一种氯喹与长春新碱的药物组合的制作方法
一种氯喹与长春新碱的药物组合的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物技术领域，尤其是涉及一种氯喹与长春新碱的药物组合。
【背景技术】
[0002] 目前儿童肿瘤比较多发，通常采用手术或化疗治疗，比如儿童视网膜母细胞瘤的 治疗方式主要是手术摘除眼球和局部化疗，其中摘除眼球的方法虽然可根治肿瘤，但由于 付出代价高昂，已逐渐被淘汰，化疗成为主要的方法，细胞毒性的药物是目前各类儿童实体 肿瘤的主流化疗方法；化疗方案局限于传统细胞毒性药物长春新碱、卡铂、环磷酰胺，长春 新碱（vincristine，VCR)最为常用，微管抑制剂长春新碱具有广谱抗肿瘤作用，但毒副作 用较高；溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine，CQ)是一种弱碱，作用于溶酶体，可抑制溶酶体 酸性环境对细胞内各类蛋白和细胞器的降解，在临床上用于治疗疟疾，由于发现氯喹可以 抑制自噬，一种细胞自我降解的生理机制和代谢途径，而自噬对肿瘤细胞存活通常具有促 进作用，故氯喹被用于各类恶性肿瘤的实验性治疗和临床实验，包括乳腺癌，黑色素瘤，肝 癌，胰腺癌等多种成人高度恶性肿瘤。
【发明内容】
[0003] 本发明是为了降低化疗用药量和毒性，增加化疗效果，提供一种用量少，毒性低， 效果显著的氯喹与长春新碱的药物组合。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种氯喹与长春新碱的药物组合， 包括氯喹、长春新碱，二者化学式分别为：
[0005] 本方案通过细胞系体外培养和细胞活力实验，发现溶酶体抑制剂氯喹（CQ)与化 疗药物微管抑制剂长春新碱（VCR)可协同杀伤、抑制多种儿童实体肿瘤，包括视网膜母细 胞瘤和肾母细胞瘤；其中，微管抑制剂长春新碱造成肿瘤细胞有丝分裂障碍，而溶酶体抑制 剂氯喹造成肿瘤细胞细胞代谢障碍，二者合力致肿瘤细胞凋亡。
[0006] 作为优选，所述的药物组合中，氯喹含量为2-40yM，长春新碱含量为10nM。氯喹 与长春新碱单用可以抑制HX0-Rb44细胞，两种药物效果强于单用，并可以促进细胞凋亡； 低剂量的药物对细胞自噬无抑制作用，但仍可以抑制肿瘤细胞生长和促凋亡。
[0007] 作为优选，所述的药物组合中，氯喹含量为5-50yM，长春新碱含量为20nM。单独 使用氯喹可抑制肾母细胞瘤细胞G401增殖并诱导凋亡，而5yM以上的氯喹联用长春新碱 可显著提高抑制肾母细胞瘤细胞G401增殖并诱导凋亡的效果。
[0008] 因此，本发明具有如下有益效果：（1)与常规用药量相比，本方案用量少，毒性低； (2)杀伤、抑制视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤的效果显著。
【附图说明】
[0009] 图1是本发明针对视网膜母细胞瘤效果示意图一。
[0010] 图2是本发明针对视网膜母细胞瘤效果示意图二。
[0011] 图3是本发明针对肾母细胞瘤效果示意图。
[0012] 图4是本发明针对视网膜母细胞瘤机制图片，包括HRP化学发光法显影自噬相关 蛋白条带图片。
[0013] 图5是本发明不同含量组合针对视网膜母细胞瘤的HRP化学发光法显影蛋白条带 示意图。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图对本发明做进一步的描述。
[0015] 实施例1，一种氯喹与长春新碱的药物组合，包括氯喹、长春新碱，其中氯喹含量为 2-40yM，长春新碱含量为10nM。
[0016] 具体实施过程是，
[0017] 视网膜母细胞瘤HX0-Rb44细胞培养于1640培养基（含10 %胎牛血清），生长状 态良好时接种于96孔板，加入药物培养24小时，通过CCK-8法检测细胞相对数目，计算细 药物对细胞的抑制率；
[0018] 细胞系和培养方法：视网膜母细胞瘤细胞系HX0-Rb44,此细胞为悬浮细胞，用含 10%胎牛血清的1640培养基培养于37°C孵箱，含5%二氧化碳和饱和水蒸气；
[0019]主要试剂：氯喹（CQ)，长春新碱（VCR) ;40%丙烯酰胺凝胶贮存液，Tris碱，TEMED， SDS，蛋白酶抑制剂，蛋白上样标准品，CCK8试剂盒，BCA试剂盒和HRP化学放光检测试剂 盒；
[0020] 抗体：一抗包括LC3,GAPDH，p62,caspase3;抗鼠与抗兔HRP偶联二抗；
[0021] 细胞活力实验：将视网膜母细胞瘤细胞HX0_Rb44以IX10A4个/孔的密度接 种于96孔板，加入药物后继续培养24小时，然后加入CCK8试剂，用酶标仪读取405nm吸光 度，根据读数做出细胞抑制曲线；
[0022] 统计分析：每种药物剂量重复5次，每次4个复孔，结果以平均值土标准误表示， 在2-40yM区间，氯喹可以协同长春新碱（IOnM)对肿瘤细胞的抑制效果，药物联用对肿瘤 细胞抑制率显著提高，如图1、图2所示，同时，通过等辐射分析，证明两个药物对肿瘤细胞 的抑制确为协同作用；
[0023] 免疫杂交（Westernblotting)实验：细胞用药物处理后离心、PBS洗涤后，用预冷 的RIPA缓冲液（加入蛋白酶和磷酸化酶抑制剂）消化，BCA法进行蛋白定量后，用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，每孔上样20yg的蛋白，用适当的抗体进行免疫杂交后，HRP化学发光 法显影蛋白条带，如图4所不，两种药物联用（CQ5yM，VCR10_20nM)可显著提尚调亡标记 蛋白caspase3片段的水平，而对自噬相关蛋白LC3与p62的水平影响不大。
[0024] 实施例2, 一种氯喹与长春新碱的药物组合，包括氯喹、长春新碱，其中氯喹含量为 5-50yM，长春新碱含量为20nM;
[0025] 具体实施过程是，
[0026] 肾母细胞瘤6401细胞培养于此&^54培养基（含10%胎牛血清），生长状态良好 时，接种于96孔板。加入长春新碱、氯喹共同培养24小时，然后通过CCK-8法检测细胞相 对数目，计算药物对细胞的抑制率；
[0027] 细胞系和培养方法：肾母细胞瘤G401，此细胞为贴壁细胞，用含10%胎牛血清的 McCoy5A培养基培养于37°C孵箱，含5%二氧化碳和饱和水蒸气；
[0028] 主要试剂：氯喹（CQ)，长春新碱（VCR) ;40%丙烯酰胺凝胶贮存液，Tris碱，TEMED， SDS，蛋白酶抑制剂，蛋白上样标准品，CCK8试剂盒，BCA试剂盒和HRP化学放光检测试剂 盒；
[0029] 抗体：一抗包括LC3,GAPDH，p62,caspase3 ;抗鼠与抗兔HRP偶联二抗；
[0030] 细胞活力实验：将肾母细胞瘤G401细胞以IX10八4个/孔的密度接种于96孔 板，加入药物后继续培养24小时，然后加入CCK8试剂，用酶标仪读取405nm吸光度。根据 读数计算细胞相对数目，做出药物对细胞的抑制曲线；
[0031] 统计分析：每种药物剂量重复5次，每次4个复孔，结果以平均值土标准误表示， 5-50yM氯喹可以抑制肾母细胞瘤G401，但效果很快达到饱和，20nM长春新碱可抑制G401 细胞，加入5-50yM氯喹后，抑瘤作用产生协同和叠加，联用的抑瘤率显著高于单用，如图3 所示，其中X轴为氯喹作用浓度（yM)，Y轴为抑瘤率（％)，曲线一为氯喹单独作用效果，曲 线二为氯喹添加长春新碱组合作用效果；
[0032] 免疫杂交（Westernblotting)实验：细胞用药物处理后离心、PBS洗涤后，用预冷 的RIPA缓冲液（加入蛋白酶和磷酸化酶抑制剂）消化，BCA法进行蛋白定量后，用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，每孔上样20yg的蛋白，用适当的抗体进行免疫杂交后，HRP化学发光 法显影蛋白条带，如图5所示；有效抑制G401细胞的药物单用与联用条件下（VCR20nM，CQ 5yM)，凋亡相关蛋白caspase3片段均明显升高，20nMVCR诱导细胞凋亡能力强于5yM CQ;而两种药物联用后，caspase3片段水平比药物单用组进一步显著上升，提示细胞凋亡 水平增加；同时，20nMVCR与5yMCQ对细胞自噬也产生一定影响，自噬受到抑制，体现为 自噬底物LC3-II和p62水平增加，药物组合使用组更加明显；与HX0-Rb44细胞中观察到的 现象相比，两种药物对两种肿瘤细胞均有诱导凋亡的作用，而对自噬调节的作用不同，药物 作用后肾母细胞瘤G401细胞中自噬水平发生改变，而视网膜母细胞瘤HX0-Rb44细胞自噬 水平未发生改变。
【主权项】
1. 一种氯喹与长春新碱的药物组合，其特征在于，包括氯喹、长春新碱，氯喹化学式为，长春新碱化学式为，2. 根据权利要求1所述的一种氯喹与长春新碱的药物组合，其特征是，所述的药物组 合中，氯喹含量为2-40yM，长春新碱含量为10-100nM。3. 根据权利要求1所述的一种氯喹与长春新碱的药物组合，其特征是，所述的药物组 合中，氯喹含量为5-50yM，长春新碱含量为10nM。
【专利摘要】本发明公开了一种氯喹与长春新碱的药物组合，包括氯喹、长春新碱，其中氯喹含量为2-40μM，长春新碱含量为10nM，或者氯喹含量为5-50μM，长春新碱含量为20nM；两种剂量的氯喹与长春新碱可协同杀伤、抑制包括视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤在内的多种儿童实体肿瘤，可作为化疗药物使用。本发明与常规用药量相比，用量少，毒性低；杀伤、抑制视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤的效果显著。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/475, A61K31/4706
【公开号】CN104906099
【申请号】CN201510378133
【发明人】陈希
【申请人】杭州泛普生物科技有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物技术领域，尤其是涉及一种氯喹与长春新碱的药物组合。
【背景技术】
[0002] 目前儿童肿瘤比较多发，通常采用手术或化疗治疗，比如儿童视网膜母细胞瘤的 治疗方式主要是手术摘除眼球和局部化疗，其中摘除眼球的方法虽然可根治肿瘤，但由于 付出代价高昂，已逐渐被淘汰，化疗成为主要的方法，细胞毒性的药物是目前各类儿童实体 肿瘤的主流化疗方法；化疗方案局限于传统细胞毒性药物长春新碱、卡铂、环磷酰胺，长春 新碱（vincristine，VCR)最为常用，微管抑制剂长春新碱具有广谱抗肿瘤作用，但毒副作 用较高；溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine，CQ)是一种弱碱，作用于溶酶体，可抑制溶酶体 酸性环境对细胞内各类蛋白和细胞器的降解，在临床上用于治疗疟疾，由于发现氯喹可以 抑制自噬，一种细胞自我降解的生理机制和代谢途径，而自噬对肿瘤细胞存活通常具有促 进作用，故氯喹被用于各类恶性肿瘤的实验性治疗和临床实验，包括乳腺癌，黑色素瘤，肝 癌，胰腺癌等多种成人高度恶性肿瘤。
【发明内容】
[0003] 本发明是为了降低化疗用药量和毒性，增加化疗效果，提供一种用量少，毒性低， 效果显著的氯喹与长春新碱的药物组合。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种氯喹与长春新碱的药物组合， 包括氯喹、长春新碱，二者化学式分别为：
[0005] 本方案通过细胞系体外培养和细胞活力实验，发现溶酶体抑制剂氯喹（CQ)与化 疗药物微管抑制剂长春新碱（VCR)可协同杀伤、抑制多种儿童实体肿瘤，包括视网膜母细 胞瘤和肾母细胞瘤；其中，微管抑制剂长春新碱造成肿瘤细胞有丝分裂障碍，而溶酶体抑制 剂氯喹造成肿瘤细胞细胞代谢障碍，二者合力致肿瘤细胞凋亡。
[0006] 作为优选，所述的药物组合中，氯喹含量为2-40yM，长春新碱含量为10nM。氯喹 与长春新碱单用可以抑制HX0-Rb44细胞，两种药物效果强于单用，并可以促进细胞凋亡； 低剂量的药物对细胞自噬无抑制作用，但仍可以抑制肿瘤细胞生长和促凋亡。
[0007] 作为优选，所述的药物组合中，氯喹含量为5-50yM，长春新碱含量为20nM。单独 使用氯喹可抑制肾母细胞瘤细胞G401增殖并诱导凋亡，而5yM以上的氯喹联用长春新碱 可显著提高抑制肾母细胞瘤细胞G401增殖并诱导凋亡的效果。
[0008] 因此，本发明具有如下有益效果：（1)与常规用药量相比，本方案用量少，毒性低； (2)杀伤、抑制视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤的效果显著。
【附图说明】
[0009] 图1是本发明针对视网膜母细胞瘤效果示意图一。
[0010] 图2是本发明针对视网膜母细胞瘤效果示意图二。
[0011] 图3是本发明针对肾母细胞瘤效果示意图。
[0012] 图4是本发明针对视网膜母细胞瘤机制图片，包括HRP化学发光法显影自噬相关 蛋白条带图片。
[0013] 图5是本发明不同含量组合针对视网膜母细胞瘤的HRP化学发光法显影蛋白条带 示意图。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图对本发明做进一步的描述。
[0015] 实施例1，一种氯喹与长春新碱的药物组合，包括氯喹、长春新碱，其中氯喹含量为 2-40yM，长春新碱含量为10nM。
[0016] 具体实施过程是，
[0017] 视网膜母细胞瘤HX0-Rb44细胞培养于1640培养基（含10 %胎牛血清），生长状 态良好时接种于96孔板，加入药物培养24小时，通过CCK-8法检测细胞相对数目，计算细 药物对细胞的抑制率；
[0018] 细胞系和培养方法：视网膜母细胞瘤细胞系HX0-Rb44,此细胞为悬浮细胞，用含 10%胎牛血清的1640培养基培养于37°C孵箱，含5%二氧化碳和饱和水蒸气；
[0019]主要试剂：氯喹（CQ)，长春新碱（VCR) ;40%丙烯酰胺凝胶贮存液，Tris碱，TEMED， SDS，蛋白酶抑制剂，蛋白上样标准品，CCK8试剂盒，BCA试剂盒和HRP化学放光检测试剂 盒；
[0020] 抗体：一抗包括LC3,GAPDH，p62,caspase3;抗鼠与抗兔HRP偶联二抗；
[0021] 细胞活力实验：将视网膜母细胞瘤细胞HX0_Rb44以IX10A4个/孔的密度接 种于96孔板，加入药物后继续培养24小时，然后加入CCK8试剂，用酶标仪读取405nm吸光 度，根据读数做出细胞抑制曲线；
[0022] 统计分析：每种药物剂量重复5次，每次4个复孔，结果以平均值土标准误表示， 在2-40yM区间，氯喹可以协同长春新碱（IOnM)对肿瘤细胞的抑制效果，药物联用对肿瘤 细胞抑制率显著提高，如图1、图2所示，同时，通过等辐射分析，证明两个药物对肿瘤细胞 的抑制确为协同作用；
[0023] 免疫杂交（Westernblotting)实验：细胞用药物处理后离心、PBS洗涤后，用预冷 的RIPA缓冲液（加入蛋白酶和磷酸化酶抑制剂）消化，BCA法进行蛋白定量后，用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，每孔上样20yg的蛋白，用适当的抗体进行免疫杂交后，HRP化学发光 法显影蛋白条带，如图4所不，两种药物联用（CQ5yM，VCR10_20nM)可显著提尚调亡标记 蛋白caspase3片段的水平，而对自噬相关蛋白LC3与p62的水平影响不大。
[0024] 实施例2, 一种氯喹与长春新碱的药物组合，包括氯喹、长春新碱，其中氯喹含量为 5-50yM，长春新碱含量为20nM;
[0025] 具体实施过程是，
[0026] 肾母细胞瘤6401细胞培养于此&^54培养基（含10%胎牛血清），生长状态良好 时，接种于96孔板。加入长春新碱、氯喹共同培养24小时，然后通过CCK-8法检测细胞相 对数目，计算药物对细胞的抑制率；
[0027] 细胞系和培养方法：肾母细胞瘤G401，此细胞为贴壁细胞，用含10%胎牛血清的 McCoy5A培养基培养于37°C孵箱，含5%二氧化碳和饱和水蒸气；
[0028] 主要试剂：氯喹（CQ)，长春新碱（VCR) ;40%丙烯酰胺凝胶贮存液，Tris碱，TEMED， SDS，蛋白酶抑制剂，蛋白上样标准品，CCK8试剂盒，BCA试剂盒和HRP化学放光检测试剂 盒；
[0029] 抗体：一抗包括LC3,GAPDH，p62,caspase3 ;抗鼠与抗兔HRP偶联二抗；
[0030] 细胞活力实验：将肾母细胞瘤G401细胞以IX10八4个/孔的密度接种于96孔 板，加入药物后继续培养24小时，然后加入CCK8试剂，用酶标仪读取405nm吸光度。根据 读数计算细胞相对数目，做出药物对细胞的抑制曲线；
[0031] 统计分析：每种药物剂量重复5次，每次4个复孔，结果以平均值土标准误表示， 5-50yM氯喹可以抑制肾母细胞瘤G401，但效果很快达到饱和，20nM长春新碱可抑制G401 细胞，加入5-50yM氯喹后，抑瘤作用产生协同和叠加，联用的抑瘤率显著高于单用，如图3 所示，其中X轴为氯喹作用浓度（yM)，Y轴为抑瘤率（％)，曲线一为氯喹单独作用效果，曲 线二为氯喹添加长春新碱组合作用效果；
[0032] 免疫杂交（Westernblotting)实验：细胞用药物处理后离心、PBS洗涤后，用预冷 的RIPA缓冲液（加入蛋白酶和磷酸化酶抑制剂）消化，BCA法进行蛋白定量后，用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，每孔上样20yg的蛋白，用适当的抗体进行免疫杂交后，HRP化学发光 法显影蛋白条带，如图5所示；有效抑制G401细胞的药物单用与联用条件下（VCR20nM，CQ 5yM)，凋亡相关蛋白caspase3片段均明显升高，20nMVCR诱导细胞凋亡能力强于5yM CQ;而两种药物联用后，caspase3片段水平比药物单用组进一步显著上升，提示细胞凋亡 水平增加；同时，20nMVCR与5yMCQ对细胞自噬也产生一定影响，自噬受到抑制，体现为 自噬底物LC3-II和p62水平增加，药物组合使用组更加明显；与HX0-Rb44细胞中观察到的 现象相比，两种药物对两种肿瘤细胞均有诱导凋亡的作用，而对自噬调节的作用不同，药物 作用后肾母细胞瘤G401细胞中自噬水平发生改变，而视网膜母细胞瘤HX0-Rb44细胞自噬 水平未发生改变。
【主权项】
1. 一种氯喹与长春新碱的药物组合，其特征在于，包括氯喹、长春新碱，氯喹化学式为，长春新碱化学式为，2. 根据权利要求1所述的一种氯喹与长春新碱的药物组合，其特征是，所述的药物组 合中，氯喹含量为2-40yM，长春新碱含量为10-100nM。3. 根据权利要求1所述的一种氯喹与长春新碱的药物组合，其特征是，所述的药物组 合中，氯喹含量为5-50yM，长春新碱含量为10nM。
【专利摘要】本发明公开了一种氯喹与长春新碱的药物组合，包括氯喹、长春新碱，其中氯喹含量为2-40μM，长春新碱含量为10nM，或者氯喹含量为5-50μM，长春新碱含量为20nM；两种剂量的氯喹与长春新碱可协同杀伤、抑制包括视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤在内的多种儿童实体肿瘤，可作为化疗药物使用。本发明与常规用药量相比，用量少，毒性低；杀伤、抑制视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤的效果显著。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/475, A61K31/4706
【公开号】CN104906099
【申请号】CN201510378133
【发明人】陈希
【申请人】杭州泛普生物科技有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月29日
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