共递送纳米载体及其制备方法
共递送纳米载体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种共递送药物和基因的纳米载体，具体涉及一种同时荷载基因和治 疗药物的靶向递药系统，本发明递药系统能够靶向靶细胞，并递送基因和药物到达胞内作 用位点，达到协同治疗的目的，属于药物制剂技术领域。
【背景技术】
[0002] 将药物与基因通过高分子纳米载体共同包载，共同递送到靶细胞，一方面缓慢释 放药物，另一方面表达治疗基因，达到互相促进的作用，可实现药物治疗与基因治疗的协同 作用，从而增加疗效，是治疗肿瘤等恶性疾病理想方法。
[0003] 小分子多胺是基因传递的优良载体，但是其分子量小，压缩核酸的能力有限，因此 有必要将其合成聚合物。精胺（spermine，SPE)是多胺小分子的典型代表。它存在于所有 的真核细胞内，在细胞内代谢中发挥一定的作用，是很好的生物相容性的材料。而且SPE 具有四个胺基，分别是两个仲胺和两个伯胺。这些胺基可以与丙烯酸酯基通过迈克尔加 成反应生成具有高缓冲能力的聚精胺（polyspermine，pSPE)。另外，聚乳酸-羟基乙酸共 聚物（PLGA)，是可生物降解的一类聚合物，具有良好的生物相容性，作为药用辅料已获得 美国FDA批准。通过对该聚合物末端的羧基进行改性，嫁接聚精胺，制备成两亲性聚合物 pSPE-PLGA，其中pSPE含有大量的仲氨基，荷正电，能很好的载带负电荷的基因，内核PLGA 作为疏水性材料能很好的装载难溶性药物，且具有缓释、粒径大小可控等优点。聚精胺PSPE 在体内亦可生物降解，该代谢产物是体内大量存在的内源性物质。因此，pSPE-PLGA具有很 好的生物相容性，是一种无毒、可实现基因和药物共传递的理想载体。在PSPE-PLGA嫁接带 靶头的PEG，在隐形材料PEG和靶头共同作用下可以实现更好的靶向药物传递。
【发明内容】
[0004] 目的：本发明提供一种共递送药物和基因的纳米载体，该递药系统是可用于协同 治疗恶性肿瘤或其他恶性疾病如肝纤维化、肝硬化等的治疗药物和基因共递送纳米给药系 统，涉及一种自组装形成共载药物和基因的纳米共递送系统，本发明的自组装纳米递送系 统能够将药物和基因同时递送到靶细胞内，在靶细胞胞质释放基因及药物。
[0005] 技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0006] 一种共递送纳米载体，由载治疗药物的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand自组 装而成的纳米粒与治疗基因形成复合物，形成共递送药物与基因纳米载体；
[0007] PLGA-pSPE-PEG-Ligand为一种非病毒两亲性的阳离子聚合物，由两亲性 PLGA-pSPE与一端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段组成的聚阳离子 载体，聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的化学结构式如下：
[0008]
[0009]其中，PLGA分子量为2-100k;pSPE分子量为2-100k;PEG分子量为I-IOk;Ligand 为靶头，选自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、维生素A(Va)、叶酸（FA)、透明质酸（HA)。
[0010] Ligand为革E头，聚乙二醇PEG，pSPE为polyspermine聚精胺，聚乳酸-羟基乙酸 共聚物（PLGA)。
[0011] 所述的共递送纳米载体，制备方法包括以下步骤：应用反相溶剂法，将治疗药 物与PLGA-pSPE-PEG-Ligand共溶于溶剂中，逐滴滴加到一定体积去离子水中，用截留 分子量500-14000的透析带在4 °C下透析2d除去溶剂，得包封治疗药物的聚合物载体 PLGA-pSPE-PEG-Ligand自组装而成的纳米粒；然后将治疗基因溶液在涡旋下加入到等体 积的载有治疗药物的PLGA-pSPE-PEG-Ligand纳米胶体溶液中，涡旋30s，室温静置30min， 即得。可适用于静脉注射给药、皮下给药、粘膜给药等。
[0012] 所述溶剂为有机溶剂，选自无水DMSO(二甲基亚砜）、甲醇、乙醇中的一种或几种； 和/或，所述治疗药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱、水飞蓟宾。
[0013] 所述治疗基因为DNA或siRNA;其中，DNA为p53、HGF、Akt、PDCD;siRNASsiBcl-2、 siAkt、siTGF-0 1、siHSP47、siTMP-l。
[0014] 作为优选方案，所述的共递送纳米载体，其特征在于：若用于治疗肝纤维化，所述 DNA为HGF，siRNA为siTGF-0 1、siHSP47、siHMP-1;所述治疗药物为水飞蓟宾；所述靶头 为甘露糖-6-磷酸（M6P)、维生素A(Va)。若用于治疗肝癌，所述DNA为p53、Akt、H)CD，siRNA 为siBcl-2;所述治疗药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱等。所述靶头为半乳糖（Gal)、透明质 酸（HA)等。
[0015]本发明提供一种聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，PLGA-pSPE-PEG-Ligand为 一种非病毒两亲性的阳离子聚合物，由两亲性PLGA-pSPE与一端羧基一端靶头的聚乙二醇 PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段组成的聚阳离子载体，聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的 化学结构式如下：
[0016]
[0017] 其中，PLGA分子量为2-100k;pSPE分子量为2 -100k;PEG分子量为I-IOk; Ligand为祀头，选自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、维生素A(Va)、叶酸（FA)、透明质 酸（HA)〇
[0018] 所述的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，由精胺（spermine)与聚乙二醇 二丙烯酸酯（PEGDA)通过迈克尔加成反应合成两端精胺的聚精胺pSPE，pSPE与聚（乳 酸-乙醇酸）共聚物PLGA通过氨基与羧基的缩合反应生成PLGA-pSPE，PLGA-pSPE与一 端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)通过氨基与羧基的缩合反应生成 PLGA-pSPE-PEG-Ligand;聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的合成方法如下：
[0019]
[0020] 其中，n、x、y、z为正整数。
[0021] 聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，其制备方法具体包括以下步骤：
[0022] DpSPE的合成：以聚乙二醇二丙稀酸醋（PEGDA)和多胺分子spermine为结构单 元，交替连接成聚合物PSPE，将精胺（SPE)溶解于重量体积比10-20倍量的溶剂中，聚乙二 醇二丙烯酸酯（PEGDA)溶解于重量体积比10-20倍量的溶剂中，SPE与PEGDA的摩尔比例 为I:1-1. 5 :1，然后将I3EGDA溶液慢慢滴加到SPE溶液中，然后在4-100°C下搅拌12-48h; 所得产物溶解于4°C的去离子水中，然后用截留分子量2000-14000的透析带在4°C下透析 2d;最后将产物冻干，即得pSPE，保存在-20°C下备用；
[0023] 2)PLGA-pSPE合成：取适量PLGA溶于溶剂，加入DCC和NHS，室温下搅拌反应 0. 5-24h，离心除去沉淀，上清液与含pSPE的无水DMSO溶液混合，pSPE与PLGA的摩尔比例 为I:1-1.5 :1，室温下搅拌反应12-48h用分子量截留值2000-14000的透析袋在4°C下透 析，得PLGA-pSPE;
[0024] 3)PLGA-pSPE-PEG-Ligand合成：取适量HOOC-PEG-Ligand，溶剂溶解，加入DCC(二 环己基碳二亚胺）和NHS，室温下搅拌反应0. 5-24h，离心除去沉淀，上清液与含PLGA-pSPE 的无水DMSO溶液混合，室温下搅拌反应12-48h，用分子量截留值2000-14000的透析袋在 4°C下透析，得PLGA-pSPE-PEG-Ligand。所述溶剂为有机溶剂，选自无水DMS0、甲醇、乙醇中 的一种或几种。
[0025] 一种上述的HOOC-PEG-Ligand，其结构式如下：
[0026]
[0027]其中，PEG分子量为Ik-IOk;连接键为酯键或酰胺键。
[0028] 所述的HOOC-PEG-Ligand，当Ligand为甘露糖-6-磷酸（M6P)，即HOOC-PEG-M6P， 合成路线如下
[0029]
[0030] 所述H00C-PEG-M6P的制备方法具体包括以下步骤：取适量H00C-PEG-C00H，先 用无水DMSO溶解，然后加入DCC和NHS，室温下搅拌反 应6-24h，离心除去沉淀，上清液与 含M6P靶头Ligand的无水DMSO溶液混合，H00C-PEG-C00H与靶头的摩尔比例为I:1-1: 1. 5,室温下搅拌反应12-48h，用分子量截留值2000 - 5000的透析袋在4°C下透析，得 PLGA-pSPE-PEG;所述溶剂为有机溶剂，选自无水DMSO二甲基亚砜、甲醇、乙醇中的一种或 几种。
[0031] 有益效果：本发明制备的基于两亲性聚合物pSPE-PLGA，其中pSPE含有大量的仲 氨基，荷正电，能很好的载带负电荷的基因，内核PLGA作为疏水性材料能很好的装载难溶 性药物，且具有缓释、粒径大小可控等优点。聚精胺在体内可生物降解，该代谢产物是体内 大量存在的内源性物质；聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)，是可生物降解的一类聚合物，具 有良好的生物相容性，作为药用辅料已获得美国FDA批准。因此，pSPE-PLGA具有很好的生 物相容性，是一种无毒、可实现基因和药物共传递的理想载体。在PSPE-PLGA嫁接带靶头的 PEG，在隐形材料PEG和靶头共同作用下可以实现更好的靶向药物传递。并且具有很低的细 胞毒性和显著地转染效率，在基因与药物共递送领域具有广阔的应用前景
【附图说明】
[0032] 图 1 是本发明按照实施例 2、4、6 制备的pSPE、PLGA-pSPE、PLGA-pSPE-PEG-Ligand 聚合物的表征：⑷氢谱图，S=1.4-1.6ppm(-CH2-，SPE)，S=3.8ppm(-CH2-，PEGDA); 8 =I. 5(-CH3-,PLGA), 8 = 4. 9 (-CH-,PLGA), 8 = 5. 2 (-CH2-,PLGA) ； 8 = 3. 5(-CH2-, PEG)⑶红外光谱图，3500~3300cm-1为仲胺（-NH-)伸缩振动（pSPE) :1750011-1左右为羧 基（-C00H)中羰基（C= 0)伸缩振动（PLGA) ;3500~3300CHT1为仲胺（-NH-)伸缩振动， 1750CHT1左右为酰胺键（-C0NH-)中C= 0伸缩振动（PLGA-pSPE) ;3500~3300CHT1为仲胺 (-NH-)伸缩振动，1750CHT1左右为酰胺键（-CONH-)中C=O伸缩振动，1270~lOlOcnT1左 右为醚键中C-O伸缩振动（PLGA-pSPE-PEG-Ligand) (C)GPC分析。
[0033] 图2是本发明按照实施例9制备的PLGA-pSPE-PEG-Ligand/DNA复合物的表征： (A)PLGA-pSPE-PEG-Ligand/DNA以不同质量比制备的复合物凝胶电泳图，（B)DNA的保护和 释放评价。
[0034] 图3是本发明按照实施例10制备的PLGA-pSPE-PEG-Ligand聚合物在不同浓度 不同细胞24h、72h时间点的细胞毒性：(A)L02细胞，（B)SMCC-7721细胞，（C)IfepG2细胞， (mean土SD，n= 3) 〇
[0035] 图4是本发明按照实施例11的体外转染实验。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0037] 本发明是通过以下的技术方案实现的，具体步骤如下：
[0038] 精胺（spermine)与聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA)通过迈克尔加成反应合成两端 精胺的聚精胺pSPE，pSPE与聚（乳酸-乙醇酸）共聚物PLGA通过氨基与羧基的缩合反应 生成PLGA-pSPE，PLGA-pSPE与一端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)通过 氨基与羧基的缩合反应生成PLGA-pSPE-PEG-Ligand。
[0039] 自组装纳米共递送系统均是新鲜制备，制备方案具体如下：
[0040] 采用反相溶剂法，将药物与PLGA-pSPE-PEG-Ligand共溶于二甲基亚砜DMSO中， 逐滴滴加到一定体积去离子水中，用截留分子量500-14000的透析带在4°C下透析2d除去 DMS0,得包封治疗药物的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand纳米粒。
[0041] 将DNA溶液在涡旋下加入到等体积的包封治疗药物的PLGA-pSPE-PEG-Ligand溶 液中，涡旋30s，室温静置30min，即得。
[0042] 上述制备方法所制备的自组装共递送药物和基因的纳米载体，测定其粒径和电 势。
[0043] 上述共递送药物和基因的纳米载体在治疗肝纤维化、肝癌上的应用。
[0044] 实施例1
[0045] pSPE合成方案具体如下：将精胺（SPE)I. 2mmol溶解IOmL的无水甲醇中，聚乙二 醇二丙烯酸酯（PEGDA)Immol溶解IOmL无水甲醇中，然后将PEGDA溶液慢慢滴加到SPE溶 液中，然后在40°C下搅拌36h。所得产物溶解于4°C的去离子水中，然后用截留分子量5000 的透析带在4°C下透析2d。最后将产物冻干，保存在-20°C下，即得pSPE。
[0046] 实施例2
[0047] pSPE聚合物的结构鉴定和分子量表征
[0048] pSPE聚合物通过氢核磁和红外鉴定结构，分子量通过凝胶阻滞色谱检测。
[0049] 实施例3
[0050] PLGA-pSPE合成：取适量PLGA-C00H(分子量 10k)lmmol，用IOmL无水DMSO溶解，加 入DCC和NHS，室温下搅拌反应0. 5-24h，离心除去沉淀，上清液与含I. 2mmolpSPE的IOmL 无水DMSO溶液混合，室温下搅拌反应12h，用分子量截留值10000的透析袋在4°C下透析 2d，得PLGA-pSPE。
[0051] 实施例4
[0052] PLGA-pSPE聚合物的结构鉴定和分子量表征
[0053] PLGA-pSPE聚合物通过氢核磁和红外鉴定结构，分子量通过凝胶阻滞色谱检测。
[0054] 实施例5
[0055] PLGA-pSPE-PEG合成：取适量lmmolHOOC-PEG-Ligand，IOmL无水DMSO溶解，加入 DCC和NHS，室温下搅拌反应12h，离心除去沉淀，上清液与含lmmolPLGA-pSPE的IOmL无 水DMSO溶液混合，室温下搅拌反应24h，用分子量截留值10000的透析袋在4°C下透析得 PLGA-pSPE-PEG。
[0056] 实施例6
[0057] PLGA-pSPE-PEG聚合物的结构鉴定和分子量表征
[0058] PLGA-pSPE-PEG聚合物通过氢核磁和红外鉴定结构，分子量通过凝胶阻滞色谱检 测。
[0059] 实施例7
[0060] PLGA-pSPE-PEG自组装空白纳米粒的制备
[0061] 采用反相溶剂法，将PLGA-pSPE-PEG溶于ImL二甲基亚砜DMSO中，逐滴滴 加到IOmL去离子水中，用截留分子量1000的透析带在4°C下透析24h除去DMS0,得 PLGA-pSPE-PEG纳米粒。
[0062] 实施例8
[0063] PLGA-pSPE-PEG空白纳米粒的表征
[0064] PLGA-pSPE-PEG纳米粒的大小和表面电荷使用动态光散射测定。粒径约70nm， Zeta电势约 +25mV。
[0065] 实施例9
[0066] PLGA-pSPE-PEG自组装空白纳米粒对DNA结合能力考察
[0067] 将DNA溶液在涡旋下加入到等体积的PLGA-pSPE-PEG空白纳米粒溶液中，涡旋 30s，室温静置30min，即得共递送纳米载体
[0068] 纳米粒对DNA压缩和保护能力通过电泳表征。PLGA-pSPE-PEG空白纳米粒和DNA 以不同的质量比结合后，加入上样颜料，最后的体积为IOuL;为了评价聚合物对DNA的保 护能力，DNaseI作为降解酶。加到1%琼脂糖凝胶中，GelRed染色，用TAE缓冲液作为电解 质，50V下跑40min。
[0069] 实施例10
[0070] 细胞毒性
[0071]采用MTS法分析空白纳米粒对L02、SMCC-7721、IfepG2细胞增殖抑制的影响。生 长状态良好的细胞以IXIO4细胞/孔加入96孔板中，过夜培养后，弃去培养基，分别加入 含PLGA-pSPE-PEG空白纳米粒和PEI25k的培养基，每个样品至少3复孔，以正常细胞作为 对照组，只加培养基的细胞为空白组。为使上述各个处理组有可比性，分别培养24h和72h 后，每孔加入20yL的MTS溶液，避光37°C振摇4h，酶标仪490nm检测吸光度值（A) 。
[0072] 实施例11
[0073] 转染
[0074] 在 37°C下，在 5%CO2培养箱（ThermoScientific)的含 10%FBS的DMEM培养基 中维持细胞。对转染实验来说，将L02细胞10XIO4个细胞/孔的量接种在24孔平底板中， 孵育18h后，用空白纳米粒/pGL3复合物在无血清或含10%血清的培养基置换，接着孵育 4h。之后用新鲜的培养基替换，再于37°C下孵育24h。荧光素酶活性测定按照生产厂家的 方法。此六蛋白测试试剂盒用于提取蛋白，其浓度用〇16111；[111111；[1101116七61'(六111：01111]^1：，1^953 ; EG&GBerthold,Germany)测定。
[0075] 实施例12
[0076]DNA为HGF，siRNA为siTGF-0 1、siHSP47、siTMP-l;治疗药物为水飞蓟宾；靶头 为甘露糖-6-磷酸（M6P)、维生素A(Va)，本材料应用于肝纤维化治疗。
[0077] 实施例13
[0078]DNA为p53、Akt、H)CD，siRNA为siBcl-2 ;治疗药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱等； 靶头为半乳糖（Gal)、透明质酸（HA)，本材料应用于肝癌治疗。
[0079] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种共递送纳米载体，由载治疗药物的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand自组装 而成的纳米粒与治疗基因形成复合物，形成共递送药物与基因纳米载体； PLGA-pSPE-PEG-Ligand为一种非病毒两亲性的阳离子聚合物，由两亲性PLGA-pSPE与 一端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段组成的聚阳离子载体，聚合物 载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的化学结构式如下：其中，PLGA分子量为2-100k;pSPE分子量为2 - 100k;PEG分子量为1 - 10k;Ligand为 靶头，选自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、维生素A(Va)、叶酸（FA)、透明质酸（HA)。2. 根据权利要求1所述的共递送纳米载体，制备方法包括以下步骤：应用反相溶剂法， 将治疗药物与PLGA-pSPE-PEG-Ligand共溶于溶剂中，逐滴滴加到一定体积去离子水中，用 截留分子量500-14000的透析带在4°C下透析2d除去溶剂，得包封治疗药物的聚合物载体 PLGA-pSPE-PEG-Ligand自组装而成的纳米粒；然后将治疗基因溶液在涡旋下加入到等体 积的载有治疗药物的PLGA-pSPE-PEG-Ligand纳米胶体溶液中，涡旋30s，室温静置30min， 即得。3. 根据权利要求2所述的共递送纳米载体，其特征在于：所述溶剂为有机溶剂，选自无 水DMS0、甲醇、乙醇中的一种或几种；和/或，所述治疗药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱、水飞 蓟宾。4. 根据权利要求1或2所述的共递送纳米载体，其特征在于：所述治疗基因为DNA或 siRNA;其中，DNA为p53、HGF、Akt、PDCD;siRNA为siBcl-2、siAkt、siTGF-0 1、siHSP47、 siTMP-1。 5?-种聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，其特征在于：PLGA-pSPE-PEG-Ligand为 一种非病毒两亲性的阳离子聚合物，由两亲性PLGA-pSPE与一端羧基一端靶头的聚乙二醇 PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段组成的聚阳离子载体，聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的 化学结构式如下：其中，PLGA分子量为2-100k;pSPE分子量为2 - 100k;PEG分子量为1 - 10k;Ligand为 靶头，选自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、维生素A(Va)、叶酸（FA)、透明质酸（HA)。6.根据权利要求5所述的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，由精胺（spermine)与 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA)通过迈克尔加成反应合成两端精胺的聚精胺pSPE，pSPE与 聚（乳酸-乙醇酸）共聚物PLGA通过氨基与羧基的缩合反应生成PLGA-pSPE，PLGA-pSPE 与一端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)通过氨基与羧基的缩合反应生成 PLGA-pSPE-PEG-Ligand;所述聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的合成方法如下：其中，n、x、y、z为正整数。7.根据权利要求5所述的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，其制备方法具体包括以 下步骤： 1)pSPE的合成：以聚乙二醇二丙稀酸醋（PEGDA)和多胺分子spermine为结构单元，交 替连接成聚合物PSPE，将精胺（SPE)溶解于重量体积比10-20倍量的溶剂中，聚乙二醇二 丙烯酸酯（PEGDA)溶解于重量体积比10-20倍量的溶剂中，SPE与PEGDA的摩尔比例为1 : 1-1. 5 :1，然后将PEGDA溶液慢慢滴加到SPE溶液中，然后在4-100°C下搅拌12-48h;所得产 物溶解于4°C的去离子水中，然后用截留分子量2000-14000的透析带在4°C下透析2d;最 后将产物冻干，即得PSPE，保存在-20°C下备用； 2. PLGA-pSPE合成：取适量PLGA溶于溶剂，加入DCC和NHS，室温下搅拌反应0. 5-24h， 离心除去沉淀，上清液与含pSPE的无水DMSO溶液混合，pSPE与PLGA的摩尔比例为1 : 1-1. 5 :1，室温下搅拌反应12-48h用分子量截留值2000-14000的透析袋在4°C下透析，得 PLGA-pSPE； 3. PLGA-pSPE-PEG-Ligand合成：取适量HOOC-PEG-Ligand，溶剂溶解，加入DCC(二环己 基碳二亚胺）和NHS，室温下搅拌反应0. 5-24h，离心除去沉淀，上清液与含PLGA-pSPE的无 水DMS0溶液混合，室温下搅拌反应12-48h，用分子量截留值2000-14000的透析袋在4°C下 透析，得PLGA-pSPE-PEG-Ligand〇8. 根据权利要求7所述的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，其特征在于：所述溶剂 为有机溶剂，选自无水DMS0、甲醇、乙醇中的一种或几种。9. 一种如权利要求1或5所述的HOOC-PEG-Ligand，其结构式如下：其中，PEG分子量为l-10k;连接键为酯键或酰胺键。10.根据权利要求9所述的HOOC-PEG-Ligand，当Ligand为甘露糖-6-磷酸（M6P)，即H00C-PEG-M6P，合成路线如下具体制备方法步骤如下：取适量H00C-PEG-C00H，先用无水DMS0溶解，然后加入DCC和NHS，室温下搅拌反应6-24h，离心除去沉淀，上清液与含M6P靶头Ligand的无水DMS0溶液 混合，H00C-PEG-C00H与靶头的摩尔比例为1 :1-1 :1. 5,室温下搅拌反应12-48h，用分子量 截留值2000 - 5000的透析袋在4°C下透析，得PLGA-pSPE-PEG;所述溶剂为有机溶剂，选自 无水DMS0、甲醇、乙醇中的一种或几种。
【专利摘要】本发明公开了一种共递送药物和基因的纳米载体及其制备方法；具体涉及一种同时荷载药物和基因药物的共递送纳米载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand。本递药系统由精胺（spermine）与聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）通过迈克尔加成反应合成两端精胺的聚精胺pSPE，pSPE与聚（乳酸-乙醇酸）共聚物PLGA通过氨基与羧基的缩合反应生成两亲性PLGA-pSPE，PLGA-pSPE与一端羧基另一端连接靶头的聚乙二醇PEG（HOOC-PEG-Ligand）通过氨基与羧基的缩合反应生成PLGA-pSPE-PEG-Ligand，自组装形成纳米粒，内核PLGA作为疏水性材料能很好的装载难溶性药物，pSPE含有大量的仲氨基，荷正电，能很好的载带负电荷的基因，嫁接带靶头的隐形材料PEG，在PEG和靶头共同作用下可以实现更好的靶向药物传递，实现将药物和基因递送到同一靶细胞。
【IPC分类】C08G81/00, A61K48/00, A61P35/00, A61K47/34, A61K9/51
【公开号】CN104906075
【申请号】CN201510346587
【发明人】姜虎林, 乔建斌, 邢磊
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种共递送药物和基因的纳米载体，具体涉及一种同时荷载基因和治 疗药物的靶向递药系统，本发明递药系统能够靶向靶细胞，并递送基因和药物到达胞内作 用位点，达到协同治疗的目的，属于药物制剂技术领域。
【背景技术】
[0002] 将药物与基因通过高分子纳米载体共同包载，共同递送到靶细胞，一方面缓慢释 放药物，另一方面表达治疗基因，达到互相促进的作用，可实现药物治疗与基因治疗的协同 作用，从而增加疗效，是治疗肿瘤等恶性疾病理想方法。
[0003] 小分子多胺是基因传递的优良载体，但是其分子量小，压缩核酸的能力有限，因此 有必要将其合成聚合物。精胺（spermine，SPE)是多胺小分子的典型代表。它存在于所有 的真核细胞内，在细胞内代谢中发挥一定的作用，是很好的生物相容性的材料。而且SPE 具有四个胺基，分别是两个仲胺和两个伯胺。这些胺基可以与丙烯酸酯基通过迈克尔加 成反应生成具有高缓冲能力的聚精胺（polyspermine，pSPE)。另外，聚乳酸-羟基乙酸共 聚物（PLGA)，是可生物降解的一类聚合物，具有良好的生物相容性，作为药用辅料已获得 美国FDA批准。通过对该聚合物末端的羧基进行改性，嫁接聚精胺，制备成两亲性聚合物 pSPE-PLGA，其中pSPE含有大量的仲氨基，荷正电，能很好的载带负电荷的基因，内核PLGA 作为疏水性材料能很好的装载难溶性药物，且具有缓释、粒径大小可控等优点。聚精胺PSPE 在体内亦可生物降解，该代谢产物是体内大量存在的内源性物质。因此，pSPE-PLGA具有很 好的生物相容性，是一种无毒、可实现基因和药物共传递的理想载体。在PSPE-PLGA嫁接带 靶头的PEG，在隐形材料PEG和靶头共同作用下可以实现更好的靶向药物传递。
【发明内容】
[0004] 目的：本发明提供一种共递送药物和基因的纳米载体，该递药系统是可用于协同 治疗恶性肿瘤或其他恶性疾病如肝纤维化、肝硬化等的治疗药物和基因共递送纳米给药系 统，涉及一种自组装形成共载药物和基因的纳米共递送系统，本发明的自组装纳米递送系 统能够将药物和基因同时递送到靶细胞内，在靶细胞胞质释放基因及药物。
[0005] 技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0006] 一种共递送纳米载体，由载治疗药物的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand自组 装而成的纳米粒与治疗基因形成复合物，形成共递送药物与基因纳米载体；
[0007] PLGA-pSPE-PEG-Ligand为一种非病毒两亲性的阳离子聚合物，由两亲性 PLGA-pSPE与一端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段组成的聚阳离子 载体，聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的化学结构式如下：
[0008]
[0009]其中，PLGA分子量为2-100k;pSPE分子量为2-100k;PEG分子量为I-IOk;Ligand 为靶头，选自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、维生素A(Va)、叶酸（FA)、透明质酸（HA)。
[0010] Ligand为革E头，聚乙二醇PEG，pSPE为polyspermine聚精胺，聚乳酸-羟基乙酸 共聚物（PLGA)。
[0011] 所述的共递送纳米载体，制备方法包括以下步骤：应用反相溶剂法，将治疗药 物与PLGA-pSPE-PEG-Ligand共溶于溶剂中，逐滴滴加到一定体积去离子水中，用截留 分子量500-14000的透析带在4 °C下透析2d除去溶剂，得包封治疗药物的聚合物载体 PLGA-pSPE-PEG-Ligand自组装而成的纳米粒；然后将治疗基因溶液在涡旋下加入到等体 积的载有治疗药物的PLGA-pSPE-PEG-Ligand纳米胶体溶液中，涡旋30s，室温静置30min， 即得。可适用于静脉注射给药、皮下给药、粘膜给药等。
[0012] 所述溶剂为有机溶剂，选自无水DMSO(二甲基亚砜）、甲醇、乙醇中的一种或几种； 和/或，所述治疗药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱、水飞蓟宾。
[0013] 所述治疗基因为DNA或siRNA;其中，DNA为p53、HGF、Akt、PDCD;siRNASsiBcl-2、 siAkt、siTGF-0 1、siHSP47、siTMP-l。
[0014] 作为优选方案，所述的共递送纳米载体，其特征在于：若用于治疗肝纤维化，所述 DNA为HGF，siRNA为siTGF-0 1、siHSP47、siHMP-1;所述治疗药物为水飞蓟宾；所述靶头 为甘露糖-6-磷酸（M6P)、维生素A(Va)。若用于治疗肝癌，所述DNA为p53、Akt、H)CD，siRNA 为siBcl-2;所述治疗药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱等。所述靶头为半乳糖（Gal)、透明质 酸（HA)等。
[0015]本发明提供一种聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，PLGA-pSPE-PEG-Ligand为 一种非病毒两亲性的阳离子聚合物，由两亲性PLGA-pSPE与一端羧基一端靶头的聚乙二醇 PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段组成的聚阳离子载体，聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的 化学结构式如下：
[0016]
[0017] 其中，PLGA分子量为2-100k;pSPE分子量为2 -100k;PEG分子量为I-IOk; Ligand为祀头，选自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、维生素A(Va)、叶酸（FA)、透明质 酸（HA)〇
[0018] 所述的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，由精胺（spermine)与聚乙二醇 二丙烯酸酯（PEGDA)通过迈克尔加成反应合成两端精胺的聚精胺pSPE，pSPE与聚（乳 酸-乙醇酸）共聚物PLGA通过氨基与羧基的缩合反应生成PLGA-pSPE，PLGA-pSPE与一 端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)通过氨基与羧基的缩合反应生成 PLGA-pSPE-PEG-Ligand;聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的合成方法如下：
[0019]
[0020] 其中，n、x、y、z为正整数。
[0021] 聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，其制备方法具体包括以下步骤：
[0022] DpSPE的合成：以聚乙二醇二丙稀酸醋（PEGDA)和多胺分子spermine为结构单 元，交替连接成聚合物PSPE，将精胺（SPE)溶解于重量体积比10-20倍量的溶剂中，聚乙二 醇二丙烯酸酯（PEGDA)溶解于重量体积比10-20倍量的溶剂中，SPE与PEGDA的摩尔比例 为I:1-1. 5 :1，然后将I3EGDA溶液慢慢滴加到SPE溶液中，然后在4-100°C下搅拌12-48h; 所得产物溶解于4°C的去离子水中，然后用截留分子量2000-14000的透析带在4°C下透析 2d;最后将产物冻干，即得pSPE，保存在-20°C下备用；
[0023] 2)PLGA-pSPE合成：取适量PLGA溶于溶剂，加入DCC和NHS，室温下搅拌反应 0. 5-24h，离心除去沉淀，上清液与含pSPE的无水DMSO溶液混合，pSPE与PLGA的摩尔比例 为I:1-1.5 :1，室温下搅拌反应12-48h用分子量截留值2000-14000的透析袋在4°C下透 析，得PLGA-pSPE;
[0024] 3)PLGA-pSPE-PEG-Ligand合成：取适量HOOC-PEG-Ligand，溶剂溶解，加入DCC(二 环己基碳二亚胺）和NHS，室温下搅拌反应0. 5-24h，离心除去沉淀，上清液与含PLGA-pSPE 的无水DMSO溶液混合，室温下搅拌反应12-48h，用分子量截留值2000-14000的透析袋在 4°C下透析，得PLGA-pSPE-PEG-Ligand。所述溶剂为有机溶剂，选自无水DMS0、甲醇、乙醇中 的一种或几种。
[0025] 一种上述的HOOC-PEG-Ligand，其结构式如下：
[0026]
[0027]其中，PEG分子量为Ik-IOk;连接键为酯键或酰胺键。
[0028] 所述的HOOC-PEG-Ligand，当Ligand为甘露糖-6-磷酸（M6P)，即HOOC-PEG-M6P， 合成路线如下
[0029]
[0030] 所述H00C-PEG-M6P的制备方法具体包括以下步骤：取适量H00C-PEG-C00H，先 用无水DMSO溶解，然后加入DCC和NHS，室温下搅拌反 应6-24h，离心除去沉淀，上清液与 含M6P靶头Ligand的无水DMSO溶液混合，H00C-PEG-C00H与靶头的摩尔比例为I:1-1: 1. 5,室温下搅拌反应12-48h，用分子量截留值2000 - 5000的透析袋在4°C下透析，得 PLGA-pSPE-PEG;所述溶剂为有机溶剂，选自无水DMSO二甲基亚砜、甲醇、乙醇中的一种或 几种。
[0031] 有益效果：本发明制备的基于两亲性聚合物pSPE-PLGA，其中pSPE含有大量的仲 氨基，荷正电，能很好的载带负电荷的基因，内核PLGA作为疏水性材料能很好的装载难溶 性药物，且具有缓释、粒径大小可控等优点。聚精胺在体内可生物降解，该代谢产物是体内 大量存在的内源性物质；聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)，是可生物降解的一类聚合物，具 有良好的生物相容性，作为药用辅料已获得美国FDA批准。因此，pSPE-PLGA具有很好的生 物相容性，是一种无毒、可实现基因和药物共传递的理想载体。在PSPE-PLGA嫁接带靶头的 PEG，在隐形材料PEG和靶头共同作用下可以实现更好的靶向药物传递。并且具有很低的细 胞毒性和显著地转染效率，在基因与药物共递送领域具有广阔的应用前景
【附图说明】
[0032] 图 1 是本发明按照实施例 2、4、6 制备的pSPE、PLGA-pSPE、PLGA-pSPE-PEG-Ligand 聚合物的表征：⑷氢谱图，S=1.4-1.6ppm(-CH2-，SPE)，S=3.8ppm(-CH2-，PEGDA); 8 =I. 5(-CH3-,PLGA), 8 = 4. 9 (-CH-,PLGA), 8 = 5. 2 (-CH2-,PLGA) ； 8 = 3. 5(-CH2-, PEG)⑶红外光谱图，3500~3300cm-1为仲胺（-NH-)伸缩振动（pSPE) :1750011-1左右为羧 基（-C00H)中羰基（C= 0)伸缩振动（PLGA) ;3500~3300CHT1为仲胺（-NH-)伸缩振动， 1750CHT1左右为酰胺键（-C0NH-)中C= 0伸缩振动（PLGA-pSPE) ;3500~3300CHT1为仲胺 (-NH-)伸缩振动，1750CHT1左右为酰胺键（-CONH-)中C=O伸缩振动，1270~lOlOcnT1左 右为醚键中C-O伸缩振动（PLGA-pSPE-PEG-Ligand) (C)GPC分析。
[0033] 图2是本发明按照实施例9制备的PLGA-pSPE-PEG-Ligand/DNA复合物的表征： (A)PLGA-pSPE-PEG-Ligand/DNA以不同质量比制备的复合物凝胶电泳图，（B)DNA的保护和 释放评价。
[0034] 图3是本发明按照实施例10制备的PLGA-pSPE-PEG-Ligand聚合物在不同浓度 不同细胞24h、72h时间点的细胞毒性：(A)L02细胞，（B)SMCC-7721细胞，（C)IfepG2细胞， (mean土SD，n= 3) 〇
[0035] 图4是本发明按照实施例11的体外转染实验。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0037] 本发明是通过以下的技术方案实现的，具体步骤如下：
[0038] 精胺（spermine)与聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA)通过迈克尔加成反应合成两端 精胺的聚精胺pSPE，pSPE与聚（乳酸-乙醇酸）共聚物PLGA通过氨基与羧基的缩合反应 生成PLGA-pSPE，PLGA-pSPE与一端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)通过 氨基与羧基的缩合反应生成PLGA-pSPE-PEG-Ligand。
[0039] 自组装纳米共递送系统均是新鲜制备，制备方案具体如下：
[0040] 采用反相溶剂法，将药物与PLGA-pSPE-PEG-Ligand共溶于二甲基亚砜DMSO中， 逐滴滴加到一定体积去离子水中，用截留分子量500-14000的透析带在4°C下透析2d除去 DMS0,得包封治疗药物的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand纳米粒。
[0041] 将DNA溶液在涡旋下加入到等体积的包封治疗药物的PLGA-pSPE-PEG-Ligand溶 液中，涡旋30s，室温静置30min，即得。
[0042] 上述制备方法所制备的自组装共递送药物和基因的纳米载体，测定其粒径和电 势。
[0043] 上述共递送药物和基因的纳米载体在治疗肝纤维化、肝癌上的应用。
[0044] 实施例1
[0045] pSPE合成方案具体如下：将精胺（SPE)I. 2mmol溶解IOmL的无水甲醇中，聚乙二 醇二丙烯酸酯（PEGDA)Immol溶解IOmL无水甲醇中，然后将PEGDA溶液慢慢滴加到SPE溶 液中，然后在40°C下搅拌36h。所得产物溶解于4°C的去离子水中，然后用截留分子量5000 的透析带在4°C下透析2d。最后将产物冻干，保存在-20°C下，即得pSPE。
[0046] 实施例2
[0047] pSPE聚合物的结构鉴定和分子量表征
[0048] pSPE聚合物通过氢核磁和红外鉴定结构，分子量通过凝胶阻滞色谱检测。
[0049] 实施例3
[0050] PLGA-pSPE合成：取适量PLGA-C00H(分子量 10k)lmmol，用IOmL无水DMSO溶解，加 入DCC和NHS，室温下搅拌反应0. 5-24h，离心除去沉淀，上清液与含I. 2mmolpSPE的IOmL 无水DMSO溶液混合，室温下搅拌反应12h，用分子量截留值10000的透析袋在4°C下透析 2d，得PLGA-pSPE。
[0051] 实施例4
[0052] PLGA-pSPE聚合物的结构鉴定和分子量表征
[0053] PLGA-pSPE聚合物通过氢核磁和红外鉴定结构，分子量通过凝胶阻滞色谱检测。
[0054] 实施例5
[0055] PLGA-pSPE-PEG合成：取适量lmmolHOOC-PEG-Ligand，IOmL无水DMSO溶解，加入 DCC和NHS，室温下搅拌反应12h，离心除去沉淀，上清液与含lmmolPLGA-pSPE的IOmL无 水DMSO溶液混合，室温下搅拌反应24h，用分子量截留值10000的透析袋在4°C下透析得 PLGA-pSPE-PEG。
[0056] 实施例6
[0057] PLGA-pSPE-PEG聚合物的结构鉴定和分子量表征
[0058] PLGA-pSPE-PEG聚合物通过氢核磁和红外鉴定结构，分子量通过凝胶阻滞色谱检 测。
[0059] 实施例7
[0060] PLGA-pSPE-PEG自组装空白纳米粒的制备
[0061] 采用反相溶剂法，将PLGA-pSPE-PEG溶于ImL二甲基亚砜DMSO中，逐滴滴 加到IOmL去离子水中，用截留分子量1000的透析带在4°C下透析24h除去DMS0,得 PLGA-pSPE-PEG纳米粒。
[0062] 实施例8
[0063] PLGA-pSPE-PEG空白纳米粒的表征
[0064] PLGA-pSPE-PEG纳米粒的大小和表面电荷使用动态光散射测定。粒径约70nm， Zeta电势约 +25mV。
[0065] 实施例9
[0066] PLGA-pSPE-PEG自组装空白纳米粒对DNA结合能力考察
[0067] 将DNA溶液在涡旋下加入到等体积的PLGA-pSPE-PEG空白纳米粒溶液中，涡旋 30s，室温静置30min，即得共递送纳米载体
[0068] 纳米粒对DNA压缩和保护能力通过电泳表征。PLGA-pSPE-PEG空白纳米粒和DNA 以不同的质量比结合后，加入上样颜料，最后的体积为IOuL;为了评价聚合物对DNA的保 护能力，DNaseI作为降解酶。加到1%琼脂糖凝胶中，GelRed染色，用TAE缓冲液作为电解 质，50V下跑40min。
[0069] 实施例10
[0070] 细胞毒性
[0071]采用MTS法分析空白纳米粒对L02、SMCC-7721、IfepG2细胞增殖抑制的影响。生 长状态良好的细胞以IXIO4细胞/孔加入96孔板中，过夜培养后，弃去培养基，分别加入 含PLGA-pSPE-PEG空白纳米粒和PEI25k的培养基，每个样品至少3复孔，以正常细胞作为 对照组，只加培养基的细胞为空白组。为使上述各个处理组有可比性，分别培养24h和72h 后，每孔加入20yL的MTS溶液，避光37°C振摇4h，酶标仪490nm检测吸光度值（A) 。
[0072] 实施例11
[0073] 转染
[0074] 在 37°C下，在 5%CO2培养箱（ThermoScientific)的含 10%FBS的DMEM培养基 中维持细胞。对转染实验来说，将L02细胞10XIO4个细胞/孔的量接种在24孔平底板中， 孵育18h后，用空白纳米粒/pGL3复合物在无血清或含10%血清的培养基置换，接着孵育 4h。之后用新鲜的培养基替换，再于37°C下孵育24h。荧光素酶活性测定按照生产厂家的 方法。此六蛋白测试试剂盒用于提取蛋白，其浓度用〇16111；[111111；[1101116七61'(六111：01111]^1：，1^953 ; EG&GBerthold,Germany)测定。
[0075] 实施例12
[0076]DNA为HGF，siRNA为siTGF-0 1、siHSP47、siTMP-l;治疗药物为水飞蓟宾；靶头 为甘露糖-6-磷酸（M6P)、维生素A(Va)，本材料应用于肝纤维化治疗。
[0077] 实施例13
[0078]DNA为p53、Akt、H)CD，siRNA为siBcl-2 ;治疗药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱等； 靶头为半乳糖（Gal)、透明质酸（HA)，本材料应用于肝癌治疗。
[0079] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种共递送纳米载体，由载治疗药物的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand自组装 而成的纳米粒与治疗基因形成复合物，形成共递送药物与基因纳米载体； PLGA-pSPE-PEG-Ligand为一种非病毒两亲性的阳离子聚合物，由两亲性PLGA-pSPE与 一端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段组成的聚阳离子载体，聚合物 载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的化学结构式如下：其中，PLGA分子量为2-100k;pSPE分子量为2 - 100k;PEG分子量为1 - 10k;Ligand为 靶头，选自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、维生素A(Va)、叶酸（FA)、透明质酸（HA)。2. 根据权利要求1所述的共递送纳米载体，制备方法包括以下步骤：应用反相溶剂法， 将治疗药物与PLGA-pSPE-PEG-Ligand共溶于溶剂中，逐滴滴加到一定体积去离子水中，用 截留分子量500-14000的透析带在4°C下透析2d除去溶剂，得包封治疗药物的聚合物载体 PLGA-pSPE-PEG-Ligand自组装而成的纳米粒；然后将治疗基因溶液在涡旋下加入到等体 积的载有治疗药物的PLGA-pSPE-PEG-Ligand纳米胶体溶液中，涡旋30s，室温静置30min， 即得。3. 根据权利要求2所述的共递送纳米载体，其特征在于：所述溶剂为有机溶剂，选自无 水DMS0、甲醇、乙醇中的一种或几种；和/或，所述治疗药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱、水飞 蓟宾。4. 根据权利要求1或2所述的共递送纳米载体，其特征在于：所述治疗基因为DNA或 siRNA;其中，DNA为p53、HGF、Akt、PDCD;siRNA为siBcl-2、siAkt、siTGF-0 1、siHSP47、 siTMP-1。 5?-种聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，其特征在于：PLGA-pSPE-PEG-Ligand为 一种非病毒两亲性的阳离子聚合物，由两亲性PLGA-pSPE与一端羧基一端靶头的聚乙二醇 PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段组成的聚阳离子载体，聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的 化学结构式如下：其中，PLGA分子量为2-100k;pSPE分子量为2 - 100k;PEG分子量为1 - 10k;Ligand为 靶头，选自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、维生素A(Va)、叶酸（FA)、透明质酸（HA)。6.根据权利要求5所述的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，由精胺（spermine)与 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA)通过迈克尔加成反应合成两端精胺的聚精胺pSPE，pSPE与 聚（乳酸-乙醇酸）共聚物PLGA通过氨基与羧基的缩合反应生成PLGA-pSPE，PLGA-pSPE 与一端羧基一端靶头的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)通过氨基与羧基的缩合反应生成 PLGA-pSPE-PEG-Ligand;所述聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand的合成方法如下：其中，n、x、y、z为正整数。7.根据权利要求5所述的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，其制备方法具体包括以 下步骤： 1)pSPE的合成：以聚乙二醇二丙稀酸醋（PEGDA)和多胺分子spermine为结构单元，交 替连接成聚合物PSPE，将精胺（SPE)溶解于重量体积比10-20倍量的溶剂中，聚乙二醇二 丙烯酸酯（PEGDA)溶解于重量体积比10-20倍量的溶剂中，SPE与PEGDA的摩尔比例为1 : 1-1. 5 :1，然后将PEGDA溶液慢慢滴加到SPE溶液中，然后在4-100°C下搅拌12-48h;所得产 物溶解于4°C的去离子水中，然后用截留分子量2000-14000的透析带在4°C下透析2d;最 后将产物冻干，即得PSPE，保存在-20°C下备用； 2. PLGA-pSPE合成：取适量PLGA溶于溶剂，加入DCC和NHS，室温下搅拌反应0. 5-24h， 离心除去沉淀，上清液与含pSPE的无水DMSO溶液混合，pSPE与PLGA的摩尔比例为1 : 1-1. 5 :1，室温下搅拌反应12-48h用分子量截留值2000-14000的透析袋在4°C下透析，得 PLGA-pSPE； 3. PLGA-pSPE-PEG-Ligand合成：取适量HOOC-PEG-Ligand，溶剂溶解，加入DCC(二环己 基碳二亚胺）和NHS，室温下搅拌反应0. 5-24h，离心除去沉淀，上清液与含PLGA-pSPE的无 水DMS0溶液混合，室温下搅拌反应12-48h，用分子量截留值2000-14000的透析袋在4°C下 透析，得PLGA-pSPE-PEG-Ligand〇8. 根据权利要求7所述的聚合物载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand，其特征在于：所述溶剂 为有机溶剂，选自无水DMS0、甲醇、乙醇中的一种或几种。9. 一种如权利要求1或5所述的HOOC-PEG-Ligand，其结构式如下：其中，PEG分子量为l-10k;连接键为酯键或酰胺键。10.根据权利要求9所述的HOOC-PEG-Ligand，当Ligand为甘露糖-6-磷酸（M6P)，即H00C-PEG-M6P，合成路线如下具体制备方法步骤如下：取适量H00C-PEG-C00H，先用无水DMS0溶解，然后加入DCC和NHS，室温下搅拌反应6-24h，离心除去沉淀，上清液与含M6P靶头Ligand的无水DMS0溶液 混合，H00C-PEG-C00H与靶头的摩尔比例为1 :1-1 :1. 5,室温下搅拌反应12-48h，用分子量 截留值2000 - 5000的透析袋在4°C下透析，得PLGA-pSPE-PEG;所述溶剂为有机溶剂，选自 无水DMS0、甲醇、乙醇中的一种或几种。
【专利摘要】本发明公开了一种共递送药物和基因的纳米载体及其制备方法；具体涉及一种同时荷载药物和基因药物的共递送纳米载体PLGA-pSPE-PEG-Ligand。本递药系统由精胺（spermine）与聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）通过迈克尔加成反应合成两端精胺的聚精胺pSPE，pSPE与聚（乳酸-乙醇酸）共聚物PLGA通过氨基与羧基的缩合反应生成两亲性PLGA-pSPE，PLGA-pSPE与一端羧基另一端连接靶头的聚乙二醇PEG（HOOC-PEG-Ligand）通过氨基与羧基的缩合反应生成PLGA-pSPE-PEG-Ligand，自组装形成纳米粒，内核PLGA作为疏水性材料能很好的装载难溶性药物，pSPE含有大量的仲氨基，荷正电，能很好的载带负电荷的基因，嫁接带靶头的隐形材料PEG，在PEG和靶头共同作用下可以实现更好的靶向药物传递，实现将药物和基因递送到同一靶细胞。
【IPC分类】C08G81/00, A61K48/00, A61P35/00, A61K47/34, A61K9/51
【公开号】CN104906075
【申请号】CN201510346587
【发明人】姜虎林, 乔建斌, 邢磊
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月19日
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