N-(苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物的新用图
N-(苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一类小分子化合物的医药应用，具体涉及N-(苯 基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物或其可药用盐在制备用于治疗与MIF相关的炎症性 疾病的药物，特别是MIF抑制剂中的用途。
【背景技术】
[0002] 巨细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一 种集细胞因子、酶活性、神经内分泌激素于一身的多功能蛋白质。作为一种细胞因子，MIF 几乎参与所有炎症性疾病过程，它通过活化巨噬细胞和T细胞来促进先天性和获得性免疫 响应，是先天性免疫系统的重要调节因子，被认为是连接内分泌系统和免疫体系的介导剂。 MIF与多种免疫性和炎症性疾病的发病机制密切相关，如MIF在单核/巨噬细胞的血管壁粘 附、跨膜移动、内皮下聚集、泡沫细胞形成及斑块稳定中的作用，涉及到类风湿性关节炎、动 脉粥样硬化发生和发展的多个方面。MIF还直接影响正常细胞的分裂和瘤基因诱导的恶性 转化，或间接通过调节机体免疫反应，促进细胞增殖、迀移以及血管增生等。
[0003] 由于具有广泛的生物活性，MIF与多种免疫、炎症以及肿瘤等疾病密切相关，已经 成为治疗这些疾病的一个重要靶点。在与MIF相关的抗炎药物研宄方面，国外许多医药公 司和科研机构正在开发新的具有抗炎效果的MIF抑制剂，但目前还没有成功上市的MIF抑 制剂。因此，积极寻找和设计新的MIF抑制剂，并探索其抗炎效果，具有重要的临床意义和 广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004] 针对上述情况，本发明提供了N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物或其 可药用盐在制备用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物中的用途，其中所述N-(苯基氨 基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物具有如式I所示的结构：
其中： R1为氢或卤素； R2为氢、卤素、甲基或甲氧甲酰基； R3为氢、卤素、甲基、异丙基、甲氧甲酰基、苯氧基甲基、三氟甲基、苯基、3, 5-二氟苯基、 3, 5-二氯苯基或3, 5-二三氟甲基苯基； R4为氢、卤素、甲基、甲氧基或甲氧甲酰基； R5为氢、卤素、乙酰基、羧基或羟甲基； R6为氢、羟基、羧基、乙酰基、乙酰氨基、甲氧甲酰基、乙氧甲酰基、氨基甲酰基或苯甲酰 氨基； R7为氢或羧基。
[0005] 优选的，在上述技术方案中，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物选 自化合物中的任意一种。
[0007] 优选的，在上述技术方案中，所述可药用盐包括(但不限于)N-(苯基氨基硫代甲酰 基）苯甲酰胺类化合物(特别是化合物I^I4C1)与盐酸、磷酸、硫酸等无机酸形成的酸加成盐 以及与醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸、酒石酸等有机酸形成的酸加成 盐。
[0008] 优选的，在上述技术方案中，所述与MIF相关的炎症性疾病包括(但不限于)类风湿 性关节炎、动脉粥样硬化和败血症。
[0009] 优选的，在上述技术方案中，所述用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物为MIF 抑制剂。
[0010] 本发明对上述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物进行了生物学活性 测定，发现其对MIF具有明显的酶抑制活性，对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264. 7中的糖皮质激 素具有负向调节效果，可以显著抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎性因子 (TNF-a和NO)的释放，这些化合物还可以抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移。此外， MTT法检测证实这些化合物在10、20和40yM三个浓度下对小胶质细胞BV-2和巨噬细胞 RAW264. 7的活力均没有显著影响。在此基础上，进一步研宄化合物抗炎作用是否与抑制 MIF对ERK1/2的活化有关，发现这些化合物可以抑制ERK1/2的磷酸化。
[0011] 本发明中的N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物具备MIF抑制剂的功 能，对与MIF相关的炎症性疾病具有明显的抑制作用，可以用于制备与MIF相关的抗炎药 物。
【附图说明】
[0012] 图1为实施例1中化合物15、18、113和Ii^MIF的酶抑制活性曲线，其中上述化 合物15、18、1 13和I15依次对应图中的（a)、（b)、（c)和（d)。
[0013] 图2为实施例2中化合物15对MIF引起的巨噬细胞趋化迀移的影响效果图。
[0014] 图3为实施例3中化合物15对培养细胞的敏感性效果图。
[0015] 图4为实施例4中化合物15、18、113和I15对小胶质细胞中LPS诱导炎性因子的影 响效果图。
[0016] 图5为实施例5中化合物15对MIF刺激的RAW264. 7巨噬细胞中ERK活化的影响 效果图。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进一步的描述。
[0018] 实施例1 :化合物对MIF的酶抑制活性实验。
[0019] 实验原理：MIF具有多巴色素互变异构酶活性，可以将橙色的D，L型多巴色素甲 醋转化为无色的11引噪衍生物，吸光度采用TecanInfiniteM1000酶标仪在475nm波长下 进行3分钟吸光度测试。
[0020] 实验试剂的准备：脂多糖(大肠杆菌血清型〇55:B5)、（L)-3, 4-二羟基苯丙酮酸甲 酯和高碘酸钠购买自西格玛奥德里奇(美国密苏里州东部城市圣路易斯）；（S，R) -3- (4-羟 苯基）-4, 5-二氢-5-异恶唑乙酸甲酯（IS0-1)为MIF的典型抑制剂，购买自德国Merck公 司旗下的生化试剂品牌Calbiochem公司，在这里作为阳性对照；将化合物溶解在IOmM的 DMSO储备溶液中，最后在缓冲液中DMSO的浓度低于0. 25%情况下，将RAW264. 7巨噬细胞 在37°C条件下添加5%热灭活胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS)，庆大霉素（50g/ml)和 5%(1)2的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium，DMEM)中生 长和维持，重组人类MIF在大肠杆菌中表达，并且进行纯化。
[0021] 实验步骤：为了制备（L)-多巴色素甲醋，将等体积L-3, 4-二羟基苯甲基丙氨酸甲 酯（4mM)和高碘酸钠（IOmM)混合，并且在室温下培养3~5分钟，然后将（L)-多巴色素甲酯 (30yL)添加到包含重组人类MIF(120nM)和IOmM磷酸钾缓冲液的96孔板中，另外添加 0. 5mMEDTA并保持pH=6. 2。为了测试化合物对MIF互变异构酶活性的抑制效应，将浓度为 1、 5、10、25、50和100yM的化合物分别添加到包含重组人类MIF( 120nM)的96孔板中，在添 加（L)-多巴色素甲酯之前培养30分钟，将孔板中的气泡去掉，采用TecanInfiniteMlOOO 酶标仪在475nm波长下进行3分钟吸光度测试。
[0022] 实验结果：将浓度为1、5、10、25、50和100 11|1的^(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲 酰胺类化合物进行MIF的酶抑制活性实验，发现大多数化合物具有较好的抑制活性，其半 抑制浓度TIC5tl见表1，其中化合物15、18、1 13和I15的11(：5(|曲线图参见图1。
[0023] 表1.化合物对MIF互变异构酶的抑制活性（TIC5tl)以及TIC5Q〈10yM的化合物对 LPS诱导的RAW264. 7巨噬细胞分泌NO的影响（NIC5tl)
[0024] 对LPS诱导的RAW264. 7巨噬细胞分泌NO的影响（NIC5tl) [0023]实施例2 :化合 物对MIF引起的巨噬细胞趋化迀移的影响。
[0025] 实验原理：MIF对巨噬细胞有趋化迀移作用，抑制剂作用于MIF，可以在一定程度 上抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移。
[0026] 实验步骤：将重组人类MIF在添加或者缺失MIF互变异构酶抑制剂的情况下，分别 置于CM-16板的下室，然后在上室将RAW264. 7巨噬细胞接种于包含20000个细胞的无血 清培养基中。 然后将CIM-16孔板转移到xCELLigenceRTCA-DP中(德国曼海姆罗氏诊断公 司），在4小时的检测周期内每隔15分钟采集一次数据，最后通过RTCA1. 2软件进行数据 分析。
[0027] 实验结果：以化合物I5为例，HitMIF表示热灭活的（Heat-inactivated)MIF，在 这里作为阴性对照，图2中左边第一列柱状图表示没有添加MIF时，RAW264. 7巨噬细胞的 趋化迀移程度；第二列表示添加了热灭活的MIF时巨噬细胞的趋化迀移程度；第三列表示 添加MIF之后引起巨噬细胞明显的趋化迀移；第四列表示添加阳性对照化合物IS0-1之后 可以显著抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移；第五列表示添加化合物15时，同样显著抑 制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移，而且相比阳性对照化合物具有更好的抑制效果。（*) /X0. 05,（#) /XO. 01表示与单独用MIF处理时做的比较。
[0028] 实施例3 :细胞敏感性实验。
[0029] 实验原理：MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定 490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对培养细胞的杀伤效果。
[0030] 实验步骤：细胞活性通过MTT实验进行测定，BV-2小神经胶质细胞，THP-I细 胞或者RAW264. 7巨噬细胞接种于一式三份的密度为5XIO4的细胞/板中，将细胞在 glycocalyixns和LPS中处理24小时，MTT添加到每个板中并且在37°C下培养4小时，在培 养基废弃之后，将DMSO添加到溶解的甲瓒燃料中，在540 nm下测试光学密度，所有的实验 结果采用M±S. D.表示，所有数据采用SPSS程序(版本14. 0)进行单向方差分析和Student Newman Keul' s分析，p < 0. 01认为具有统计显著性。
[0031] 实验结果：以化合物I5为例，图3中左边第一列表示没有添加任何其他物质时，细 胞的活性；第二列表示添加脂多糖LPS后细胞的活性；第三列表示同时添加LPS和DEX之后 细胞的活性，DEX(Dexamethasone)是上市的抗炎药地塞米松，在这里作为对照；第四列表 示添加完LPS、DEX和MIF之后细胞的活性；第五列表示添加完LPS、DEX、MIF和IS0-1之后 细胞的活性；第六列表示添加完LPS、DEX、MIF和化合物15之后细胞的活性。总体来说，化 合物15对BV-2小神经胶质细胞、THP-I细胞和RAW264. 7巨噬细胞均没有明显毒性。
[0032] 实施例4 :化合物对小胶质细胞中LPS诱导炎性因子的影响。
[0033] 实验原理:MIF分子与抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性， 也不影响MIF的生物学活性。此种MIF标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生 特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在MIF作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变 成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反 应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
[0034] 实验步骤：将96孔板用鼠抗大鼠TNF-a抗体包被，并使用250y1含有1%牛血清 蛋白、5%蔗糖及0. 05%似队的PBS阻断抗体的非特异性结合位点，在4°C孵育16小时。然 后用洗涤液洗涤平板3次，加入大鼠TNF-a标准血清及测试血清样本，孵育2小时后进行 检测。检测抗体为生物素标记的大鼠TNF-a抗体。通过次级反应物链霉亲和素-辣根过 氧化物酶，与四甲基联苯胺反应显色。
[0035] 实验结果：以化合物15、18、1 13和I15为例，图4中第一列表示，没有添加其他物质 时TNF-a的含量；第二列表示添加脂多糖LPS之后可以显著诱导TNF-a的释放；第三、四、 五、六列表示添加完化合物15、1 8、113、115之后可以显著抑制^^诱导的炎性因子1即-€[的 释放，其中化合物1 5具有最好的抑制效果。
[0036] 实施例5 :化合物对MIF刺激的RAW264. 7巨噬细胞中ERK活化的影响实验。
[0037] 实验原理：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，"探针"是抗体，"显色"用标记的二抗。经 过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性 不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素 标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。
[0038] 实验步骤：将BV-2小胶质细胞以2.OXIO5密度接种于6孔板中，在37°C培养24 小时后用于实验。加药处理16小时后弃去培养基，用4°C的PBS清洗2次，再向每孔中加入 ImLPBS，将细胞吹下收集到离心管中，离心5分钟，弃去上清。加入细胞裂解液，震荡混匀 反应10分钟，再离心15分钟，收集上清液到离心管中。采用BCA法测定每个样品中蛋白质 的含量，并通过westernblot对蛋白质进行定性定量分析。
[0039] 实验结果：以化合物I5为例，采用westernblot方法检测了RAW264. 7细胞胞浆 中ERK1/2的蛋白质表达变化，以a-球管蛋白作为内参，发现该化合物可以抑制ERK1/2的 磷酸化(如图5所示)。
【主权项】
1. N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物或其可药用盐在制备用于治疗与MIF 相关的炎症性疾病的药物中的用途，其中所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合 物具有如式I所示的结构：其中： 札为氢或卤素； R2为氢、卤素、甲基或甲氧甲酰基； R3为氢、卤素、甲基、异丙基、甲氧甲酰基、苯氧基甲基、三氟甲基、苯基、3, 5-二氟苯基、 3, 5-二氯苯基或3, 5-二三氟甲基苯基； R4为氢、卤素、甲基、甲氧基或甲氧甲酰基； R5为氢、卤素、乙酰基、羧基或羟甲基； R6为氢、羟基、羧基、乙酰基、乙酰氨基、甲氧甲酰基、乙氧甲酰基、氨基甲酰基或苯甲酰 氨基； R7为氢或羧基。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺 类化合物选自如下所示的化合物中的任意一种：3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺 类化合物选自如权利要求2中所示的化合物15、1 8、113、115中的任意一种。4. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺 类化合物为如权利要求2中所示的化合物15。5. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述可药用盐为N-(苯基氨基硫代甲酰 基）苯甲酰胺类化合物与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述无机酸选自盐酸、磷酸和硫酸。7. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述有机酸选自醋酸、马来酸、枸橼酸、苯 磺酸、甲基苯磺酸、富马酸和酒石酸。8. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述与MIF相关的炎症性疾病选自类风湿 性关节炎、动脉粥样硬化和败血症。9. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的 药物为MIF抑制剂。
【专利摘要】本发明公开了N-(苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物的新用途。具体而言，本发明中如式I所示的N-(苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物具备MIF抑制剂的功能，可以显著抑制LPS诱导的炎性因子（TNF-α和NO）的释放，抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移，还可以抑制ERK1/2的磷酸化，可以用于制备与MIF相关的抗炎药物。
【IPC分类】A61K31/245, A61P9/10, A61K31/196, A61P29/00, A61P19/02, A61K31/17, A61P7/00
【公开号】CN104906082
【申请号】CN201510375278
【发明人】镇学初, 侯廷军, 许磊, 张瑜, 郑龙太
【申请人】苏州大学张家港工业技术研究院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月30日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一类小分子化合物的医药应用，具体涉及N-(苯 基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物或其可药用盐在制备用于治疗与MIF相关的炎症性 疾病的药物，特别是MIF抑制剂中的用途。
【背景技术】
[0002] 巨细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一 种集细胞因子、酶活性、神经内分泌激素于一身的多功能蛋白质。作为一种细胞因子，MIF 几乎参与所有炎症性疾病过程，它通过活化巨噬细胞和T细胞来促进先天性和获得性免疫 响应，是先天性免疫系统的重要调节因子，被认为是连接内分泌系统和免疫体系的介导剂。 MIF与多种免疫性和炎症性疾病的发病机制密切相关，如MIF在单核/巨噬细胞的血管壁粘 附、跨膜移动、内皮下聚集、泡沫细胞形成及斑块稳定中的作用，涉及到类风湿性关节炎、动 脉粥样硬化发生和发展的多个方面。MIF还直接影响正常细胞的分裂和瘤基因诱导的恶性 转化，或间接通过调节机体免疫反应，促进细胞增殖、迀移以及血管增生等。
[0003] 由于具有广泛的生物活性，MIF与多种免疫、炎症以及肿瘤等疾病密切相关，已经 成为治疗这些疾病的一个重要靶点。在与MIF相关的抗炎药物研宄方面，国外许多医药公 司和科研机构正在开发新的具有抗炎效果的MIF抑制剂，但目前还没有成功上市的MIF抑 制剂。因此，积极寻找和设计新的MIF抑制剂，并探索其抗炎效果，具有重要的临床意义和 广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004] 针对上述情况，本发明提供了N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物或其 可药用盐在制备用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物中的用途，其中所述N-(苯基氨 基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物具有如式I所示的结构：
其中： R1为氢或卤素； R2为氢、卤素、甲基或甲氧甲酰基； R3为氢、卤素、甲基、异丙基、甲氧甲酰基、苯氧基甲基、三氟甲基、苯基、3, 5-二氟苯基、 3, 5-二氯苯基或3, 5-二三氟甲基苯基； R4为氢、卤素、甲基、甲氧基或甲氧甲酰基； R5为氢、卤素、乙酰基、羧基或羟甲基； R6为氢、羟基、羧基、乙酰基、乙酰氨基、甲氧甲酰基、乙氧甲酰基、氨基甲酰基或苯甲酰 氨基； R7为氢或羧基。
[0005] 优选的，在上述技术方案中，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物选 自化合物中的任意一种。
[0007] 优选的，在上述技术方案中，所述可药用盐包括(但不限于)N-(苯基氨基硫代甲酰 基）苯甲酰胺类化合物(特别是化合物I^I4C1)与盐酸、磷酸、硫酸等无机酸形成的酸加成盐 以及与醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸、酒石酸等有机酸形成的酸加成 盐。
[0008] 优选的，在上述技术方案中，所述与MIF相关的炎症性疾病包括(但不限于)类风湿 性关节炎、动脉粥样硬化和败血症。
[0009] 优选的，在上述技术方案中，所述用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物为MIF 抑制剂。
[0010] 本发明对上述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物进行了生物学活性 测定，发现其对MIF具有明显的酶抑制活性，对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264. 7中的糖皮质激 素具有负向调节效果，可以显著抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎性因子 (TNF-a和NO)的释放，这些化合物还可以抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移。此外， MTT法检测证实这些化合物在10、20和40yM三个浓度下对小胶质细胞BV-2和巨噬细胞 RAW264. 7的活力均没有显著影响。在此基础上，进一步研宄化合物抗炎作用是否与抑制 MIF对ERK1/2的活化有关，发现这些化合物可以抑制ERK1/2的磷酸化。
[0011] 本发明中的N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物具备MIF抑制剂的功 能，对与MIF相关的炎症性疾病具有明显的抑制作用，可以用于制备与MIF相关的抗炎药 物。
【附图说明】
[0012] 图1为实施例1中化合物15、18、113和Ii^MIF的酶抑制活性曲线，其中上述化 合物15、18、1 13和I15依次对应图中的（a)、（b)、（c)和（d)。
[0013] 图2为实施例2中化合物15对MIF引起的巨噬细胞趋化迀移的影响效果图。
[0014] 图3为实施例3中化合物15对培养细胞的敏感性效果图。
[0015] 图4为实施例4中化合物15、18、113和I15对小胶质细胞中LPS诱导炎性因子的影 响效果图。
[0016] 图5为实施例5中化合物15对MIF刺激的RAW264. 7巨噬细胞中ERK活化的影响 效果图。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进一步的描述。
[0018] 实施例1 :化合物对MIF的酶抑制活性实验。
[0019] 实验原理：MIF具有多巴色素互变异构酶活性，可以将橙色的D，L型多巴色素甲 醋转化为无色的11引噪衍生物，吸光度采用TecanInfiniteM1000酶标仪在475nm波长下 进行3分钟吸光度测试。
[0020] 实验试剂的准备：脂多糖(大肠杆菌血清型〇55:B5)、（L)-3, 4-二羟基苯丙酮酸甲 酯和高碘酸钠购买自西格玛奥德里奇(美国密苏里州东部城市圣路易斯）；（S，R) -3- (4-羟 苯基）-4, 5-二氢-5-异恶唑乙酸甲酯（IS0-1)为MIF的典型抑制剂，购买自德国Merck公 司旗下的生化试剂品牌Calbiochem公司，在这里作为阳性对照；将化合物溶解在IOmM的 DMSO储备溶液中，最后在缓冲液中DMSO的浓度低于0. 25%情况下，将RAW264. 7巨噬细胞 在37°C条件下添加5%热灭活胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS)，庆大霉素（50g/ml)和 5%(1)2的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium，DMEM)中生 长和维持，重组人类MIF在大肠杆菌中表达，并且进行纯化。
[0021] 实验步骤：为了制备（L)-多巴色素甲醋，将等体积L-3, 4-二羟基苯甲基丙氨酸甲 酯（4mM)和高碘酸钠（IOmM)混合，并且在室温下培养3~5分钟，然后将（L)-多巴色素甲酯 (30yL)添加到包含重组人类MIF(120nM)和IOmM磷酸钾缓冲液的96孔板中，另外添加 0. 5mMEDTA并保持pH=6. 2。为了测试化合物对MIF互变异构酶活性的抑制效应，将浓度为 1、 5、10、25、50和100yM的化合物分别添加到包含重组人类MIF( 120nM)的96孔板中，在添 加（L)-多巴色素甲酯之前培养30分钟，将孔板中的气泡去掉，采用TecanInfiniteMlOOO 酶标仪在475nm波长下进行3分钟吸光度测试。
[0022] 实验结果：将浓度为1、5、10、25、50和100 11|1的^(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲 酰胺类化合物进行MIF的酶抑制活性实验，发现大多数化合物具有较好的抑制活性，其半 抑制浓度TIC5tl见表1，其中化合物15、18、1 13和I15的11(：5(|曲线图参见图1。
[0023] 表1.化合物对MIF互变异构酶的抑制活性（TIC5tl)以及TIC5Q〈10yM的化合物对 LPS诱导的RAW264. 7巨噬细胞分泌NO的影响（NIC5tl)
[0024] 对LPS诱导的RAW264. 7巨噬细胞分泌NO的影响（NIC5tl) [0023]实施例2 :化合 物对MIF引起的巨噬细胞趋化迀移的影响。
[0025] 实验原理：MIF对巨噬细胞有趋化迀移作用，抑制剂作用于MIF，可以在一定程度 上抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移。
[0026] 实验步骤：将重组人类MIF在添加或者缺失MIF互变异构酶抑制剂的情况下，分别 置于CM-16板的下室，然后在上室将RAW264. 7巨噬细胞接种于包含20000个细胞的无血 清培养基中。 然后将CIM-16孔板转移到xCELLigenceRTCA-DP中(德国曼海姆罗氏诊断公 司），在4小时的检测周期内每隔15分钟采集一次数据，最后通过RTCA1. 2软件进行数据 分析。
[0027] 实验结果：以化合物I5为例，HitMIF表示热灭活的（Heat-inactivated)MIF，在 这里作为阴性对照，图2中左边第一列柱状图表示没有添加MIF时，RAW264. 7巨噬细胞的 趋化迀移程度；第二列表示添加了热灭活的MIF时巨噬细胞的趋化迀移程度；第三列表示 添加MIF之后引起巨噬细胞明显的趋化迀移；第四列表示添加阳性对照化合物IS0-1之后 可以显著抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移；第五列表示添加化合物15时，同样显著抑 制MIF引起的巨噬细胞的趋化迀移，而且相比阳性对照化合物具有更好的抑制效果。（*) /X0. 05,（#) /XO. 01表示与单独用MIF处理时做的比较。
[0028] 实施例3 :细胞敏感性实验。
[0029] 实验原理：MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定 490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对培养细胞的杀伤效果。
[0030] 实验步骤：细胞活性通过MTT实验进行测定，BV-2小神经胶质细胞，THP-I细 胞或者RAW264. 7巨噬细胞接种于一式三份的密度为5XIO4的细胞/板中，将细胞在 glycocalyixns和LPS中处理24小时，MTT添加到每个板中并且在37°C下培养4小时，在培 养基废弃之后，将DMSO添加到溶解的甲瓒燃料中，在540 nm下测试光学密度，所有的实验 结果采用M±S. D.表示，所有数据采用SPSS程序(版本14. 0)进行单向方差分析和Student Newman Keul' s分析，p < 0. 01认为具有统计显著性。
[0031] 实验结果：以化合物I5为例，图3中左边第一列表示没有添加任何其他物质时，细 胞的活性；第二列表示添加脂多糖LPS后细胞的活性；第三列表示同时添加LPS和DEX之后 细胞的活性，DEX(Dexamethasone)是上市的抗炎药地塞米松，在这里作为对照；第四列表 示添加完LPS、DEX和MIF之后细胞的活性；第五列表示添加完LPS、DEX、MIF和IS0-1之后 细胞的活性；第六列表示添加完LPS、DEX、MIF和化合物15之后细胞的活性。总体来说，化 合物15对BV-2小神经胶质细胞、THP-I细胞和RAW264. 7巨噬细胞均没有明显毒性。
[0032] 实施例4 :化合物对小胶质细胞中LPS诱导炎性因子的影响。
[0033] 实验原理:MIF分子与抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性， 也不影响MIF的生物学活性。此种MIF标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生 特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在MIF作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变 成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反 应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
[0034] 实验步骤：将96孔板用鼠抗大鼠TNF-a抗体包被，并使用250y1含有1%牛血清 蛋白、5%蔗糖及0. 05%似队的PBS阻断抗体的非特异性结合位点，在4°C孵育16小时。然 后用洗涤液洗涤平板3次，加入大鼠TNF-a标准血清及测试血清样本，孵育2小时后进行 检测。检测抗体为生物素标记的大鼠TNF-a抗体。通过次级反应物链霉亲和素-辣根过 氧化物酶，与四甲基联苯胺反应显色。
[0035] 实验结果：以化合物15、18、1 13和I15为例，图4中第一列表示，没有添加其他物质 时TNF-a的含量；第二列表示添加脂多糖LPS之后可以显著诱导TNF-a的释放；第三、四、 五、六列表示添加完化合物15、1 8、113、115之后可以显著抑制^^诱导的炎性因子1即-€[的 释放，其中化合物1 5具有最好的抑制效果。
[0036] 实施例5 :化合物对MIF刺激的RAW264. 7巨噬细胞中ERK活化的影响实验。
[0037] 实验原理：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，"探针"是抗体，"显色"用标记的二抗。经 过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性 不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素 标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。
[0038] 实验步骤：将BV-2小胶质细胞以2.OXIO5密度接种于6孔板中，在37°C培养24 小时后用于实验。加药处理16小时后弃去培养基，用4°C的PBS清洗2次，再向每孔中加入 ImLPBS，将细胞吹下收集到离心管中，离心5分钟，弃去上清。加入细胞裂解液，震荡混匀 反应10分钟，再离心15分钟，收集上清液到离心管中。采用BCA法测定每个样品中蛋白质 的含量，并通过westernblot对蛋白质进行定性定量分析。
[0039] 实验结果：以化合物I5为例，采用westernblot方法检测了RAW264. 7细胞胞浆 中ERK1/2的蛋白质表达变化，以a-球管蛋白作为内参，发现该化合物可以抑制ERK1/2的 磷酸化(如图5所示)。
【主权项】
1. N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合物或其可药用盐在制备用于治疗与MIF 相关的炎症性疾病的药物中的用途，其中所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺类化合 物具有如式I所示的结构：其中： 札为氢或卤素； R2为氢、卤素、甲基或甲氧甲酰基； R3为氢、卤素、甲基、异丙基、甲氧甲酰基、苯氧基甲基、三氟甲基、苯基、3, 5-二氟苯基、 3, 5-二氯苯基或3, 5-二三氟甲基苯基； R4为氢、卤素、甲基、甲氧基或甲氧甲酰基； R5为氢、卤素、乙酰基、羧基或羟甲基； R6为氢、羟基、羧基、乙酰基、乙酰氨基、甲氧甲酰基、乙氧甲酰基、氨基甲酰基或苯甲酰 氨基； R7为氢或羧基。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺 类化合物选自如下所示的化合物中的任意一种：3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺 类化合物选自如权利要求2中所示的化合物15、1 8、113、115中的任意一种。4. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺 类化合物为如权利要求2中所示的化合物15。5. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述可药用盐为N-(苯基氨基硫代甲酰 基）苯甲酰胺类化合物与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述无机酸选自盐酸、磷酸和硫酸。7. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述有机酸选自醋酸、马来酸、枸橼酸、苯 磺酸、甲基苯磺酸、富马酸和酒石酸。8. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述与MIF相关的炎症性疾病选自类风湿 性关节炎、动脉粥样硬化和败血症。9. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的 药物为MIF抑制剂。
【专利摘要】本发明公开了N-(苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物的新用途。具体而言，本发明中如式I所示的N-(苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物具备MIF抑制剂的功能，可以显著抑制LPS诱导的炎性因子（TNF-α和NO）的释放，抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移，还可以抑制ERK1/2的磷酸化，可以用于制备与MIF相关的抗炎药物。
【IPC分类】A61K31/245, A61P9/10, A61K31/196, A61P29/00, A61P19/02, A61K31/17, A61P7/00
【公开号】CN104906082
【申请号】CN201510375278
【发明人】镇学初, 侯廷军, 许磊, 张瑜, 郑龙太
【申请人】苏州大学张家港工业技术研究院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月30日
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