为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节的制作方法
为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节的制作方法
【专利说明】为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节
[0001]本申请是申请日为2006年5月18日、申请号为200680024082.7、发明名称为“为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节”的发明专利申请的分案申请。
[0002]本申请要求2005年5月18日提交的美国临时申请N0.60/682, 110的优先权，申请60/682，110的文本全部引入本文作为参考。
技术领域
[0003]本发明涉及癌症治疗领域。具体地，本发明涉及癌细胞中端粒延长的调节。更具体地，本发明涉及无环(acyclic)核苷类似物在治疗或预防癌症中的用途。
【背景技术】
[0004]前导和后随DNA链合成中的不对称造成了线性基因组复制的“终止问题”1。为了克服这个问题，真核生物染色体具有特化的末端结构，即由TTAGGG重复序列组成的端粒2。端粒酶3，4是延长端粒并因此在细胞倍增期间保持大多数癌细胞的染色体稳定性的核糖核蛋白酶5。细胞倍增期间DNA从端粒末端的逐渐损失涉及体细胞中细胞增殖潜力的控制6。
[0005]培养的正常人类细胞在培养中具有有限的复制潜力。培养中的正常细胞进行复制，直到它们达到群体生长停止时的离散点。这被称为死亡期1(M1期)，是由于少数端粒缩短到导致被称为细胞老化的生长停滞的大小而引起的。能够通过消除P53和pRB人肿瘤抑制基因的功能而绕过这个阶段。之后该细胞可继续增殖而端粒长度进一步变短，直到另一个被称为死亡期2 (M2期)或转折期的限制点。M2期的生长停滞是由细胞增殖和细胞死亡速率之间的平衡引起的。在这个阶段，当大多数端粒非常短的时候，末端与末端的融合和染色体断裂一融合引起显著的染色体异常和细胞凋亡。在极少的情况下，细胞能够脱离M2并通过稳定其端粒的长度而变为无限增殖的。这是通过端粒酶活化或替代性端粒延长机制(即替代的端粒延长或ALT)而发生的7，8。
[0006]人类种系9和多数癌细胞3表达端粒酶。端粒酶对已缩短的端粒的延长是人类癌细胞中端粒维持的主要机制。对端粒酶的抑制通过缩短端粒的长度而限制人类端粒酶阳性癌细胞的生长n。
[0007]已经尝试利用核苷类似物(例如AZT)干扰人端粒酶活性以达到治疗癌症的目的。然而现有技术中公开的施用核苷类似物改变端粒酶活性的方法不能令人满意，或者不适合临床情况，因为它们的临床应用受到低治疗比(即毒性剂量与有效剂量之比)的限制。
[0008]此外，由于细胞(包括癌细胞)的增殖能力是由于端粒酶介导的端粒延长机制和/或ALT机制的激活，用于控制细胞增殖的理想的核苷类似物是对于这两种机制都有效并且对正常细胞和组织毒性最小或没有毒性的那些核苷类似物。因此，需要鉴定可以抑制增殖的细胞例如通过端粒酶和/或ALT机制维持其端粒的癌细胞的治疗性核苷类似物。
【发明内容】
[0009]本发明提供涉及使用抗病毒核苷类似物调节、抑制或阻止细胞中端粒延长的方法和组合物，而无论端粒延长机制如何(端粒酶或ALT机制)。本发明还公开了使用特定核苷类似物预防和/或治疗增生性疾病和所有类型的癌症的方法。更具体地，本发明公开了在对相应的正常体细胞没有细胞毒性的水平上可以干扰增殖的细胞、包括癌细胞(例如人类癌细胞)中的端粒酶活性和L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码的逆转录酶(LlRT)活性的无环核苷类似物。本发明公开了如何使用无环核苷类似物作为抗肿瘤剂或抗癌剂。在本发明的一个方面，已经发现用更昔洛韦、阿昔洛韦和/或喷昔洛韦处理端粒酶阳性或端粒酶阴性细胞(但是具有LlRT活性)诱导了进行性的端粒损失、G2期停滞、染色体异常和最终的细胞死亡。此外，这些抗肿瘤核苷类似物对端粒酶或LlRT具有惊人的效果，因为其临床上可接受的水平足以在增殖的细胞中控制端粒酶活性并且诱导细胞死亡，由此允许治疗或预防所有类型的癌症。
[0010]当前，在应用中还没有基于无环的、抗端粒酶、抗LlRT和抗肿瘤核苷类似物的治疗性组合物。申请人第一次披露了使用无环核苷类似物(在本文中也被称为端粒延长的抑制剂或拮抗剂)在体内抑制端粒延长在治疗上是有益的。而且，在本发明之前，本领域技术人员没有认识到可以预测这种处理具有治疗用途。
[0011]由于端粒酶参与控制细胞周期、细胞复制和老化，因此本发明的含有核苷类似物的组合物可以阻止或控制不受控制的细胞生长和肿瘤细胞的无限增殖性。本发明的组合物尤其可用于治疗细胞增殖性疾病，特别是以端粒酶或LlRT维持或延长端粒为特征的人类肿瘤。
[0012]因此，一方面，本发明提供了一种治疗与端粒酶或LlRT维持或延长端粒有关的、特别是与细胞中端粒酶或LlRT活性水平升高有关的疾病的方法。该方法包括给所述细胞或需要治疗的哺乳动物施用一种组合物，该组合物含有治疗有效量的至少一种为无环、抗端粒酶、抗LlRT和抗肿瘤剂的核苷类似物。细胞中的端粒酶活性或LlRT活性水平可以如以下文献中所述测定，例如:本申请人于2005年3月25日提交的名称为“Modulat1n OfTelomere Length In Telomerase Positive Cells For Cancer Therapy，，的美国专利申请 60/655，105，以及于 2005 年 I 月 18 日提交的名称为“Modulat1n Of Line-1 ReverseTranscriptase”的国际专利申请PCT/US05/001319，该专利申请引入本文作为参考。细胞中的端粒酶活性或LlRT活性水平也可以通过任意其他现有的方法或等同的方法测定。端粒酶活性或LlRT活性的“升高的水平”是指特定细胞中端粒酶活性或LlRT活性的绝对水平比受试者或个体的正常细胞升高，或者比未患该疾病的其他受试者或个体的正常细胞升高。这些疾病的例子包括癌性疾病，或与正常情况下不存在于个体中的细胞的存在有关的疾病。优选地，该组合物含有GCV或ACV或它们的前药。这些组合物(直接抑制端粒酶活性或LlRT活性，或者间接整合到端粒中从而阻止端粒进一步延长)的应用将在端粒酶具有活性的肿瘤中导致进行性的端粒缩短。一旦端粒长度缩短到临界长度，肿瘤就进入转折期并最终死亡。这些抑制剂对正常体细胞没有影响或者只有极小的影响，因为正常细胞中的端粒酶活性和/或LlRT活性通常较低或者检测不到。
[0013]干扰端粒的延长或维持可能直接导致细胞死亡或者可能加强最终通过凋亡杀死细胞的化疗剂的作用。特别地，本发明提供一种通过施用含有本发明的无环核苷类似物的组合物来抑制具有细胞数持续增长潜力的端粒酶/LlRT表达细胞增殖的方法。核苷类似物的施用可以通过本领域技术人员公知的任何期望的方法来实现。
[0014]在本发明的一个实施方案中，提供一种预防以需要该预防的哺乳动物或受试者(例如人)的细胞表达端粒酶或LlRT为特征的癌症的方法。该预防方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的组合物。该组合物含有本发明的端粒酶抑制剂或拮抗剂。该抑制剂或拮抗剂阻断端粒酶阳性/端粒酶阴性细胞中端粒的延长，由此抑制端粒酶表达细胞的增殖。该抑制剂是无环核苷类似物或这种类似物的药学上可接受的盐或富含该抑制剂或拮抗剂的液体或固体食品材料。该食品可以是，例如，黄油、人造黄油、饼干、面包、蛋糕、蜜饯、糖果、酸奶酪或其他发酵乳制品、或适于人类消费的谷类食品形式的功能性食物。或者可以是营养补充物、营养物、药品、食品、营养品、健康食品和/或特制食品。定时检测人体中端粒酶阳性细胞的存在。一旦在哺乳动物中不再检测到端粒酶阳性细胞，即可停止使用抑制剂或拮抗剂。
[0015]除了治疗方面以外，本发明还提供用于检测病理性增殖的表达端粒酶或LlRT的细胞的诊断方法和试剂盒。本发明的这些和其他实施方案将会在下文更详细地描述。
[0016]本发明涉及但不限于以下各项:
[0017]第I项.一种预防或治疗哺乳动物或人体中由于存在不适当地或病理性增殖的细胞或无限增殖细胞而引起的疾病或治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的人施用治疗有效量的包含一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物。
[0018]第2项.第I项的方法，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0019]第3项.第I项的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0020]第4项.第I项的方法，其中所述组合物通过口服、非肠胃、皮下、肌肉内或血管内施用。
[0021]第5项.第2项的方法，其中施用包含两种或多种所述核苷类似物的组合物。
[0022]第6项.第I项的方法，其中所述核苷类似物之一的施用量为每天大约10mg/kg体重到大约150mg/kg体重。
[0023]第7项.第I项的方法，其中所述核苷类似物与放射治疗和/或非核苷化疗剂联合施用。
[0024]第8项.一种干扰肿瘤细胞中端粒延长的方法，该方法包括给所述细胞施用有效量的无环核苷类似物。
[0025]第9项.第8项的方法，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0026]第10项.第9项的方法，其中所述核苷类似物与选自下组的不同类型的类似物联合施用:3’ -叠氮-2’，3’ -双脱氧胸苷(AZT)、2’，3’ -双脱氧肌苷(ddl)、2’，3’ -双脱氢_3’ -脱氧胸苷(d4T)，其中所述不同类型的类似物以低剂量存在，其单独时不足以终止端粒的延长。
[0027]第11项.第8项的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0028]第12项.一种防止或抑制端粒酶阳性细胞生长的方法，该方法包括使细胞接触足量的无环核苷类似物。
[0029]第13项.第12项的方法，其中所述细胞与浓度为大约1.5 μΜ至3.0 μΜ的核苷类似物接触。
[0030]第14项.第12项的方法，其中所述核苷类似物是阿昔洛韦、更昔洛韦或喷昔洛韦或其前药。
[0031]第15项.第12项的方法，其中所述端粒酶阳性细胞是癌细胞，其中所述癌细胞选自:骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。
[0032]第16项.一种在需要的人中预防癌症的方法，其中所述癌症是由于该人细胞中的端粒酶活性引起的，该方法包括给所述人施用治疗有效量的含有一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物。
[0033]第17项.第16项的方法，其中所述癌症选自:骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。
[0034]第18项.一种治疗患有癌症的个体的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的含有逆转录酶的抑制剂或拮抗剂的组合物，该逆转录酶由L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码或是端粒酶逆转录酶(TERT)，并且与所述个体细胞中端粒的延长有关，其中该抑制剂或拮抗剂阻断所述端粒的延长，其中该抑制剂或措抗剂是选自阿昔洛韦、更昔洛韦、喂'昔洛韦或其前药的无环核苷类似物。
[0035]第19项.第18项的方法，其中所述癌症不包括移植后淋巴增生性疾病。
[0036]第20项.第19项的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0037]第21项.第20项的方法，其中所述组合物通过口服、非肠胃、皮下、肌肉内、血管内或局 部施用。
[0038]第22项.一种治疗人的癌症的方法，其中所述癌症是由于该人细胞中显示端粒酶介导的端粒延长或L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码的逆转录酶诱导的替代性端粒延长的细胞引起的，该方法包括给所述患有癌症的人施用治疗有效量的含有一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述核苷类似物阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物选自阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0039]第23项.第22项的方法，其中施用包含两种或多种所述核苷类似物的组合物。
[0040]第24项.第23项的方法，其中所述核苷类似物之一的施用量为每天大约10mg/kg体重到大约500mg/kg体重。
[0041]第25项.一种终止端粒酶阳性和端粒酶阴性肿瘤细胞中的端粒延长的方法，该方法包括给所述细胞施用有效量的端粒酶的抑制剂或拮抗剂或由L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码的逆转录酶的抑制剂或拮抗剂，其中所述抑制剂或拮抗剂阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物选自阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0042]第26项.第25项的方法，其中所述核苷类似物与选自下组的不同类型的类似物联合施用:3’ -叠氮-2’，3’ -双脱氧胸苷(AZT)、2’，3’ -双脱氧肌苷(ddl)、2’，3’ -双脱氢_3’ -脱氧胸苷(d4T)，其中所述不同类型的类似物以低剂量存在，其单独时不足以终止端粒的延长。
[0043]第27项.第26项的方法，其中所述肿瘤细胞是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0044]第28项.一种防止或抑制显示端粒延长的端粒酶阳性或阴性细胞生长的方法，该方法包括:
[0045]使所述细胞接触一种核苷类似物，其中所述核苷类似物阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物是阿昔洛韦、更昔洛韦、或喷昔洛韦或其前药。
[0046]第29项.第28项的方法，其中所述细胞与浓度为0.2 μ M的核苷类似物接触。
[0047]第30项.第28项的方法，其中所述端粒酶阴性细胞是癌细胞，其中所述癌细胞选自骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0048]第31项.一种干扰系统中端粒酶或LlRT活性的方法，包括给显示由端粒酶或LlRT活性介导的端粒延长的系统提供一定量的核苷类似物，其中所述核苷类似物阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物是阿昔洛韦、更昔洛韦、或喷昔洛韦或其前药，其中所述系统是在体外或体内生长的细胞。
[0049]第32项.一种在需要的人中预防癌症的方法，其中所述癌症是由于该人细胞中显示由端粒酶或L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码的逆转录酶诱导或介导的替代性端粒延长的细胞引起的，该方法包括给该人施用治疗有效量的含有一种或多种核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述核苷类似物阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物选自阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0050]第33项.第32项的方法，其中所述癌症选自:骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。
【附图说明】
[0051]图1表示流动-FISH数据，显示HeLa细胞在处理10天后的端粒长度缩短、大规模凋亡和细胞周期变化(点图一左图，直方图一右图)。数据007 -未处理；数据008 -用3 μ M ACV 处理；数据 009 -用 1.5 μ M GCV 处理；数据 010-用 1.5 μ M PCV 处理。FLl -PNA-FITC, FL3 -ΡΙ。
[0052]图2表示流动-FISH数据，显示U-20S细胞在处理10天后的端粒长度缩短、大规模凋亡和细胞周期变化(点图一左图，直方图一右图)。数据001 -未处理；数据002 -用3 μ M ACV 处理；数据 003 -用 1.5 μ M GCV 处理；数据 004 -用 1.5 μ M PCV 处理。FLl -PNA-FITC, FL3 -ΡΙ。
[0053]图3表示流动-FISH数据，显示U-20S细胞在处理14天后的端粒长度缩短、大规模凋亡和细胞周期变化(点图一左图，直方图一右图)。数据001 -未处理；数据002 -用3 μ M ACV 处理；数据 003 -用 1.5 μ M GCV 处理；数据 004 -用 1.5 μ M PCV 处理。FLl -PNA-FITC, FL3 -ΡΙ。
[0054]发曰月详沐
[0055]本发明提供涉及使用能够干扰细胞中端粒延长的核苷类似物的组合物和方法。特别是，已经发现某些核苷类似物在临床上可接受的水平时可以影响细胞中的端粒、端粒酶和LlRT功能。特别地，在本发明的上下文中，“核苷类似物”是与天然存在的核苷在结构上相似的化合物，但是仅限于无环的那些类似物。本发明中涉及的无环核苷类似物具有嘌呤(或嘧啶)骨架，该骨架具有一个尾部分(例如鸟嘌呤中存在的9-(1,3-二羟基-2-丙氧甲基))，但是缺乏羟环(戊糖)。本发明的类似物的例子包括但不限于以下化合物:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药，即，分别为伐昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦。阿昔洛韦12通过模拟细胞DNA组分鸟嘌呤起作用。鸟嘌呤即DNA的AT-GC中的“G”。阿昔洛韦(9_[2 (羟甲氧基)-甲基]鸟嘌呤)尽管在结构上类似于“G”，但是它的尾部一羟“环”(戊糖)缺失，因此为“无环的”。更昔洛韦13，1415和喷昔洛韦16，17也是“无环的”，因为它们也缺少羟环。在本发明的一个实施方案中，本发明的无环核苷类似物的尾部具有至少一个羟基，该羟基模拟核苷的2’ -脱氧核糖部分的3’ -和5’ -羟基。已经发现本发明的无环核苷类似物表现出抗端粒酶和抗肿瘤性质，其毒性程度在临床上可以接受。无环核苷类似物阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药，即伐昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦，均被批准作为抗病毒药临床应用。它们的化学结构和对抗病毒感染的剂量方案是本领域技术人员公知的。
[0056]尽管阿昔洛韦、更昔洛韦、喂■昔洛韦及相应的如药是公知的治疗或缓解痕疼病毒或/和CMV感染的药物，但是它们在治疗肿瘤疾病中的应用还是未知的。例如，喷昔洛韦用于人的唇部和面部以治疗单纯疱瘆病毒引起的唇疱瘆。本领域中还知道这些核苷类似物的目标酶是DNA聚合酶。
[0057]本发明表明无环抗病毒剂也可以针对端粒酶或LlRT并影响哺乳动物细胞中的端粒延长(或损害端粒)。一般认为这些药物一旦进入增殖的细胞内即被磷酸化(例如二磷酸盐和三磷酸盐形式)，并且与端粒酶反应的天然底物(例如dGTP)竞争。磷酸化类似物可以抑制天然底物向正在延长的端粒DNA链中的掺入，或者其本身可以掺入到DNA中，由此干扰端粒酶或LlRT介导的聚合活性，最终导致链延长的终止。实质上，这些核苷类似物通过链延长的终止损害端粒DNA、缩短端粒并且导致细胞凋亡。对端粒的损害对于快速生长的(例如肿瘤)细胞比对于正常细胞更加有害。
[0058]已经报道了抗HIV和抗疱瘆核苷类似物只有在从核苷磷酸化为核苷酸的阶段之后才具有活性。因此，磷酸化看来是核苷类似物针对其靶标的活性的关键因素。在这点上，曾经报道了 AZT需要三次连续的磷酸化才具有针对端粒酶的活性。
[0059]本发明的无环核苷类似物是比现有技术中已知的抗端粒酶核苷类似物如AZT更强并且选择性更高的端粒延长抑制剂；与诸如AZT的核苷类似物相比，其临床上可接受的剂量a 19, 20,21, 22足以实现端粒长度的缩短和细胞凋亡或细胞死亡。
[0060]尽管没有提到通过本发明可能实现有利的应用，但是以前为了治疗CMV(巨细胞病毒)感染而给AIDS或其他免疫缺陷患者施用(例如)GCV意味着GCV可以容易地给癌症患者施用。
[0061]进一步地，目前大量无环核苷类似物对于HSV和CMV患者的应用，以及这些类似物以明显较低剂量使用的能力，应当加快管理部门批准阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药(即伐昔洛韦、缬更昔洛韦和泛昔洛韦)用于治疗端粒酶和/或LlRT诱导的和/或介导的癌症。
[0062]本发明还包括各种动物模型的使用。通过开发或分离表达端粒酶的细胞系，可以在各种实验动物中产生疾病模型。这些模型可以采用皮下、原位(orthotopic)或全身施用细胞，以模拟各种疾病状态。例如，可以将HeLa细胞系皮下注射进裸鼠体内以获得端粒酶阳性肿瘤。产生的肿瘤在端粒重复扩增法(TRAP)试验中应当显示端粒酶活性。这样的动物模型也提供了分别以及组合检测核苷类似物的有用工具。
[0063]在体内确定一种化合物的有效性涉及多种标准，包括但不限于存活率、肿瘤消退、肿瘤进展的停滞或减缓、肿瘤消失以及转移的抑制或阻止。
[0064]用试验化合物处理动物包括给动物施用适当形式的化合物或组合物。本发明的药物组合物、抑制剂或拮抗剂可以通过多种途径施用，包括但不限于口服、非肠胃、经鼻、口腔、直肠、阴道或局部途径。此外，也可通过气管内滴注、支气管滴注、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行施用。特别预期的是全身性静脉内注射、通过血液或淋巴供应的局部给药和肿瘤内注射。
[0065]本发明的组合物在许多方面是重要的。它们在端粒酶/LlRT相关癌症的治疗方案中至关重要，无论在癌症治疗中是单独给药还是与本领域技术人员已知的化疗和/或放疗方案联合。另外，这些组合物仅仅通过降低端粒酶或LlRT活性就将有助于选择性诱导癌细胞的大规模凋亡。
[0066]核苷类似物可以在生理学或药学上可接受的载体中施用于宿主以治疗增生性疾病等。药学上可接受的载体部分取决于所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法。
[0067]在本发明的一个方面，提供了预防或治疗哺乳动物中由于存在不适当地或病理性增殖的细胞或无限增殖细胞而引起的疾病的方法。这些不适当地或病理性增殖的细胞或无限增殖细胞独立于细胞的正常调控机制而存在并且复制。这些细胞是病理性的，因为它们由于细胞元件即端粒酶的活性而不同于正常细胞。当然，本文所使用的不适当地增殖的细胞可能是良性的高度增殖细胞，但是除非另外说明，否则这些细胞是指所有类型的恶性高度增殖细胞如癌细胞，包括，例如，骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。在本发明的一个实施方案中，本文涉及的癌症范围内不包括移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，它是一种血液癌症。
[0068]特别地，提供了预防或治疗以表达端粒酶或LlRT为特征的人类肿瘤的方法。根据本发明，疾病的预防和治疗是通过使用本发明的无环核苷类似物(端粒酶或LlRT的抑制剂或拮抗剂)而获得的。本发明中使用的抑制剂或拮抗剂是直接或间接地与端粒酶和LlRT相互作用从而抑制其活性的那些无环核苷类似物，和/或掺入到端粒中并由此阻止端粒进一步延长(尽管存在功能性端粒酶或L1RT)、由此抑制表达端粒酶或LlRT的细胞生长的那些无环核苷类似物。因此，端粒酶或LlRT的抑制剂或拮抗剂可用于抑制细胞的生长。例如，当给患者施用端粒酶或LlRT的抑制剂或措抗剂时，引起细胞中的进行性端粒缩短、细胞周期停滞、和/或表达端粒酶的细胞的大规模凋亡。在本发明中，术语“抑制生长”或“生长的抑制”也可以指减少或阻止细胞分裂。根据本发明，表达端粒酶和/或LlRT的细胞生长的抑制可以是大约100%或小于100%，但不是0%。例如，与对照细胞(对照细胞表达端粒酶但是不用抑制剂或拮抗剂处理)相比，抑制可以是大约10%至大约100%，优选地至 少约25%，更优选地至少约50%，更优选地至少大约90%、95%或正好100%。生长的抑制可以用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以将被处理样品中的活细胞数与对照样品中的活细胞数进行比较，与活体染料一起孵育后进行测定。另外，生长抑制也可以通过能够在体外或体内检测细胞增殖减少的测定方法来检测，例如氚化氢掺入试验、BdU掺入试验、MTT试验、形成病灶的能力的改变、贴壁依赖性或丧失无限增殖能力、丧失肿瘤特异性标记、和/或当被注射进动物宿主体内时不能形成或抑制肿瘤(Dorafshar等人，2003, J SurgRes., 114:179-186 ；Yang 等人,2004, Acta Pharmacol Sin., 25:68-75)。
[0069]人体中由一个无限增殖化细胞或几个这样的细胞发展为癌性肿瘤可能需要几个月至几年。但是通过实施本发明，可以预防癌症，因为用含有一种或多种无环核苷类似物的组合物处理的致肿瘤细胞在有机会生长为肿瘤之前就丧失了增殖潜力。而且，在出现癌症的临床表现之前，给危险人群定期预防性施用抑制剂或拮抗剂以终止肿瘤进展可以有效地显著降低新发癌症病例的速度。
[0070]核苷化合物可以通过任何给药途径(包括口服)单独给药或者与不同类似物联合给药。核苷类似物ACV、GCV或其L-valil酯缬更昔洛韦(V-GCV)和伐昔洛韦(V-ACV)是优选的核苷类似物。它们都可以购买得到，其制剂在大量专利和出版物中已有描述。
[0071]具有端粒酶和/或LlRT活性的细胞应当被选择性地靶向，因为这些细胞依赖于端粒酶和/或LlRT来延长或维持端粒，并且端粒的延长或维持需要核苷和/或其类似物与端粒酶或LlRT相互作用。为了发挥抗癌效果，需要任何特异性靶向剂来递送类似物，本文预期使用靶向的PCV或ACV或GCV和/或其他类似物。因此，在一些实施方案中，药物组合物可能具有已经连接到靶向剂(例如肽)上的活性化合物，在该情况下为PCV、ACV和GCV或另一种核苷类似物，用于特异性地递送给特定的靶细胞或细胞内的核部分。
[0072]端粒酶和LlRT的特定抑制剂或拮抗剂的剂量可以由本领域技术人员在进行常规实验后确定。在给患者施用之前，其效力可以在标准实验动物模型中显示。在这点上，可以使用本领域公知的任何端粒酶诱导的癌症的动物模型(Hahn等人，1999，NatureMedicine, 5(10):1164-1170 ；Yeager 等人，1999，Cancer Research, 59(17):4175-4179)。利用本发明方法治疗的受试者或患者优选地是人，且可以是胎儿、儿童或成人。可接受治疗的其他哺乳动物可以是小鼠、大鼠、兔子、猴子和猪。
[0073]抑制剂或拮抗剂可以单独施用，或与其他化学疗法联合使用。例如，端粒酶诱导的癌症的治疗可以与化学和/或放射性疗法相结合，以治疗由端粒酶或其他一些因素诱导的癌症。本领域技术人员已知的化疗剂的实例包括但不限于抗癌药物，例如博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿嘧啶脱氧核苷(5-FUdR)、氨甲喋呤(MTX)、秋水仙碱和己烯雌酚(DES)。为了进行联合治疗，以在动物或患者体内有效导致其组合抗癌作用的方式给动物施用与另一种抗癌剂(化学或放射)组合的本发明的抑制剂成分。因此，应以有效导致其在靶细胞区域中组合存在的量和时间提供该药剂。为了达到这个目的，这些药剂可以同时施用，在化疗剂的情况下，以单一组合物施用或作为使用不同给药途径的两种不同的组合物施用。或者，两种治疗可以先后进行，例如间隔几分钟到几小时或几天。例如但不限于，全身使用的GCV的平均每日剂量对于成年人可以是每天100mg/kg，对于小鼠和婴儿可以是每天50mg/kg。
[0074]根据被治疗对象的状况可能发生一定的剂量变化。负责给药的内科医生将能确定用于患者个体的合适剂量，并且可能取决于多种因素，例如，所述患者的年龄、状况、病史等。
[0075]因此，本发明的方法可以用于与端粒酶诱导的病理性细胞增殖有关的状况和疾病的治疗应用。可受益于本发明的治疗应用的疾病包括，以细胞高度增殖为特征的所有疾病，包括(例如)实体瘤和白血病，以及非癌症状况。进一步预期本发明的方法不仅在体内环境中，而且在离体(ex vivo)条件下，能够用于抑制癌细胞的生长。本发明的方法尤其可用于抑制病理性增殖的人细胞的离体生长，包括但不限于人类癌细胞一骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0076]本发明提供用于鉴定由于细胞中端粒酶或LlRT表达而不适当地、病理性或异常增殖的细胞的方法和试剂盒。该方法可以用作筛选方法，通过确定患者组织中端粒酶或LlRT表达的存在(和/或水平)帮助诊断患者中癌细胞或肿瘤的存在，水平升高的端粒酶或LlRT表达的存在指示患者中存在癌细胞或病理性细胞增殖。
[0077]例如，癌性肿瘤样品可以根据它们不能在本发明的无环核苷类似物存在下增殖而得到诊断。该诊断可进一步包括通过多种方法检测端粒酶特异性mRNA表达，这些方法包括但不限于:应用核酸的杂交、Northern印迹法、原位杂交、RNA微阵列、RNA保护分析、RT-PCR、实时RT-PCR，或通过多种方法测定端粒酶催化亚单位编码的蛋白质的存在，该方法包括但不限于=Western印迹法、免疫沉淀或免疫组化、或端粒酶的酶活性(TRAP试验及其改进WO。
[0078]在一个优选实施方案中，可以利用针对端粒酶催化亚单位RNA的核酸探针检测经历快速增殖的组织中端粒酶催化亚单位RNA mRNA水平的存在和/或增加，所述组织例如是原发癌细胞，包括人类骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。因此，本发明提供使用与端粒酶亚序列互补的核酸探针检测和确定病理性增殖的细胞(包括癌细胞)的方法。例如，确定病理性增殖的细胞的方法可包括使用针对hTERT mRNA或LlRT mRNA的核酸探针将受检细胞中hTERT mRNA或LlRT mRNA的表达水平与对照细胞中hTERT mRNA或LlRT mRNA的表达水平进行比较。当观察到如同对照细胞中的hTERT或LlRT表达水平时，受检细胞就被确定为病理性增殖细胞。然而，本发明的方法中使用的核酸探针也可以基本上互补于人、小鼠或其他哺乳动物的hTERT mRNA或LlRT mRNA序列。
[0079]本领域技术人员应当理解，可以在核酸探针中进行不影响该探针有效检测病理性增殖细胞(例如癌细胞)中hTERT mRNA或LlRT mRNA的能力的取代，因此这样的取代在本发明的范围之内。在本发明方法中使用的核酸探针可以是DNA探针或修饰的探针，例如肽核酸探针、硫代磷酸探针、或2’ -O甲基探针。核酸探针的长度可以是大约8个或10到50个核苷酸，优选地大约15到25个核苷酸。本发明的方法可以很容易地在来自人、哺乳动物或其他脊椎动物的细胞提取物、培养的细胞或组织样品中进行。
[0080]本发明的方法可用于检测由于体外细胞、细胞培养物以及人类细胞和组织例如实体瘤和癌(例如人类骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌、或黑素瘤)中端粒酶表达而引起的不适当地、病理性或异常增殖的细胞。
[0081]本发明还提供检测和/或抑制高度增殖细胞或癌细胞的试剂盒。该试剂盒可含有PCV、ACV、GCV、缬更昔洛韦、伐昔洛韦、或其他无环核苷类似物，和/或含有与hTERT mRNA或LlRT mRNA的亚序列完全互补或基本互补的核酸探针。
[0082]本发明的药物组合物、抑制剂或拮抗剂可以通过多种方式给药，包括口服、局部、非肠胃给药，例如皮下、腹膜内、通过病毒感染、血管内给药等。根据导入的方式，化合物可以用多种方式配制。适用于口服给药的制剂可以是液体溶液。适用于非肠胃给药(例如通过关节内、心室内、鼻内、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的制剂包括等渗无菌注射水溶液和非水溶液。在本发明的实施中，组合物可以(例如)通过静脉输注、口服、局部、非肠胃或腹膜内途径给药。口服和非肠胃给药是优选的给药方法。配制和给药技术在本领域中是常规的，进一步的细节可见例如Remington’s PharmaceuticalSciences (2000), Gennaro AR(ed), 20th edit1n, Maack Publishing Company, Easton, PA。
[0083]治疗有效量或药理学有效量是本领域公认的短语，是指产生预期药理学结果的有效药物剂量。例如，治疗有效量是足以随时间在患者中产生有益治疗反应(即，治疗疾病或病症，或缓解患者的所治疗疾病的症状)的量。实际施用的量取决于应用治疗的个体，优选地是获得所需效果且没有明显副作用的优化的量。如下文进一步详细描述的，也可根据所施用的特定抑制剂或拮抗剂的效力和患者的状况以及被治疗的患者的体重或表面积来确定剂量。剂量的大小也可以根据对特定患者施用(例如)特定试剂、载体或转导细胞型所伴随的任何不良副作用的存在、特性和程度来确定。
[0084]利用来自本文公开的细胞培养试验和/或来自利用动物模型的体内试验所获得的数据，很容易确定能够防止、抑制或减少端粒酶/LlRT介导的癌症发病率的药物的治疗有效量。也可以利用动物模型来估计对于人体的适当剂量范围和给药途径。在换算为临床环境之前，经常利用荷有人源实体瘤的实验动物(或本领域公认的动物模型)优化适当的治疗剂量。已知这些模型在预测有效的抗癌策略方面是非常可靠的。例如，荷有实体瘤的小鼠或本领域公认的小鼠模型被广泛用于临床前试验，用于确定产生有益抗肿瘤效果而毒性最小的治疗剂的工作范围。由于安全性已经在本领域公认的模型中得到证实，至少对于本文举例说明的核苷类似物来说，本发明的临床前检测主要是常规实验。体内有效性可利用测量肿瘤形成(进展)的抑制、肿瘤消退或转移等的试验来预测。
[0085]以下描述了利用由人HeLa癌细胞系生长的裸鼠皮下(s.c.)肿瘤(S卩，携带异种移植物的小鼠)作为癌症模型测定ACV、PCV和/或GCV的抗肿瘤效力的示例性体内试验。
[0086]体内试验需要的人类癌细胞例如可如下制备:从公共来源获得端粒酶阳性HeLa人细胞系和端粒酶阴性U-20S人细胞系。将细胞于37°C和5% 0)2的潮湿空气中保存在补充有10%胎牛血清的D-MEM培养基中。
[0087]对于体内试验，获得合适的宿主，例如大约5 — 7周龄的裸鼠(nu/nu)，并且置于不含病原体的环境中。将包含在200 μ I无血清培养基中的大约I X 16个HeLa细胞(和/或U-20S细胞)通过胁腹皮下注射(s.c.)输送给所有用甲氧氟烷(Metofane)暂时麻醉的动物。之后将小鼠分为实验组和对照组。使用适当浓度的ACV、PCV和/或GCV进行肿瘤生长进展或消退试验。
[0088]在一个实施方案中，评估皮下肿瘤生长或进展时间的减少，而不是已建立的肿瘤大小的缩小(消退)。在这个实施方案中，从第O天开始，实验组中的小鼠在饮用水中任意获得GCV。水中GCV的浓度可以是2mg/ml。每3天提供一次新鲜的GCV溶液。对照组中的小鼠只接受饮用水。每2 — 3天测量一次肿瘤。当肿瘤超过Icm3时，处死小鼠。肿瘤体积用公式4/3 Jir3计算，其中1*是肿瘤的半径。对照组中的所有小鼠均长出肿瘤，而实验组中的所有小鼠保持没有肿瘤。
[0089]在另一个实施方案中，本发明的试剂和方法可用于促进携带预先已建立的肿瘤的免疫活性动物体内肿瘤的消退；即，本发明的 试剂可用来治疗预先存在肿瘤的动物。在这种情况下，将16个小鼠肝癌MH-22细胞或类似细胞皮下注射到C3HA小鼠的侧腹来建立肿瘤。一旦在肿瘤细胞植入后形成肿瘤，即在随意提供的饮用水中给实验组小鼠施用含有Famvir胃内(1.g.)溶液的组合物，而对照组小鼠接受不含该药物的相同组合物(例如蒸馏水)。每2 — 3天监测一次肿瘤生长。Famvir含有泛昔洛韦，即口服给药的喷昔洛韦的前药。在化学上，泛昔洛韦被称为二乙酸2-[2-(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基]-1，3-丙二醇。当给这些荷瘤动物施用Famvir 21 一 28天时，观察到肿瘤生长迟缓。这种肿瘤细胞生长的抑制在对照组中未发现。治疗开始几周后，只有用Famvir处理的动物显示100%的存活率。
[0090]在另一个实施方案中，也可采用确定细胞凋亡促进的体内试验。在这个实施方案中，可以检测用治疗性组合物治疗的带有异种移植物的动物中凋亡灶的存在，并与未治疗的带有异种移植物的对照动物相比较。在治疗组动物的肿瘤中发现凋亡灶的程度提供了关于该组合物的治疗效果的指示。
[0091]在设计用于治疗端粒酶介导的人类癌症(早期肿瘤和血管化的肿瘤)的药物的适当剂量时，可由本文描述的动物研宄外推而容易地获得用于临床给药的合适剂量。为了实现这种转换，需考虑每单位质量的实验动物所施用的药物质量，优选地考虑实验动物和人类患者之间体表面积的差异。所有这些计算对本领域普通技术人员来说是已知的和常规的。因此，治疗有效剂量的确定属于本领域技术人员的能力范围之内。
[0092]例如，采用在细胞培养试验和小鼠研宄中成功的GCV或ACV (V-GCV或V-ACV)剂量，并且应用基于质量和表面积的标准计算，得出用于成人患者的有效剂量是每名患者每天大约100mg到大约6000mg的GCV或ACV，优选地是每名患者每天大约500mg到大约100mg的V-GCV或V-ACV。因此，应用这些信息，本文预期用于人类给药的治疗剂(例如阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药，即，伐昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦)的低剂量可以是每名患者每天大约1、5、10、20、25或大约30mg ;用于人类给药的治疗剂的有用高剂量可以是每名患者每天大约250、300、400、450、500或大约600mg。有用的中等剂量可以是每名患者大约40mg到大约200mg。
[0093]尽管提到这些范围，但是应当理解，考虑到本文所述的参数和详细指导，在本发明的范围内也包括活性或最佳范围的进一步变化。本发明的治疗方案的目的总的是产生明显的抗肿瘤效果，同时仍然使剂量保持在与不可接受的毒性有关的水平以下。除了改变剂量本身外，也可以改变给药方案以优化治疗策略。目前优选的一种治疗策略是在大约60天的期限内施用大约I 一 500mg、优选地大约1-1OOmg的端粒酶抑制剂或拮抗剂或包含它们的治疗性混合物，大约4次。例如，可以在大约第1、第3或第4天和第6或第7天给予剂量。可通过口服单个或分开的剂量进行给药，或者例如直接向实体瘤部位给药，或者以缓释制剂形式给药。负责给药的医生根据本发明的公开内容，将能够确定适合受试个体的剂量、给药的形式和途径。这种优化和调整在本领域中常规进行，不需要过多的实验。在施用特定剂量本身时，根据关于无菌性、致热原性、纯度和对人类患者全身的总体安全性的管理标准，优选地提供药物学上可接受的组合物。当然，身体检查、肿瘤测量和实验室检验应当在治疗前进行，并且在治疗后以最多I到几个月的间隔进行，本领域技术人员应当知道如何进行这种常规程序。临床反应可用任何可接受的指标来定义。例如，完全有效可以定义为在治疗后特定期限内所有可测到的肿瘤均消失。
[0094]工作实施例
[0095]提供下列工作实施例是为了证明本发明的优选实施方案，而绝不应视为限制本发明的范围。除了另外详细说明外，下述实施例采用本领域技术人员公知的常规技术进行。此夕卜，本领域技术人员还应当理解，该实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在实施本发明中工作良好的技术，因此可以被视为构成了优选实施模式。然而，本领域技术人员根据本申请的公开内容应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，而仍然获得同样的或类似的结果。
[0096]端粒酶阳性癌细胞中端粒酶缩短、G2停滞和细胞凋亡的诱导已经如下所述进行。
[0097]使用端粒酶阳性(HeLa)和端粒酶阴性(U-20S)细胞系。进行适当的试验以检测和证实这些细胞中的端粒酶/LlRT比活性。
[0098]这些细胞系用治疗浓度的ACV (3.0 μ M)、GCV (1.5 μ M)或PCV (1.5 μ Μ)处理，以证明这些细胞内的端粒DNA合成可被抑制，由此诱导端粒缩短。ACV、GCV和PCV处理的和未处理的细胞系中的端粒长度采用端粒特异性肽核酸(PM)探针通过流式细胞术进行测量23’24。为了确定细胞周期分布，用二碘化丙锭(PD将细胞染色23。在处理后10天和14天，证明两种细胞系发生端粒缩短、大规模细胞凋亡和G2停滞(图1、2、3)。
[0099]为了证明细胞周期分布的变化，用ACV、GCV或PCV处理HeLa和U-20S细胞14天，用PI染色，并同时通过流式细胞术进行分析。结果显示细胞周期G2停滞。重要的是注意到这种变化是快速的，并且在ACV处理仅仅几天后就可检测到。
[0100]该研宄中使用的U-20S(骨肉瘤)和HeLa(子宫颈)细胞系从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collect1n) (Rockville, MD)获得。细胞在 37°C和 5%CO2的潮湿气氛下在补充10%胎牛血清的D-MEM培养基中培养。为了用ACV处理细胞，向培养基中补加3 μΜ阿昔洛韦(阿昔洛韦，TEVA Pharm.1nd.Ltd,以色列)。为了用GCV处理细胞，向培养基中补加1.5 μΜ GCV(Cymevene, Hoffman-La Roche)。为了用PCV处理细胞，向培养基中补加1.5 μΜ PCV(喷昔洛韦，Merck&C0.)。
[0101]实时TRAP 试验如前所述进行(Wege 等人，SYBR Green real-time telomericrepeat amplificat1n protocol for the rapid quantificat1n of telomeraseactivity.Nucleic Acids Res.2003 ;31(2):E3_3)。
[0102]对于通过流式细胞术进行的端粒长度测量，如Rufer等人，1998，Telomerelength dynamics in human lymphocyte subpopulat1ns were measured by flowcytometry, Nat.B1technol.16, 743-747所述，将细胞用端粒特异性FITC偶联的(C3TA2)3PNA(Applied B1systems)探针染色，并且用 0.06 μ g/ml PI 复染。
[0103]因此，本文已经证实了核苷类似物ACV、GCV和PCV显然导致端粒长度缩短。绝不应认为有用的抑制性化合物仅限于以上具体举例说明的特定化合物或核苷类似物和衍生物。实际上，可以证明根据本申请公开内容设计和合成的大多数有用的药理学化合物是第二代衍生物或进一步化学修饰的无环核苷类似物。
[0104]引用的参考文献:
[0105]下列编号为I 一 26的参考文献在上述说明书中被引用(带有相应的上标号)，因此本领域的技术人员会将这些参考文献与上文中适当的上标号相对应。
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[0132]说明书中提到的全部出版物、专利和专利申请体现本发明所属领域的技术人员的水平。全部出版物、专利和专利申请引入本文作为参考，其程度等同于每个单独的出版物或专利申请具体且分别地引入作为参考。尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和实施例详细描述了上述发明，但是显然可在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修改。
【主权项】
1.治疗有效量的仅包含一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐作为组合物中活性化合物的组合物在制备预防或治疗哺乳动物或人体中由于存在不适当地或病理性增殖的细胞或无限增殖细胞而引起的疾病或治疗癌症的药物中的用途，所述组合物用于调节、抑制或阻止细胞中端粒延长，其中增殖的细胞、无限增殖细胞和癌细胞是端粒酶阳性的或表达L-1 (LINE-1)逆转录酶，且其中所述组合物的使用诱导了增殖的细胞、无限增殖细胞和癌细胞中的进行性端粒缩短、G2期停滞、染色体异常和最终的细胞死亡。2.权利要求1的用途，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。3.权利要求1的用途，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。4.权利要求1的用途，其中所述组合物通过口服、非肠胃、皮下、肌肉内或血管内施用。5.权利要求2的用途，其中施用包含两种或多种所述核苷类似物的组合物。6.权利要求1的用途，其中所述核苷类似物之一的施用量为每天大约10mg/kg体重到大约150mg/kg体重。7.权利要求1的用途，其中所述核苷类似物与放射治疗和/或非核苷化疗剂联合施用。8.治疗有效量的仅包含一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐作为组合物中活性化合物的组合物在制备干扰肿瘤细胞中端粒延长的药物中的用途，其中所述肿瘤细胞是端粒酶阳性的或表达L-1 (LINE-1)逆转录酶，且其中所述无环核苷类似物的使用诱导了肿瘤细胞中的进行性端粒损失、G2期停滞、染色体异常和最终的细胞死亡。9.权利要求8的用途，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。10.权利要求9的用途，其中所述核苷类似物与选自下组的不同类型的类似物联合施用:3’_叠氮-2’，3’-双脱氧胸苷(AZT)、2’，3’-双脱氧肌苷(ddl)、2’，3’-双脱氢-3’-脱氧胸苷(d4T)，其中所述不同类型的类似物以低剂量存在，其单独时不足以终止端粒的延长。11.权利要求8的用途，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
【专利摘要】无环核苷类似物，如阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药，即，分别为伐昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦，已经被鉴定为端粒酶(由TERT编码)和由L-1(LINE-1)RT编码的逆转录酶的抑制剂或拮抗剂，并且可用于治疗或预防由这两种酶诱导的或介导的癌症。治疗或预防患者中的这些癌症的方法包括在患者细胞中施用治疗有效量的含有逆转录酶的抑制剂或拮抗剂的组合物。所述抑制剂或拮抗剂阻断端粒酶阳性和端粒酶阴性细胞中的端粒延长。还公开了用于检测表达TERT和L1RT的病理学增殖细胞的方法和试剂盒。
【IPC分类】A61K31/522, A61K31/708, A61K31/7072, A61P35/00
【公开号】CN104906105
【申请号】CN201510093008
【发明人】I·E·邦达雷夫
【申请人】Alt解决方案公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2006年5月18日
【公告号】CA2609303A1, CN101588805A, EP1885370A2, EP1885370A4, US8609623, US9078901, US20090137503, US20140113918, WO2006125166A2, WO2006125166A3, WO2006125166A9
【专利说明】为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节
[0001]本申请是申请日为2006年5月18日、申请号为200680024082.7、发明名称为“为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节”的发明专利申请的分案申请。
[0002]本申请要求2005年5月18日提交的美国临时申请N0.60/682, 110的优先权，申请60/682，110的文本全部引入本文作为参考。
技术领域
[0003]本发明涉及癌症治疗领域。具体地，本发明涉及癌细胞中端粒延长的调节。更具体地，本发明涉及无环(acyclic)核苷类似物在治疗或预防癌症中的用途。
【背景技术】
[0004]前导和后随DNA链合成中的不对称造成了线性基因组复制的“终止问题”1。为了克服这个问题，真核生物染色体具有特化的末端结构，即由TTAGGG重复序列组成的端粒2。端粒酶3，4是延长端粒并因此在细胞倍增期间保持大多数癌细胞的染色体稳定性的核糖核蛋白酶5。细胞倍增期间DNA从端粒末端的逐渐损失涉及体细胞中细胞增殖潜力的控制6。
[0005]培养的正常人类细胞在培养中具有有限的复制潜力。培养中的正常细胞进行复制，直到它们达到群体生长停止时的离散点。这被称为死亡期1(M1期)，是由于少数端粒缩短到导致被称为细胞老化的生长停滞的大小而引起的。能够通过消除P53和pRB人肿瘤抑制基因的功能而绕过这个阶段。之后该细胞可继续增殖而端粒长度进一步变短，直到另一个被称为死亡期2 (M2期)或转折期的限制点。M2期的生长停滞是由细胞增殖和细胞死亡速率之间的平衡引起的。在这个阶段，当大多数端粒非常短的时候，末端与末端的融合和染色体断裂一融合引起显著的染色体异常和细胞凋亡。在极少的情况下，细胞能够脱离M2并通过稳定其端粒的长度而变为无限增殖的。这是通过端粒酶活化或替代性端粒延长机制(即替代的端粒延长或ALT)而发生的7，8。
[0006]人类种系9和多数癌细胞3表达端粒酶。端粒酶对已缩短的端粒的延长是人类癌细胞中端粒维持的主要机制。对端粒酶的抑制通过缩短端粒的长度而限制人类端粒酶阳性癌细胞的生长n。
[0007]已经尝试利用核苷类似物(例如AZT)干扰人端粒酶活性以达到治疗癌症的目的。然而现有技术中公开的施用核苷类似物改变端粒酶活性的方法不能令人满意，或者不适合临床情况，因为它们的临床应用受到低治疗比(即毒性剂量与有效剂量之比)的限制。
[0008]此外，由于细胞(包括癌细胞)的增殖能力是由于端粒酶介导的端粒延长机制和/或ALT机制的激活，用于控制细胞增殖的理想的核苷类似物是对于这两种机制都有效并且对正常细胞和组织毒性最小或没有毒性的那些核苷类似物。因此，需要鉴定可以抑制增殖的细胞例如通过端粒酶和/或ALT机制维持其端粒的癌细胞的治疗性核苷类似物。
【发明内容】
[0009]本发明提供涉及使用抗病毒核苷类似物调节、抑制或阻止细胞中端粒延长的方法和组合物，而无论端粒延长机制如何(端粒酶或ALT机制)。本发明还公开了使用特定核苷类似物预防和/或治疗增生性疾病和所有类型的癌症的方法。更具体地，本发明公开了在对相应的正常体细胞没有细胞毒性的水平上可以干扰增殖的细胞、包括癌细胞(例如人类癌细胞)中的端粒酶活性和L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码的逆转录酶(LlRT)活性的无环核苷类似物。本发明公开了如何使用无环核苷类似物作为抗肿瘤剂或抗癌剂。在本发明的一个方面，已经发现用更昔洛韦、阿昔洛韦和/或喷昔洛韦处理端粒酶阳性或端粒酶阴性细胞(但是具有LlRT活性)诱导了进行性的端粒损失、G2期停滞、染色体异常和最终的细胞死亡。此外，这些抗肿瘤核苷类似物对端粒酶或LlRT具有惊人的效果，因为其临床上可接受的水平足以在增殖的细胞中控制端粒酶活性并且诱导细胞死亡，由此允许治疗或预防所有类型的癌症。
[0010]当前，在应用中还没有基于无环的、抗端粒酶、抗LlRT和抗肿瘤核苷类似物的治疗性组合物。申请人第一次披露了使用无环核苷类似物(在本文中也被称为端粒延长的抑制剂或拮抗剂)在体内抑制端粒延长在治疗上是有益的。而且，在本发明之前，本领域技术人员没有认识到可以预测这种处理具有治疗用途。
[0011]由于端粒酶参与控制细胞周期、细胞复制和老化，因此本发明的含有核苷类似物的组合物可以阻止或控制不受控制的细胞生长和肿瘤细胞的无限增殖性。本发明的组合物尤其可用于治疗细胞增殖性疾病，特别是以端粒酶或LlRT维持或延长端粒为特征的人类肿瘤。
[0012]因此，一方面，本发明提供了一种治疗与端粒酶或LlRT维持或延长端粒有关的、特别是与细胞中端粒酶或LlRT活性水平升高有关的疾病的方法。该方法包括给所述细胞或需要治疗的哺乳动物施用一种组合物，该组合物含有治疗有效量的至少一种为无环、抗端粒酶、抗LlRT和抗肿瘤剂的核苷类似物。细胞中的端粒酶活性或LlRT活性水平可以如以下文献中所述测定，例如:本申请人于2005年3月25日提交的名称为“Modulat1n OfTelomere Length In Telomerase Positive Cells For Cancer Therapy，，的美国专利申请 60/655，105，以及于 2005 年 I 月 18 日提交的名称为“Modulat1n Of Line-1 ReverseTranscriptase”的国际专利申请PCT/US05/001319，该专利申请引入本文作为参考。细胞中的端粒酶活性或LlRT活性水平也可以通过任意其他现有的方法或等同的方法测定。端粒酶活性或LlRT活性的“升高的水平”是指特定细胞中端粒酶活性或LlRT活性的绝对水平比受试者或个体的正常细胞升高，或者比未患该疾病的其他受试者或个体的正常细胞升高。这些疾病的例子包括癌性疾病，或与正常情况下不存在于个体中的细胞的存在有关的疾病。优选地，该组合物含有GCV或ACV或它们的前药。这些组合物(直接抑制端粒酶活性或LlRT活性，或者间接整合到端粒中从而阻止端粒进一步延长)的应用将在端粒酶具有活性的肿瘤中导致进行性的端粒缩短。一旦端粒长度缩短到临界长度，肿瘤就进入转折期并最终死亡。这些抑制剂对正常体细胞没有影响或者只有极小的影响，因为正常细胞中的端粒酶活性和/或LlRT活性通常较低或者检测不到。
[0013]干扰端粒的延长或维持可能直接导致细胞死亡或者可能加强最终通过凋亡杀死细胞的化疗剂的作用。特别地，本发明提供一种通过施用含有本发明的无环核苷类似物的组合物来抑制具有细胞数持续增长潜力的端粒酶/LlRT表达细胞增殖的方法。核苷类似物的施用可以通过本领域技术人员公知的任何期望的方法来实现。
[0014]在本发明的一个实施方案中，提供一种预防以需要该预防的哺乳动物或受试者(例如人)的细胞表达端粒酶或LlRT为特征的癌症的方法。该预防方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的组合物。该组合物含有本发明的端粒酶抑制剂或拮抗剂。该抑制剂或拮抗剂阻断端粒酶阳性/端粒酶阴性细胞中端粒的延长，由此抑制端粒酶表达细胞的增殖。该抑制剂是无环核苷类似物或这种类似物的药学上可接受的盐或富含该抑制剂或拮抗剂的液体或固体食品材料。该食品可以是，例如，黄油、人造黄油、饼干、面包、蛋糕、蜜饯、糖果、酸奶酪或其他发酵乳制品、或适于人类消费的谷类食品形式的功能性食物。或者可以是营养补充物、营养物、药品、食品、营养品、健康食品和/或特制食品。定时检测人体中端粒酶阳性细胞的存在。一旦在哺乳动物中不再检测到端粒酶阳性细胞，即可停止使用抑制剂或拮抗剂。
[0015]除了治疗方面以外，本发明还提供用于检测病理性增殖的表达端粒酶或LlRT的细胞的诊断方法和试剂盒。本发明的这些和其他实施方案将会在下文更详细地描述。
[0016]本发明涉及但不限于以下各项:
[0017]第I项.一种预防或治疗哺乳动物或人体中由于存在不适当地或病理性增殖的细胞或无限增殖细胞而引起的疾病或治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的人施用治疗有效量的包含一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物。
[0018]第2项.第I项的方法，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0019]第3项.第I项的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0020]第4项.第I项的方法，其中所述组合物通过口服、非肠胃、皮下、肌肉内或血管内施用。
[0021]第5项.第2项的方法，其中施用包含两种或多种所述核苷类似物的组合物。
[0022]第6项.第I项的方法，其中所述核苷类似物之一的施用量为每天大约10mg/kg体重到大约150mg/kg体重。
[0023]第7项.第I项的方法，其中所述核苷类似物与放射治疗和/或非核苷化疗剂联合施用。
[0024]第8项.一种干扰肿瘤细胞中端粒延长的方法，该方法包括给所述细胞施用有效量的无环核苷类似物。
[0025]第9项.第8项的方法，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0026]第10项.第9项的方法，其中所述核苷类似物与选自下组的不同类型的类似物联合施用:3’ -叠氮-2’，3’ -双脱氧胸苷(AZT)、2’，3’ -双脱氧肌苷(ddl)、2’，3’ -双脱氢_3’ -脱氧胸苷(d4T)，其中所述不同类型的类似物以低剂量存在，其单独时不足以终止端粒的延长。
[0027]第11项.第8项的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0028]第12项.一种防止或抑制端粒酶阳性细胞生长的方法，该方法包括使细胞接触足量的无环核苷类似物。
[0029]第13项.第12项的方法，其中所述细胞与浓度为大约1.5 μΜ至3.0 μΜ的核苷类似物接触。
[0030]第14项.第12项的方法，其中所述核苷类似物是阿昔洛韦、更昔洛韦或喷昔洛韦或其前药。
[0031]第15项.第12项的方法，其中所述端粒酶阳性细胞是癌细胞，其中所述癌细胞选自:骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。
[0032]第16项.一种在需要的人中预防癌症的方法，其中所述癌症是由于该人细胞中的端粒酶活性引起的，该方法包括给所述人施用治疗有效量的含有一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物。
[0033]第17项.第16项的方法，其中所述癌症选自:骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。
[0034]第18项.一种治疗患有癌症的个体的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的含有逆转录酶的抑制剂或拮抗剂的组合物，该逆转录酶由L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码或是端粒酶逆转录酶(TERT)，并且与所述个体细胞中端粒的延长有关，其中该抑制剂或拮抗剂阻断所述端粒的延长，其中该抑制剂或措抗剂是选自阿昔洛韦、更昔洛韦、喂'昔洛韦或其前药的无环核苷类似物。
[0035]第19项.第18项的方法，其中所述癌症不包括移植后淋巴增生性疾病。
[0036]第20项.第19项的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0037]第21项.第20项的方法，其中所述组合物通过口服、非肠胃、皮下、肌肉内、血管内或局 部施用。
[0038]第22项.一种治疗人的癌症的方法，其中所述癌症是由于该人细胞中显示端粒酶介导的端粒延长或L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码的逆转录酶诱导的替代性端粒延长的细胞引起的，该方法包括给所述患有癌症的人施用治疗有效量的含有一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述核苷类似物阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物选自阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0039]第23项.第22项的方法，其中施用包含两种或多种所述核苷类似物的组合物。
[0040]第24项.第23项的方法，其中所述核苷类似物之一的施用量为每天大约10mg/kg体重到大约500mg/kg体重。
[0041]第25项.一种终止端粒酶阳性和端粒酶阴性肿瘤细胞中的端粒延长的方法，该方法包括给所述细胞施用有效量的端粒酶的抑制剂或拮抗剂或由L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码的逆转录酶的抑制剂或拮抗剂，其中所述抑制剂或拮抗剂阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物选自阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0042]第26项.第25项的方法，其中所述核苷类似物与选自下组的不同类型的类似物联合施用:3’ -叠氮-2’，3’ -双脱氧胸苷(AZT)、2’，3’ -双脱氧肌苷(ddl)、2’，3’ -双脱氢_3’ -脱氧胸苷(d4T)，其中所述不同类型的类似物以低剂量存在，其单独时不足以终止端粒的延长。
[0043]第27项.第26项的方法，其中所述肿瘤细胞是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0044]第28项.一种防止或抑制显示端粒延长的端粒酶阳性或阴性细胞生长的方法，该方法包括:
[0045]使所述细胞接触一种核苷类似物，其中所述核苷类似物阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物是阿昔洛韦、更昔洛韦、或喷昔洛韦或其前药。
[0046]第29项.第28项的方法，其中所述细胞与浓度为0.2 μ M的核苷类似物接触。
[0047]第30项.第28项的方法，其中所述端粒酶阴性细胞是癌细胞，其中所述癌细胞选自骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0048]第31项.一种干扰系统中端粒酶或LlRT活性的方法，包括给显示由端粒酶或LlRT活性介导的端粒延长的系统提供一定量的核苷类似物，其中所述核苷类似物阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物是阿昔洛韦、更昔洛韦、或喷昔洛韦或其前药，其中所述系统是在体外或体内生长的细胞。
[0049]第32项.一种在需要的人中预防癌症的方法，其中所述癌症是由于该人细胞中显示由端粒酶或L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码的逆转录酶诱导或介导的替代性端粒延长的细胞引起的，该方法包括给该人施用治疗有效量的含有一种或多种核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物，其中所述核苷类似物阻断所述端粒延长，其中所述核苷类似物选自阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0050]第33项.第32项的方法，其中所述癌症选自:骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。
【附图说明】
[0051]图1表示流动-FISH数据，显示HeLa细胞在处理10天后的端粒长度缩短、大规模凋亡和细胞周期变化(点图一左图，直方图一右图)。数据007 -未处理；数据008 -用3 μ M ACV 处理；数据 009 -用 1.5 μ M GCV 处理；数据 010-用 1.5 μ M PCV 处理。FLl -PNA-FITC, FL3 -ΡΙ。
[0052]图2表示流动-FISH数据，显示U-20S细胞在处理10天后的端粒长度缩短、大规模凋亡和细胞周期变化(点图一左图，直方图一右图)。数据001 -未处理；数据002 -用3 μ M ACV 处理；数据 003 -用 1.5 μ M GCV 处理；数据 004 -用 1.5 μ M PCV 处理。FLl -PNA-FITC, FL3 -ΡΙ。
[0053]图3表示流动-FISH数据，显示U-20S细胞在处理14天后的端粒长度缩短、大规模凋亡和细胞周期变化(点图一左图，直方图一右图)。数据001 -未处理；数据002 -用3 μ M ACV 处理；数据 003 -用 1.5 μ M GCV 处理；数据 004 -用 1.5 μ M PCV 处理。FLl -PNA-FITC, FL3 -ΡΙ。
[0054]发曰月详沐
[0055]本发明提供涉及使用能够干扰细胞中端粒延长的核苷类似物的组合物和方法。特别是，已经发现某些核苷类似物在临床上可接受的水平时可以影响细胞中的端粒、端粒酶和LlRT功能。特别地，在本发明的上下文中，“核苷类似物”是与天然存在的核苷在结构上相似的化合物，但是仅限于无环的那些类似物。本发明中涉及的无环核苷类似物具有嘌呤(或嘧啶)骨架，该骨架具有一个尾部分(例如鸟嘌呤中存在的9-(1,3-二羟基-2-丙氧甲基))，但是缺乏羟环(戊糖)。本发明的类似物的例子包括但不限于以下化合物:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药，即，分别为伐昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦。阿昔洛韦12通过模拟细胞DNA组分鸟嘌呤起作用。鸟嘌呤即DNA的AT-GC中的“G”。阿昔洛韦(9_[2 (羟甲氧基)-甲基]鸟嘌呤)尽管在结构上类似于“G”，但是它的尾部一羟“环”(戊糖)缺失，因此为“无环的”。更昔洛韦13，1415和喷昔洛韦16，17也是“无环的”，因为它们也缺少羟环。在本发明的一个实施方案中，本发明的无环核苷类似物的尾部具有至少一个羟基，该羟基模拟核苷的2’ -脱氧核糖部分的3’ -和5’ -羟基。已经发现本发明的无环核苷类似物表现出抗端粒酶和抗肿瘤性质，其毒性程度在临床上可以接受。无环核苷类似物阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药，即伐昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦，均被批准作为抗病毒药临床应用。它们的化学结构和对抗病毒感染的剂量方案是本领域技术人员公知的。
[0056]尽管阿昔洛韦、更昔洛韦、喂■昔洛韦及相应的如药是公知的治疗或缓解痕疼病毒或/和CMV感染的药物，但是它们在治疗肿瘤疾病中的应用还是未知的。例如，喷昔洛韦用于人的唇部和面部以治疗单纯疱瘆病毒引起的唇疱瘆。本领域中还知道这些核苷类似物的目标酶是DNA聚合酶。
[0057]本发明表明无环抗病毒剂也可以针对端粒酶或LlRT并影响哺乳动物细胞中的端粒延长(或损害端粒)。一般认为这些药物一旦进入增殖的细胞内即被磷酸化(例如二磷酸盐和三磷酸盐形式)，并且与端粒酶反应的天然底物(例如dGTP)竞争。磷酸化类似物可以抑制天然底物向正在延长的端粒DNA链中的掺入，或者其本身可以掺入到DNA中，由此干扰端粒酶或LlRT介导的聚合活性，最终导致链延长的终止。实质上，这些核苷类似物通过链延长的终止损害端粒DNA、缩短端粒并且导致细胞凋亡。对端粒的损害对于快速生长的(例如肿瘤)细胞比对于正常细胞更加有害。
[0058]已经报道了抗HIV和抗疱瘆核苷类似物只有在从核苷磷酸化为核苷酸的阶段之后才具有活性。因此，磷酸化看来是核苷类似物针对其靶标的活性的关键因素。在这点上，曾经报道了 AZT需要三次连续的磷酸化才具有针对端粒酶的活性。
[0059]本发明的无环核苷类似物是比现有技术中已知的抗端粒酶核苷类似物如AZT更强并且选择性更高的端粒延长抑制剂；与诸如AZT的核苷类似物相比，其临床上可接受的剂量a 19, 20,21, 22足以实现端粒长度的缩短和细胞凋亡或细胞死亡。
[0060]尽管没有提到通过本发明可能实现有利的应用，但是以前为了治疗CMV(巨细胞病毒)感染而给AIDS或其他免疫缺陷患者施用(例如)GCV意味着GCV可以容易地给癌症患者施用。
[0061]进一步地，目前大量无环核苷类似物对于HSV和CMV患者的应用，以及这些类似物以明显较低剂量使用的能力，应当加快管理部门批准阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药(即伐昔洛韦、缬更昔洛韦和泛昔洛韦)用于治疗端粒酶和/或LlRT诱导的和/或介导的癌症。
[0062]本发明还包括各种动物模型的使用。通过开发或分离表达端粒酶的细胞系，可以在各种实验动物中产生疾病模型。这些模型可以采用皮下、原位(orthotopic)或全身施用细胞，以模拟各种疾病状态。例如，可以将HeLa细胞系皮下注射进裸鼠体内以获得端粒酶阳性肿瘤。产生的肿瘤在端粒重复扩增法(TRAP)试验中应当显示端粒酶活性。这样的动物模型也提供了分别以及组合检测核苷类似物的有用工具。
[0063]在体内确定一种化合物的有效性涉及多种标准，包括但不限于存活率、肿瘤消退、肿瘤进展的停滞或减缓、肿瘤消失以及转移的抑制或阻止。
[0064]用试验化合物处理动物包括给动物施用适当形式的化合物或组合物。本发明的药物组合物、抑制剂或拮抗剂可以通过多种途径施用，包括但不限于口服、非肠胃、经鼻、口腔、直肠、阴道或局部途径。此外，也可通过气管内滴注、支气管滴注、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行施用。特别预期的是全身性静脉内注射、通过血液或淋巴供应的局部给药和肿瘤内注射。
[0065]本发明的组合物在许多方面是重要的。它们在端粒酶/LlRT相关癌症的治疗方案中至关重要，无论在癌症治疗中是单独给药还是与本领域技术人员已知的化疗和/或放疗方案联合。另外，这些组合物仅仅通过降低端粒酶或LlRT活性就将有助于选择性诱导癌细胞的大规模凋亡。
[0066]核苷类似物可以在生理学或药学上可接受的载体中施用于宿主以治疗增生性疾病等。药学上可接受的载体部分取决于所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法。
[0067]在本发明的一个方面，提供了预防或治疗哺乳动物中由于存在不适当地或病理性增殖的细胞或无限增殖细胞而引起的疾病的方法。这些不适当地或病理性增殖的细胞或无限增殖细胞独立于细胞的正常调控机制而存在并且复制。这些细胞是病理性的，因为它们由于细胞元件即端粒酶的活性而不同于正常细胞。当然，本文所使用的不适当地增殖的细胞可能是良性的高度增殖细胞，但是除非另外说明，否则这些细胞是指所有类型的恶性高度增殖细胞如癌细胞，包括，例如，骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。在本发明的一个实施方案中，本文涉及的癌症范围内不包括移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，它是一种血液癌症。
[0068]特别地，提供了预防或治疗以表达端粒酶或LlRT为特征的人类肿瘤的方法。根据本发明，疾病的预防和治疗是通过使用本发明的无环核苷类似物(端粒酶或LlRT的抑制剂或拮抗剂)而获得的。本发明中使用的抑制剂或拮抗剂是直接或间接地与端粒酶和LlRT相互作用从而抑制其活性的那些无环核苷类似物，和/或掺入到端粒中并由此阻止端粒进一步延长(尽管存在功能性端粒酶或L1RT)、由此抑制表达端粒酶或LlRT的细胞生长的那些无环核苷类似物。因此，端粒酶或LlRT的抑制剂或拮抗剂可用于抑制细胞的生长。例如，当给患者施用端粒酶或LlRT的抑制剂或措抗剂时，引起细胞中的进行性端粒缩短、细胞周期停滞、和/或表达端粒酶的细胞的大规模凋亡。在本发明中，术语“抑制生长”或“生长的抑制”也可以指减少或阻止细胞分裂。根据本发明，表达端粒酶和/或LlRT的细胞生长的抑制可以是大约100%或小于100%，但不是0%。例如，与对照细胞(对照细胞表达端粒酶但是不用抑制剂或拮抗剂处理)相比，抑制可以是大约10%至大约100%，优选地至 少约25%，更优选地至少约50%，更优选地至少大约90%、95%或正好100%。生长的抑制可以用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以将被处理样品中的活细胞数与对照样品中的活细胞数进行比较，与活体染料一起孵育后进行测定。另外，生长抑制也可以通过能够在体外或体内检测细胞增殖减少的测定方法来检测，例如氚化氢掺入试验、BdU掺入试验、MTT试验、形成病灶的能力的改变、贴壁依赖性或丧失无限增殖能力、丧失肿瘤特异性标记、和/或当被注射进动物宿主体内时不能形成或抑制肿瘤(Dorafshar等人，2003, J SurgRes., 114:179-186 ；Yang 等人,2004, Acta Pharmacol Sin., 25:68-75)。
[0069]人体中由一个无限增殖化细胞或几个这样的细胞发展为癌性肿瘤可能需要几个月至几年。但是通过实施本发明，可以预防癌症，因为用含有一种或多种无环核苷类似物的组合物处理的致肿瘤细胞在有机会生长为肿瘤之前就丧失了增殖潜力。而且，在出现癌症的临床表现之前，给危险人群定期预防性施用抑制剂或拮抗剂以终止肿瘤进展可以有效地显著降低新发癌症病例的速度。
[0070]核苷化合物可以通过任何给药途径(包括口服)单独给药或者与不同类似物联合给药。核苷类似物ACV、GCV或其L-valil酯缬更昔洛韦(V-GCV)和伐昔洛韦(V-ACV)是优选的核苷类似物。它们都可以购买得到，其制剂在大量专利和出版物中已有描述。
[0071]具有端粒酶和/或LlRT活性的细胞应当被选择性地靶向，因为这些细胞依赖于端粒酶和/或LlRT来延长或维持端粒，并且端粒的延长或维持需要核苷和/或其类似物与端粒酶或LlRT相互作用。为了发挥抗癌效果，需要任何特异性靶向剂来递送类似物，本文预期使用靶向的PCV或ACV或GCV和/或其他类似物。因此，在一些实施方案中，药物组合物可能具有已经连接到靶向剂(例如肽)上的活性化合物，在该情况下为PCV、ACV和GCV或另一种核苷类似物，用于特异性地递送给特定的靶细胞或细胞内的核部分。
[0072]端粒酶和LlRT的特定抑制剂或拮抗剂的剂量可以由本领域技术人员在进行常规实验后确定。在给患者施用之前，其效力可以在标准实验动物模型中显示。在这点上，可以使用本领域公知的任何端粒酶诱导的癌症的动物模型(Hahn等人，1999，NatureMedicine, 5(10):1164-1170 ；Yeager 等人，1999，Cancer Research, 59(17):4175-4179)。利用本发明方法治疗的受试者或患者优选地是人，且可以是胎儿、儿童或成人。可接受治疗的其他哺乳动物可以是小鼠、大鼠、兔子、猴子和猪。
[0073]抑制剂或拮抗剂可以单独施用，或与其他化学疗法联合使用。例如，端粒酶诱导的癌症的治疗可以与化学和/或放射性疗法相结合，以治疗由端粒酶或其他一些因素诱导的癌症。本领域技术人员已知的化疗剂的实例包括但不限于抗癌药物，例如博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿嘧啶脱氧核苷(5-FUdR)、氨甲喋呤(MTX)、秋水仙碱和己烯雌酚(DES)。为了进行联合治疗，以在动物或患者体内有效导致其组合抗癌作用的方式给动物施用与另一种抗癌剂(化学或放射)组合的本发明的抑制剂成分。因此，应以有效导致其在靶细胞区域中组合存在的量和时间提供该药剂。为了达到这个目的，这些药剂可以同时施用，在化疗剂的情况下，以单一组合物施用或作为使用不同给药途径的两种不同的组合物施用。或者，两种治疗可以先后进行，例如间隔几分钟到几小时或几天。例如但不限于，全身使用的GCV的平均每日剂量对于成年人可以是每天100mg/kg，对于小鼠和婴儿可以是每天50mg/kg。
[0074]根据被治疗对象的状况可能发生一定的剂量变化。负责给药的内科医生将能确定用于患者个体的合适剂量，并且可能取决于多种因素，例如，所述患者的年龄、状况、病史等。
[0075]因此，本发明的方法可以用于与端粒酶诱导的病理性细胞增殖有关的状况和疾病的治疗应用。可受益于本发明的治疗应用的疾病包括，以细胞高度增殖为特征的所有疾病，包括(例如)实体瘤和白血病，以及非癌症状况。进一步预期本发明的方法不仅在体内环境中，而且在离体(ex vivo)条件下，能够用于抑制癌细胞的生长。本发明的方法尤其可用于抑制病理性增殖的人细胞的离体生长，包括但不限于人类癌细胞一骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0076]本发明提供用于鉴定由于细胞中端粒酶或LlRT表达而不适当地、病理性或异常增殖的细胞的方法和试剂盒。该方法可以用作筛选方法，通过确定患者组织中端粒酶或LlRT表达的存在(和/或水平)帮助诊断患者中癌细胞或肿瘤的存在，水平升高的端粒酶或LlRT表达的存在指示患者中存在癌细胞或病理性细胞增殖。
[0077]例如，癌性肿瘤样品可以根据它们不能在本发明的无环核苷类似物存在下增殖而得到诊断。该诊断可进一步包括通过多种方法检测端粒酶特异性mRNA表达，这些方法包括但不限于:应用核酸的杂交、Northern印迹法、原位杂交、RNA微阵列、RNA保护分析、RT-PCR、实时RT-PCR，或通过多种方法测定端粒酶催化亚单位编码的蛋白质的存在，该方法包括但不限于=Western印迹法、免疫沉淀或免疫组化、或端粒酶的酶活性(TRAP试验及其改进WO。
[0078]在一个优选实施方案中，可以利用针对端粒酶催化亚单位RNA的核酸探针检测经历快速增殖的组织中端粒酶催化亚单位RNA mRNA水平的存在和/或增加，所述组织例如是原发癌细胞，包括人类骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。因此，本发明提供使用与端粒酶亚序列互补的核酸探针检测和确定病理性增殖的细胞(包括癌细胞)的方法。例如，确定病理性增殖的细胞的方法可包括使用针对hTERT mRNA或LlRT mRNA的核酸探针将受检细胞中hTERT mRNA或LlRT mRNA的表达水平与对照细胞中hTERT mRNA或LlRT mRNA的表达水平进行比较。当观察到如同对照细胞中的hTERT或LlRT表达水平时，受检细胞就被确定为病理性增殖细胞。然而，本发明的方法中使用的核酸探针也可以基本上互补于人、小鼠或其他哺乳动物的hTERT mRNA或LlRT mRNA序列。
[0079]本领域技术人员应当理解，可以在核酸探针中进行不影响该探针有效检测病理性增殖细胞(例如癌细胞)中hTERT mRNA或LlRT mRNA的能力的取代，因此这样的取代在本发明的范围之内。在本发明方法中使用的核酸探针可以是DNA探针或修饰的探针，例如肽核酸探针、硫代磷酸探针、或2’ -O甲基探针。核酸探针的长度可以是大约8个或10到50个核苷酸，优选地大约15到25个核苷酸。本发明的方法可以很容易地在来自人、哺乳动物或其他脊椎动物的细胞提取物、培养的细胞或组织样品中进行。
[0080]本发明的方法可用于检测由于体外细胞、细胞培养物以及人类细胞和组织例如实体瘤和癌(例如人类骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌、或黑素瘤)中端粒酶表达而引起的不适当地、病理性或异常增殖的细胞。
[0081]本发明还提供检测和/或抑制高度增殖细胞或癌细胞的试剂盒。该试剂盒可含有PCV、ACV、GCV、缬更昔洛韦、伐昔洛韦、或其他无环核苷类似物，和/或含有与hTERT mRNA或LlRT mRNA的亚序列完全互补或基本互补的核酸探针。
[0082]本发明的药物组合物、抑制剂或拮抗剂可以通过多种方式给药，包括口服、局部、非肠胃给药，例如皮下、腹膜内、通过病毒感染、血管内给药等。根据导入的方式，化合物可以用多种方式配制。适用于口服给药的制剂可以是液体溶液。适用于非肠胃给药(例如通过关节内、心室内、鼻内、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的制剂包括等渗无菌注射水溶液和非水溶液。在本发明的实施中，组合物可以(例如)通过静脉输注、口服、局部、非肠胃或腹膜内途径给药。口服和非肠胃给药是优选的给药方法。配制和给药技术在本领域中是常规的，进一步的细节可见例如Remington’s PharmaceuticalSciences (2000), Gennaro AR(ed), 20th edit1n, Maack Publishing Company, Easton, PA。
[0083]治疗有效量或药理学有效量是本领域公认的短语，是指产生预期药理学结果的有效药物剂量。例如，治疗有效量是足以随时间在患者中产生有益治疗反应(即，治疗疾病或病症，或缓解患者的所治疗疾病的症状)的量。实际施用的量取决于应用治疗的个体，优选地是获得所需效果且没有明显副作用的优化的量。如下文进一步详细描述的，也可根据所施用的特定抑制剂或拮抗剂的效力和患者的状况以及被治疗的患者的体重或表面积来确定剂量。剂量的大小也可以根据对特定患者施用(例如)特定试剂、载体或转导细胞型所伴随的任何不良副作用的存在、特性和程度来确定。
[0084]利用来自本文公开的细胞培养试验和/或来自利用动物模型的体内试验所获得的数据，很容易确定能够防止、抑制或减少端粒酶/LlRT介导的癌症发病率的药物的治疗有效量。也可以利用动物模型来估计对于人体的适当剂量范围和给药途径。在换算为临床环境之前，经常利用荷有人源实体瘤的实验动物(或本领域公认的动物模型)优化适当的治疗剂量。已知这些模型在预测有效的抗癌策略方面是非常可靠的。例如，荷有实体瘤的小鼠或本领域公认的小鼠模型被广泛用于临床前试验，用于确定产生有益抗肿瘤效果而毒性最小的治疗剂的工作范围。由于安全性已经在本领域公认的模型中得到证实，至少对于本文举例说明的核苷类似物来说，本发明的临床前检测主要是常规实验。体内有效性可利用测量肿瘤形成(进展)的抑制、肿瘤消退或转移等的试验来预测。
[0085]以下描述了利用由人HeLa癌细胞系生长的裸鼠皮下(s.c.)肿瘤(S卩，携带异种移植物的小鼠)作为癌症模型测定ACV、PCV和/或GCV的抗肿瘤效力的示例性体内试验。
[0086]体内试验需要的人类癌细胞例如可如下制备:从公共来源获得端粒酶阳性HeLa人细胞系和端粒酶阴性U-20S人细胞系。将细胞于37°C和5% 0)2的潮湿空气中保存在补充有10%胎牛血清的D-MEM培养基中。
[0087]对于体内试验，获得合适的宿主，例如大约5 — 7周龄的裸鼠(nu/nu)，并且置于不含病原体的环境中。将包含在200 μ I无血清培养基中的大约I X 16个HeLa细胞(和/或U-20S细胞)通过胁腹皮下注射(s.c.)输送给所有用甲氧氟烷(Metofane)暂时麻醉的动物。之后将小鼠分为实验组和对照组。使用适当浓度的ACV、PCV和/或GCV进行肿瘤生长进展或消退试验。
[0088]在一个实施方案中，评估皮下肿瘤生长或进展时间的减少，而不是已建立的肿瘤大小的缩小(消退)。在这个实施方案中，从第O天开始，实验组中的小鼠在饮用水中任意获得GCV。水中GCV的浓度可以是2mg/ml。每3天提供一次新鲜的GCV溶液。对照组中的小鼠只接受饮用水。每2 — 3天测量一次肿瘤。当肿瘤超过Icm3时，处死小鼠。肿瘤体积用公式4/3 Jir3计算，其中1*是肿瘤的半径。对照组中的所有小鼠均长出肿瘤，而实验组中的所有小鼠保持没有肿瘤。
[0089]在另一个实施方案中，本发明的试剂和方法可用于促进携带预先已建立的肿瘤的免疫活性动物体内肿瘤的消退；即，本发明的 试剂可用来治疗预先存在肿瘤的动物。在这种情况下，将16个小鼠肝癌MH-22细胞或类似细胞皮下注射到C3HA小鼠的侧腹来建立肿瘤。一旦在肿瘤细胞植入后形成肿瘤，即在随意提供的饮用水中给实验组小鼠施用含有Famvir胃内(1.g.)溶液的组合物，而对照组小鼠接受不含该药物的相同组合物(例如蒸馏水)。每2 — 3天监测一次肿瘤生长。Famvir含有泛昔洛韦，即口服给药的喷昔洛韦的前药。在化学上，泛昔洛韦被称为二乙酸2-[2-(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基]-1，3-丙二醇。当给这些荷瘤动物施用Famvir 21 一 28天时，观察到肿瘤生长迟缓。这种肿瘤细胞生长的抑制在对照组中未发现。治疗开始几周后，只有用Famvir处理的动物显示100%的存活率。
[0090]在另一个实施方案中，也可采用确定细胞凋亡促进的体内试验。在这个实施方案中，可以检测用治疗性组合物治疗的带有异种移植物的动物中凋亡灶的存在，并与未治疗的带有异种移植物的对照动物相比较。在治疗组动物的肿瘤中发现凋亡灶的程度提供了关于该组合物的治疗效果的指示。
[0091]在设计用于治疗端粒酶介导的人类癌症(早期肿瘤和血管化的肿瘤)的药物的适当剂量时，可由本文描述的动物研宄外推而容易地获得用于临床给药的合适剂量。为了实现这种转换，需考虑每单位质量的实验动物所施用的药物质量，优选地考虑实验动物和人类患者之间体表面积的差异。所有这些计算对本领域普通技术人员来说是已知的和常规的。因此，治疗有效剂量的确定属于本领域技术人员的能力范围之内。
[0092]例如，采用在细胞培养试验和小鼠研宄中成功的GCV或ACV (V-GCV或V-ACV)剂量，并且应用基于质量和表面积的标准计算，得出用于成人患者的有效剂量是每名患者每天大约100mg到大约6000mg的GCV或ACV，优选地是每名患者每天大约500mg到大约100mg的V-GCV或V-ACV。因此，应用这些信息，本文预期用于人类给药的治疗剂(例如阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药，即，伐昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦)的低剂量可以是每名患者每天大约1、5、10、20、25或大约30mg ;用于人类给药的治疗剂的有用高剂量可以是每名患者每天大约250、300、400、450、500或大约600mg。有用的中等剂量可以是每名患者大约40mg到大约200mg。
[0093]尽管提到这些范围，但是应当理解，考虑到本文所述的参数和详细指导，在本发明的范围内也包括活性或最佳范围的进一步变化。本发明的治疗方案的目的总的是产生明显的抗肿瘤效果，同时仍然使剂量保持在与不可接受的毒性有关的水平以下。除了改变剂量本身外，也可以改变给药方案以优化治疗策略。目前优选的一种治疗策略是在大约60天的期限内施用大约I 一 500mg、优选地大约1-1OOmg的端粒酶抑制剂或拮抗剂或包含它们的治疗性混合物，大约4次。例如，可以在大约第1、第3或第4天和第6或第7天给予剂量。可通过口服单个或分开的剂量进行给药，或者例如直接向实体瘤部位给药，或者以缓释制剂形式给药。负责给药的医生根据本发明的公开内容，将能够确定适合受试个体的剂量、给药的形式和途径。这种优化和调整在本领域中常规进行，不需要过多的实验。在施用特定剂量本身时，根据关于无菌性、致热原性、纯度和对人类患者全身的总体安全性的管理标准，优选地提供药物学上可接受的组合物。当然，身体检查、肿瘤测量和实验室检验应当在治疗前进行，并且在治疗后以最多I到几个月的间隔进行，本领域技术人员应当知道如何进行这种常规程序。临床反应可用任何可接受的指标来定义。例如，完全有效可以定义为在治疗后特定期限内所有可测到的肿瘤均消失。
[0094]工作实施例
[0095]提供下列工作实施例是为了证明本发明的优选实施方案，而绝不应视为限制本发明的范围。除了另外详细说明外，下述实施例采用本领域技术人员公知的常规技术进行。此夕卜，本领域技术人员还应当理解，该实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在实施本发明中工作良好的技术，因此可以被视为构成了优选实施模式。然而，本领域技术人员根据本申请的公开内容应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，而仍然获得同样的或类似的结果。
[0096]端粒酶阳性癌细胞中端粒酶缩短、G2停滞和细胞凋亡的诱导已经如下所述进行。
[0097]使用端粒酶阳性(HeLa)和端粒酶阴性(U-20S)细胞系。进行适当的试验以检测和证实这些细胞中的端粒酶/LlRT比活性。
[0098]这些细胞系用治疗浓度的ACV (3.0 μ M)、GCV (1.5 μ M)或PCV (1.5 μ Μ)处理，以证明这些细胞内的端粒DNA合成可被抑制，由此诱导端粒缩短。ACV、GCV和PCV处理的和未处理的细胞系中的端粒长度采用端粒特异性肽核酸(PM)探针通过流式细胞术进行测量23’24。为了确定细胞周期分布，用二碘化丙锭(PD将细胞染色23。在处理后10天和14天，证明两种细胞系发生端粒缩短、大规模细胞凋亡和G2停滞(图1、2、3)。
[0099]为了证明细胞周期分布的变化，用ACV、GCV或PCV处理HeLa和U-20S细胞14天，用PI染色，并同时通过流式细胞术进行分析。结果显示细胞周期G2停滞。重要的是注意到这种变化是快速的，并且在ACV处理仅仅几天后就可检测到。
[0100]该研宄中使用的U-20S(骨肉瘤)和HeLa(子宫颈)细胞系从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collect1n) (Rockville, MD)获得。细胞在 37°C和 5%CO2的潮湿气氛下在补充10%胎牛血清的D-MEM培养基中培养。为了用ACV处理细胞，向培养基中补加3 μΜ阿昔洛韦(阿昔洛韦，TEVA Pharm.1nd.Ltd,以色列)。为了用GCV处理细胞，向培养基中补加1.5 μΜ GCV(Cymevene, Hoffman-La Roche)。为了用PCV处理细胞，向培养基中补加1.5 μΜ PCV(喷昔洛韦，Merck&C0.)。
[0101]实时TRAP 试验如前所述进行(Wege 等人，SYBR Green real-time telomericrepeat amplificat1n protocol for the rapid quantificat1n of telomeraseactivity.Nucleic Acids Res.2003 ;31(2):E3_3)。
[0102]对于通过流式细胞术进行的端粒长度测量，如Rufer等人，1998，Telomerelength dynamics in human lymphocyte subpopulat1ns were measured by flowcytometry, Nat.B1technol.16, 743-747所述，将细胞用端粒特异性FITC偶联的(C3TA2)3PNA(Applied B1systems)探针染色，并且用 0.06 μ g/ml PI 复染。
[0103]因此，本文已经证实了核苷类似物ACV、GCV和PCV显然导致端粒长度缩短。绝不应认为有用的抑制性化合物仅限于以上具体举例说明的特定化合物或核苷类似物和衍生物。实际上，可以证明根据本申请公开内容设计和合成的大多数有用的药理学化合物是第二代衍生物或进一步化学修饰的无环核苷类似物。
[0104]引用的参考文献:
[0105]下列编号为I 一 26的参考文献在上述说明书中被引用(带有相应的上标号)，因此本领域的技术人员会将这些参考文献与上文中适当的上标号相对应。
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[0132]说明书中提到的全部出版物、专利和专利申请体现本发明所属领域的技术人员的水平。全部出版物、专利和专利申请引入本文作为参考，其程度等同于每个单独的出版物或专利申请具体且分别地引入作为参考。尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和实施例详细描述了上述发明，但是显然可在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修改。
【主权项】
1.治疗有效量的仅包含一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐作为组合物中活性化合物的组合物在制备预防或治疗哺乳动物或人体中由于存在不适当地或病理性增殖的细胞或无限增殖细胞而引起的疾病或治疗癌症的药物中的用途，所述组合物用于调节、抑制或阻止细胞中端粒延长，其中增殖的细胞、无限增殖细胞和癌细胞是端粒酶阳性的或表达L-1 (LINE-1)逆转录酶，且其中所述组合物的使用诱导了增殖的细胞、无限增殖细胞和癌细胞中的进行性端粒缩短、G2期停滞、染色体异常和最终的细胞死亡。2.权利要求1的用途，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。3.权利要求1的用途，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。4.权利要求1的用途，其中所述组合物通过口服、非肠胃、皮下、肌肉内或血管内施用。5.权利要求2的用途，其中施用包含两种或多种所述核苷类似物的组合物。6.权利要求1的用途，其中所述核苷类似物之一的施用量为每天大约10mg/kg体重到大约150mg/kg体重。7.权利要求1的用途，其中所述核苷类似物与放射治疗和/或非核苷化疗剂联合施用。8.治疗有效量的仅包含一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐作为组合物中活性化合物的组合物在制备干扰肿瘤细胞中端粒延长的药物中的用途，其中所述肿瘤细胞是端粒酶阳性的或表达L-1 (LINE-1)逆转录酶，且其中所述无环核苷类似物的使用诱导了肿瘤细胞中的进行性端粒损失、G2期停滞、染色体异常和最终的细胞死亡。9.权利要求8的用途，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。10.权利要求9的用途，其中所述核苷类似物与选自下组的不同类型的类似物联合施用:3’_叠氮-2’，3’-双脱氧胸苷(AZT)、2’，3’-双脱氧肌苷(ddl)、2’，3’-双脱氢-3’-脱氧胸苷(d4T)，其中所述不同类型的类似物以低剂量存在，其单独时不足以终止端粒的延长。11.权利要求8的用途，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
【专利摘要】无环核苷类似物，如阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦及相应的前药，即，分别为伐昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦，已经被鉴定为端粒酶(由TERT编码)和由L-1(LINE-1)RT编码的逆转录酶的抑制剂或拮抗剂，并且可用于治疗或预防由这两种酶诱导的或介导的癌症。治疗或预防患者中的这些癌症的方法包括在患者细胞中施用治疗有效量的含有逆转录酶的抑制剂或拮抗剂的组合物。所述抑制剂或拮抗剂阻断端粒酶阳性和端粒酶阴性细胞中的端粒延长。还公开了用于检测表达TERT和L1RT的病理学增殖细胞的方法和试剂盒。
【IPC分类】A61K31/522, A61K31/708, A61K31/7072, A61P35/00
【公开号】CN104906105
【申请号】CN201510093008
【发明人】I·E·邦达雷夫
【申请人】Alt解决方案公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2006年5月18日
【公告号】CA2609303A1, CN101588805A, EP1885370A2, EP1885370A4, US8609623, US9078901, US20090137503, US20140113918, WO2006125166A2, WO2006125166A3, WO2006125166A9
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