一种冬凌草片的制备方法及应用
一种冬凌草片的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种冬凌草片的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 冬凌草片记载于国家药品监督管理局药品标准WS3-B-0527-2001，处方为冬凌草， 生产工艺为取冬凌草3000g，粉碎成粗粉，置罐内加入乙醇10倍量，加热加压（0. 15mPa)， 提取16小时，收集提取液，回收乙醇至稠膏状。烘干，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适 量，混匀，压制成1000片，包衣，即得。清热消肿。用于慢性扁桃体炎，咽炎，喉炎，口腔炎。 口服。一次2~5片，一日3次。
[0003] 现有技术中，尚未有冬凌草片在提取制备方面采用超临界技术的报道，而采用乙 醇提取方法，工艺粗糙、复杂、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便使用，脐部皮肤破损 及有炎症者容易感染，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种冬凌草片的制备方法。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖 药物中的应用。
[0006] 技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：
[0007] -种冬凌草片的制备方法，由冬凌草作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组 成：取上述药材加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积 百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，C02流量l-3ml/g生药.min,萃取时间 150-180min，得超临界萃取物，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适量，混匀，压制成800 片，包衣，即得。
[0008] 所述冬凌草片的制备方法，所述C02超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分 比为5%。
[0009] 所述冬凌草片的制备方法，所述C02超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，C02 流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。
[0010] 所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，由冬凌草作为 原料药制成，制备方法为：取冬凌草，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，C02流量l-3ml/ g生药min,萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适 量，混匀，压制成800片，包衣，即得。
[0011] 所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，其特征在于冬 凌草片的制备方法中所述C02超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
[0012] 所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，其特征在于冬 凌草片的制备方法中所述C02超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，C02流量2ml/g生 药?min，萃取时间160min。
[0013] 现有技术中，冬凌草片每片0. 25g，内服，一次2~5片，一日3次，采用本发明制备 成的冬凌草片每片〇. 25g，但含有的药材量比原来多，在具有更多活性成分的条件下大大减 少了使用量。
【具体实施方式】
[0014] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0015] 实施例1 :取冬凌草3000g，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力30MPa，温度30°C，C02流量lml/g生药min, 萃取时间180min，得超临界萃取物，加入淀粉50g，制成颗粒，加硬脂酸镁2g，混匀，压制成 800片，包衣，即得。
[0016] 实施例2 :取冬凌草3000g，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力15MPa，温度50°C，C02流量lml/g生药min, 萃取时间180min，得超临界萃取物，加入淀粉50g，制成颗粒，加硬脂酸镁2g，混匀，压制成 800片，包衣，即得。
[0017] 实施例3 :取冬凌草3000g，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40°C，C02流量2ml/g生药.min, 萃取时间160min，得超临界萃取物，加入淀粉50g，制成颗粒，加硬脂酸镁2g，混匀，压制成 800片，包衣，即得。
[0018] 实施例4:冬凌草片抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖的实验研宄资料
[0019] 1实验材料
[0020]I. 1实验用细胞株：大鼠心肌细胞H9C2,南京医科大学实验室细胞库，DMEM+10% FBS常规培养。
[0021] 1. 2实验药物：研宄药物：本发明冬凌草片：按实施例3方法制备。药液储液：称取 IOOmg冬凌草片，溶于5ml无水乙醇中，0. 2ym滤器过滤，500yIdoff管分装，_20°C存储， 同时0. 2ym滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0022] L3 实验试剂：DMEM(GIBCO公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清 (浙江天杭生物科技有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat. No.11810-033Lot.No. 1088387)Jrypsin(AMRESC0 公司批号：2010/04) ;EDTA(AMRESCO 公司批号：2009/10);PenicillinGSodiumSalt(AMRESC0公司批号：2010242); Str印tomycinSulfate(AMRESO)公司批号：2010382);无水乙醇（南京化学试剂有限公司 批号：080310182) ;MTT(Biosharp批号：0793) ;PBS(实验室自配）；
[0023] 1. 4实验器材：莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMlL);可见-紫外光微孔板检 测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190) ;C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏 净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD);纯水仪（美国Spring公司型号：S/N020579);精 密移液器（法国吉尔森公司型号：P2);电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S); 全自动高压灭菌锅（日本SANK)公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密 实验设备公司型号：DHG9123A);冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号： 2001);低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000) ;0. 2ym滤器（MILLIPORE型号： SLGP033RB) ;10cm培养皿（NEST公司）、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移 液管、Tips若干。
[0024] 2实验方法：1)H9C2细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养（IOcm培 养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋 白酶-0. 04%EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将 其转入离心管中，1000 rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。2)将细胞种入96 孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 111，培养板放入细胞培养箱中（371：，5%〇)2)常规培 养。3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入冬凌草片溶液，继续培养24h。4) 24h 后加入20yIMTT溶液（5mg/ml，即0. 5%MTT)，继续培养4h。5) 4h后扣板法倒去上清，用 吸水纸轻轻拍干，每孔加入200y1二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶 解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6)同时设置本底（不加细胞，只加培 养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个 复孔。7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率（％) = (对照孔OD值-给药 孔OD值）/对照孔OD值X100%。实验重复3次。
[0025] 3实验结果：MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对 H9C2细胞增殖抑制有差异（P〈0. 05)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂 量达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
[0026] 表1冬凌草片对大鼠心肌细胞H9C2增殖抑制影响研宄IX土SD)
[0027]
[0028]注：与对照组比较，*P〈0. 01 ;#P〈0. 001
[0029] 4实验结论：冬凌草片可以抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖，减少大鼠心肌细胞H9C2 的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 一种冬凌草片的制备方法，由冬凌草作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下 列步骤组成：取上述药材加入到〇) 2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶 剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药^min, 萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适量，混匀，压 制成800片，包衣，即得。2. 根据权利要求1所述冬凌草片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为5%。3. 根据权利要求1所述冬凌草片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的萃取 压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。4. 根据权利要求1所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应 用，其特征在于冬凌草片由冬凌草作为原料药制成，制备方法为：取冬凌草，加入到〇) 2超 临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力 15-30MPa，温度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min,萃取时间150-180min，得超临界萃取 物，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适量，混匀，压制成800片，包衣，即得。5. 根据权利要求4所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，其 特征在于冬凌草片的制备方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6. 根据权利要求4所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，其 特征在于冬凌草片的制备方法中所述〇)2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，0)2流 量2ml/g生药?min，萃取时间160min。
【专利摘要】本发明属于中药制剂领域，具体提供一种冬凌草片的制备方法，由冬凌草作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得含量有很大提高，用量减少，本发明还提供了冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61K9/28, A61P9/00, A61K36/53
【公开号】CN104906061
【申请号】CN201510347352
【发明人】李洋
【申请人】南京华宽信息咨询中心
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月22日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种冬凌草片的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 冬凌草片记载于国家药品监督管理局药品标准WS3-B-0527-2001，处方为冬凌草， 生产工艺为取冬凌草3000g，粉碎成粗粉，置罐内加入乙醇10倍量，加热加压（0. 15mPa)， 提取16小时，收集提取液，回收乙醇至稠膏状。烘干，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适 量，混匀，压制成1000片，包衣，即得。清热消肿。用于慢性扁桃体炎，咽炎，喉炎，口腔炎。 口服。一次2~5片，一日3次。
[0003] 现有技术中，尚未有冬凌草片在提取制备方面采用超临界技术的报道，而采用乙 醇提取方法，工艺粗糙、复杂、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便使用，脐部皮肤破损 及有炎症者容易感染，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种冬凌草片的制备方法。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖 药物中的应用。
[0006] 技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：
[0007] -种冬凌草片的制备方法，由冬凌草作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组 成：取上述药材加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积 百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，C02流量l-3ml/g生药.min,萃取时间 150-180min，得超临界萃取物，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适量，混匀，压制成800 片，包衣，即得。
[0008] 所述冬凌草片的制备方法，所述C02超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分 比为5%。
[0009] 所述冬凌草片的制备方法，所述C02超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，C02 流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。
[0010] 所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，由冬凌草作为 原料药制成，制备方法为：取冬凌草，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，C02流量l-3ml/ g生药min,萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适 量，混匀，压制成800片，包衣，即得。
[0011] 所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，其特征在于冬 凌草片的制备方法中所述C02超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
[0012] 所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，其特征在于冬 凌草片的制备方法中所述C02超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，C02流量2ml/g生 药?min，萃取时间160min。
[0013] 现有技术中，冬凌草片每片0. 25g，内服，一次2~5片，一日3次，采用本发明制备 成的冬凌草片每片〇. 25g，但含有的药材量比原来多，在具有更多活性成分的条件下大大减 少了使用量。
【具体实施方式】
[0014] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0015] 实施例1 :取冬凌草3000g，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力30MPa，温度30°C，C02流量lml/g生药min, 萃取时间180min，得超临界萃取物，加入淀粉50g，制成颗粒，加硬脂酸镁2g，混匀，压制成 800片，包衣，即得。
[0016] 实施例2 :取冬凌草3000g，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力15MPa，温度50°C，C02流量lml/g生药min, 萃取时间180min，得超临界萃取物，加入淀粉50g，制成颗粒，加硬脂酸镁2g，混匀，压制成 800片，包衣，即得。
[0017] 实施例3 :取冬凌草3000g，加入到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40°C，C02流量2ml/g生药.min, 萃取时间160min，得超临界萃取物，加入淀粉50g，制成颗粒，加硬脂酸镁2g，混匀，压制成 800片，包衣，即得。
[0018] 实施例4:冬凌草片抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖的实验研宄资料
[0019] 1实验材料
[0020]I. 1实验用细胞株：大鼠心肌细胞H9C2,南京医科大学实验室细胞库，DMEM+10% FBS常规培养。
[0021] 1. 2实验药物：研宄药物：本发明冬凌草片：按实施例3方法制备。药液储液：称取 IOOmg冬凌草片，溶于5ml无水乙醇中，0. 2ym滤器过滤，500yIdoff管分装，_20°C存储， 同时0. 2ym滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0022] L3 实验试剂：DMEM(GIBCO公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清 (浙江天杭生物科技有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat. No.11810-033Lot.No. 1088387)Jrypsin(AMRESC0 公司批号：2010/04) ;EDTA(AMRESCO 公司批号：2009/10);PenicillinGSodiumSalt(AMRESC0公司批号：2010242); Str印tomycinSulfate(AMRESO)公司批号：2010382);无水乙醇（南京化学试剂有限公司 批号：080310182) ;MTT(Biosharp批号：0793) ;PBS(实验室自配）；
[0023] 1. 4实验器材：莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMlL);可见-紫外光微孔板检 测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190) ;C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏 净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD);纯水仪（美国Spring公司型号：S/N020579);精 密移液器（法国吉尔森公司型号：P2);电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S); 全自动高压灭菌锅（日本SANK)公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密 实验设备公司型号：DHG9123A);冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号： 2001);低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000) ;0. 2ym滤器（MILLIPORE型号： SLGP033RB) ;10cm培养皿（NEST公司）、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移 液管、Tips若干。
[0024] 2实验方法：1)H9C2细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养（IOcm培 养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋 白酶-0. 04%EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将 其转入离心管中，1000 rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。2)将细胞种入96 孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 111，培养板放入细胞培养箱中（371：，5%〇)2)常规培 养。3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入冬凌草片溶液，继续培养24h。4) 24h 后加入20yIMTT溶液（5mg/ml，即0. 5%MTT)，继续培养4h。5) 4h后扣板法倒去上清，用 吸水纸轻轻拍干，每孔加入200y1二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶 解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6)同时设置本底（不加细胞，只加培 养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个 复孔。7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率（％) = (对照孔OD值-给药 孔OD值）/对照孔OD值X100%。实验重复3次。
[0025] 3实验结果：MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对 H9C2细胞增殖抑制有差异（P〈0. 05)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂 量达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
[0026] 表1冬凌草片对大鼠心肌细胞H9C2增殖抑制影响研宄IX土SD)
[0027]
[0028]注：与对照组比较，*P〈0. 01 ;#P〈0. 001
[0029] 4实验结论：冬凌草片可以抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖，减少大鼠心肌细胞H9C2 的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 一种冬凌草片的制备方法，由冬凌草作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下 列步骤组成：取上述药材加入到〇) 2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶 剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药^min, 萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适量，混匀，压 制成800片，包衣，即得。2. 根据权利要求1所述冬凌草片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为5%。3. 根据权利要求1所述冬凌草片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的萃取 压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。4. 根据权利要求1所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应 用，其特征在于冬凌草片由冬凌草作为原料药制成，制备方法为：取冬凌草，加入到〇) 2超 临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力 15-30MPa，温度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min,萃取时间150-180min，得超临界萃取 物，加入淀粉适量，制成颗粒，加润滑剂适量，混匀，压制成800片，包衣，即得。5. 根据权利要求4所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，其 特征在于冬凌草片的制备方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6. 根据权利要求4所述冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用，其 特征在于冬凌草片的制备方法中所述〇)2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，0)2流 量2ml/g生药?min，萃取时间160min。
【专利摘要】本发明属于中药制剂领域，具体提供一种冬凌草片的制备方法，由冬凌草作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得含量有很大提高，用量减少，本发明还提供了冬凌草片在制备抑制大鼠心肌细胞H9C2增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61K9/28, A61P9/00, A61K36/53
【公开号】CN104906061
【申请号】CN201510347352
【发明人】李洋
【申请人】南京华宽信息咨询中心
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月22日
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