二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒b3所致病毒性心肌炎药物的用图
二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒b3所致病毒性心肌炎药物的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，特别涉及一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致 病毒性心肌炎疾病的药物的用途。
【背景技术】
[0002] 柯萨奇病毒（CVB)属于小RNA病毒科（Picornaviridae)肠道病毒属 (Enterovirus)，病毒颗粒为二十面体，立方对称呈球形，无包膜，直径约25_30nm，病毒衣壳 包绕着一条单股正链RNA。柯萨奇病毒B组（coxsackievirusB)具有高度亲心肌性和流行 性，共包括6种血清型（CVB1-CVB6)，其中柯萨奇病毒B3被认为是引起心肌炎和扩张型心肌 病最为常见的病原体，回顾性研宄表明50%以上的病毒性心肌炎和25 %的心肌病与之有 关。
[0003] 病毒性心肌炎（viralmyocarditis)是指嗜心性病毒感染引起的以心肌炎性病变 为主的疾病，可引起急性心功能不全，且约有1/3的患者进一步发展为慢性心肌炎和扩张 型心肌病，是引发心力衰竭的常见病因之一。近年来该病发病率呈上升趋势，已成为危害青 少年健康的常见疾病之一，但迄今尚无有效的疫苗以及特异性治疗方法。
[0004] 目前对于病毒性心肌炎的临床治疗，还存在诸多不足。现临床主要采用抗病毒和 调节细胞免疫功能疗法。其中临床抗病毒药物包括阿昔洛韦、病毒唑和更昔洛韦等，在感 染早期，这些抗病毒药物能有效抑制病毒复制，减轻心肌损伤，提高生存率，但是，在感染后 期，其疗效有限，因此，目前临床应用的抗病毒药物的疗效均不够满意。在细胞免疫功能调 节方面，目前临床上使用的药物包括：丙种球蛋白、人白细胞干扰素等，虽然这些药物能减 弱免疫反应，清除病毒，改善左心室功能，提高生存率，但仍存在个体疗效差异大，有一定副 作用，成本过高等问题。因而，筛选和研制治疗病毒性心肌炎的新药具有重要意义。
[0005] 二甲双胍（Metformin，其分子式为C4H11N5 ?HC1，分子量为165. 62)作为临床上广 泛应用的治疗2型糖尿病的降糖药物，近年来不断有研宄表明其还具有一定的保护心血管 及抗肿瘤的作用，但对于抗柯萨奇病毒B3及所致病毒性心肌炎的活性尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌 炎疾病药物的用途。采用本发明所述药物，治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病，具 有抗CVB3病毒复制的作用，抑制心肌炎症及纤维化效果明显，可用于制备治疗病毒性心肌 炎的药物，该副作用小，疗效高，在目前临床上治疗CVB3所致病毒性心肌炎尤其是在感染 后期，治疗的疗效不够满意的情况下，应用前景良好。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] 二甲双胍在制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病的药物中的用途。
[0009] 本发明所述药物采用口服方式给药，对于成人而言，用药量为每公斤体重每天 5 ~IOmg0
[0010] 本发明的有益效果是：
[0011] (1)药理活性方面
[0012] 申请人的动物实验证明，二甲双胍显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率， 心脏组织实验方面，二甲双胍能明显的抑制炎症细胞浸润和组织坏死，具有抗CVB3作用和 抑制其复制的作用，血清样本用全自动生物分析仪进行检测，结果表明，二甲双胍具有抑制 心肌酶活性的作用、保护心肌功能的作用，体外抗CVB3活性作用表明二甲双胍具有显著的 抑制病毒蛋白表达水平的作用。
[0013] ⑵药学方面
[0014] 二甲双胍为双胍类口服降血糖药，其本身理化性质稳定，药理作用广泛，毒性和副 作用较小。
【附图说明】
[0015] 图1为二甲双胍改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率的曲线；
[0016] 图2为二甲双胍改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠心脏功能（EF为射血分数，LV mass为左心室质量），*表示p〈0. 05 ;
[0017] 图3为二甲双胍抑制CVB3感染所致炎症细胞浸润的结果；
[0018] 图4为小鼠心肌组织切片H&E染色结果，图中Mock为正常对照组，CVB3为CVB3感 染组，CVB3+Met为二甲双胍治疗组；
[0019] 图5为小鼠心肌组织切片Masson染色结果；
[0020] 图6为二甲双胍抑制CVB3在心肌组织中的复制，图为dsRNA染色结果；
[0021] 图7为二甲双胍抑制小鼠心肌组织中CVB3衣壳蛋白VPlRNA表达量（注表示 p<0. 05)；
[0022] 图8为Westernblot检测二甲双狐体外抗CVB3的作用，其中A图为Westernblot 检测条带结果，0-actin为内参对照；B图为对A图条带进行灰度扫描定量分析结果（注： * 表示p〈〇. 05);
[0023] 图9为qRT-PCR检测二甲双胍体外抗CVB3作用（注表示p〈0. 05)。
【具体实施方式】
[0024] -、材料和试剂
[0025] 1.动物、病毒株
[0026] BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，购买于第三军医大学大坪医院动物中心；
[0027] 柯萨奇病毒B3(Nancy株）购买于中国科学院武汉病毒研宄所；
[0028] Hela细胞株购于中国科学院上海生命科学研宄院细胞资源中心。
[0029] 2?主要试剂
[0030]
[0035] 二、实验方法
[0036] 1.病毒性心肌炎模型的建立
[0037]BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，适应性喂养3天。实验分为正常对照组、病毒性心肌 炎模型组、二甲双胍治疗组。小鼠腹腔注射0.1mlCVB3病毒液（3X105PFU/ml)，次日分别 给予灌胃PBS(正常对照组、病毒性心肌炎模型组）、二甲双胍（50mg/kg)(转算成人每日适 应剂量是：5-10mg/kg)。连续灌胃7天，7天后每周灌胃3次，21天时进行心功能检测，28天 处死小鼠，收集心肌组织和血液标本。
[0038] 2.小鼠心肌功能检测
[0039] 小鼠给药21天（感染CVB3后连续给药7天，7天后每周给药3次），小鼠用7% 水合氯醛按3ml/kg经腹腔注射麻醉，固定，用Vev〇2100高分辨率超声系统经小鼠胸廓进行 超声心动图（30MHz，100帧/秒），经测量计算得到射血分数（EF)和左心室质量（LVmass) 的数值。
[0040] 5.免疫组化染色方法
[0041] 小鼠心脏组织用4%多 聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，组织 切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交（CD45、CD68、CD3及dsRNA抗 体），DAB显色，复染，脱水、透明和封片后镜检。
[0042]6.H&E及Masson染色方法
[0043] 小鼠心脏组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，苏木 素伊红染色（hematoxylin_eosine，H&E)及Masson三色法染色后镜检。光学显微镜下观察 组织切片心肌组织炎性细胞浸润、细胞损伤程度，以及心肌纤维化程度。
[0044] 7.qRT-PCR检测方法
[0045] 具体步骤包括：设计并合成VPl和GAPDH引物；Trizol试剂提取RNA，核酸仪检测 RNA浓度和纯度，逆转录试剂盒合成cDNA;以cDNA为模板，采用SYBRGreen试剂盒进行实 时定量PCR。
[0046] 8.Westernblot检测
[0047] 药物处理后的细胞进行总蛋白提取；BCA法进行蛋白浓度测定；然后进行SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗稀释液孵育过夜，相应二抗孵育2h(室温），化学发光 显影。应用ImageJ软件测定灰度值。
[0048] 9?心肌酶谱检测方法
[0049] 将小鼠血清用自动生物化学分析仪（公司：日立，型号：7170S)进行检测，测定天 冬氨酸转氨酶（AST)、肌酸激酶（CK)、肌酸激酶同工酶（CK-MB)、乳酸脱氢酶（LDH)和a-羟 丁酸脱氢酶（a-HBDH)的活性。
[0050] 10.HeLa细胞感染及药物处理
[0051] 以含10%FBS的高糖DMEM培养基调整HeLa细胞密度，以5XIO5/孔接种于六孔 板中，37°C、5%CO2的条件培养24小时。用CVB3(MOI= 3)感染1小时，弃去病毒液，PBS 洗绦两次，加药处理。提取RNA和总蛋白进行定量PCR及Westernblot检测。
[0052] 三、结果
[0053] 1.二甲双胍显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率
[0054] 在小鼠感染CVB3后，灌胃二甲双胍（50mg/kg)，灌胃28天（连续灌胃7天，7天后 每周灌胃3次），二甲双胍干预组小鼠生存率明显得到提高。结果显示二甲双胍可显著改善 CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率（参见图1)。
[0055] 2.二甲双胍具有保护心肌功能的作用
[0056] 将二甲双胍治疗21天的小鼠进行心功能检测，结果表明二甲双胍治疗组具有保 护心肌功能的作用（参见图2)。
[0057] 3.二甲双胍抑制炎症细胞浸润
[0058] 小鼠心肌组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，经 ⑶45、⑶68及⑶3抗体进行免疫组化染色后镜下观察。结果表明二甲双胍治疗组可明显抑 制炎症细胞浸润（见图3)。
[0059] 4.二甲双胍抑制炎症细胞浸润和组织损伤
[0060] 小鼠心肌组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，苏木 素伊红染色（hematoxylin_eosine，H&E)后镜下观察。结果表明二甲双胍治疗组明显的抑 制炎症细胞浸润和组织坏死（见图4)。
[0061] 5.二甲双胍抑制心肌组织纤维化
[0062] 小鼠心脏组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym， Masson三色法染色后镜检。光学显微镜下观察心肌纤维化程度。结果表明二甲双胍治疗组 明显抑制心肌组织的纤维化（见图5)。
[0063] 6.二甲双胍具有抑制心肌酶活性的作用
[0064] 小鼠血清样本进行心肌酶活性检测，结果表明二甲双胍治疗组中天冬氨酸转氨酶 (AST)、肌酸激酶（CK)、肌酸激酶同工酶（CK-MB)、乳酸脱氢酶（LDH)和a-羟丁酸脱氢酶 (a-HBDH)的活性相对于病毒感染组明显被抑制，见表1。
[0065] 表1?小鼠血清心肌酶谱结果（平均值土标准误）
[0066]
[0067] a.p< 0? 05CVB3感染组与正常对照组比较；
[0068] b.p< 0? 05二甲双胍治疗组与CVB3感染组比较。
[0069] 7?二甲双胍具有抗CVB3作用
[0070] 小鼠心脏组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，组织 切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交（dsRNA抗体），DAB显色，复 染，脱水、透明和封片后镜检。结果表明二甲双胍治疗组具有明显的抗CVB3作用和抑制其 复制的作用（见图6)。
[0071] qRT-PCR方法检测小鼠心肌组织中CVB3衣壳蛋白VPl的RNA水平，结果表明二甲 双胍治疗组明显降低其RNA水平（见图7)。
[0072] 8.二甲双胍体外抗CVB3活性作用
[0073] 将HeLa细胞经药物处理12小时后，提取总蛋白，Westernblot检测CVB3衣壳蛋 白VPl的表达水平，结果表明，二甲双胍具有显著的抑制VPl蛋白表达水平的作用（见图 8)。提取总RNA，实时定量PCR检测CVB3衣壳蛋白VPl的RNA水平，结果表明，二甲双胍具 有显著的抑制VPl的RNA水平的作用（见图9)。
【主权项】
1. 一种二甲双胍在制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物以口服给药。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物用药量为每公斤体重每天5~ IOmg0
【专利摘要】本发明涉及一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病药物的用途。采用本发明所述药物治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病，具有抗CVB3病毒复制的作用，改善心肌功能，抑制心肌炎症及纤维化效果明显，可用于制备治疗病毒性心肌炎的药物，该药物副作用小，疗效高，在目前临床上治疗CVB3所致病毒性心肌炎尤其是在感染后期，治疗的疗效不够满意的情况下，其应用前景良好。
【IPC分类】A61P9/04, A61P31/14, A61K31/155
【公开号】CN104906080
【申请号】CN201510337052
【发明人】张克斌, 谢玮, 王蕾, 周小波, 代黔, 钱桂生, 周世文, 余华, 何晓梅, 熊浚智, 辛榕
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第二附属医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月17日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，特别涉及一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致 病毒性心肌炎疾病的药物的用途。
【背景技术】
[0002] 柯萨奇病毒（CVB)属于小RNA病毒科（Picornaviridae)肠道病毒属 (Enterovirus)，病毒颗粒为二十面体，立方对称呈球形，无包膜，直径约25_30nm，病毒衣壳 包绕着一条单股正链RNA。柯萨奇病毒B组（coxsackievirusB)具有高度亲心肌性和流行 性，共包括6种血清型（CVB1-CVB6)，其中柯萨奇病毒B3被认为是引起心肌炎和扩张型心肌 病最为常见的病原体，回顾性研宄表明50%以上的病毒性心肌炎和25 %的心肌病与之有 关。
[0003] 病毒性心肌炎（viralmyocarditis)是指嗜心性病毒感染引起的以心肌炎性病变 为主的疾病，可引起急性心功能不全，且约有1/3的患者进一步发展为慢性心肌炎和扩张 型心肌病，是引发心力衰竭的常见病因之一。近年来该病发病率呈上升趋势，已成为危害青 少年健康的常见疾病之一，但迄今尚无有效的疫苗以及特异性治疗方法。
[0004] 目前对于病毒性心肌炎的临床治疗，还存在诸多不足。现临床主要采用抗病毒和 调节细胞免疫功能疗法。其中临床抗病毒药物包括阿昔洛韦、病毒唑和更昔洛韦等，在感 染早期，这些抗病毒药物能有效抑制病毒复制，减轻心肌损伤，提高生存率，但是，在感染后 期，其疗效有限，因此，目前临床应用的抗病毒药物的疗效均不够满意。在细胞免疫功能调 节方面，目前临床上使用的药物包括：丙种球蛋白、人白细胞干扰素等，虽然这些药物能减 弱免疫反应，清除病毒，改善左心室功能，提高生存率，但仍存在个体疗效差异大，有一定副 作用，成本过高等问题。因而，筛选和研制治疗病毒性心肌炎的新药具有重要意义。
[0005] 二甲双胍（Metformin，其分子式为C4H11N5 ?HC1，分子量为165. 62)作为临床上广 泛应用的治疗2型糖尿病的降糖药物，近年来不断有研宄表明其还具有一定的保护心血管 及抗肿瘤的作用，但对于抗柯萨奇病毒B3及所致病毒性心肌炎的活性尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌 炎疾病药物的用途。采用本发明所述药物，治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病，具 有抗CVB3病毒复制的作用，抑制心肌炎症及纤维化效果明显，可用于制备治疗病毒性心肌 炎的药物，该副作用小，疗效高，在目前临床上治疗CVB3所致病毒性心肌炎尤其是在感染 后期，治疗的疗效不够满意的情况下，应用前景良好。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] 二甲双胍在制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病的药物中的用途。
[0009] 本发明所述药物采用口服方式给药，对于成人而言，用药量为每公斤体重每天 5 ~IOmg0
[0010] 本发明的有益效果是：
[0011] (1)药理活性方面
[0012] 申请人的动物实验证明，二甲双胍显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率， 心脏组织实验方面，二甲双胍能明显的抑制炎症细胞浸润和组织坏死，具有抗CVB3作用和 抑制其复制的作用，血清样本用全自动生物分析仪进行检测，结果表明，二甲双胍具有抑制 心肌酶活性的作用、保护心肌功能的作用，体外抗CVB3活性作用表明二甲双胍具有显著的 抑制病毒蛋白表达水平的作用。
[0013] ⑵药学方面
[0014] 二甲双胍为双胍类口服降血糖药，其本身理化性质稳定，药理作用广泛，毒性和副 作用较小。
【附图说明】
[0015] 图1为二甲双胍改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率的曲线；
[0016] 图2为二甲双胍改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠心脏功能（EF为射血分数，LV mass为左心室质量），*表示p〈0. 05 ;
[0017] 图3为二甲双胍抑制CVB3感染所致炎症细胞浸润的结果；
[0018] 图4为小鼠心肌组织切片H&E染色结果，图中Mock为正常对照组，CVB3为CVB3感 染组，CVB3+Met为二甲双胍治疗组；
[0019] 图5为小鼠心肌组织切片Masson染色结果；
[0020] 图6为二甲双胍抑制CVB3在心肌组织中的复制，图为dsRNA染色结果；
[0021] 图7为二甲双胍抑制小鼠心肌组织中CVB3衣壳蛋白VPlRNA表达量（注表示 p<0. 05)；
[0022] 图8为Westernblot检测二甲双狐体外抗CVB3的作用，其中A图为Westernblot 检测条带结果，0-actin为内参对照；B图为对A图条带进行灰度扫描定量分析结果（注： * 表示p〈〇. 05);
[0023] 图9为qRT-PCR检测二甲双胍体外抗CVB3作用（注表示p〈0. 05)。
【具体实施方式】
[0024] -、材料和试剂
[0025] 1.动物、病毒株
[0026] BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，购买于第三军医大学大坪医院动物中心；
[0027] 柯萨奇病毒B3(Nancy株）购买于中国科学院武汉病毒研宄所；
[0028] Hela细胞株购于中国科学院上海生命科学研宄院细胞资源中心。
[0029] 2?主要试剂
[0030]
[0035] 二、实验方法
[0036] 1.病毒性心肌炎模型的建立
[0037]BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，适应性喂养3天。实验分为正常对照组、病毒性心肌 炎模型组、二甲双胍治疗组。小鼠腹腔注射0.1mlCVB3病毒液（3X105PFU/ml)，次日分别 给予灌胃PBS(正常对照组、病毒性心肌炎模型组）、二甲双胍（50mg/kg)(转算成人每日适 应剂量是：5-10mg/kg)。连续灌胃7天，7天后每周灌胃3次，21天时进行心功能检测，28天 处死小鼠，收集心肌组织和血液标本。
[0038] 2.小鼠心肌功能检测
[0039] 小鼠给药21天（感染CVB3后连续给药7天，7天后每周给药3次），小鼠用7% 水合氯醛按3ml/kg经腹腔注射麻醉，固定，用Vev〇2100高分辨率超声系统经小鼠胸廓进行 超声心动图（30MHz，100帧/秒），经测量计算得到射血分数（EF)和左心室质量（LVmass) 的数值。
[0040] 5.免疫组化染色方法
[0041] 小鼠心脏组织用4%多 聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，组织 切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交（CD45、CD68、CD3及dsRNA抗 体），DAB显色，复染，脱水、透明和封片后镜检。
[0042]6.H&E及Masson染色方法
[0043] 小鼠心脏组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，苏木 素伊红染色（hematoxylin_eosine，H&E)及Masson三色法染色后镜检。光学显微镜下观察 组织切片心肌组织炎性细胞浸润、细胞损伤程度，以及心肌纤维化程度。
[0044] 7.qRT-PCR检测方法
[0045] 具体步骤包括：设计并合成VPl和GAPDH引物；Trizol试剂提取RNA，核酸仪检测 RNA浓度和纯度，逆转录试剂盒合成cDNA;以cDNA为模板，采用SYBRGreen试剂盒进行实 时定量PCR。
[0046] 8.Westernblot检测
[0047] 药物处理后的细胞进行总蛋白提取；BCA法进行蛋白浓度测定；然后进行SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗稀释液孵育过夜，相应二抗孵育2h(室温），化学发光 显影。应用ImageJ软件测定灰度值。
[0048] 9?心肌酶谱检测方法
[0049] 将小鼠血清用自动生物化学分析仪（公司：日立，型号：7170S)进行检测，测定天 冬氨酸转氨酶（AST)、肌酸激酶（CK)、肌酸激酶同工酶（CK-MB)、乳酸脱氢酶（LDH)和a-羟 丁酸脱氢酶（a-HBDH)的活性。
[0050] 10.HeLa细胞感染及药物处理
[0051] 以含10%FBS的高糖DMEM培养基调整HeLa细胞密度，以5XIO5/孔接种于六孔 板中，37°C、5%CO2的条件培养24小时。用CVB3(MOI= 3)感染1小时，弃去病毒液，PBS 洗绦两次，加药处理。提取RNA和总蛋白进行定量PCR及Westernblot检测。
[0052] 三、结果
[0053] 1.二甲双胍显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率
[0054] 在小鼠感染CVB3后，灌胃二甲双胍（50mg/kg)，灌胃28天（连续灌胃7天，7天后 每周灌胃3次），二甲双胍干预组小鼠生存率明显得到提高。结果显示二甲双胍可显著改善 CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率（参见图1)。
[0055] 2.二甲双胍具有保护心肌功能的作用
[0056] 将二甲双胍治疗21天的小鼠进行心功能检测，结果表明二甲双胍治疗组具有保 护心肌功能的作用（参见图2)。
[0057] 3.二甲双胍抑制炎症细胞浸润
[0058] 小鼠心肌组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，经 ⑶45、⑶68及⑶3抗体进行免疫组化染色后镜下观察。结果表明二甲双胍治疗组可明显抑 制炎症细胞浸润（见图3)。
[0059] 4.二甲双胍抑制炎症细胞浸润和组织损伤
[0060] 小鼠心肌组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，苏木 素伊红染色（hematoxylin_eosine，H&E)后镜下观察。结果表明二甲双胍治疗组明显的抑 制炎症细胞浸润和组织坏死（见图4)。
[0061] 5.二甲双胍抑制心肌组织纤维化
[0062] 小鼠心脏组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym， Masson三色法染色后镜检。光学显微镜下观察心肌纤维化程度。结果表明二甲双胍治疗组 明显抑制心肌组织的纤维化（见图5)。
[0063] 6.二甲双胍具有抑制心肌酶活性的作用
[0064] 小鼠血清样本进行心肌酶活性检测，结果表明二甲双胍治疗组中天冬氨酸转氨酶 (AST)、肌酸激酶（CK)、肌酸激酶同工酶（CK-MB)、乳酸脱氢酶（LDH)和a-羟丁酸脱氢酶 (a-HBDH)的活性相对于病毒感染组明显被抑制，见表1。
[0065] 表1?小鼠血清心肌酶谱结果（平均值土标准误）
[0066]
[0067] a.p< 0? 05CVB3感染组与正常对照组比较；
[0068] b.p< 0? 05二甲双胍治疗组与CVB3感染组比较。
[0069] 7?二甲双胍具有抗CVB3作用
[0070] 小鼠心脏组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，组织 切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交（dsRNA抗体），DAB显色，复 染，脱水、透明和封片后镜检。结果表明二甲双胍治疗组具有明显的抗CVB3作用和抑制其 复制的作用（见图6)。
[0071] qRT-PCR方法检测小鼠心肌组织中CVB3衣壳蛋白VPl的RNA水平，结果表明二甲 双胍治疗组明显降低其RNA水平（见图7)。
[0072] 8.二甲双胍体外抗CVB3活性作用
[0073] 将HeLa细胞经药物处理12小时后，提取总蛋白，Westernblot检测CVB3衣壳蛋 白VPl的表达水平，结果表明，二甲双胍具有显著的抑制VPl蛋白表达水平的作用（见图 8)。提取总RNA，实时定量PCR检测CVB3衣壳蛋白VPl的RNA水平，结果表明，二甲双胍具 有显著的抑制VPl的RNA水平的作用（见图9)。
【主权项】
1. 一种二甲双胍在制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物以口服给药。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物用药量为每公斤体重每天5~ IOmg0
【专利摘要】本发明涉及一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病药物的用途。采用本发明所述药物治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病，具有抗CVB3病毒复制的作用，改善心肌功能，抑制心肌炎症及纤维化效果明显，可用于制备治疗病毒性心肌炎的药物，该药物副作用小，疗效高，在目前临床上治疗CVB3所致病毒性心肌炎尤其是在感染后期，治疗的疗效不够满意的情况下，其应用前景良好。
【IPC分类】A61P9/04, A61P31/14, A61K31/155
【公开号】CN104906080
【申请号】CN201510337052
【发明人】张克斌, 谢玮, 王蕾, 周小波, 代黔, 钱桂生, 周世文, 余华, 何晓梅, 熊浚智, 辛榕
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第二附属医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月17日
最新回复(0)