~1.1°(：/111111速率上升到-8~-12°(：，真空度0~0.2 1'〇1^维持140~160 111111，最后升温 到21~23°C，真空度(TO. 2Torr至少维持24h; c) PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心 分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述 上清放入超低温冰箱，直接降温至-75~-85°C，保持12h以上，然后液氮浴Ih以上；再 将所述血浆或所述上清放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01、. 03Torr并维持 140~160 1^11，然后温度以0.9~1.1°(：/1^11速率上升到-8~-12°(：，真空度0~0.2 1'〇1^维 持140~160min，最后升温到21~23 °C，真空度(TO. 2Torr至少维持24h。
[0010] 优选地，所述的海藻糖浓度为35mM。
[0011] 优选地，所述的制备方法包括以下步骤： a) 高浓度PRP的制备； b) PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后 用含有35mM海藻糖的bufferA溶液37°C温育4h，再用冻干缓冲液重悬后放入超低 温冰箱，以-rC/min速率降温到-80°C，维持12h，液氮浴Ih以上；再放入冻干机，升温 至-35°C，真空度0.02Torr并维持150min，然后温度以1°C/min速率上升到-10°C， 真空度0.ITorr维持150min，最后升温到22°C，真空度0.ITorr至少维持24h; c) PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心 分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述 上清放入超低温冰箱，直接降温至-80°C，保持12h，液氮浴Ih以上；再将所述血浆或所 述上清放入冻干机，升温至-35°C，真空度0.02 Torr并维持150min，然后温度以1°C/ min速率上升到-10°C，真空度0.1 Torr，维持150min，最后升温到22°C，真空度0.1 Torr，至少维持24h。
[0012] 作为本发明的一种实施方式，所述的步骤a)具体是：将外周血在200Xg下离心10 min,保留上层血楽，再1390Xg离心15min,保留沉淀和上层部分血楽。
[0013] 作为本发明的一种实施方式，所述的"用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP"具体 是将质量分数10%的氯化钙溶液与步骤a)制备的PRP混合后在21~23 °C静置Ih以上。
[0014] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是： 一种富血小板血浆的保存方法，它是按照如上任一所述的方法制备得到富血小板血浆 冻干粉，然后真空密封保存。
[0015] 本发明优点在于： 本发明可制备获得高浓度富血小板血浆，再采用海藻糖作为血小板的负载保护剂，对 细胞膜在降温和干燥过程中进行保护，防止血小板聚集和激活，并通过冷冻、真空干燥等步 骤进一步制备获得PRP血小板部分冻干粉、PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉， 该制备方法经济有效、容易开展，冻干粉制品储存条件方便(室温下即可，无需冷藏）并可长 期保存，6个月仍然具备高浓度的血小板及细胞因子，同时该冻干粉制品的使用方法简单， 直接复水即可，无需再次激活。本发明的技术使得病人抽一次血就可以多次使用自体来源 的PRP及细胞因子冻干粉，有利于提高治疗效果，安全性更高，在临床上具有广阔的应用前 旦 -5^ 〇
[0016]【【具体实施方式】】 下面对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0017] 本发明的基本技术路线是： 1、高浓度PRP的制备及激活 将抗凝全血通过两步离心法分离制备高浓度PRP。将部分PRP用氯化钙溶液进行激活， 激活后Ih至24h内分离上清和沉淀，离心后弃去沉淀，保留上清并进行冻干；未激活的 PRP直接尚心法分尚血小板及血楽，分别冻干。
[0018] 2、冷冻干燥 冻干过程主要分为冷冻过程和低温真空干燥过程，以下分别介绍： ①PRP血小板部分的冷冻干燥 将血小板沉淀用缓冲液A (buffer A)和冻干缓冲液（lyophilization buffer)进行 预处理。然后进行程序冷冻。冷冻结束后，样品放入冻干机按照一定预设程序进行低温真 空干燥。
[0019] ②PRP血浆部分及PRP激活后上清的冷冻干燥 将PRP血浆部分或PRP激活后上清进行程序冷冻。冷冻结束后，样品放入冻干机按照 一定预设程序进行低温真空干燥。
[0020] ③所有冻干后的样品于室温下真空保存。
[0021] 实施例IPRP冻干粉的制备(一） 1、高浓度PRP的制备及激活 ①抽取一定量的外周抗凝静脉血至无菌离心管，记录初始体积（V〇 mL)。采用两步离心 法制备PRP。第一次采用离心力200Xg，离心10 min。小心吸取上层血浆至另一离心管，弃 去下层红细胞。第二次离心采用离心力1390Xg，离心15 min。按照保留初始体积1/10计 算需要保存PRP体积（PRP体积为1/10 Vtl mL)。弃去上层多余血浆，将下层血小板沉淀吹 匀，获得高浓度PRP。
[0022] ②取全血和步骤①制备的少量PRP用全自动血液体液分析仪（HST-N system， Sysmex, TOA Medical Electronics Co.，Kobe, Japan)进行血小板计数。当 PRP 血小板 数目是全血4倍或以上，并且计数高于1，000, 000/yL时可用于后续激活及冻干。
[0023] ③取部分PRP用于激活，具体方法是每1.2mLPRP加入50iiL质量分数10%的氯 化钙（CaCl2)溶液，室温（22° C)静置Ih以上。激活后的PRP会形成纤维蛋白凝胶（fibrin glue/ gel),可先用无菌针头破坏胶体，然后进行高速离心，离心力21，000Xg，离心5 min。 弃去沉淀，保留上清，记录上层清液体积（V2mL)。
[0024] 需要说明的是，以上所有技术操作均在室温（22°C)和无菌环境中进行。
[0025] 2、冷冻干燥 2.1PRP血小板部分的冷冻干燥 ①将新鲜分离制备的PRP通过离心力12, 000Xg，离心1秒，分离血小板及上层血浆。记 录血楽部分体积（V1 mL)。然后将下层血小板沉淀用buffer A (100mMNaCl, 10mMKC1, 1〇1111￡614，1〇1111;[1111(132016，101111。1'08七381311(1;[11-￡1，。116.8)溶液重悬和洗漆2次。 每次离心方法同前。第二次重悬后进行血小板计数，用含有35mM海藻糖（trehalose)的 buffer A溶液调整血小板浓度在（1-2) XlO9 /mL，37°C温育4 h。 温育结束后，12, OOOXg 离心Isec，吸去上层血浆，保存该部分血浆于无菌冻存管中用于后续冻干。用冻干缓冲液 (lyophilization buffer，包含9. 5mMHEPES，142.5mMNaCl, 4.8mMKC1,ImMMgCl2, 30mMtrehalose, 1%人血清白蛋白）重悬血小板沉淀，获得含有血小板的冻存液。
[0026] ②用与相应实验室冻干机（VirTis?Advantage?,SPIndustries,NY)配套的无 菌冻存管分装含有血小板的冻存液，每支冻存管样品体积不超过1/2。然后将冻存管放入程 序降温盒（Nalgene?)进行程序降温，程序降温盒放入-80° C冰箱内，降温程序为：从室温 开始，降温速率_l°C/min，温度降低到-80°C，维持时间12 h。然后迅速取出冻存管，放入 液氮（-196° C) I h以上。
[0027] ③在完成冷冻过程后，将冻干机冷凝器和隔板的温度调整到-45° C，同时设定温 控程序。从液氮中取出样本，迅速放入冻干机隔板上，进行真空冻干过程。当样本液氮浴去 除后，温度上升到-35° C，真空度0.02Torr，在这一条件下维持150min。然后温度以1° C/ min速率上升到-10° C，真空度O.lTorr，维持150min。最后温度上升到室温（22° C)，速 率不要求，真空度O.lTorr，维持24h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0028] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 ①将PRP离心后的血浆部分直接程序降温至-80°C，保持12h。然后放入液氮 (-196°C)Ih〇
[0029] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.02Torr在这一条件下维持150min。然 后温度以1°C/min速率上升到-10°C，真空度0.ITorr，维持150min。最后温度上升到 室温（22°C)，速率不要求，真空度O.lTorr，至少维持24h。然后用氮气压瓶塞，真空密封 样本。
[0030] 2.3激活后PRP上清部分的冷冻干燥 ①将激活后PRP上清部分直接程序降温至-80°C，保持12h。然后放入液氮 (-196°C)Ih以上。
[0031] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.02Torr，在这一条件下维持150min。 然后温度以1°C/min速率上升到-10°C，真空度0.1Torr，维持150min。最后温度上 升到室温（22°C)，速率不要求，真空度0.1Torr，至少维持24h。然后用氮气压瓶塞，真 空密封样本。
[0032] 实施例2PRP冻干粉的制备(二） 1、高浓度PRP的制备及激活 具体操作同实施例1。
[0033] 2、冷冻干燥 2.1PRP血小板部分的冷冻干燥 ①将新鲜分离制备的PRP通过离心力12, 000X g，离心1秒，分离血小板及上层血浆。记 录血楽部分体积（V1 mL)。然后将下层血小板沉淀用buffer A (100 mM NaCl, 10 mM KC1, 10 mM EGTA, 10 mM imidazole, 10 mM prostaglandin-El, pH 6. 8)溶液重悬和洗漆 2 次。每次离心方法同前。第二次重悬后进行血小板计数，用含有33 mM海藻糖（trehalose) 的buffer A溶液调整血小板浓度在IXlO9 /mL，36° C温育4. 5h。温育结束后，12, OOOXg 离心 I sec，用冻干缓冲液（lyophilization buffer，包含9.5 mM HEPES, 142.5 mM NaCl, 4. 8 mM KC1, I mM MgCl2, 30 mM trehalose, 1%人血清白蛋白）重悬，获得含有血小板的 冻存液。
[0034] ②用与相应实验室冻干机（VirTis?Advantage?,SPIndustries,NY)配套的 无菌冻存管分装含有血小板的冻存液，每支冻存管样品体积不超过1/2。然后将冻存管放 入程序降温盒（Nalgene?)进行程序降温，程序降温盒放入-80°C冰箱内，降温程序为：降 温速率-〇.9°C/min，温度降低到-75°C，维持时间15h。然后迅速取出冻存管，放入液氮 (-196°C)8h〇
[0035] ③在完成冷冻过程后，将冻干机冷凝器和隔板的温度调整到-45°C，同时设定温 控程序。从液氮中取出样本，迅速放入冻干机隔板上，进行真空冻干过程。当样本液氮浴去 除后，温度上升到_35°C，真空度0.03Torr在这一条件维持160min。然后温度以0.9°C/ min速率上升到-12°C，真空度0Torr维持140min。最后温度上升到23°C，真空度0 Torr速率不要求，维持48h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0036] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 ①将PRP离心后的血浆部分直接程序降温至-75°C，保持15h。然后放入液氮 (-196°C)8h〇
[0037] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.03Torr，在这一条件维持160min。然 后温度以0.9°C/min速率上升到-12°C，真空度0Torr，维持140min。最后温度上升 到23°C，真空度0Torr，速率不要求，维持48h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0038] 2.3激活后PRP上清部分的冷冻干燥 ①将激活后PRP上清部分直接程序降温至-75°C，保持15h。然后放入液氮（-196°C) 8h〇
[0039] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-35°C，真空度0.03Torr，在这一条件维持160min。然 后温度以0.9°C/min速率上升到-12°C，真空度0Torr，维持140min。最后温度上升 到23°C，真空度0Torr，速率不要求，维持48h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0040] 实施例3PRP冻干粉的制备(三） 1、高浓度PRP的制备及激活 具体操作同实施例1。
[0041] 2、冷冻干燥 2.1PRP血小板部分的冷冻干燥 ①将新鲜分离制备的PRP通过离心力12,OOOXg，离心1秒，分离血小板及上层血浆。记 录血楽部分体积（V1mL)。然后将下层血小板沉淀用bufferA(100mMNaCl, 10mMKC1, 10mMEGTA, 10mMimidazole, 10mMprostaglandin-El,pH6. 8)溶液重悬和洗漆 2 次。每次离心方法同前。第二次重悬后进行血小板计数，用含有37mM海藻糖（trehalose) 的bufferA溶液调整血小板浓度在2X109/mL，38°C温育3.5h。温育结束后，12,000Xg 离心Isec，用冻干缓冲液（lyophilizationbuffer，包含9.5mMHEPES, 142.5mMNaCl, 4. 8mMKC1,ImMMgCl2, 30mMtrehalose, 1%人血清白蛋白）重悬，获得含有血小板的 冻存液。
[0042] ②用与相应实验室冻干机（VirTis?Advantage?,SPIndustries,NY)配套的无 菌冻存管分装含有血小板的冻存液，每支冻存管样品体积不超过1/2。然后将冻存管放入程 序降温盒（Nalgene?)进行程序降温，程序降温盒放入-80°C冰箱内，降温程序为：降温速 率-I. 1°C/min，温度降低到-85°c，时间14h。然后迅速取出冻存管，放入液氮（-196°C) 10h〇
[0043] ③在完成冷冻过程后，将冻干机冷凝器和隔板的温度调整到-45°C，同时设定 温控程序。从液氮中取出样本，迅速放入冻干机隔板上，进行真空冻干过程。当样本液氮 浴去除后，温度上升到-38°C，真空度0.01Torr，在这一温度维持140min。然后温度以 1.1°C/min速率上升到-8°C，真空度0.2Torr，维持160min。最后温度上升到21°C， 速率不要求，真空度0.2Torr，维持80h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0044] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 ①将PRP离心后的血浆部分直接程序降温至-85°C，保持14h。然后放入液氮 (-196°OlOh0
[0045] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-38°C，真空度0.01Torr，在这一温度维持140min。然 后温度以1. 1°C/min速率上升到-8°C，真空度0. 2Torr，维持160min。最后温度上升 到21°C，速率不要求，真空度0.2Torr，维持80h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0046] 2.3激活后PRP上清部分的冷冻干燥 ①将激活后PRP上清部分直接程序降温-85°C，保持14h。然后放入液氮（-196°C) 10h〇
[0047] ②待冻干机冷凝器及隔板温度降到-45°C后，从液氮中取出样本放入冻干机。当 样本液氮浴去除后，温度上升到-38°C，真空度0.01Torr，在这一温度维持140min。然 后温度以1. 1°C/min速率上升到-8°C，真空度0. 2Torr，维持160min。最后温度上升 到21°C，速率不要求，真空度0.2Torr，维持80h。然后用氮气压瓶塞，真空密封样本。
[0048] 对比例1 1、高浓度PRP的制备及激活 具体操作同实施例2。
[0049] 2 、冷冻干燥 2.1 PRP血小板部分的冷冻干燥 具体操作同实施例2,不同之处仅在于所用的bufferA溶液中海藻糖浓度为32mM。
[0050] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 具体操作同实施例2。
[0051] 对比例2 1、高浓度PRP的制备及激活 具体操作同实施例3。
[0052] 2、冷冻干燥 2.1 PRP血小板部分的冷冻干燥 具体操作同实施例3,不同之处仅在于步骤②的降温速率为-I. 15°C/min。
[0053] 2. 2PRP血浆部分的冷冻干燥 具体操作同实施例3,不同之处仅在于步骤②中温度上升到21°C后，控制真空度为 0? 3Torr，维持 80h。
[0054] 2. 3激活后PRP上清部分的冷冻干燥 具体操作同实施例3,不同之处仅在于步骤②中是以1.15°C/min速率上升到-8°C。
[0055] 实施例4稳定性实验 1方法与材料 ①将实施例1-3及对比例1-2的所有冻干样本室温真空避光保存，分别设保存1个月 和6个月两个处理。
[0056] ②保存到期后将样本进行复水。Ca-FDPRP(激活后PRP上清部分)直接加入同体 积（V2mL)无菌生理盐水，并取少量样本检测其中的细胞因子含量。对于FDPRP(冻干富 血小板血浆)，先用同体积生理盐水复水血浆冻干粉，然后将复水后血浆和血小板冻干粉混 合均匀，取少量复水后FDPRP样本，检测血小板含量，离心去除血小板后检测其中细胞因子 含量。
[0057] ③通过酶联免疫吸附试验（ELISA)检测全血及PRP(未激活)、Ca-FDPRP、复水后 FDPRP中的转化生长因子（Transforminggrowthfactor-0 1，TGF_0 1)、血小板来源生 长因子-AB(Platelet-derivedgrowthfactor-AB，F1DGF-AB)和血管内皮细胞生长因子 (Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的含量。
[0058] ④数据统计：统计结果采用均数土标准差，在统计方法上，同种细胞因子在不同 处理组的比较采用非配对样本Students't-test。数据处理及分析采用SPSS19. 0软件包 进行相关分析。P〈〇. 05认为有统计学显著性差异。
[0059] 2 结果 2. 1血小板计数 各处理血小板计数结果见表1。表中数据表明，在室温保存1个月后，实施例1-3的FD PRP复水后仍然保持较高血小板含量，尤其实施例1在保存6个月后血小板含量仍然高达 (1059±167) X 106/mL。新鲜分离PRP血小板计数比较全血血小板计数具有显著性差异： p〈0. 05 ;各实施例及对比例复水后FD PRP血小板计数比较全血血小板计数均具有显著性 差异：p〈0. 05 ;实施例1-3复水后FD PRP血小板计数比较对比例1复水后FD PRP血小板计 数具有显著性差异：P〈〇. 05 ;实施例1-3复水后FD PRP血小板计数比较对比例2复水后FD PRP血小板计数具有显著性差异：p〈0. 05。
[0060] 表1血小板计数
注：PRP表示富血小板血浆；FDPRP表示冻干富血小板血浆；Ca-FDPRP表示氯化钙激 活1小时后进行冻干的富血小板血浆。血小板计数结果用均数土标准差。
[0061] 2. 2细胞因子含量测定 细胞因子含量测定结果见表2和表3。表中数据表明，在TGF-PUTOGF-AB和VEGF含 量方面，Ca-FDPRP分别比较FDPRP和新鲜分离PRP均具有显著性差异，p〈0. 05;而FDPRP 和新鲜分离PRP比较P> 〇. 05,无明显统计学差异。保存1个月后，在TGF-0 1、TOGF-AB 和VEGF含量方面，实施例1-3复水后FDPRP比较对比例2均具有显著性差异：p〈0. 05 ;实 施例1-3复水后Ca-FDPRP比较对比例2均具有显著性差异：p〈0. 05。保存6个月后，在 TGF-P1、I3DGF-AB和VEGF含量方面，实施例1-3复水后FDPRP比较对比例2均具有显著 性差异：P〈〇.05 ;实施例1-3复水后Ca-FDPRP比较对比例2均具有显著性差异：p〈0. 05。 实施例1-3的TGF-P1、TOGF-AB和VEGF含量在保存1个月及6个月后比较均无显著性差 异：P> 0? 05。
[0062] 表2细胞因子含量测定结果（1个月）
注：PRP表示富血小板血浆；FDPRP表示冻干富血小板血浆；Ca-FDPRP表示氯化钙激 活1小时后进行冻干的富血小板血浆。细胞因子含量以均数土标准差表示。
[0063] 表3细胞因子含量测定结果（6个月）
注：PRP表示富血小板血浆；FDPRP表示冻干富血小板血浆；Ca-FDPRP表示氯化钙激 活1小时后进行冻干的富血小板血浆。细胞因子含量以均数土标准差表示。
[0064] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种富血小板血浆冻干粉的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤： a) 高浓度PRP的制备； b) PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后 用含有33~37mM海藻糖的溶液36~37°C温育3. 5~4. 5h，然后用冻干缓冲液重悬后放入 超低温冰箱，以-0. 9'1. 1°C/min速率降温到-75'85°C，维持12h以上，液氮浴Ih以 上；再放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01~0.03Torr并维持140~160min后，以 0.9~1.1°(：/111111速率上升到-8~-12°(：，真空度0~0.2 1'〇1^维持140~160 111111，最后升温 到21~23°C，真空度(TO. 2Torr至少维持24h; c) PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心 分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述 上清放入超低温冰箱，直接降温至-75~-85°C，保持12h以上，然后液氮浴Ih以上；再 将所述血浆或所述上清放入冻干机，升温至-35~-38°C，真空度0.01、. 03Torr并维持 140~160 1^11，然后温度以0.9~1.1°(：/1^11速率上升到-8~-12°(：，真空度0~0.2 1'〇1^维 持140~160min，最后升温到21~23 °C，真空度(TO. 2Torr至少维持24h。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的海藻糖浓度为35mM。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤： a) 高浓度PRP的制备； b) PRP血小板部分冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心分离获得血小板，洗涤后 用含有35mM海藻糖的bufferA溶液37°C温育4h，再用冻干缓冲液重悬后放入超低 温冰箱，以_l°C/min速率降温到-80°C，维持12h，液氮浴Ih以上；再放入冻干机，升温 至-35°C，真空度0.02Torr并维持150min，然后温度以1°C/min速率上升到-10°C， 真空度0.ITorr维持150min，最后升温到22°C，真空度0.ITorr至少维持24h; c) PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备：将步骤a)制备的PRP离心 分离获得血浆；用氯化钙溶液处理步骤a)制备的PRP，离心后保留上清；将所述血浆或所述 上清放入超低温冰箱，直接降温至-80°C，保持12h，液氮浴Ih以上；再将所述血浆或所 述上清放入冻干机，升温至-35°C，真空度0.02Torr并维持150min，然后温度以1°C/ min速率上升到-10°C，真空度0.1Torr，维持150min，最后升温到22°C，真空度0.1 Torr，至少维持24h。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤a)具体是：将外周血在 200Xg下离心10min,保留上层血楽，再1390Xg离心15min,保留沉淀和上层部分血楽。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的"用氯化钙溶液处理步骤a)制 备的PRP"具体是将质量分数10%的氯化钙溶液与步骤a)制备的PRP混合后在21~23 °C 静置Ih以上。6. -种富血小板血楽的保存方法，其特征在于，它是按照权利要求1-5任一所述的方 法制备得到富血小板血浆冻干粉，然后真空密封保存。
【专利摘要】本发明涉及一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法：首先制备高浓度PRP；然后离心PRP获得血小板和血浆，血小板负载海藻糖后以-0.9~-1.1℃/min速率降温到-75~-85℃，维持12h以上，液氮浴1h以上冷冻，同时将血浆直接降温至-75~-85°C，保持12h以上，液氮浴1h以上；另外取部分PRP激活后冷冻；最后所有样品均升温至-35~-38°C，0.01~0.03Torr下维持140~160min，再以0.9~1.1°C/min速率升温到-8~-12°C，0~0.2Torr下维持140~160min，最后升温到21~23°C，0~0.2Torr下至少维持24h，获得冻干粉。本发明制备的冻干粉储存条件方便并可长期保存，且使用方法简便。
【IPC分类】A61K47/26, A61K9/19, A61K35/19, A61K35/16
【公开号】CN104906052
【申请号】CN201410093843
【发明人】徐剑炜, 潘龙
【申请人】复旦大学附属中山医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月14日
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