汉防己甲素在制备药物中的用图
汉防己甲素在制备药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药制剂领域，特别涉及汉防己甲素在制备药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 慢性周围血管闭塞性疾病如下肢动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病足 等患者逐年增多。当病情加重而无法采用血流重建（bypass)、血管成形（angioplasty) 等方法治疗时患者往往面临截肢的危险。近年来治疗性血管新生（therapeutic neovascularization)的兴起，提供了治疗此类疾病的新思路。血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)作为特异性血管生长因子，可在体内诱导 血管新生，在治疗性血管新生中起着重要作用。
[0003] 汉防己甲素（tetrandrine，Tet)，其结构式为：
[0004]
[0005] 该化合物的分子式为C38H42O6N2，无色针状结晶，分子质量622,几乎不溶于水、石油 醚，溶于乙醚。该化合物为一双苄基异喹啉生物碱，主要存在于防己科多年生木质藤本植物 粉防己（StephaniatetrandraS.Moore)的根中，是一种具有抗炎、解热、止痛的传统中药。
[0006] 目前已知汉防己甲素的药理作用有：⑴具有抗肿瘤作用；（2)具有降血压、抗心 肌缺血和心律失常作用；(4)具有抗矽肺作用；(6)具有抗脂质过氧化作用；（7)防止四氧 嘧啶升高血糖的作用；(8)具有镇痛作用。
【发明内容】
[0007] 发明人意外地发现，汉防己甲素可以上调血管内皮生长因子（VEGF)的表达，并基 于此完成了本发明。
[0008] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防慢性周围血管闭塞性疾病的药 物中的用途。
[0009] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防下肢动脉硬化闭塞症的药物中 的用途。
[0010] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防血栓闭塞性脉管炎的药物中的 用途。
[0011] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防糖尿病足疾病的药物中的用途。
[0012] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于促进缺血组织周围侧支循环血管形成的药 物中的用途。
[0013] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于促进内源性的血管旁路形成的药物中的用 途。
[0014] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于改善和恢复缺血组织血流的药物中的用途。
[0015] 本发明公开了汉防己甲素在制备药物中的用途。由于汉防己甲素能够促进VEGF 上调表达，而VEGF能增加血管通透性，促进血管内皮细胞增殖，诱导血管新生，因此，汉防 己甲素具有制备治疗或预防慢性周围血管闭塞性疾病的药物的用途。
【附图说明】
[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图。
[0017] 图1为：汉防己甲素加入量与H9c2细胞VEGFmRNA表达的关系图；
[0018] 图2为：汉防己甲素加入量与H9c2细胞VEGF蛋白表达的关系图；
[0019] 图3A为：汉防己甲素与小鼠后下肢血流关系图；
[0020] 图3B为：激光多普勒灌注成像仪扫描小鼠后下肢血流图；
[0021] 图4A为：汉防己甲素与小鼠毛细血管密度关系图；
[0022] 图4B为：焚光标记小鼠缺血后下肢毛细血管密度图；
[0023] 图5A为：汉防己甲素与小鼠左室射血分数关系图；
[0024] 图5B为：汉防己甲素与小鼠左室短轴缩短率关系图；
[0025] 图6A为：小鼠心肌组织石赌切片Masson's-Trichrome染色图；
[0026] 图6B为：汉防己甲素与小鼠心肌梗死面积关系图。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028] 本发明对已知化合物汉防己甲素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领 域。具体地，由于血管内皮生长因子（VEGF)能增加血管通透性，促进血管内皮细胞增殖，促 进血管形成。汉防己甲素可以通过上调VEGF表达，从而促进缺血组织周围侧支循环血管的 形成或内源性的血管旁路的形成，改善和恢复缺血组织血流，这些作用有利于治疗和预防 慢性周围血管闭塞性疾病。
[0029] 本领域技术人员可以理解的是，汉防己甲素来源丰富，可做成口服剂型、注射剂 型、片剂型等，使用方便，注射剂能作肌肉注射和穴位注射，可作静脉注射。
[0030] 进一步需要说明的是，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的 一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及 的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
[0031] 本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽 然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此 作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和 操作方法是本领域公知的。
[0032] 下述各实施例中所米用的汉防己甲素购自于Sigma-Aldrich，Cat.No.T2695。当 然本领域技术人员也可以通过其它的途径来获取汉防己甲素，例如，采用现有技术从粉防 己植物中提取，本发明在此不作具体限定。采用其它途径获得的汉防己甲素进行下述各实 施例，只要给药量拆算成等当量即可。
[0033]H9c2 细胞为H9c2 (2-1)ATCCKNumber:CRL-1446?。
[0034]LectinI源自Vectorlaboratories，Cat.No.L-IlOO0
[0035]SU5416 源自Sigma-Aldrich，Cat.No.S8442 ;SU5416 是血管内皮细胞生长因子受 体2 (VEGFR2)选择性阻断剂。目前已经公认，VEGF对内皮细胞的增殖、分化作用是由VEGFR2 介导的。
[0036] AAV-solubleFlt是腺相关病毒表达的可溶性VEGF受体1，由美国西北大学芬伯 格心血管研宄所覃刚健教授惠赠。AAV-solubleFlt是本领域技术人员公知的VEGF的阻断 剂。
[0037]Masson's-Trichrome源自Solarbio,Cat.No.G1340。
[0038] 实施例一汉防己甲素对H9c2细胞VEGF的mRNA表达的影响
[0039]H9c2细胞以含10 %胎牛血清（FBS)的DMEM完全培养基常规培养，显微镜下镜 检80 %的FBS融合时，用0. 25 %胰酶消化，以每孔5XIO5个细胞接种于6孔板中，每孔接 种体积相同，并置于37°C，5%CO2培养箱中培养4 8h后，分别加入终摩尔浓度为5X1(T6M、 lXl〇-6M、2X10_7M和4X10_8M的汉防己甲素，同时设溶剂（0. 1%DMS0)对照组，每组重复3 次。不同浓度的Tet作用于H9c2细胞6h，用200y1冷的PBS冲洗，重复3次，彻底去除培 养基。提取H9c2细胞的RNA。RT-PCR检测VEGF的mRNA表达，结果如图1所示（数值用均 数土 标准差（mean土SD)表示，n= 3 ;*P〈0. 05, **P〈0. 01，与 0? 1%DMSO溶剂组相比）。
[0040]RT-PCR试验结果表明：Tet作用 6 小时，5X1(T6M、1X1(T6M、2XKT7M和 4XKT8M各 组，相对于对照组，分别可以上调VEGF的mRNA表达至1. 6倍、1. 7倍、2. 3倍和3. 0倍。Tet 可以浓度依赖性上调VEGF的mRNA表达。
[0041] 实施例二汉防己甲素对H9c2细胞VEGF的蛋白表达的影响
[0042]H9c2细胞以含10 %胎牛血清（FBS)的DMEM完全培养基常规培养，显微镜下镜检 80%的FBS融合时，用0. 25 %胰酶消化，以每孔5XIO5个细胞接种于96孔板中，每孔接 种体积相同，并置于37°C，5%CO2培养箱中培养48h后，分别加入终摩尔浓度为5X1(T6M、 1X10_6M、2X10_7M和4X10_8M的汉防己甲素，同时设溶剂（0. 1%DMS0)对照组，每组重复 6次。不同浓度的Tet作用于H9c2细胞24h，取细胞培养上清，ELISA检测VEGF蛋白水平， 结果如图2所示（数值用均数土标准差（mean土SD)表示，n= 6 ;*P〈0. 05, **P〈0. 01，与 0? 1%DMSO溶剂组相比）。
[0043]ELISA试验结果表明：Tet作用24小时，5XKT6M组VEGF的蛋白表达量 (176.4±9.l)pg/ml约为对照组（33.5±4.5)pg/ml的6倍。Tet可促进VEGF的蛋白表达。
[0044] 实施例三小鼠后下肢缺血模型试验
[0045]6-8周雄性C57BL/6J小鼠行后下肢缺血手术（HLI)，结扎股动脉。术后立即腹腔注 射给药。随机分为对照（生理盐水）组、Tet组、SU5416+生理盐水组、SU5416+Tet组，每组 5只小鼠。生理盐水、Tet、SU5416的给药计量为小鼠体重25mg/kg，每3天腹腔注射1次。
[0046] 检测小鼠后肢血流灌注：结扎股动脉前、结扎后立即给药的第7天、14天、28天用 激光多普勒灌注成像仪测定小鼠后肢血流灌注，将缺血侧后肢的血流除以非缺血后肢的血 流获得的比值作为校正后的组织血流。选择3个连续的血流值，取平均值。实验结果如图 3A和图3B所示（数值用均数土标准差（mean土SD)表示，n= 5 ;扑〈0.05，*扑〈0.01，与对 照组（生理盐水组）相比）。
[0047] 试验结果表明，汉防己甲素可增强小鼠缺血后下肢血流，该作用可被VEGFR2选择 性阻断剂SU5416所拮抗。
[0048] 检测毛细血管密度：分别在HLI术后第7天、14天、28天，50yLLectinI尾静脉 注射，10分钟后处死，分别取缺血肌肉组织制作石蜡切片，抗LectinI抗体染色，DAPI复染 细胞核，荧光显微镜下观察切片，LectinI阳性的管状结构被认定为毛细血管，毛细血管密 度由4个随机视野下单位面积内毛细管的个数表示。实验结果如图3A和图3B所示（数值 用均数土标准差（mean土SD)表示，n= 5。*P〈0. 05, #P〈0. 01，与对照组（生理盐水组） 相比）。
[0049] 试验结果表明，汉防己甲素可增强小鼠缺血后下肢血流和增加缺血组织毛细血管 密度，该作用可被VEGFR2选择性阻断剂SU5416所拮抗。
[0050] 实施例4小鼠心肌梗死模型试验
[0051] 在6-8周雄性C57BL/6J小鼠上行左冠状动脉前降支（LAD)起始部结扎手术诱导 心肌梗死（MI)。术后立即给药。随机分为对照组（生理盐水）、Tet组、Tet+AAV-soluble Fit、生理盐水+AAV-solubleFit组，每组5只小鼠。生理盐水、AAV-solubleFit和Tet的 给药计量为小鼠体重25mg/kg。从手术当天起，每日腹腔注射1次。
[0052] 检测心功能：MI术前，术后第7天、14天、28天对各组大鼠进行胸腔的超声心动图 检测，记录左室射血分数、左室短轴缩短率。试验结果如图5A和5B所示（数值用均数土 标准差（mean土SD)表示，n= 5 ;*P〈0. 05,与对照组（生理盐水组）相比）。
[0053] 试验结果表明，Tet增强小鼠MI术后左室射血分数、左室短轴缩短率，该作用可被 AAV-solubleFlt阻断。
[0054] 检测心肌梗死面积：选取Tet组和生理盐水组的小鼠，术后28天处死，取心肌缺血 边缘组织制做石赌切片，Masson's-Trichrome染色检测心肌梗死面积，如图6A所示。计算 纤维化区域占左室内部周长的百分比，如图6B所示（数值用均数土标准差（mean土SD)表 示，n = 5 ;#P〈〇. 01，与对照组（生理盐水组）相比）。
[0055] 试验结果表明，Tet增强小鼠MI术后心功能，减小小鼠MI术后28天心肌梗死面 积。
[0056] M在化学领域表示物质的摩尔浓度，是一个浓度单位，IM=lmol/L。
[0057] 胎牛血清Fetal Bovine Serum(FBS)和DMEM完全培养基皆为本领域技术人员常 用的药品，配制和使用方法皆为本领域公知常识。
[0058] 所述PBS为磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline)，本领域技术人员通常使 用磷酸钠盐缓冲溶液或磷酸钾盐缓冲溶液。所述冷的磷酸缓冲盐溶液可将磷酸缓冲溶液冰 浴或于冰箱中冷藏来实现。
[0059] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在 本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围 内。
【主权项】
1. 汉防己甲素在制备用于治疗或预防慢性周围血管闭塞性疾病的药物中的用途。2. 汉防己甲素在制备用于治疗或预防下肢动脉硬化闭塞症的药物中的用途。3. 汉防己甲素在制备用于治疗或预防血栓闭塞性脉管炎的药物中的用途。4. 汉防己甲素在制备用于治疗或预防糖尿病足疾病的药物中的用途。5. 汉防己甲素在制备用于促进缺血组织周围侧支循环血管形成的药物中的用途。6. 汉防己甲素在制备用于促进内源性的血管旁路形成的药物中的用途。7. 汉防己甲素在制备用于改善和恢复缺血组织血流的药物中的用途。
【专利摘要】本发明实施例公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防慢性周围血管闭塞性疾病的药物中的用途。
【IPC分类】A61P9/00, A61P3/10, A61K31/4748, A61P9/10, A61P9/14, A61P19/00
【公开号】CN104906098
【申请号】CN201510245381
【发明人】王虹, 覃刚健, 高秀梅, 陈璐, 田晓轩, 张晗, 毛浩萍, 苗琳, 张伯礼
【申请人】天津中医药大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月14日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药制剂领域，特别涉及汉防己甲素在制备药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 慢性周围血管闭塞性疾病如下肢动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病足 等患者逐年增多。当病情加重而无法采用血流重建（bypass)、血管成形（angioplasty) 等方法治疗时患者往往面临截肢的危险。近年来治疗性血管新生（therapeutic neovascularization)的兴起，提供了治疗此类疾病的新思路。血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)作为特异性血管生长因子，可在体内诱导 血管新生，在治疗性血管新生中起着重要作用。
[0003] 汉防己甲素（tetrandrine，Tet)，其结构式为：
[0004]
[0005] 该化合物的分子式为C38H42O6N2，无色针状结晶，分子质量622,几乎不溶于水、石油 醚，溶于乙醚。该化合物为一双苄基异喹啉生物碱，主要存在于防己科多年生木质藤本植物 粉防己（StephaniatetrandraS.Moore)的根中，是一种具有抗炎、解热、止痛的传统中药。
[0006] 目前已知汉防己甲素的药理作用有：⑴具有抗肿瘤作用；（2)具有降血压、抗心 肌缺血和心律失常作用；(4)具有抗矽肺作用；(6)具有抗脂质过氧化作用；（7)防止四氧 嘧啶升高血糖的作用；(8)具有镇痛作用。
【发明内容】
[0007] 发明人意外地发现，汉防己甲素可以上调血管内皮生长因子（VEGF)的表达，并基 于此完成了本发明。
[0008] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防慢性周围血管闭塞性疾病的药 物中的用途。
[0009] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防下肢动脉硬化闭塞症的药物中 的用途。
[0010] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防血栓闭塞性脉管炎的药物中的 用途。
[0011] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防糖尿病足疾病的药物中的用途。
[0012] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于促进缺血组织周围侧支循环血管形成的药 物中的用途。
[0013] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于促进内源性的血管旁路形成的药物中的用 途。
[0014] 本发明公开了汉防己甲素在制备用于改善和恢复缺血组织血流的药物中的用途。
[0015] 本发明公开了汉防己甲素在制备药物中的用途。由于汉防己甲素能够促进VEGF 上调表达，而VEGF能增加血管通透性，促进血管内皮细胞增殖，诱导血管新生，因此，汉防 己甲素具有制备治疗或预防慢性周围血管闭塞性疾病的药物的用途。
【附图说明】
[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图。
[0017] 图1为：汉防己甲素加入量与H9c2细胞VEGFmRNA表达的关系图；
[0018] 图2为：汉防己甲素加入量与H9c2细胞VEGF蛋白表达的关系图；
[0019] 图3A为：汉防己甲素与小鼠后下肢血流关系图；
[0020] 图3B为：激光多普勒灌注成像仪扫描小鼠后下肢血流图；
[0021] 图4A为：汉防己甲素与小鼠毛细血管密度关系图；
[0022] 图4B为：焚光标记小鼠缺血后下肢毛细血管密度图；
[0023] 图5A为：汉防己甲素与小鼠左室射血分数关系图；
[0024] 图5B为：汉防己甲素与小鼠左室短轴缩短率关系图；
[0025] 图6A为：小鼠心肌组织石赌切片Masson's-Trichrome染色图；
[0026] 图6B为：汉防己甲素与小鼠心肌梗死面积关系图。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028] 本发明对已知化合物汉防己甲素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领 域。具体地，由于血管内皮生长因子（VEGF)能增加血管通透性，促进血管内皮细胞增殖，促 进血管形成。汉防己甲素可以通过上调VEGF表达，从而促进缺血组织周围侧支循环血管的 形成或内源性的血管旁路的形成，改善和恢复缺血组织血流，这些作用有利于治疗和预防 慢性周围血管闭塞性疾病。
[0029] 本领域技术人员可以理解的是，汉防己甲素来源丰富，可做成口服剂型、注射剂 型、片剂型等，使用方便，注射剂能作肌肉注射和穴位注射，可作静脉注射。
[0030] 进一步需要说明的是，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的 一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及 的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
[0031] 本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽 然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此 作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和 操作方法是本领域公知的。
[0032] 下述各实施例中所米用的汉防己甲素购自于Sigma-Aldrich，Cat.No.T2695。当 然本领域技术人员也可以通过其它的途径来获取汉防己甲素，例如，采用现有技术从粉防 己植物中提取，本发明在此不作具体限定。采用其它途径获得的汉防己甲素进行下述各实 施例，只要给药量拆算成等当量即可。
[0033]H9c2 细胞为H9c2 (2-1)ATCCKNumber:CRL-1446?。
[0034]LectinI源自Vectorlaboratories，Cat.No.L-IlOO0
[0035]SU5416 源自Sigma-Aldrich，Cat.No.S8442 ;SU5416 是血管内皮细胞生长因子受 体2 (VEGFR2)选择性阻断剂。目前已经公认，VEGF对内皮细胞的增殖、分化作用是由VEGFR2 介导的。
[0036] AAV-solubleFlt是腺相关病毒表达的可溶性VEGF受体1，由美国西北大学芬伯 格心血管研宄所覃刚健教授惠赠。AAV-solubleFlt是本领域技术人员公知的VEGF的阻断 剂。
[0037]Masson's-Trichrome源自Solarbio,Cat.No.G1340。
[0038] 实施例一汉防己甲素对H9c2细胞VEGF的mRNA表达的影响
[0039]H9c2细胞以含10 %胎牛血清（FBS)的DMEM完全培养基常规培养，显微镜下镜 检80 %的FBS融合时，用0. 25 %胰酶消化，以每孔5XIO5个细胞接种于6孔板中，每孔接 种体积相同，并置于37°C，5%CO2培养箱中培养4 8h后，分别加入终摩尔浓度为5X1(T6M、 lXl〇-6M、2X10_7M和4X10_8M的汉防己甲素，同时设溶剂（0. 1%DMS0)对照组，每组重复3 次。不同浓度的Tet作用于H9c2细胞6h，用200y1冷的PBS冲洗，重复3次，彻底去除培 养基。提取H9c2细胞的RNA。RT-PCR检测VEGF的mRNA表达，结果如图1所示（数值用均 数土 标准差（mean土SD)表示，n= 3 ;*P〈0. 05, **P〈0. 01，与 0? 1%DMSO溶剂组相比）。
[0040]RT-PCR试验结果表明：Tet作用 6 小时，5X1(T6M、1X1(T6M、2XKT7M和 4XKT8M各 组，相对于对照组，分别可以上调VEGF的mRNA表达至1. 6倍、1. 7倍、2. 3倍和3. 0倍。Tet 可以浓度依赖性上调VEGF的mRNA表达。
[0041] 实施例二汉防己甲素对H9c2细胞VEGF的蛋白表达的影响
[0042]H9c2细胞以含10 %胎牛血清（FBS)的DMEM完全培养基常规培养，显微镜下镜检 80%的FBS融合时，用0. 25 %胰酶消化，以每孔5XIO5个细胞接种于96孔板中，每孔接 种体积相同，并置于37°C，5%CO2培养箱中培养48h后，分别加入终摩尔浓度为5X1(T6M、 1X10_6M、2X10_7M和4X10_8M的汉防己甲素，同时设溶剂（0. 1%DMS0)对照组，每组重复 6次。不同浓度的Tet作用于H9c2细胞24h，取细胞培养上清，ELISA检测VEGF蛋白水平， 结果如图2所示（数值用均数土标准差（mean土SD)表示，n= 6 ;*P〈0. 05, **P〈0. 01，与 0? 1%DMSO溶剂组相比）。
[0043]ELISA试验结果表明：Tet作用24小时，5XKT6M组VEGF的蛋白表达量 (176.4±9.l)pg/ml约为对照组（33.5±4.5)pg/ml的6倍。Tet可促进VEGF的蛋白表达。
[0044] 实施例三小鼠后下肢缺血模型试验
[0045]6-8周雄性C57BL/6J小鼠行后下肢缺血手术（HLI)，结扎股动脉。术后立即腹腔注 射给药。随机分为对照（生理盐水）组、Tet组、SU5416+生理盐水组、SU5416+Tet组，每组 5只小鼠。生理盐水、Tet、SU5416的给药计量为小鼠体重25mg/kg，每3天腹腔注射1次。
[0046] 检测小鼠后肢血流灌注：结扎股动脉前、结扎后立即给药的第7天、14天、28天用 激光多普勒灌注成像仪测定小鼠后肢血流灌注，将缺血侧后肢的血流除以非缺血后肢的血 流获得的比值作为校正后的组织血流。选择3个连续的血流值，取平均值。实验结果如图 3A和图3B所示（数值用均数土标准差（mean土SD)表示，n= 5 ;扑〈0.05，*扑〈0.01，与对 照组（生理盐水组）相比）。
[0047] 试验结果表明，汉防己甲素可增强小鼠缺血后下肢血流，该作用可被VEGFR2选择 性阻断剂SU5416所拮抗。
[0048] 检测毛细血管密度：分别在HLI术后第7天、14天、28天，50yLLectinI尾静脉 注射，10分钟后处死，分别取缺血肌肉组织制作石蜡切片，抗LectinI抗体染色，DAPI复染 细胞核，荧光显微镜下观察切片，LectinI阳性的管状结构被认定为毛细血管，毛细血管密 度由4个随机视野下单位面积内毛细管的个数表示。实验结果如图3A和图3B所示（数值 用均数土标准差（mean土SD)表示，n= 5。*P〈0. 05, #P〈0. 01，与对照组（生理盐水组） 相比）。
[0049] 试验结果表明，汉防己甲素可增强小鼠缺血后下肢血流和增加缺血组织毛细血管 密度，该作用可被VEGFR2选择性阻断剂SU5416所拮抗。
[0050] 实施例4小鼠心肌梗死模型试验
[0051] 在6-8周雄性C57BL/6J小鼠上行左冠状动脉前降支（LAD)起始部结扎手术诱导 心肌梗死（MI)。术后立即给药。随机分为对照组（生理盐水）、Tet组、Tet+AAV-soluble Fit、生理盐水+AAV-solubleFit组，每组5只小鼠。生理盐水、AAV-solubleFit和Tet的 给药计量为小鼠体重25mg/kg。从手术当天起，每日腹腔注射1次。
[0052] 检测心功能：MI术前，术后第7天、14天、28天对各组大鼠进行胸腔的超声心动图 检测，记录左室射血分数、左室短轴缩短率。试验结果如图5A和5B所示（数值用均数土 标准差（mean土SD)表示，n= 5 ;*P〈0. 05,与对照组（生理盐水组）相比）。
[0053] 试验结果表明，Tet增强小鼠MI术后左室射血分数、左室短轴缩短率，该作用可被 AAV-solubleFlt阻断。
[0054] 检测心肌梗死面积：选取Tet组和生理盐水组的小鼠，术后28天处死，取心肌缺血 边缘组织制做石赌切片，Masson's-Trichrome染色检测心肌梗死面积，如图6A所示。计算 纤维化区域占左室内部周长的百分比，如图6B所示（数值用均数土标准差（mean土SD)表 示，n = 5 ;#P〈〇. 01，与对照组（生理盐水组）相比）。
[0055] 试验结果表明，Tet增强小鼠MI术后心功能，减小小鼠MI术后28天心肌梗死面 积。
[0056] M在化学领域表示物质的摩尔浓度，是一个浓度单位，IM=lmol/L。
[0057] 胎牛血清Fetal Bovine Serum(FBS)和DMEM完全培养基皆为本领域技术人员常 用的药品，配制和使用方法皆为本领域公知常识。
[0058] 所述PBS为磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline)，本领域技术人员通常使 用磷酸钠盐缓冲溶液或磷酸钾盐缓冲溶液。所述冷的磷酸缓冲盐溶液可将磷酸缓冲溶液冰 浴或于冰箱中冷藏来实现。
[0059] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在 本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围 内。
【主权项】
1. 汉防己甲素在制备用于治疗或预防慢性周围血管闭塞性疾病的药物中的用途。2. 汉防己甲素在制备用于治疗或预防下肢动脉硬化闭塞症的药物中的用途。3. 汉防己甲素在制备用于治疗或预防血栓闭塞性脉管炎的药物中的用途。4. 汉防己甲素在制备用于治疗或预防糖尿病足疾病的药物中的用途。5. 汉防己甲素在制备用于促进缺血组织周围侧支循环血管形成的药物中的用途。6. 汉防己甲素在制备用于促进内源性的血管旁路形成的药物中的用途。7. 汉防己甲素在制备用于改善和恢复缺血组织血流的药物中的用途。
【专利摘要】本发明实施例公开了汉防己甲素在制备用于治疗或预防慢性周围血管闭塞性疾病的药物中的用途。
【IPC分类】A61P9/00, A61P3/10, A61K31/4748, A61P9/10, A61P9/14, A61P19/00
【公开号】CN104906098
【申请号】CN201510245381
【发明人】王虹, 覃刚健, 高秀梅, 陈璐, 田晓轩, 张晗, 毛浩萍, 苗琳, 张伯礼
【申请人】天津中医药大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月14日
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