一种黄芩苷-pvp共沉淀物及其制剂、制备方法与用图
一种黄芩苷-pvp共沉淀物及其制剂、制备方法与用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种组合药物，具体涉及黄芩苷-PVP共沉淀物、制剂及其制备方法和 用途。
【背景技术】
[0002] 黄零（RadixScutellariae)为唇形科植物黄零 (ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根。味苦，性寒。归肺、胆、脾、大肠、小肠经。具 有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎功效，现代医学用于呼吸道感染，急性胆道感染，泌尿系 统感染，急性细菌性痢疾，病毒性肝炎，猩红热，流脑，高血压等症的治疗。其主要有效成分 为黄酮类化合物，如黄芩苷元、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷、黄芩新素及二氢黄酮苷等。
[0003] 黄芩苷（Baicalin)是从黄芩中分离提纯的天然产物，为一种单体化合物，是黄芩 的有效成分之一。黄芩苷具有多种药理活性：
[0004] 1.黄芩苷具有阻滞钙离子通道的作用。
[0005] 2.黄芩苷对超氧自由基具有明显的清除作用，可有效对抗脂质过氧化损伤。
[0006] 3.黄芩苷对各种实验性肝损伤都有一定的保护作用。
[0007] 4.黄芩苷具有免疫调节作用，可以增加机体的免疫力。
[0008] 5.黄芩苷有抑制醛糖还原酶的作用，可用于糖尿病慢性并发症的治疗。
[0009] 6.黄芩苷具有抗HIV-I的活性，是一种有效的预防和治疗HIV感染的药物。
[0010]7.黄芩苷具有心脑血管的保护作用：黄芩苷有扩张血管及降压作用，抗心律失 常，抑制血管平滑肌细胞增殖，保护心肌缺血再灌注损伤，调节血脂，抗动脉粥样硬化，保护 脑组织损伤。
[0011] 但目前尚未见有黄芩苷在抑制舌鳞癌干细胞生长方面的报道。
[0012] 名词解释：癌症干细胞（CancerStemCel1，CSC)，又称癌干细胞、肿瘤干细胞，是指 具有干细胞（StemCell)性质的癌细胞，也就是具有"自我复制"（Self-Renewal)以及"具 有多细胞分化" (Differentiation)等能力。通常这类的细胞被认为有形成肿瘤，发展成癌 症的潜力。肿瘤干细胞自我更新的特性是造成肿瘤复发的主要原因。
[0013] PVP，即聚乙烯基吡咯烷酮。
【发明内容】
[0014] 本发明首先所要解决的技术问题是提供一种以黄芩苷为主要成分，抑制舌鳞癌症 干细胞生长的药物及其制备方法。
[0015] 为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
[0016] 一种黄芩苷-PVP共沉淀物，是以含有黄芩苷、聚乙烯基吡咯烷酮的混合溶液为原 料，经过加热，去除混合溶液中的溶剂后所得到的沉淀物；其中混合溶液中的溶剂为有机溶 剂，黄芩苷与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1 :3。
[0017] 制备黄芩苷-PVP共沉淀物的方法，包括如下步骤：
[0018] 步骤1)取一定量的黄芩苷溶解于有机溶剂中形成溶液，以水浴超声处理该溶液， 并向溶液中加入聚乙烯基吡咯烷酮，其中黄芩苷与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1 :3 ;
[0019] 步骤2)聚乙烯基吡咯烷酮添加完毕后，将步骤1)所得到的溶液转移到室温环境 下进行充分混合，形成混合溶液；加热混合溶液，使混合溶液内的有机溶剂挥发，这样便有 共沉淀物析出，该共沉淀物即是所要制备的黄芩苷_PVP共沉淀物。
[0020] 经实验验证，采用本发明的技术方案制备的黄芩苷-聚乙烯基吡咯烷酮（PVP)共 沉淀物，可以抑制舌鳞癌症干细胞的生长，逆转肿瘤干细胞高醛脱氢酶活性，降低癌细胞恶 性程度（即高恶性肿瘤转为低恶性肿瘤）。比起现有的单纯以黄芩苷为有效成分的药物， 本发明制备的黄芩苷-PVP共沉淀物更易于溶解，溶解度更高；而且在黄芩苷相对使用量 (质量）同等的情况下，比起现有的单纯以黄芩苷为有效成分的药物，服用本发明制备的黄 芩苷-PVP共沉淀物，服用者的血药浓度（单位体积血液中黄芩苷的含量）要更高，即证明 本发明制备的黄芩苷-PVP共沉淀物具有较强的生物活性。
[0021] 进一步，还包括步骤3)对所得的黄芩苷-PVP共沉淀物进行研磨，并采用筛网进行 筛选，将能通过筛网的粉末颗粒装入空胶囊壳中存放备用。
[0022] 进一步，所述有机溶剂是指无水乙醇，所述加热混合溶液，是将混合溶液放入温度 为65°C，气压90kPa的环境下使混合溶液升温。
[0023] 升温同时降压，是使混合溶液升温，溶剂快速挥发的技术手段，有助于提高制备效 率。
[0024] 本发明还提供了黄芩苷-PVP共沉淀物的制剂，所述黄芩苷-PVP共沉淀物灌封于 胶囊中，形成胶囊剂型。
[0025] 通过胶囊进行药物存放，保质期长，而且便于病人定量口服。
[0026] 本发明另一个要解决的技术问题是提供一种用途，即黄芩苷-PVP共沉淀物用于 制备舌鳞癌症干细胞抑制药的用途。
[0027] 药效机理：
[0028] 通过细胞实验与动物实验发现，增加黄芩苷的有效注入量，会直接影响NF-KB信 号通路，使得舌鳞癌干细胞的醛脱氢酶的表达减少，干细胞生长增殖活性受到抑制，最终导 致舌鳞癌的增殖与侵袭能力得到有效抑制。
【附图说明】
[0029] 图1是采用UV-3105分光光度仪，本发明中黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊与活性制药 成分胶囊在4组溶液的溶解度检测图表；A :0.Imol/lHCl溶液；B:pH4. 5的磷酸缓冲液；C: pH6. 8的磷酸缓冲液；D :蒸馏水。
[0030] 图2中口腔给予0. 25g黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊与活性制药成分胶囊后不同时 间的血药浓度曲线图。
[0031] 图3为流式细胞术检测舌鳞癌Tca8113细胞系中ALDH+细胞的情况。
[0032] A:ALDH抑制剂DEAB建立的基线荧光；B:无DEAB情况下Tca8113细胞系中ALDH+ 细胞。
[0033] 图4为ALDH+细胞与ALDH-细胞的体外增殖对照表。
[0034] 图5为使用Zeiss倒置显微镜检测的Tca8113细胞形成肿瘤球的检测图。
[0035] A、B、C为ALDH+Tca8113 细胞，D、E、F为ALDH-Tca8113 细胞。
[0036] 图6为采用Aldefluor分析不同浓度黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48h后 醛脱氢酶活性检测图。从左到右依次是：DMSO溶剂对照组、36. 48ng/ml、364. 8ng/ml及 3648ng/ml黄芩苷组。
[0037] 图7为高醛脱氢酶活性鳞癌细胞及黄芩苷处理后低醛脱氢酶活性细胞分别提取 总RNA经琼脂糖凝胶电泳结果。A与B分别为高醛脱氢酶活性鳞癌细胞与黄芩苷处理后细 胞。
[0038] 图8为采用WesternBlot检测的NF-KB蛋白表达情况对照图（图8右侧的数字 表示实验材料用量水平）。
[0039] 图9为人舌鳞癌裸鼠体内成瘤的宏观观察与解剖后观察。A:0. 25g黄芩苷-PVP共 沉淀物胶囊组，B: "参阳"方72. 8mg+生理盐水至0. 25g组，与C:0. 25g生理盐水对照组。
[0040] 图10为人舌鳞癌裸鼠体内成瘤的HE染色检测肿瘤外Imm处鳞癌细胞浸润情况。 A:0. 25g黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊组，B: "参阳"方72. 8mg+生理盐水至0? 25g组，C:0. 25g 生理盐水对照组。
[0041] Coprecipitatecapsule共沉淀胶囊，APIcapsule活性制药成分胶囊。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明：
[0043] 本发明通过实施例研宄表明，黄芩苷-PVP共沉淀物可以抑制与高醛脱氢酶活性 呈正相关的舌鳞癌干细胞的生长。
[0044] 实施例1:黄芩苷-PVP共沉淀物的制备及生物学活性检测。
[0045] 材料与方法：
[0046] 1，采用溶剂法制备黄芩苷-聚乙烯基吡咯烷酮共沉淀物。
[0047] 7g黄芩苷溶解在1050毫升无水乙醇，72 ±2°C水浴超声处理，加入2Ig聚乙烯基吡 咯烷酮，黄芩苷质量：聚乙烯基吡咯烷酮质量=1 :3。将得到的溶液转移到一个圆底烧瓶， 室温下轻轻晃动混合30分钟。在65°C，90kPa下使无水乙醇完全挥发，圆底烧瓶内形成共 沉淀物。共沉淀物在真空干燥器至少干燥24h。研钵内研磨，经80目筛网筛选，能通过80 目筛网的即所述黄芩苷-PVP共沉淀物。
[0048] 2,取0. 500±0. 025g黄芩苷-PVP共沉淀物转入0号空胶囊壳内，即制备含有 0.125g黄芩苷的黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊。
[0049] 对照试剂：黄芩苷-活性制药成分（API)胶囊包含0. 250±0. 012gAPI(于武汉能 仁医药有限公司购买得到的纯度为99%的胶囊成品）。本发明的黄芩苷-PVP共沉淀物胶 囊中黄芩苷重量是市面上胶囊内黄芩苷重量的一半。
[0050] 3,把黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊溶解于甲醇溶剂，黄芩苷药物纯度在278nm的分 光光度法测定。测定结果：黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊中黄芩苷药物纯度为98. 8±0. 5%。
[0051]4,UV-3105分光光度仪检测黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊与活性制药成分胶囊在4 组溶液的溶解度情况。A:0.lmol/LHCl溶液；B:pH4.5的磷酸缓冲液；C:pH6.8的磷酸缓冲 液；D:蒸馏水。如图1所示，黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊在不同溶液的溶解度均较活性制药 成分胶囊（即现有的黄芩苷药物）溶解度有显著地提高与改善。
[0052] 5,高效液相色谱仪检测给予6只比格犬随机分为2组口服0. 25g黄芩苷-PVP共 沉淀物胶囊与活性制药成分胶囊；检测不同时间的血药浓度。相隔2周的间隔期后，动物分 组调换分别接受0. 25g活性制药成分胶囊与黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊处理；并检测不同时 间的血药浓度。如图2所示黄芩苷-PVP共沉淀物在黄芩苷使用量仅为现有的黄芩苷药物 一半的情况，依然具有较强的生物学活性。
[0053] 结论1，黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊较活性制药成分胶囊具有更好的溶解度与生物 学活性。
[0054] 实施例2 :黄芩苷抑制人舌鳞癌的动物实验研宄
[0055] 材料与方法：
[0056] 1，（N0D/SCID)裸鼠购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。4周龄，雌 性，18只，体重约17_20g。SPF以上级环境培养。
[0057] 2,TCA8113细胞系购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。体外培养 IXlO6细胞/ml，接种Iml于裸鼠的右侧背部皮下。每3天观察一次。
[0058] 3,实验分组：分为0? 25g生理盐水对照组、"参阳"方72. 8mg+生理盐水至0? 25g 组，与0. 25g黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊组（n= 6)。接种后第8 天开始分别口服上述三种 处理试剂，每天一次，至接种后第35天。
[0059] 4,动物处死及标本收集：接种术后第35d，用颈椎脱臼法处死动物。用眼科剪刀、 镊子等手术器械将肿瘤剥出，游标卡尺测量其直径及电子天平称肿瘤重量，并取部分肿瘤 组织，置10%的甲醛固定液固定，送检。肿瘤组织固定后，石蜡包埋，作常规病理切片，HE 染色，对肿瘤组织外Imm处采集图像分析鳞癌浸润情况。
[0060] 数据统计分析：结果采用均数土标准差表示，应用SPSS17. 0统计学软件，对结果 进行单因素方差分析，P< 〇. 05表示差异有统计学意义。
[0061] 结果：
[0062] 1，解剖学观察，肉眼见肿瘤位于皮下，表面凹凸不平，可呈结节状，实性，肿瘤生 长靠近表皮，可有出血灶，其面积随时间增长而增大；解剖后可见肿瘤多呈结节状，实质， 表面有出血灶（图9)。生长潜伏期约3-6d，9-21d生长迅速。
[0063] 2,实验对照组、"参阳"方组，与黄芩苷组三组移植瘤平均瘤重分别为： 3. 1356±0. 5972, 3. 4071±0. 7123,与4. 8529±0. 4042)。两实验组较对照组具有显著性差 异（P< 0. 05)，而两实验组之间没有显著性差异（P> 0. 05,），但是黄芩苷组在瘤重方面稍 低于"参阳"方组。
[0064] 3,肿瘤组织HE染色后，肿瘤组织外Imm处图像显示：对照组有大量肿瘤细胞浸 润，并形成癌细胞巢；"参阳"方组与黄芩苷组未见明显的癌细胞巢，且仅有少量癌细胞浸润 (图 10)。
[0065] 结论2 :黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊能够显著抑制人舌鳞癌细胞动物体内生长，以 及对其浸润能力仍有一定的抑制能力；与"参阳"方向比较亦稍具优势。
[0066] 实施例3 :醛脱氢酶活性与舌鳞癌干细胞之关系。
[0067] 材料与方法：
[0068] 1，TCA8113细胞系购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。体外培养用于 实验。
[0069] 2,采用DEAB抑制醛脱氢酶活性的AldefIuor(干细胞鉴定试剂盒）分析，流式细 胞仪检测醛脱氢酶（ALDH)阳性TCA8113细胞系。
[0070] 3,流式细胞仪筛选的ALDH+，ALDH-，及未经筛选的TCA8113细胞1，000细胞/ml的 密度接种于96孔板，培养1，3,5,7天后采用CellCountingkit-8(Dojindo)进行统计，结果 以均数土标准差表示。
[0071] 4,ALDH+与ALDH-细胞以20, 000细胞/ml的密度培养于无血清6孔板中。Zeiss 倒置显微镜检测肿瘤球形成情况。
[0072] 数据统计分析：应用SPSS17. 0统计学软件，对结果进行单因素方差分析，P< 0. 05 表示差异有统计学意义。
[0073] 结果：
[0074] 1，如图3所示，采用Aldefluor分析检测舌鳞癌Tca8113细胞系中ALDH+细胞： ALDH+Tca8113细胞数量较少。
[0075] 2,如图4所示，ALDH+细胞的体外增殖速率远大于ALDH-细胞，并具有统计学意义 (n= 3,P〈0. 01).
[0076] 3,如图5所示，A和D:单一ALDH+与ALDH-Tca8113细胞在无血清培养基中培养。 B和C:ALDH+Tca8113细胞在第5天及第10天均形成肿瘤球。E和F:ALDH-Tca8113细胞在 第5天及第10天均未形成肿瘤球。
[0077] 结论3,高醛脱氢酶活性是舌鳞癌干细胞的筛选与鉴定标志，提高醛脱氢酶活性 有助于促进舌鳞癌干细胞生长，低醛脱氢酶活性将抑制舌鳞癌干细胞生长。
[0078] 实施例4 :黄芩苷抑制醛脱氢酶的研宄 [0079]材料与方法：
[0080] 1，TCA8113细胞系购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。体外培养用于 实验。
[0081] 2,实验分组：分为对照组、不同浓度黄芩苷药物组。对照组用含DMSO溶剂的 RPMI1640培养液培养舌鳞癌细胞Tca8113;黄芩苷组根据预实验结果，把黄芩苷浓度分为 36. 48ng/ml、364. 8ng/ml及 3648ng/ml四组，分别处理舌鳞癌Tca8113 细胞。
[0082] 3,采用ALDEFLU0R分析不同浓度黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48h后醛脱氢 酶活性。
[0083] 4,采用MTT(DMSO)法检测不同浓度野黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞24h、48h 后细胞增殖抑制情况。
[0084]数据统计分析：结果采用均数土标准差表示（见表1)，应用SPSS17. 0统计学软 件，对结果进行重复测量方差分析，P< 〇. 05表示差异有统计学意义。
[0085] 结果：
[0086] 1，四组高醛脱氢酶活性细胞分别为I.3%、1. 0%、0. 6%、0.2%。随着黄芩苷有效 浓度的增加，高醛脱氢酶活性舌鳞癌干细胞的比率降低，即黄芩苷对舌鳞癌干细胞的抑制 效能逐渐增大（如图6所示）。
[0087]2,不同浓度黄芩苷作用舌鳞癌细胞后MTT检测结果：显示DMSO溶剂对照组的抑制 率为0%，说明DMSO溶剂对细胞没有影响；舌鳞癌细胞在黄芩苷作用相同的时间内，随着黄 芩苷浓度的增加，细胞抑制率逐渐升高，表现出明显的剂量依赖性（P〈〇. 05);同一浓度的 黄芩苷作用的时间越长，细胞的抑制率越高，表现出时间依赖性（P〈〇. 05)。
[0088] 表1不同浓度黄芩苷作用舌鳞癌细胞后MTT检测结果
[0089]
[0090] 结论4,不同浓度黄芩苷对高醛脱氢酶活性细胞均有不同程度的增殖抑制作用。
[0091] 实施例5 :黄芩苷通过NF-KB信号通路下调醛脱氢酶活性达到抑制人舌鳞癌干细 胞的目的药效学研宄
[0092] 材料与方法：
[0093] 1，TCA8113细胞系购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。体外培养用于 实验。
[0094] 2,实验分组：分为对照组、黄芩苷药物组。对照组用DMSO溶剂的RPMI1640培养液 培养舌鳞癌细胞Tca8113 ;黄芩苷组根据实验结果，采用364. 8ng/ml浓度黄芩苷处理舌鳞 癌Tca8113细胞48h后取样。
[0095] 3,SSH文库的构建及鉴定分别提取高表达ALDH、低表达ALDH细胞的总RNA，按 PCR-SelectTMcDNASubtractionkit推荐的程序依次进行。在测序所得基因序列中查找PCR 引物以去除载体序列，利用NCBI的Blast2. 2. 25进行核苷酸序列相似性分析，对相似度较 高的基因采用GeneSetAnalysisToolkitV2在线分析系统进行基因本体论（geneontology， GO)功能注释与分类和信号通路分析。
[0096] 4,WesternBlot分别检测对照组、黄芩苷药物组NF- KB蛋白表达情况，采用 |3 -action作为对照。
[0097] 结果：
[0098] 1，从高醛脱氢酶活性鳞癌细胞及黄芩苷处理后低醛脱氢酶活性细胞分别提取总 RNA经琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。
[0099] 2,经Blast比对分析，筛选出52个与差异片段同源性较高的已知基因，其中正向 文库即ALDH高表达基因28条，反向文库即ALDH低表达基因24条（表2, 3)。
[0100] 表2在ALDH亚群细胞高表达的部分基因
[0101]
[0104] 3,WesternBlot分别检测对照组、黄苳苷药物组NF-KB蛋白表达情况，0-action 为对照，可见黄芩苷药物组NF-KB蛋白表达显著低于对照组NF-KB蛋白表达（图8)。
[0105] 结论5,结合图7、8及本实施例的表2、3可知，黄芩苷通过NF-KB信号通路抑制人 舌鳞癌干细胞的生物学活性。结合以上实验数据得出：黄芩苷通过NF-kB信号通路下调醛 脱氢酶活性剂抑制人舌鳞癌干细胞特性。
[0106] 全文总结：黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊具有良好的溶解度与生物学活性，黄芩苷通 过NF-KB信号通路下调醛脱氢酶活性抑制人舌鳞癌干细胞及人舌鳞癌动物体内成瘤的生 长、增殖及侵袭特性。
[0107] 对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变 形和改进，如胶囊可选用硬胶囊、软胶囊或缓控释胶囊，这些也应该视为本发明的保护范 围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
【主权项】
1. 一种黄芩苷-PVP共沉淀物，其特征在于：是以含有黄芩苷、聚乙烯基吡咯烷酮的混 合溶液为原料，经过加热，去除混合溶液中的溶剂后所得到的沉淀物；其中混合溶液中的溶 剂为有机溶剂，黄芩苷与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1 :3。2. 权利要求1所述的黄芩苷-PVP共沉淀物的制剂，其特征在于：所述黄芩苷-PVP共 沉淀物灌封于胶囊中，形成胶囊剂型。3. 权利要求1所述的黄芩苷-PVP共沉淀物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 步骤1)取一定量的黄芩苷溶解于有机溶剂中形成溶液，以水浴超声处理该溶液，并向 溶液中加入聚乙烯基吡咯烷酮，其中黄芩苷与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1 :3 ; 步骤2)聚乙烯基吡咯烷酮添加完毕后，将步骤1)所得到的溶液转移到室温环境下进 行充分混合，形成混合溶液；加热混合溶液，使混合溶液内的有机溶剂挥发，这样便有共沉 淀物析出，该共沉淀物即是所要制备的黄芩苷_PVP共沉淀物。4. 如权利要求3所述的黄芩苷-PVP共沉淀物的制备方法，其特征在于：还包括步骤3) 对所得的黄芩苷-PVP共沉淀物进行研磨，并采用筛网进行筛选，将能通过筛网的粉末颗粒 装入空胶囊壳中存放备用。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂是指无水乙醇，所述加热混合 溶液，是将混合溶液放入温度为65 °C，气压90kPa的环境下使混合溶液升温。6. 权利要求1所述的黄芩苷-PVP共沉淀物，其用于制备舌鳞癌症干细胞抑制药的用 途。
【专利摘要】本发明公开了一种组合药物，特别涉及一种黄芩苷-PVP共沉淀物及其制剂、制备方法与用途。黄芩苷-PVP共沉淀物，是以含有黄芩苷、聚乙烯基吡咯烷酮的混合溶液为原料，经过加热，去除混合溶液中的溶剂后所得到的沉淀物；依照本发明中的黄芩苷-PVP共沉淀物具有用于制备舌鳞癌症干细胞抑制药的用途。与同等有效含量的现有黄芩苷药物相比，本发明中的黄芩苷-PVP共沉淀物的溶解度及药物活性更强。
【IPC分类】A61K9/48, A61K47/32, A61P35/00, A61K31/7048
【公开号】CN104906070
【申请号】CN201510312210
【发明人】季平, 张富贵, 李勇, 邱丽华
【申请人】重庆医科大学附属口腔医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月9日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种组合药物，具体涉及黄芩苷-PVP共沉淀物、制剂及其制备方法和 用途。
【背景技术】
[0002] 黄零（RadixScutellariae)为唇形科植物黄零 (ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根。味苦，性寒。归肺、胆、脾、大肠、小肠经。具 有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎功效，现代医学用于呼吸道感染，急性胆道感染，泌尿系 统感染，急性细菌性痢疾，病毒性肝炎，猩红热，流脑，高血压等症的治疗。其主要有效成分 为黄酮类化合物，如黄芩苷元、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷、黄芩新素及二氢黄酮苷等。
[0003] 黄芩苷（Baicalin)是从黄芩中分离提纯的天然产物，为一种单体化合物，是黄芩 的有效成分之一。黄芩苷具有多种药理活性：
[0004] 1.黄芩苷具有阻滞钙离子通道的作用。
[0005] 2.黄芩苷对超氧自由基具有明显的清除作用，可有效对抗脂质过氧化损伤。
[0006] 3.黄芩苷对各种实验性肝损伤都有一定的保护作用。
[0007] 4.黄芩苷具有免疫调节作用，可以增加机体的免疫力。
[0008] 5.黄芩苷有抑制醛糖还原酶的作用，可用于糖尿病慢性并发症的治疗。
[0009] 6.黄芩苷具有抗HIV-I的活性，是一种有效的预防和治疗HIV感染的药物。
[0010]7.黄芩苷具有心脑血管的保护作用：黄芩苷有扩张血管及降压作用，抗心律失 常，抑制血管平滑肌细胞增殖，保护心肌缺血再灌注损伤，调节血脂，抗动脉粥样硬化，保护 脑组织损伤。
[0011] 但目前尚未见有黄芩苷在抑制舌鳞癌干细胞生长方面的报道。
[0012] 名词解释：癌症干细胞（CancerStemCel1，CSC)，又称癌干细胞、肿瘤干细胞，是指 具有干细胞（StemCell)性质的癌细胞，也就是具有"自我复制"（Self-Renewal)以及"具 有多细胞分化" (Differentiation)等能力。通常这类的细胞被认为有形成肿瘤，发展成癌 症的潜力。肿瘤干细胞自我更新的特性是造成肿瘤复发的主要原因。
[0013] PVP，即聚乙烯基吡咯烷酮。
【发明内容】
[0014] 本发明首先所要解决的技术问题是提供一种以黄芩苷为主要成分，抑制舌鳞癌症 干细胞生长的药物及其制备方法。
[0015] 为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
[0016] 一种黄芩苷-PVP共沉淀物，是以含有黄芩苷、聚乙烯基吡咯烷酮的混合溶液为原 料，经过加热，去除混合溶液中的溶剂后所得到的沉淀物；其中混合溶液中的溶剂为有机溶 剂，黄芩苷与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1 :3。
[0017] 制备黄芩苷-PVP共沉淀物的方法，包括如下步骤：
[0018] 步骤1)取一定量的黄芩苷溶解于有机溶剂中形成溶液，以水浴超声处理该溶液， 并向溶液中加入聚乙烯基吡咯烷酮，其中黄芩苷与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1 :3 ;
[0019] 步骤2)聚乙烯基吡咯烷酮添加完毕后，将步骤1)所得到的溶液转移到室温环境 下进行充分混合，形成混合溶液；加热混合溶液，使混合溶液内的有机溶剂挥发，这样便有 共沉淀物析出，该共沉淀物即是所要制备的黄芩苷_PVP共沉淀物。
[0020] 经实验验证，采用本发明的技术方案制备的黄芩苷-聚乙烯基吡咯烷酮（PVP)共 沉淀物，可以抑制舌鳞癌症干细胞的生长，逆转肿瘤干细胞高醛脱氢酶活性，降低癌细胞恶 性程度（即高恶性肿瘤转为低恶性肿瘤）。比起现有的单纯以黄芩苷为有效成分的药物， 本发明制备的黄芩苷-PVP共沉淀物更易于溶解，溶解度更高；而且在黄芩苷相对使用量 (质量）同等的情况下，比起现有的单纯以黄芩苷为有效成分的药物，服用本发明制备的黄 芩苷-PVP共沉淀物，服用者的血药浓度（单位体积血液中黄芩苷的含量）要更高，即证明 本发明制备的黄芩苷-PVP共沉淀物具有较强的生物活性。
[0021] 进一步，还包括步骤3)对所得的黄芩苷-PVP共沉淀物进行研磨，并采用筛网进行 筛选，将能通过筛网的粉末颗粒装入空胶囊壳中存放备用。
[0022] 进一步，所述有机溶剂是指无水乙醇，所述加热混合溶液，是将混合溶液放入温度 为65°C，气压90kPa的环境下使混合溶液升温。
[0023] 升温同时降压，是使混合溶液升温，溶剂快速挥发的技术手段，有助于提高制备效 率。
[0024] 本发明还提供了黄芩苷-PVP共沉淀物的制剂，所述黄芩苷-PVP共沉淀物灌封于 胶囊中，形成胶囊剂型。
[0025] 通过胶囊进行药物存放，保质期长，而且便于病人定量口服。
[0026] 本发明另一个要解决的技术问题是提供一种用途，即黄芩苷-PVP共沉淀物用于 制备舌鳞癌症干细胞抑制药的用途。
[0027] 药效机理：
[0028] 通过细胞实验与动物实验发现，增加黄芩苷的有效注入量，会直接影响NF-KB信 号通路，使得舌鳞癌干细胞的醛脱氢酶的表达减少，干细胞生长增殖活性受到抑制，最终导 致舌鳞癌的增殖与侵袭能力得到有效抑制。
【附图说明】
[0029] 图1是采用UV-3105分光光度仪，本发明中黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊与活性制药 成分胶囊在4组溶液的溶解度检测图表；A :0.Imol/lHCl溶液；B:pH4. 5的磷酸缓冲液；C: pH6. 8的磷酸缓冲液；D :蒸馏水。
[0030] 图2中口腔给予0. 25g黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊与活性制药成分胶囊后不同时 间的血药浓度曲线图。
[0031] 图3为流式细胞术检测舌鳞癌Tca8113细胞系中ALDH+细胞的情况。
[0032] A:ALDH抑制剂DEAB建立的基线荧光；B:无DEAB情况下Tca8113细胞系中ALDH+ 细胞。
[0033] 图4为ALDH+细胞与ALDH-细胞的体外增殖对照表。
[0034] 图5为使用Zeiss倒置显微镜检测的Tca8113细胞形成肿瘤球的检测图。
[0035] A、B、C为ALDH+Tca8113 细胞，D、E、F为ALDH-Tca8113 细胞。
[0036] 图6为采用Aldefluor分析不同浓度黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48h后 醛脱氢酶活性检测图。从左到右依次是：DMSO溶剂对照组、36. 48ng/ml、364. 8ng/ml及 3648ng/ml黄芩苷组。
[0037] 图7为高醛脱氢酶活性鳞癌细胞及黄芩苷处理后低醛脱氢酶活性细胞分别提取 总RNA经琼脂糖凝胶电泳结果。A与B分别为高醛脱氢酶活性鳞癌细胞与黄芩苷处理后细 胞。
[0038] 图8为采用WesternBlot检测的NF-KB蛋白表达情况对照图（图8右侧的数字 表示实验材料用量水平）。
[0039] 图9为人舌鳞癌裸鼠体内成瘤的宏观观察与解剖后观察。A:0. 25g黄芩苷-PVP共 沉淀物胶囊组，B: "参阳"方72. 8mg+生理盐水至0. 25g组，与C:0. 25g生理盐水对照组。
[0040] 图10为人舌鳞癌裸鼠体内成瘤的HE染色检测肿瘤外Imm处鳞癌细胞浸润情况。 A:0. 25g黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊组，B: "参阳"方72. 8mg+生理盐水至0? 25g组，C:0. 25g 生理盐水对照组。
[0041] Coprecipitatecapsule共沉淀胶囊，APIcapsule活性制药成分胶囊。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明：
[0043] 本发明通过实施例研宄表明，黄芩苷-PVP共沉淀物可以抑制与高醛脱氢酶活性 呈正相关的舌鳞癌干细胞的生长。
[0044] 实施例1:黄芩苷-PVP共沉淀物的制备及生物学活性检测。
[0045] 材料与方法：
[0046] 1，采用溶剂法制备黄芩苷-聚乙烯基吡咯烷酮共沉淀物。
[0047] 7g黄芩苷溶解在1050毫升无水乙醇，72 ±2°C水浴超声处理，加入2Ig聚乙烯基吡 咯烷酮，黄芩苷质量：聚乙烯基吡咯烷酮质量=1 :3。将得到的溶液转移到一个圆底烧瓶， 室温下轻轻晃动混合30分钟。在65°C，90kPa下使无水乙醇完全挥发，圆底烧瓶内形成共 沉淀物。共沉淀物在真空干燥器至少干燥24h。研钵内研磨，经80目筛网筛选，能通过80 目筛网的即所述黄芩苷-PVP共沉淀物。
[0048] 2,取0. 500±0. 025g黄芩苷-PVP共沉淀物转入0号空胶囊壳内，即制备含有 0.125g黄芩苷的黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊。
[0049] 对照试剂：黄芩苷-活性制药成分（API)胶囊包含0. 250±0. 012gAPI(于武汉能 仁医药有限公司购买得到的纯度为99%的胶囊成品）。本发明的黄芩苷-PVP共沉淀物胶 囊中黄芩苷重量是市面上胶囊内黄芩苷重量的一半。
[0050] 3,把黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊溶解于甲醇溶剂，黄芩苷药物纯度在278nm的分 光光度法测定。测定结果：黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊中黄芩苷药物纯度为98. 8±0. 5%。
[0051]4,UV-3105分光光度仪检测黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊与活性制药成分胶囊在4 组溶液的溶解度情况。A:0.lmol/LHCl溶液；B:pH4.5的磷酸缓冲液；C:pH6.8的磷酸缓冲 液；D:蒸馏水。如图1所示，黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊在不同溶液的溶解度均较活性制药 成分胶囊（即现有的黄芩苷药物）溶解度有显著地提高与改善。
[0052] 5,高效液相色谱仪检测给予6只比格犬随机分为2组口服0. 25g黄芩苷-PVP共 沉淀物胶囊与活性制药成分胶囊；检测不同时间的血药浓度。相隔2周的间隔期后，动物分 组调换分别接受0. 25g活性制药成分胶囊与黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊处理；并检测不同时 间的血药浓度。如图2所示黄芩苷-PVP共沉淀物在黄芩苷使用量仅为现有的黄芩苷药物 一半的情况，依然具有较强的生物学活性。
[0053] 结论1，黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊较活性制药成分胶囊具有更好的溶解度与生物 学活性。
[0054] 实施例2 :黄芩苷抑制人舌鳞癌的动物实验研宄
[0055] 材料与方法：
[0056] 1，（N0D/SCID)裸鼠购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。4周龄，雌 性，18只，体重约17_20g。SPF以上级环境培养。
[0057] 2,TCA8113细胞系购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。体外培养 IXlO6细胞/ml，接种Iml于裸鼠的右侧背部皮下。每3天观察一次。
[0058] 3,实验分组：分为0? 25g生理盐水对照组、"参阳"方72. 8mg+生理盐水至0? 25g 组，与0. 25g黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊组（n= 6)。接种后第8 天开始分别口服上述三种 处理试剂，每天一次，至接种后第35天。
[0059] 4,动物处死及标本收集：接种术后第35d，用颈椎脱臼法处死动物。用眼科剪刀、 镊子等手术器械将肿瘤剥出，游标卡尺测量其直径及电子天平称肿瘤重量，并取部分肿瘤 组织，置10%的甲醛固定液固定，送检。肿瘤组织固定后，石蜡包埋，作常规病理切片，HE 染色，对肿瘤组织外Imm处采集图像分析鳞癌浸润情况。
[0060] 数据统计分析：结果采用均数土标准差表示，应用SPSS17. 0统计学软件，对结果 进行单因素方差分析，P< 〇. 05表示差异有统计学意义。
[0061] 结果：
[0062] 1，解剖学观察，肉眼见肿瘤位于皮下，表面凹凸不平，可呈结节状，实性，肿瘤生 长靠近表皮，可有出血灶，其面积随时间增长而增大；解剖后可见肿瘤多呈结节状，实质， 表面有出血灶（图9)。生长潜伏期约3-6d，9-21d生长迅速。
[0063] 2,实验对照组、"参阳"方组，与黄芩苷组三组移植瘤平均瘤重分别为： 3. 1356±0. 5972, 3. 4071±0. 7123,与4. 8529±0. 4042)。两实验组较对照组具有显著性差 异（P< 0. 05)，而两实验组之间没有显著性差异（P> 0. 05,），但是黄芩苷组在瘤重方面稍 低于"参阳"方组。
[0064] 3,肿瘤组织HE染色后，肿瘤组织外Imm处图像显示：对照组有大量肿瘤细胞浸 润，并形成癌细胞巢；"参阳"方组与黄芩苷组未见明显的癌细胞巢，且仅有少量癌细胞浸润 (图 10)。
[0065] 结论2 :黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊能够显著抑制人舌鳞癌细胞动物体内生长，以 及对其浸润能力仍有一定的抑制能力；与"参阳"方向比较亦稍具优势。
[0066] 实施例3 :醛脱氢酶活性与舌鳞癌干细胞之关系。
[0067] 材料与方法：
[0068] 1，TCA8113细胞系购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。体外培养用于 实验。
[0069] 2,采用DEAB抑制醛脱氢酶活性的AldefIuor(干细胞鉴定试剂盒）分析，流式细 胞仪检测醛脱氢酶（ALDH)阳性TCA8113细胞系。
[0070] 3,流式细胞仪筛选的ALDH+，ALDH-，及未经筛选的TCA8113细胞1，000细胞/ml的 密度接种于96孔板，培养1，3,5,7天后采用CellCountingkit-8(Dojindo)进行统计，结果 以均数土标准差表示。
[0071] 4,ALDH+与ALDH-细胞以20, 000细胞/ml的密度培养于无血清6孔板中。Zeiss 倒置显微镜检测肿瘤球形成情况。
[0072] 数据统计分析：应用SPSS17. 0统计学软件，对结果进行单因素方差分析，P< 0. 05 表示差异有统计学意义。
[0073] 结果：
[0074] 1，如图3所示，采用Aldefluor分析检测舌鳞癌Tca8113细胞系中ALDH+细胞： ALDH+Tca8113细胞数量较少。
[0075] 2,如图4所示，ALDH+细胞的体外增殖速率远大于ALDH-细胞，并具有统计学意义 (n= 3,P〈0. 01).
[0076] 3,如图5所示，A和D:单一ALDH+与ALDH-Tca8113细胞在无血清培养基中培养。 B和C:ALDH+Tca8113细胞在第5天及第10天均形成肿瘤球。E和F:ALDH-Tca8113细胞在 第5天及第10天均未形成肿瘤球。
[0077] 结论3,高醛脱氢酶活性是舌鳞癌干细胞的筛选与鉴定标志，提高醛脱氢酶活性 有助于促进舌鳞癌干细胞生长，低醛脱氢酶活性将抑制舌鳞癌干细胞生长。
[0078] 实施例4 :黄芩苷抑制醛脱氢酶的研宄 [0079]材料与方法：
[0080] 1，TCA8113细胞系购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。体外培养用于 实验。
[0081] 2,实验分组：分为对照组、不同浓度黄芩苷药物组。对照组用含DMSO溶剂的 RPMI1640培养液培养舌鳞癌细胞Tca8113;黄芩苷组根据预实验结果，把黄芩苷浓度分为 36. 48ng/ml、364. 8ng/ml及 3648ng/ml四组，分别处理舌鳞癌Tca8113 细胞。
[0082] 3,采用ALDEFLU0R分析不同浓度黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48h后醛脱氢 酶活性。
[0083] 4,采用MTT(DMSO)法检测不同浓度野黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞24h、48h 后细胞增殖抑制情况。
[0084]数据统计分析：结果采用均数土标准差表示（见表1)，应用SPSS17. 0统计学软 件，对结果进行重复测量方差分析，P< 〇. 05表示差异有统计学意义。
[0085] 结果：
[0086] 1，四组高醛脱氢酶活性细胞分别为I.3%、1. 0%、0. 6%、0.2%。随着黄芩苷有效 浓度的增加，高醛脱氢酶活性舌鳞癌干细胞的比率降低，即黄芩苷对舌鳞癌干细胞的抑制 效能逐渐增大（如图6所示）。
[0087]2,不同浓度黄芩苷作用舌鳞癌细胞后MTT检测结果：显示DMSO溶剂对照组的抑制 率为0%，说明DMSO溶剂对细胞没有影响；舌鳞癌细胞在黄芩苷作用相同的时间内，随着黄 芩苷浓度的增加，细胞抑制率逐渐升高，表现出明显的剂量依赖性（P〈〇. 05);同一浓度的 黄芩苷作用的时间越长，细胞的抑制率越高，表现出时间依赖性（P〈〇. 05)。
[0088] 表1不同浓度黄芩苷作用舌鳞癌细胞后MTT检测结果
[0089]
[0090] 结论4,不同浓度黄芩苷对高醛脱氢酶活性细胞均有不同程度的增殖抑制作用。
[0091] 实施例5 :黄芩苷通过NF-KB信号通路下调醛脱氢酶活性达到抑制人舌鳞癌干细 胞的目的药效学研宄
[0092] 材料与方法：
[0093] 1，TCA8113细胞系购买于重庆医科大学生命科学研宄中心实验室。体外培养用于 实验。
[0094] 2,实验分组：分为对照组、黄芩苷药物组。对照组用DMSO溶剂的RPMI1640培养液 培养舌鳞癌细胞Tca8113 ;黄芩苷组根据实验结果，采用364. 8ng/ml浓度黄芩苷处理舌鳞 癌Tca8113细胞48h后取样。
[0095] 3,SSH文库的构建及鉴定分别提取高表达ALDH、低表达ALDH细胞的总RNA，按 PCR-SelectTMcDNASubtractionkit推荐的程序依次进行。在测序所得基因序列中查找PCR 引物以去除载体序列，利用NCBI的Blast2. 2. 25进行核苷酸序列相似性分析，对相似度较 高的基因采用GeneSetAnalysisToolkitV2在线分析系统进行基因本体论（geneontology， GO)功能注释与分类和信号通路分析。
[0096] 4,WesternBlot分别检测对照组、黄芩苷药物组NF- KB蛋白表达情况，采用 |3 -action作为对照。
[0097] 结果：
[0098] 1，从高醛脱氢酶活性鳞癌细胞及黄芩苷处理后低醛脱氢酶活性细胞分别提取总 RNA经琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。
[0099] 2,经Blast比对分析，筛选出52个与差异片段同源性较高的已知基因，其中正向 文库即ALDH高表达基因28条，反向文库即ALDH低表达基因24条（表2, 3)。
[0100] 表2在ALDH亚群细胞高表达的部分基因
[0101]
[0104] 3,WesternBlot分别检测对照组、黄苳苷药物组NF-KB蛋白表达情况，0-action 为对照，可见黄芩苷药物组NF-KB蛋白表达显著低于对照组NF-KB蛋白表达（图8)。
[0105] 结论5,结合图7、8及本实施例的表2、3可知，黄芩苷通过NF-KB信号通路抑制人 舌鳞癌干细胞的生物学活性。结合以上实验数据得出：黄芩苷通过NF-kB信号通路下调醛 脱氢酶活性剂抑制人舌鳞癌干细胞特性。
[0106] 全文总结：黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊具有良好的溶解度与生物学活性，黄芩苷通 过NF-KB信号通路下调醛脱氢酶活性抑制人舌鳞癌干细胞及人舌鳞癌动物体内成瘤的生 长、增殖及侵袭特性。
[0107] 对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变 形和改进，如胶囊可选用硬胶囊、软胶囊或缓控释胶囊，这些也应该视为本发明的保护范 围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
【主权项】
1. 一种黄芩苷-PVP共沉淀物，其特征在于：是以含有黄芩苷、聚乙烯基吡咯烷酮的混 合溶液为原料，经过加热，去除混合溶液中的溶剂后所得到的沉淀物；其中混合溶液中的溶 剂为有机溶剂，黄芩苷与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1 :3。2. 权利要求1所述的黄芩苷-PVP共沉淀物的制剂，其特征在于：所述黄芩苷-PVP共 沉淀物灌封于胶囊中，形成胶囊剂型。3. 权利要求1所述的黄芩苷-PVP共沉淀物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 步骤1)取一定量的黄芩苷溶解于有机溶剂中形成溶液，以水浴超声处理该溶液，并向 溶液中加入聚乙烯基吡咯烷酮，其中黄芩苷与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1 :3 ; 步骤2)聚乙烯基吡咯烷酮添加完毕后，将步骤1)所得到的溶液转移到室温环境下进 行充分混合，形成混合溶液；加热混合溶液，使混合溶液内的有机溶剂挥发，这样便有共沉 淀物析出，该共沉淀物即是所要制备的黄芩苷_PVP共沉淀物。4. 如权利要求3所述的黄芩苷-PVP共沉淀物的制备方法，其特征在于：还包括步骤3) 对所得的黄芩苷-PVP共沉淀物进行研磨，并采用筛网进行筛选，将能通过筛网的粉末颗粒 装入空胶囊壳中存放备用。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂是指无水乙醇，所述加热混合 溶液，是将混合溶液放入温度为65 °C，气压90kPa的环境下使混合溶液升温。6. 权利要求1所述的黄芩苷-PVP共沉淀物，其用于制备舌鳞癌症干细胞抑制药的用 途。
【专利摘要】本发明公开了一种组合药物，特别涉及一种黄芩苷-PVP共沉淀物及其制剂、制备方法与用途。黄芩苷-PVP共沉淀物，是以含有黄芩苷、聚乙烯基吡咯烷酮的混合溶液为原料，经过加热，去除混合溶液中的溶剂后所得到的沉淀物；依照本发明中的黄芩苷-PVP共沉淀物具有用于制备舌鳞癌症干细胞抑制药的用途。与同等有效含量的现有黄芩苷药物相比，本发明中的黄芩苷-PVP共沉淀物的溶解度及药物活性更强。
【IPC分类】A61K9/48, A61K47/32, A61P35/00, A61K31/7048
【公开号】CN104906070
【申请号】CN201510312210
【发明人】季平, 张富贵, 李勇, 邱丽华
【申请人】重庆医科大学附属口腔医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月9日
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