TGF-β1受体阻断剂在制备治疗包虫病的药物中应用
TGF-β1受体阻断剂在制备治疗包虫病的药物中应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种治疗包虫病的方法，具体涉及TGF-M受体阻断剂在制备治疗包 虫病的药物中应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 包虫病（Hydatiddisease)又称棘球蝴病，是棘球蝴寄生于中间宿主引起的一种 严重影响人畜健康的寄生虫疾病。包虫病在手术治疗过程中或者在正常患者体内，由于包 囊意外破裂，部分原头节可能进入组织内，造成再次感染，也给包虫病的治疗带来很大困 难。
[0003] 针对包虫病的治疗，本领域已发展出了多种治疗方案，主要是以外科手术为主，内 科药物化疗为辅的方法。但此方法有许多弊端，如手术治疗对人体损伤较大，且易复发。目 前，主要的抗包虫病药物有吡喹酮和苯并咪唑类药物两大类，但是由于这两类药物仍然存 在许多不足之处，如：毒副作用较大，且个体差异性大，有的患者不能耐受，或产生耐药性， 有文献报道，其化疗在随访一年中仅有30 %的患者被治愈，30 %~50 %的患者改善，并且 疗效不稳定。
[0004]另外，包虫病与其他寄生虫病一样，是一个慢性感染过程，其对宿主的作用也是慢 性而持久的过程，两者之间的相互作用及其致病的免疫机制十分复杂，加之此病发病隐匿， 多数患者都是因包虫病的并发症而来医院就诊。
[0005] 为了进一步提高治疗效果，近年来，国内外学者在包虫致病机理、新型抗包虫药物 等领域开展了大量的研宄和临床工作。
[0006]转化生长因子-0(transforminggrowthfactor-0，TGF-0 )是属于一组新近发 现的调节细胞生长和分化的TGF-0超家族。TGF-M属于分泌性多肽因子，分布于多种组 织细胞中，TGF-M是种多功能生长因子。TGF-0具有调节细胞增殖、生长控制、分化、刺激 细胞外基质的形成、增加粘附分子表达和抑制免疫应答等多种生物功能。
[0007]Q34+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcells，Tregs)是体内天然存在的、具有 独特调节功能的T细胞亚群，其不同于Thl和Th2,它通过分泌抑制性细胞因子TGF-M和 IL-10细胞膜分子或与其他细胞直接接触等方式发挥广泛的免疫抑制作用，抑制体内T淋 巴细胞及NK细胞等多种免疫细胞的增殖和活化。包虫病患者血清中发现，IL-10和TGF- 0 在包虫病组的表达显著高于健康对照组；体外小鼠实验发现，原头蝴/囊液与小鼠淋巴细 胞共培养组TGF-M显著高于对照组；提示可能在这种特殊感染状态下，能够增强免疫抑 制相关性免疫应答刺激Treg细胞，从而加强对宿主的免疫抑制作用。
[0008] 研宄发现，虫体之所以能在宿主体内长期生存，依赖于对宿主的免疫逃避功能。目 前关于虫体免疫逃逸的研宄主要是Thl/Th2的漂移可能产生的免疫逃避。Treg细胞是一种 新型的T细胞亚群，是有别于Thl和Th2效应T细胞，在包虫病病灶附近发现Treg细胞的 特异性因子及相关因子TGF-0、IL-10高表达，申请人通过之前的研宄发现，细粒棘球蝴/ 囊液感染可使小鼠Treg细胞数量、特异性因子及相关因子TGF-0增加。因此，理论上讲， 利用TGF-M受体阻断剂在可用于预防包虫病的复发，但是如何利用TGF-M受体阻断剂 制备用于治疗包虫病，特别是针对细粒棘球蝴感染中的宿主，尚无报道。
[0009] 从目前的临床实践看，包虫病的临床诊断和防治研宄工作尽管已经取得了很大的 进步，但是，研发一种毒副作用小、药效稳定、能有效治疗细粒棘球蝴感染并预防其复发的 药物及其应用，仍然是本领域亟待解决的难题。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是通过深入研宄探索一种利用TGF-M受体阻断剂有效治疗细粒 棘球蝴感染及其复发的方法。
[0011] 申请人深入研宄了包虫病发病的生物学机理以及感染初期宿主免疫应答机制。申 请人通过建立细粒棘球蝴感染小鼠动物模型，研宄发现细粒棘球蝴通过促进脾细胞分泌抑 制性分子TGF-M而促使⑶4+CD25+T细胞分化，从而下调NK细胞活性受体NKG2D的表达， 最终抑制NK细胞对细粒棘球蝴原头蝴的杀伤，而形成对宿主的免疫逃避。为此，在理论上 讲，如果能够有效抑制包虫虫体在宿主体内的免疫逃逸，重新激活宿主机体的免疫反应，就 能够有效治疗细粒棘球蝴感染及其复发症。
[0012] 具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的：
[0013]TGF-M受体阻断剂在制备治疗包虫病的药物中应用，该应用方法包括对细粒棘 球蝴感染中的宿主应用一定量的TGF-M受体阻断剂。
[0014]SB-431542、SB-505124和SB-525334是有效的TGF-0 1受体阻断剂，可有效抑制 TGF-M诱导的Smad2/3磷酸化和核转位，申请人通过研宄发现，SB-525334对宿主细胞 TGF-0I受体的抑制效果最佳。
[0015] 申请人采用如下试验步骤：制备细粒棘球蝴原头节；分离小鼠脾脏细胞；体外 TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞分组共培养；LDH法检测NK的杀伤活性； 流式细胞染色及检测淋巴细胞数量；结果分析。
[0016] 其中，申请人研宄了TGF-M受体阻断浓度、原头蝴浓度以及两者不同浓度之间 的组合，每次试验均设置了阴性对照、阳性对照、空白对照和技术重复，结果显示，原头蝴浓 度为1000个/mL-2000个/mL左右时，SB-525334的最佳工作浓度为：10-20ymol/mL。
[0017] 采用工作浓度为10-20ymol/mL的SB-525334体外阻断TGF-0 1受体后，细粒棘 球蝴与小鼠淋巴细胞37°C，5%CO2共培养48小时后收集细胞，分析分组试验结果。结果显 示，在TGF- 0 1受体阻断组，小鼠NK细胞的活性受体NKG2D和NK细胞的杀伤活性是显著高 于阴性对照和空白对照组，即TGF-M受体阻断后可使小鼠NK的活性受体NKG2D和NK细 胞的杀伤活性恢复甚至超过正常对照组水平。
[0018] 另外，棘球蝴组的⑶4+T细胞减少，而⑶8+T细胞则增多，从而使得⑶47⑶8+T的 比值减小，与临床包虫病患者淋巴细胞亚群分析的结果相一致。但TGF-M受体阻断组， ⑶4+T细胞增多，而⑶8+T细胞则减少，从而使得⑶47⑶8+T细胞的比值增加至接近正常宿 主⑶47⑶8+T细胞的比值水平。
[0019] 最后，⑶47⑶25+T细胞比例在TGF-0 1受体阻断的细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共 培养组显著低于未阻断TGF-M受体组（P< 0. 001)，而稍高于空白对照组，但差异无统计 学意义。即体外棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养可使CD4+CD25+T细胞比例增加，而选用前述 优化浓度的TGF-M受体阻断剂后，宿主细胞⑶47⑶25+T细胞比例下降至正常的水平。
[0020] 综上所述，采用合适量的TGF-M受体阻断剂可使细粒棘球蝴感染中的宿主细胞 ⑶4+CD25+T细胞数量减少、⑶47⑶8+T细胞比值升高，使NK细胞活性受体NKG2D的表达增 加，而使因感染细粒棘球蝴而受抑制的NK细胞杀伤活性得到恢复，因此，TGF-M受体阻断 剂在临床上可作为制备治疗包虫病并预防其复发的有效药物，具有良好的临床应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1显示了流式细胞术检测体外TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠 ⑶4+CD25+T细胞的影响。
[0022] A:流式细胞仪检测体外TGF-0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠⑶4+⑶25+T细 胞的流式结果图；B:CD4+CD25+T细胞流式结果统计分析图，PSC+SB组小鼠CD4+CD25+T细胞 数量显著低于PSC+PBS组；注：PSC:原头节；SB:TGF-0 1受体阻断剂（SB-525334) ;1640 : RPMI-1640 培养基；*:P< 0? 05, **:P< 0? 001。
[0023] 图2为流式细胞术检测体外TGF- 0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠T细胞亚群 的影响。
[0024] A :流式细胞仪检测各组⑶47⑶8+T细胞的1次流式结果图；B :流式检测各组 ⑶4+T细胞比例结果统计分析图，PSC+SB组均高于PBS+PSC组；C :流式检测各组⑶8+T细胞 比例结果统计分析图，PSC+SB组均低于PSC+PBS组；D各组⑶47⑶8+T细胞比值结果统计分 析图，PSC+SB组较PBS+PSC组高；注：PSC :原头节；SB :TGF-0 1受体阻断剂（SB-525334); 木：P < 0. 05, ** :P < 0. 001。
[0025] 图3为流式细胞术检测体外TGF- 0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠NK细胞的影 响。
[0026]A流式细胞术检测NK细胞活性受体NKG2D的结果图；B流式检测各组NKG2D结果 统计分析图，PSC+SB组的表达显著高于其它组；CLDH法检测各组小鼠NK细胞杀伤活性的 统计分析图，PSC+SB组小鼠NK细胞杀伤活性明显高于其它组；D小鼠NK细胞杀伤活性与 其活性受体NKG2D的相关性分析，R2 = 0. 904 ;注：PSC:原头节；SB:TGF-M受体阻断剂 (SB-525334) ;*:P<0? 05, **:P<0? 001。
【具体实施方式】
[0027] 1.细粒棘球蝴原头节的制备：
[0028] 从感染细粒棘球蝴病的羊肝上，无菌抽取无钙化、无感染、全整的单囊型细粒棘球 蝴包囊内容物，置于无菌离心管内，原头节（Protoscole，PSC)自然沉淀，再用含有100IU/ mL青霉素和链霉素双抗的无菌PBS(pH7. 3)中漂洗3次，除去育囊碎片使其自然沉淀，经 0. 5%伊红染色5min，在显微镜下鉴定具有活性的虫体数（> 90% )，用含双抗的无菌PBS 稀释制成含有原头节10000个/mL的原头节悬液，备用。
[0029] 2小鼠脾脏细胞分离：
[0030] 脱颈处死小鼠，无菌摘取小鼠脾脏，用1支5mL和1支ImL注射器在含有少许PBS 的小平皿中刮出脾细胞。用ImL注射器抽吸刮出的脾细胞3-5次，使脾细胞尽量分散。向 1新离心管加入3mL的小鼠淋巴细胞分离液，再将约I. 5mL的脾细胞悬液缓慢加入（V分离 液：V 脾细胞悬液=2 :l)，2000r/min，20分钟离心分离。取出中间的云絮层（淋巴细胞 层）用3mLPBS，1000r/min，5分钟洗涤2-3次。最后将沉淀细胞悬浮于lmL1640液中。细 胞计数，配成2-3XIO6个/mL，备用。
[0031] 3.体外TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养分组：
[0032]每组设3个复孔，37°C，5%CO2培养48小时后收集细胞，PBS洗涤2遍，用于流式 细胞仪检测T细胞亚群变化、CD4+CD25+T细胞、NK细胞及其活性受体NKG2D的变化；用乳酸 脱氢酶法检测NK细胞杀伤活性。
[0033] 表1细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养分组
[0034]
[0035] 4. LDH法检测NK的杀伤活性：
[0036] 取效应细胞淋巴细胞IXIO7个/mL和靶细胞Yac-IcellsIXIO5个/mL各 0.lmL(E:T= 100 : 1)加入细胞培养板中，设3复孔，同时设靶细胞自然释放孔（0.ImL 靶细胞+0.ImL10%FCS-RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.ImL靶细胞+0.lmLl%NP40 液），1000r/min，低速离心2分钟。置37°C，5%CO2孵育2小时。1000r/min，离心5分钟。 吸取各孔上清〇.ImL加至新96孔板中，37°C，10分钟。每孔再加入0.ImL新配制的LDH底 物溶液，室温避光反应10~15分钟。加入30yIlmJ/L柠檬酸终止液终止酶促反映。酶 联监测仪在570nm波长下读各孔A值。
[0037] 计算：根据下列公式计算NK细胞活性：
[0039] 5.流式细胞染色及检测：
[0040] 取IXIO6个脾细胞，向各管中加入小鼠血清孵育15min，再分别加入Anti-Mouse CD49b-FITC(DX-5)，Anti-MouseCD314-PE(NKG2D)抗体，4°C下避光孵育 30min，进行表面染 色；PBS洗涤1次，加入0. 5mLPBS重悬细胞，用FACSAriaIII流式细胞仪进行检测。
[0041] 6?数据分析：
[0042] 所有数据用SPSS17. 0软件进行统计学分析，计量资料采用x±s表示。两组间比 较采用两样本均数的t参数检验，多组间比较采用方差分析。
[0043] 7?试验结果：
[0044] (1)体外TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴对共培养小鼠淋巴细胞CD4+CD25+T细 胞变化的影响
[0045] 流式细胞术检测各组⑶4+⑶25+T细胞的变化（图1-A)，粒棘球蝴感染组 CD4+CD25+T细胞数量较TGF-0 1受体阻断剂与细粒棘球蝴共作用组高；CD4+CD25+T细胞 数量在PBS+PSC1000组稍高于PBS+PSC500组，但无统计学差异；经q检验，PBS+PSC组 CD4+CD25+T细胞数量显著高于PSC+SB组（图1-B，P< 0. 001)，即在对TGF-M受体特异性 阻断后，⑶4+⑶25+T细胞数量显著下降并接近正常组的数量。
[0046] 通过体外TGF-0 1受体阻断后，细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养，流式细胞仪 检测CD4+CD25+T细胞的比例变化。结果提示，CD4+CD25+T细胞比例在TGF-0 1受体阻断的 细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养组显著低于未阻断TGF-M受体组（P< 0. 001)，而稍高 于空白对照组（1640组），但差异无统计学意义。即体外棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养可使 CD4+CD25+T细胞比例增加，而TGF-0 1受体阻断后，可使CD4+CD25+T细胞比例下降至正常的 水平。
[0047] (2)体外TGF- 0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠T淋巴细胞亚群的影响
[0048] I.体外阻断TGF- 0 1受体后，细粒棘球蝴介导的小鼠⑶4+T细胞数量升高
[0049] 流式细胞术检测体外TGF-M受体阻断后⑶4+T细胞比例的变化（图2-A)。流式结 果显示各组〇)4+1'细胞比例，了6?-01受体阻断剂处理组細+?5(：组）比棘球蝴组邮5+?5〇 组）高，经统计学分析发现SB+PSC组均显著高于PBS+PSC组（P< 0. 05)。SB+PSC1000组 ⑶4+T细胞比例最高，显著高于其他组。
[0050] II.体外阻断TGF-0 1受体后，细粒棘球蝴介导的小鼠⑶8+T细胞数量降低
[0051] 流式细胞术检测体外TGF-M受体阻断后⑶8+T细胞比例的变化（图2-B)。结果 显示，在TGF- 0 1受体阻断剂处理组（SB+PSC组）低于棘球蝴组（PBS+PSC)，SB+PSC1000组 CD8+T细胞比例最低；经统计学分析，SB+PSC1000组CD8+T细胞比例显著低于PBS+PSC组， SB+PSC500组与其他组差异不显著（图2-C，P< 0. 05)。
[0052] III.体外TGF-0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠⑶47⑶8+T细胞的比值增高
[0053] 流式细胞术检测各组小鼠⑶47⑶8+T细胞比值的变化（图2-A)，⑶47⑶8+T细胞 比值，在SB+PSC1000组最高，PBS+PSC500组最低，经统计学分析，SB+PSC组CD4+/CD8+T细 胞比值显著高于PBS+PSC组（图2-D，P< 0? 05)。
[0054] 本实验利用流式细胞仪检测各组T细胞亚群的变化，棘球蝴组的⑶4+T细胞减少， 而⑶8+T细胞则曾多，从而使得⑶47⑶8+T的比值减小，与临床包虫病患者淋巴细胞亚群分 析的结果相一致。但TGF-M受体阻断组，⑶4+T细胞曾多，而⑶8+T细胞则减少，从而使得 CD4+/CD8+T的比值增加，有助于阻止或控制细粒棘球蝴在机体内生长。
[0055] (3)体外TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠NK细胞的影响
[0056] I.体外阻断TGF-M受体后，细粒棘球蝴介导的共培养小鼠NK细胞活性受体 NKG2D的表达增加
[0057] 流式细胞术检测各组小鼠NK细胞活性受体NKG2D的表达（图3-A)。小鼠NK细胞 活性受体NKG2D的表达量在TGF-M受体阻断剂与细粒棘球蝴共作用组表达高于细粒棘球 蝴组；NK细胞的活性受体NKG2D的表达量在PBS+PSC组显著高于PBS+SB组，而PBS+PSC1000 组最高，显著高于其他组（图3-B，P< 0. 05);即在对TGF-M受体特异性阻断后，NK细胞 的活性受体NKG2D的表达量显著增加。
[0058]II.体外阻断TGF-M受体后，细粒棘球蝴介导的靶细胞Yac-I的裂解率增加
[0059] 用乳酸脱氢酶法（LDH)检测各组NK细胞对靶细胞Yac-I细胞的裂解率（NK细胞 杀伤活性），从图3C可见小鼠NK细胞对靶细胞的裂解率，在PBS+PSC组和1640组较低， 而在TGF-M受体被特异性阻断后（SB+PSC组）的NK细胞杀伤活性增高；经统计学分析 发现TGF-M受体阻断组（SB+PSC)的NK细胞杀伤活性分别显著高于其他组（图3-C)， SB+PSC1000组的NK细胞杀伤活性稍高于SB+PSC500组，但无统计学差异。
[0060]III.体外阻断TGF-M受体后，细粒棘球蝴对共培养小鼠NK细胞活性及其活性受 体NKG2D的相关性分析
[0061] 对各组小鼠NK细胞的活性及其活性受体NKG2D的表达结果进行相关性分析，结果 显示，各组小鼠NK细胞的杀伤活性与其活性受体NKG2D的表达呈正相关，相关系数R2 = 0? 904(图3-D)。
[0062] 本实验显示，棘球蝴组，小鼠NK细胞的活性受体NKG2D和NK细胞的杀伤活性是与 正常水平一致，则小鼠NK细胞杀伤活性可能没有被激活或者受体抑制；而在TGF-M受体 阻断组，小鼠NK细胞的活性受体NKG2D和NK细胞的杀伤活性是显著高于棘球蝴组和1640 组，即TGF-M受体阻断后可使小鼠NK的活性受体NKG2D和NK细胞的杀伤活性恢复。
[0063] 综上所述，通过TGF-M受体阻断剂抑制细粒棘球蝴对感染中宿主的免疫逃避， 引起CD4+CD25+T细胞数量减少和CD4+/CD8+T细胞比值升高，使NK细胞活性受体NKG2D的表 达增加，而使受到抑制的NK细胞杀伤活性得到恢复。上述试验结果表明，采用TGF-M受 体阻断剂抑制细粒棘球蝴对感染中宿主的免疫逃避，可有效增强宿主对细粒棘球蝴感染的 抑制作用，该方法可有效用于治疗包虫病，具有良好的临床应用前景。
【主权项】
1. TGF-M受体阻断剂在制备治疗包虫病的药物中应用，其特征在于，包括对细粒棘球 蝴感染中的宿主应用TGF-M受体阻断剂。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TGF-M受体阻断剂为SB-431542、 SB-505124 或SB-525334。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述TGF- M受体阻断剂为SB525334,其工 作浓度为10-20 ymol/mL。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞浓度为：5 X105-5 XIO6个/ mL，细粒棘球蝴原头节浓度为：1000-4000个/ml。
【专利摘要】本发明提供了TGF-β1受体阻断剂在制备治疗包虫病的药物中应用，具体是通过TGF-β1受体阻断剂抑制细粒棘球蚴对感染中宿主的免疫逃避，引起宿主细胞中CD4+T细胞数量升高、CD8+T细胞数量降低、CD4+/CD8+T细胞比值升高、CD4+CD25+T细胞数量减少、NK细胞活性受体NKG2D的表达增加以及NK细胞对靶细胞Yac-1的裂解率增加，同时，研究表明NK细胞活性及其活性受体NKG2D成正相关，结果显示，本发明提供的方法可有效增强宿主对细粒棘球蚴感染的抑制作用，该方法可有效用于治疗包虫病，具有良好的临床应用前景。
【IPC分类】A61P33/10, A61K31/517, A61K31/4439
【公开号】CN104906104
【申请号】CN201510245580
【发明人】印双红, 张俊波, 陈雪玲, 陈小林, 徐芳洁
【申请人】铜仁学院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月15日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种治疗包虫病的方法，具体涉及TGF-M受体阻断剂在制备治疗包 虫病的药物中应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 包虫病（Hydatiddisease)又称棘球蝴病，是棘球蝴寄生于中间宿主引起的一种 严重影响人畜健康的寄生虫疾病。包虫病在手术治疗过程中或者在正常患者体内，由于包 囊意外破裂，部分原头节可能进入组织内，造成再次感染，也给包虫病的治疗带来很大困 难。
[0003] 针对包虫病的治疗，本领域已发展出了多种治疗方案，主要是以外科手术为主，内 科药物化疗为辅的方法。但此方法有许多弊端，如手术治疗对人体损伤较大，且易复发。目 前，主要的抗包虫病药物有吡喹酮和苯并咪唑类药物两大类，但是由于这两类药物仍然存 在许多不足之处，如：毒副作用较大，且个体差异性大，有的患者不能耐受，或产生耐药性， 有文献报道，其化疗在随访一年中仅有30 %的患者被治愈，30 %~50 %的患者改善，并且 疗效不稳定。
[0004]另外，包虫病与其他寄生虫病一样，是一个慢性感染过程，其对宿主的作用也是慢 性而持久的过程，两者之间的相互作用及其致病的免疫机制十分复杂，加之此病发病隐匿， 多数患者都是因包虫病的并发症而来医院就诊。
[0005] 为了进一步提高治疗效果，近年来，国内外学者在包虫致病机理、新型抗包虫药物 等领域开展了大量的研宄和临床工作。
[0006]转化生长因子-0(transforminggrowthfactor-0，TGF-0 )是属于一组新近发 现的调节细胞生长和分化的TGF-0超家族。TGF-M属于分泌性多肽因子，分布于多种组 织细胞中，TGF-M是种多功能生长因子。TGF-0具有调节细胞增殖、生长控制、分化、刺激 细胞外基质的形成、增加粘附分子表达和抑制免疫应答等多种生物功能。
[0007]Q34+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcells，Tregs)是体内天然存在的、具有 独特调节功能的T细胞亚群，其不同于Thl和Th2,它通过分泌抑制性细胞因子TGF-M和 IL-10细胞膜分子或与其他细胞直接接触等方式发挥广泛的免疫抑制作用，抑制体内T淋 巴细胞及NK细胞等多种免疫细胞的增殖和活化。包虫病患者血清中发现，IL-10和TGF- 0 在包虫病组的表达显著高于健康对照组；体外小鼠实验发现，原头蝴/囊液与小鼠淋巴细 胞共培养组TGF-M显著高于对照组；提示可能在这种特殊感染状态下，能够增强免疫抑 制相关性免疫应答刺激Treg细胞，从而加强对宿主的免疫抑制作用。
[0008] 研宄发现，虫体之所以能在宿主体内长期生存，依赖于对宿主的免疫逃避功能。目 前关于虫体免疫逃逸的研宄主要是Thl/Th2的漂移可能产生的免疫逃避。Treg细胞是一种 新型的T细胞亚群，是有别于Thl和Th2效应T细胞，在包虫病病灶附近发现Treg细胞的 特异性因子及相关因子TGF-0、IL-10高表达，申请人通过之前的研宄发现，细粒棘球蝴/ 囊液感染可使小鼠Treg细胞数量、特异性因子及相关因子TGF-0增加。因此，理论上讲， 利用TGF-M受体阻断剂在可用于预防包虫病的复发，但是如何利用TGF-M受体阻断剂 制备用于治疗包虫病，特别是针对细粒棘球蝴感染中的宿主，尚无报道。
[0009] 从目前的临床实践看，包虫病的临床诊断和防治研宄工作尽管已经取得了很大的 进步，但是，研发一种毒副作用小、药效稳定、能有效治疗细粒棘球蝴感染并预防其复发的 药物及其应用，仍然是本领域亟待解决的难题。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是通过深入研宄探索一种利用TGF-M受体阻断剂有效治疗细粒 棘球蝴感染及其复发的方法。
[0011] 申请人深入研宄了包虫病发病的生物学机理以及感染初期宿主免疫应答机制。申 请人通过建立细粒棘球蝴感染小鼠动物模型，研宄发现细粒棘球蝴通过促进脾细胞分泌抑 制性分子TGF-M而促使⑶4+CD25+T细胞分化，从而下调NK细胞活性受体NKG2D的表达， 最终抑制NK细胞对细粒棘球蝴原头蝴的杀伤，而形成对宿主的免疫逃避。为此，在理论上 讲，如果能够有效抑制包虫虫体在宿主体内的免疫逃逸，重新激活宿主机体的免疫反应，就 能够有效治疗细粒棘球蝴感染及其复发症。
[0012] 具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的：
[0013]TGF-M受体阻断剂在制备治疗包虫病的药物中应用，该应用方法包括对细粒棘 球蝴感染中的宿主应用一定量的TGF-M受体阻断剂。
[0014]SB-431542、SB-505124和SB-525334是有效的TGF-0 1受体阻断剂，可有效抑制 TGF-M诱导的Smad2/3磷酸化和核转位，申请人通过研宄发现，SB-525334对宿主细胞 TGF-0I受体的抑制效果最佳。
[0015] 申请人采用如下试验步骤：制备细粒棘球蝴原头节；分离小鼠脾脏细胞；体外 TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞分组共培养；LDH法检测NK的杀伤活性； 流式细胞染色及检测淋巴细胞数量；结果分析。
[0016] 其中，申请人研宄了TGF-M受体阻断浓度、原头蝴浓度以及两者不同浓度之间 的组合，每次试验均设置了阴性对照、阳性对照、空白对照和技术重复，结果显示，原头蝴浓 度为1000个/mL-2000个/mL左右时，SB-525334的最佳工作浓度为：10-20ymol/mL。
[0017] 采用工作浓度为10-20ymol/mL的SB-525334体外阻断TGF-0 1受体后，细粒棘 球蝴与小鼠淋巴细胞37°C，5%CO2共培养48小时后收集细胞，分析分组试验结果。结果显 示，在TGF- 0 1受体阻断组，小鼠NK细胞的活性受体NKG2D和NK细胞的杀伤活性是显著高 于阴性对照和空白对照组，即TGF-M受体阻断后可使小鼠NK的活性受体NKG2D和NK细 胞的杀伤活性恢复甚至超过正常对照组水平。
[0018] 另外，棘球蝴组的⑶4+T细胞减少，而⑶8+T细胞则增多，从而使得⑶47⑶8+T的 比值减小，与临床包虫病患者淋巴细胞亚群分析的结果相一致。但TGF-M受体阻断组， ⑶4+T细胞增多，而⑶8+T细胞则减少，从而使得⑶47⑶8+T细胞的比值增加至接近正常宿 主⑶47⑶8+T细胞的比值水平。
[0019] 最后，⑶47⑶25+T细胞比例在TGF-0 1受体阻断的细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共 培养组显著低于未阻断TGF-M受体组（P< 0. 001)，而稍高于空白对照组，但差异无统计 学意义。即体外棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养可使CD4+CD25+T细胞比例增加，而选用前述 优化浓度的TGF-M受体阻断剂后，宿主细胞⑶47⑶25+T细胞比例下降至正常的水平。
[0020] 综上所述，采用合适量的TGF-M受体阻断剂可使细粒棘球蝴感染中的宿主细胞 ⑶4+CD25+T细胞数量减少、⑶47⑶8+T细胞比值升高，使NK细胞活性受体NKG2D的表达增 加，而使因感染细粒棘球蝴而受抑制的NK细胞杀伤活性得到恢复，因此，TGF-M受体阻断 剂在临床上可作为制备治疗包虫病并预防其复发的有效药物，具有良好的临床应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1显示了流式细胞术检测体外TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠 ⑶4+CD25+T细胞的影响。
[0022] A:流式细胞仪检测体外TGF-0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠⑶4+⑶25+T细 胞的流式结果图；B:CD4+CD25+T细胞流式结果统计分析图，PSC+SB组小鼠CD4+CD25+T细胞 数量显著低于PSC+PBS组；注：PSC:原头节；SB:TGF-0 1受体阻断剂（SB-525334) ;1640 : RPMI-1640 培养基；*:P< 0? 05, **:P< 0? 001。
[0023] 图2为流式细胞术检测体外TGF- 0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠T细胞亚群 的影响。
[0024] A :流式细胞仪检测各组⑶47⑶8+T细胞的1次流式结果图；B :流式检测各组 ⑶4+T细胞比例结果统计分析图，PSC+SB组均高于PBS+PSC组；C :流式检测各组⑶8+T细胞 比例结果统计分析图，PSC+SB组均低于PSC+PBS组；D各组⑶47⑶8+T细胞比值结果统计分 析图，PSC+SB组较PBS+PSC组高；注：PSC :原头节；SB :TGF-0 1受体阻断剂（SB-525334); 木：P < 0. 05, ** :P < 0. 001。
[0025] 图3为流式细胞术检测体外TGF- 0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠NK细胞的影 响。
[0026]A流式细胞术检测NK细胞活性受体NKG2D的结果图；B流式检测各组NKG2D结果 统计分析图，PSC+SB组的表达显著高于其它组；CLDH法检测各组小鼠NK细胞杀伤活性的 统计分析图，PSC+SB组小鼠NK细胞杀伤活性明显高于其它组；D小鼠NK细胞杀伤活性与 其活性受体NKG2D的相关性分析，R2 = 0. 904 ;注：PSC:原头节；SB:TGF-M受体阻断剂 (SB-525334) ;*:P<0? 05, **:P<0? 001。
【具体实施方式】
[0027] 1.细粒棘球蝴原头节的制备：
[0028] 从感染细粒棘球蝴病的羊肝上，无菌抽取无钙化、无感染、全整的单囊型细粒棘球 蝴包囊内容物，置于无菌离心管内，原头节（Protoscole，PSC)自然沉淀，再用含有100IU/ mL青霉素和链霉素双抗的无菌PBS(pH7. 3)中漂洗3次，除去育囊碎片使其自然沉淀，经 0. 5%伊红染色5min，在显微镜下鉴定具有活性的虫体数（> 90% )，用含双抗的无菌PBS 稀释制成含有原头节10000个/mL的原头节悬液，备用。
[0029] 2小鼠脾脏细胞分离：
[0030] 脱颈处死小鼠，无菌摘取小鼠脾脏，用1支5mL和1支ImL注射器在含有少许PBS 的小平皿中刮出脾细胞。用ImL注射器抽吸刮出的脾细胞3-5次，使脾细胞尽量分散。向 1新离心管加入3mL的小鼠淋巴细胞分离液，再将约I. 5mL的脾细胞悬液缓慢加入（V分离 液：V 脾细胞悬液=2 :l)，2000r/min，20分钟离心分离。取出中间的云絮层（淋巴细胞 层）用3mLPBS，1000r/min，5分钟洗涤2-3次。最后将沉淀细胞悬浮于lmL1640液中。细 胞计数，配成2-3XIO6个/mL，备用。
[0031] 3.体外TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养分组：
[0032]每组设3个复孔，37°C，5%CO2培养48小时后收集细胞，PBS洗涤2遍，用于流式 细胞仪检测T细胞亚群变化、CD4+CD25+T细胞、NK细胞及其活性受体NKG2D的变化；用乳酸 脱氢酶法检测NK细胞杀伤活性。
[0033] 表1细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养分组
[0034]
[0035] 4. LDH法检测NK的杀伤活性：
[0036] 取效应细胞淋巴细胞IXIO7个/mL和靶细胞Yac-IcellsIXIO5个/mL各 0.lmL(E:T= 100 : 1)加入细胞培养板中，设3复孔，同时设靶细胞自然释放孔（0.ImL 靶细胞+0.ImL10%FCS-RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.ImL靶细胞+0.lmLl%NP40 液），1000r/min，低速离心2分钟。置37°C，5%CO2孵育2小时。1000r/min，离心5分钟。 吸取各孔上清〇.ImL加至新96孔板中，37°C，10分钟。每孔再加入0.ImL新配制的LDH底 物溶液，室温避光反应10~15分钟。加入30yIlmJ/L柠檬酸终止液终止酶促反映。酶 联监测仪在570nm波长下读各孔A值。
[0037] 计算：根据下列公式计算NK细胞活性：
[0039] 5.流式细胞染色及检测：
[0040] 取IXIO6个脾细胞，向各管中加入小鼠血清孵育15min，再分别加入Anti-Mouse CD49b-FITC(DX-5)，Anti-MouseCD314-PE(NKG2D)抗体，4°C下避光孵育 30min，进行表面染 色；PBS洗涤1次，加入0. 5mLPBS重悬细胞，用FACSAriaIII流式细胞仪进行检测。
[0041] 6?数据分析：
[0042] 所有数据用SPSS17. 0软件进行统计学分析，计量资料采用x±s表示。两组间比 较采用两样本均数的t参数检验，多组间比较采用方差分析。
[0043] 7?试验结果：
[0044] (1)体外TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴对共培养小鼠淋巴细胞CD4+CD25+T细 胞变化的影响
[0045] 流式细胞术检测各组⑶4+⑶25+T细胞的变化（图1-A)，粒棘球蝴感染组 CD4+CD25+T细胞数量较TGF-0 1受体阻断剂与细粒棘球蝴共作用组高；CD4+CD25+T细胞 数量在PBS+PSC1000组稍高于PBS+PSC500组，但无统计学差异；经q检验，PBS+PSC组 CD4+CD25+T细胞数量显著高于PSC+SB组（图1-B，P< 0. 001)，即在对TGF-M受体特异性 阻断后，⑶4+⑶25+T细胞数量显著下降并接近正常组的数量。
[0046] 通过体外TGF-0 1受体阻断后，细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养，流式细胞仪 检测CD4+CD25+T细胞的比例变化。结果提示，CD4+CD25+T细胞比例在TGF-0 1受体阻断的 细粒棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养组显著低于未阻断TGF-M受体组（P< 0. 001)，而稍高 于空白对照组（1640组），但差异无统计学意义。即体外棘球蝴与小鼠淋巴细胞共培养可使 CD4+CD25+T细胞比例增加，而TGF-0 1受体阻断后，可使CD4+CD25+T细胞比例下降至正常的 水平。
[0047] (2)体外TGF- 0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠T淋巴细胞亚群的影响
[0048] I.体外阻断TGF- 0 1受体后，细粒棘球蝴介导的小鼠⑶4+T细胞数量升高
[0049] 流式细胞术检测体外TGF-M受体阻断后⑶4+T细胞比例的变化（图2-A)。流式结 果显示各组〇)4+1'细胞比例，了6?-01受体阻断剂处理组細+?5(：组）比棘球蝴组邮5+?5〇 组）高，经统计学分析发现SB+PSC组均显著高于PBS+PSC组（P< 0. 05)。SB+PSC1000组 ⑶4+T细胞比例最高，显著高于其他组。
[0050] II.体外阻断TGF-0 1受体后，细粒棘球蝴介导的小鼠⑶8+T细胞数量降低
[0051] 流式细胞术检测体外TGF-M受体阻断后⑶8+T细胞比例的变化（图2-B)。结果 显示，在TGF- 0 1受体阻断剂处理组（SB+PSC组）低于棘球蝴组（PBS+PSC)，SB+PSC1000组 CD8+T细胞比例最低；经统计学分析，SB+PSC1000组CD8+T细胞比例显著低于PBS+PSC组， SB+PSC500组与其他组差异不显著（图2-C，P< 0. 05)。
[0052] III.体外TGF-0 1受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠⑶47⑶8+T细胞的比值增高
[0053] 流式细胞术检测各组小鼠⑶47⑶8+T细胞比值的变化（图2-A)，⑶47⑶8+T细胞 比值，在SB+PSC1000组最高，PBS+PSC500组最低，经统计学分析，SB+PSC组CD4+/CD8+T细 胞比值显著高于PBS+PSC组（图2-D，P< 0? 05)。
[0054] 本实验利用流式细胞仪检测各组T细胞亚群的变化，棘球蝴组的⑶4+T细胞减少， 而⑶8+T细胞则曾多，从而使得⑶47⑶8+T的比值减小，与临床包虫病患者淋巴细胞亚群分 析的结果相一致。但TGF-M受体阻断组，⑶4+T细胞曾多，而⑶8+T细胞则减少，从而使得 CD4+/CD8+T的比值增加，有助于阻止或控制细粒棘球蝴在机体内生长。
[0055] (3)体外TGF-M受体阻断后，细粒棘球蝴对小鼠NK细胞的影响
[0056] I.体外阻断TGF-M受体后，细粒棘球蝴介导的共培养小鼠NK细胞活性受体 NKG2D的表达增加
[0057] 流式细胞术检测各组小鼠NK细胞活性受体NKG2D的表达（图3-A)。小鼠NK细胞 活性受体NKG2D的表达量在TGF-M受体阻断剂与细粒棘球蝴共作用组表达高于细粒棘球 蝴组；NK细胞的活性受体NKG2D的表达量在PBS+PSC组显著高于PBS+SB组，而PBS+PSC1000 组最高，显著高于其他组（图3-B，P< 0. 05);即在对TGF-M受体特异性阻断后，NK细胞 的活性受体NKG2D的表达量显著增加。
[0058]II.体外阻断TGF-M受体后，细粒棘球蝴介导的靶细胞Yac-I的裂解率增加
[0059] 用乳酸脱氢酶法（LDH)检测各组NK细胞对靶细胞Yac-I细胞的裂解率（NK细胞 杀伤活性），从图3C可见小鼠NK细胞对靶细胞的裂解率，在PBS+PSC组和1640组较低， 而在TGF-M受体被特异性阻断后（SB+PSC组）的NK细胞杀伤活性增高；经统计学分析 发现TGF-M受体阻断组（SB+PSC)的NK细胞杀伤活性分别显著高于其他组（图3-C)， SB+PSC1000组的NK细胞杀伤活性稍高于SB+PSC500组，但无统计学差异。
[0060]III.体外阻断TGF-M受体后，细粒棘球蝴对共培养小鼠NK细胞活性及其活性受 体NKG2D的相关性分析
[0061] 对各组小鼠NK细胞的活性及其活性受体NKG2D的表达结果进行相关性分析，结果 显示，各组小鼠NK细胞的杀伤活性与其活性受体NKG2D的表达呈正相关，相关系数R2 = 0? 904(图3-D)。
[0062] 本实验显示，棘球蝴组，小鼠NK细胞的活性受体NKG2D和NK细胞的杀伤活性是与 正常水平一致，则小鼠NK细胞杀伤活性可能没有被激活或者受体抑制；而在TGF-M受体 阻断组，小鼠NK细胞的活性受体NKG2D和NK细胞的杀伤活性是显著高于棘球蝴组和1640 组，即TGF-M受体阻断后可使小鼠NK的活性受体NKG2D和NK细胞的杀伤活性恢复。
[0063] 综上所述，通过TGF-M受体阻断剂抑制细粒棘球蝴对感染中宿主的免疫逃避， 引起CD4+CD25+T细胞数量减少和CD4+/CD8+T细胞比值升高，使NK细胞活性受体NKG2D的表 达增加，而使受到抑制的NK细胞杀伤活性得到恢复。上述试验结果表明，采用TGF-M受 体阻断剂抑制细粒棘球蝴对感染中宿主的免疫逃避，可有效增强宿主对细粒棘球蝴感染的 抑制作用，该方法可有效用于治疗包虫病，具有良好的临床应用前景。
【主权项】
1. TGF-M受体阻断剂在制备治疗包虫病的药物中应用，其特征在于，包括对细粒棘球 蝴感染中的宿主应用TGF-M受体阻断剂。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TGF-M受体阻断剂为SB-431542、 SB-505124 或SB-525334。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述TGF- M受体阻断剂为SB525334,其工 作浓度为10-20 ymol/mL。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞浓度为：5 X105-5 XIO6个/ mL，细粒棘球蝴原头节浓度为：1000-4000个/ml。
【专利摘要】本发明提供了TGF-β1受体阻断剂在制备治疗包虫病的药物中应用，具体是通过TGF-β1受体阻断剂抑制细粒棘球蚴对感染中宿主的免疫逃避，引起宿主细胞中CD4+T细胞数量升高、CD8+T细胞数量降低、CD4+/CD8+T细胞比值升高、CD4+CD25+T细胞数量减少、NK细胞活性受体NKG2D的表达增加以及NK细胞对靶细胞Yac-1的裂解率增加，同时，研究表明NK细胞活性及其活性受体NKG2D成正相关，结果显示，本发明提供的方法可有效增强宿主对细粒棘球蚴感染的抑制作用，该方法可有效用于治疗包虫病，具有良好的临床应用前景。
【IPC分类】A61P33/10, A61K31/517, A61K31/4439
【公开号】CN104906104
【申请号】CN201510245580
【发明人】印双红, 张俊波, 陈雪玲, 陈小林, 徐芳洁
【申请人】铜仁学院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月15日
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