由羟基酪醇制成的治疗肝损伤的药物组合物及其制备工艺的制作方法
由羟基酪醇制成的治疗肝损伤的药物组合物及其制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药、天然药物领域，涉及一种由羟基酪醇、环维黄杨星D组成的具有 保肝、解酒作用的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 第一部分羟基酪醇的研宄现状 羟基酪醇（hydroxytyrosol，HT)化学名：3, 4-二羟基苯乙醇，具有很强的抗氧化活性， 主要以酯类的形式存在于橄榄的果实和枝叶中。橄榄苦苷经水解后得到HT单体。HT结构 简单，分子量小，具有良好的药物和保健功能，受到国内外研宄者的广泛关注。其药理作用 及其机制如下。
[0003] 一、抗癌作用研宄 一般认为，肿瘤是由于体内多余的自由基和活性氧（ROS)破坏了DNA致使基因异常表 达造成的，如结肠癌病人体内ROS的量明显增高。HT具有邻苯二酚结构，是一个典型的抗氧 化应激物质和自由基清除剂，这就使其具有潜在的抗肿瘤活性。研宄资料表明，HT能抑制 肿瘤发生的多个阶段且具有广谱性。
[0004] 首先，HT能保护细胞内DNA和酶免受ROS与自由基的破坏以预防癌症的发生。与 其酯化物橄榄苦苷相比，HT具有更强的抗氧化应激作用，研宄证实在外周血单核细胞中HT 降低了二噁英诱导的氧化应激和DNA破坏，它通过降低过氧化脂质、ROS的量和增加抗氧化 酶的活性，抑制细胞内DNA被破坏，并减少细胞形态学的变化。另外，HT在较低浓度下即能 抑制丙二醛、H2O2脂肪酸和7-酮基胆固醇的生成，并能有效地阻断ERK和Akt/Pkb的磷酸 化状态发生改变，还能抑制外来因素(如紫外线B、苯胼芘等）所导致的DNA破坏。
[0005] 其次，HT能抑制癌细胞增殖与促进其凋亡来发挥抗癌作用。研宄发现HT在浓度 为50yg/mL时即能通过抑制增殖和促进凋亡作用使乳腺癌细胞（MCF-7)明显减少，机制可 能是增加GO~Gl期的细胞数目，阻止Gl~S期的转化。但是有科研人员却指出HT在正 常生理浓度下对人乳腺表皮细胞(MCFlOA)和乳腺癌上皮细胞(MDA-MB-2312、MCF-7)的增 殖和凋亡均没有影响，但是HT能预防3种细胞中DNA遭破坏，另有人指出HT还能促进其他 癌细胞的凋亡，如结肠癌、直肠癌等，使细胞周期停留在S期。
[0006] 再次，HT还能通过抑制癌细胞的扩散来发挥广谱的抗癌作用。HT对恶性肿瘤入侵 结肠细胞具有明显的抑制作用，当浓度为25yg/mL时，HT在人结肠癌细胞HT115中表现出 强烈抑制细胞转移的作用且呈剂量依赖关系，却没有降低细胞活性，而且对细胞的贴壁生 长状况也没有明显影响，提示HT并不是通过细胞毒性抑制癌细胞的转移。另外，有研宄者 将HT与间碘苄胍（I-MIBG)合用治疗嗜铬细胞瘤，不仅诱导了去甲肾上腺素转运蛋白（NET) 的快速表达，而且增强了NET的活性，同时还降低了去甲肾上腺素的释放，实验表明HT能影 响和NET有关的细胞膜，而不是以一种新型的去甲肾上腺素转运分子纳入到细胞中，将HT 和I-MIBG合用治疗嗜铬细胞瘤是一种新颖而有效的方法。基于以上研宄，可以将HT开发 成一种绿色的抗癌药物，它避开了传统抗癌药的固有威胁，对正常细胞没有杀伤作用，因而 大大提升了其安全性和有效性。
[0007] 最后，HT通过抑制血管的生成发挥治疗癌症的作用。美国学者提出了肿瘤血管 生成的概念，他认为只有刺激新生血管的形成，恶性肿瘤才能生长和转移，只要能阻止新血 管的形成，就能饿死肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。研宄证明HT在血管形成不 同阶段均能发挥作用，且具有多个靶点，在人工基底膜上试验中HT抑制了血管内皮细胞的 增殖、转移和"管状"结构的形成，而且改变了上皮细胞增殖周期细胞的分布，明显增加了 subGl亚群的量，提示癌细胞凋亡增加。
[0008] 通过以上抗肿瘤机制的研宄可知，HT能在多个阶段预防癌症的发生，并在肿瘤的 治疗中发挥明显作用。但是已发表文献之间也存在着一定的矛盾，以MCF-7细胞为例，有研 宄证明HT对其具有抑制增殖和促进凋亡作用，而另有研宄者认为HT仅对MCF-7细胞的活 性氧有清除作用，对细胞增殖和凋亡几乎没有影响。因此，HT的抗肿瘤作用仍然是值得深 入探讨的一个问题，可能还有别的作用机制有待发现。
[0009] 二、抗血栓、调血脂和抗动脉硬化作用研宄 研宄发现食用橄榄油能大大降低心血管疾病的发病率，其中HT发挥了重要的作用。有 研宄指出，HT抗心血管疾病的作用与抑制血小板凝集密切相关，研宄人员以水杨酸作参比 考察了HT对大鼠体外血的抗凝集作用，实验结果证明它能抑制血栓素B的合成，并能提高 氧化亚氮的生成量，从而达到抗凝作用。有科研人员则以人血细胞为研宄对象考察了HT的 抗凝集作用，当浓度为l〇〇mg/L时，蛋白质组学研宄表明它参与调节9种蛋白发挥抗凝集作 用，如血小板结构、活性和整合素allb/b3的转导等。由结果可知，HT能抑制血小板的活性 和粘连，可用于预防血栓的形成。
[0010] HT抗心血管疾病的作用可能与降低血糖和脂类氧化物浓度有关。实验证明HT 能降低糖尿病大鼠血浆中的血糖浓度和血清中三酰甘油、总胆固醇的量，并能增强肝肾内 S0D、过氧化氢酶（CAT)和谷胱甘肽（GSH)过氧化物酶活性，降低碱性磷酸酶和硫代巴比妥 酸反应物等含量，从而表现出降低肝肾器官毒性的作用，其机制可能与HT和LDL结合有关。 还有资料表明，HT可以治疗由糖尿病引起的高血糖及氧化应激病症。HT还能预防动脉粥样 硬化的发生。研宄证明HT可以降低猪肺动脉上皮细胞内过氧化氢诱导的ROS的水平，并增 强mRNA酶、蛋白质活性和细胞内转录调节因子3a(F0X03a)的水平，诱导磷酸腺苷-激活蛋 白激酶使F0X03a向细胞核转移。其中F0X03a是一种转录调节因子，主要存在于心脏组织， 其活化状态对抑制血管平滑肌增殖、心肌细胞增生肥大和抗氧化应激具有明显作用，但当 其由细胞核转运至细胞质便发生失活。HT通过诱导腺苷酸活化蛋白激酶和激活F0X03a酶 活性的表达，保护机体上皮细胞中免受氧化破坏，且可以预防动脉硬化的发生。此外，HT也 是一种强效的脑内抗氧化剂，实验证明它能降低纹状体和脑其余部位过氧化脂产物水平， 阻碍GSH的消耗，摄取含有HT的食物能降低脑神经病变的风险。以上研宄均表明HT可以 降低脑内和血管内皮细胞活性氧的量，为治疗心脑血管疾病提供了分子依据。
[0011] 三、抗病原微生物作用研宄 HT可能开发成一种治疗肠道和呼吸道感染的药物，它具有高效和广谱的特点。以幽 门螺旋杆菌为例，其在世界范围内存在多种耐抗生素的菌株，但是HT对耐药和非耐药菌株 均具有强力的杀伤作用。另有研宄HT对5种标准菌株（ATCC9006、ATCC8176、ATCC6539、 ATCC17802、ATCC25923)和临床上得到的44种菌株最低抑菌浓度分别为0. 24~7. 85yg/ mL、0. 97~31. 25yg/mL，抑菌浓度明显低于其他植物提取物，而且对抑制革兰阳性菌的活 性高于革兰阴性菌。
[0012] 值得注意的是，其抗菌活性不仅表现在肠道内有害菌种方面，还对嗜乳酸菌和双 歧杆菌具有抑制作用。HT也可以抑制多种病毒的活性，包括HIV-1、H1N1、H3N2、H5N1*H9N2 亚型和新城鸡瘟病毒等，但是对牛轮状病毒和腺病毒无效。研宄发现HT能降低HIV-I融合 酶的活性，并能通过与病毒包膜外层的疏水基团形成氢键等阻碍gp41活性核心的融合。实 验发现用HT预处理狗肾细胞（MDCK)后，不影响H9N2在MDCK上的增殖情况，但向细胞内灌 输HT和灭活H9N2后，结果显示病毒的DNA和蛋白均无法检测到，而且电镜观测HT处理后 的H9N2病毒形态学发生变化，由此可知其靶点是病毒自身的包膜或其他部位，而不是宿主 细胞。由此，HT不仅可以作为抗菌、抗病毒的药物，而且还可以增强机体的防御功能，凸显 了其开发为抗病原微生物药物的潜力。
[0013]四、对视网膜黄斑变性防治作用研宄 HT可以预防由丙烯醛、环境毒性、氧化脂肪粒和年龄增长等因素造成的视网膜上皮细 胞氧化破坏，特别适用于老年人维持眼的健康和高分辨率，改善视力。在人视网膜上皮细胞 APRE-19中，HT同时保护Nrf2细胞通路和活化辅酶PPARGC1a受体，Nrf2能激活II期的净 化酶，如y-谷酰基-半胱氨酰连接酶、NADPH-醌氧化还原酶1、红细胞合酶1等抗氧化酶， II期净化酶将和自由基"结合"并将其他毒性化合物转化为活性较弱的分子；而PPARGC1a 则对蛋白质和线粒体复合物进行解链，以增强线粒体转运因子A的表达免受线粒体功能减 退，提高细胞生存能力。因此HT能诱导II期净化酶的活性和增强线粒体的生成，从而预防 或治疗黄斑变性。
[0014]五、保护软骨和抗骨质疏松作用研宄 软骨是一种由成骨软细胞或软骨细胞等组成的致密结缔组织，包埋在细胞外基质中， 是骨骼的一种重要组成成分，因其具有低代谢的特点，所以受伤或破损后的软骨恢复较慢。 HT能诱导和增强软骨细胞增殖，提高其产生细胞外基质组分的能力，进而促进软骨修复和 再生。研宄人员以成骨细胞和破骨细胞为对象，考察了HT对骨形成以及切除卵巢后骨流失 的影响，当浓度达到10~100umol/L时，HT能刺激钙的沉积且成剂量依赖关系，但是对原 成骨细胞胶原蛋白和碱性磷酸酶没有影响，当浓度为50~100ymol/L时，HT能阻碍多核 破骨细胞的形成且成剂量依赖关系。HT在去卵巢股骨小梁骨细胞中表现出抑制骨流失的作 用，而且还能降低原成骨细胞中H202的水平，因此能预防由氧化应激造成的骨质疏松。HT 在骨的形成和维持骨健康方面起到关键的作用，可以作为治疗骨质疏松的有效药物，适用 于诱导或增强软骨修复或软骨再生，尤其适用于运动员和具有活跃生活方式的人群。
[0015]六、其他保健作用研宄 HT能减少细胞内C0X-2的生成和5-氧脂化酶的表达，降低前列腺素E-2的合成，可用 于抗炎、镇痛。HT有助于修复由于过度运动或劳累损害的线粒体，能使体能快速恢复，并能 增强抵抗力和运动能力，还能降低小鼠C3H10T1/2细胞内脂肪滴的形成，从而达到减肥的 目的。
[0016]七、展望 国外学者对HT在抗癌、抗血栓、调血脂和抗动脉硬化、抗病原微生物、防治视网膜黄斑 变性、保护软骨和抗骨质疏松等多方面的药理作用进行了很好的研宄，部分研宄还在分子 水平上探讨了HT的药理作用机制。国内对HT的研宄主要表现在保健品和食品添加剂方面， 对其药用方面研宄较少，目前有针对HT治疗前列腺癌申请了专利。随着对HT药理作用的 深入研宄，其药用价值亟待开发，不失时机地 对HT进行成药性研宄和临床研宄，将是HT研 宄的未来方向。
[0017] 第二部分环维黄杨星D的研宄现状 黄杨木在明代《本草纲目》中就有记载，主要用于行气活血，祛湿通络等。环维黄杨星D是从黄杨木中提取的有效单体，临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常、心肌缺血 等。2010版《中国药典》一部第382页对环维黄杨星D亦有详细的记载。
[0018] 一、对心肌的作用 (一）对心肌梗死心肌代谢影响结扎兔心左前降支，静脉注射环维黄杨星D大、中、小 剂量后，均能缩小心肌梗死范围，较结扎对照组分别缩小83%、81%、46%，心电图51'段上抬减 轻，但效力较心得安差。环维黄杨星D对心肌代谢作用不明显，远不及普萘洛尔。
[0019](二）正性肌力作用环维黄杨星D在有效剂量下，对体外兔和蟾蜍心脏以及麻 醉猫、犬心脏均有强心作用，切断犬的交感和副交神经并不影响环维黄杨星D的作用，从而 推测，环维黄杨星D的强心作用不是通过神经反射机制所致。采用豚鼠左心室乳头肌标本 测定心肌收缩力证实，1〇_ 7~10_5mol?I71环维黄杨星D能增加豚鼠左心室乳头肌的收缩 张力，这种正性肌力作用不被普萘洛尔阻断，和异丙肾上腺素的正性肌力作用无相互加强 作用，能抑制由异丙肾上腺素引起的心肌节律性活动。提示环维黄杨星D能加强心肌收缩 力，但并不是通过细胞膜上的e-受体而发挥正性肌力作用。分离纯化兔心肌细胞膜，测定 Na+-K+-ATPase活力，结果显示，10_7~10_5mol?I71环维黄杨星D对兔心肌细胞膜活力有抑 制作用，K+对此有对抗作用。环维黄杨星D的抑制作用的剂量-效应曲线和哇巴因相似，但 其半数抑制浓度为哇巴因的10倍左右。哇巴因不影响[%]标记的环维黄杨星D和心肌细 胞膜的结合，因此提示环维黄杨星D的正性肌力作用可能与抑制心肌细胞膜Na+-K+-ATPase 活力有关，但其抑制途径和哇巴因不同。在环维黄杨星D对另一豚鼠体外心肌标本实验中， 证实环维黄杨星D1~10ymol?I71能增强哇巴因、异丙肾上腺素、去氧肾上腺素、组胺和 氯化钙的正性肌力作用，量效曲线左移，最大反应增加，说明环维黄杨星D正性肌力的机理 与a、0和组胺受体、电压依赖性钙通道激动剂、哇巴因不同。但环维黄杨星D能对抗维拉 帕米和低浓度的乙酰胆碱（Ach)所致的负性肌力作用，提示其强心机制可能与促进心肌细 胞外Ca2+内流，抑制心肌细胞内K+外流有关。另有研宄证明，环维黄杨星D对豚鼠体外左、 右心房肌呈剂量依赖性正性变力作用，能增强正性阶梯效应。乳头肌动作电位和同步记录 的结果证实，环维黄杨星D能延长APD50和APD90,推测环维黄杨星D正性变力作用和促进 心肌细胞外Ca2+内流有关。并且，环维黄杨星D能增强左心房静息后收缩正性阶梯和成对 刺激效应，提示环维黄杨星D能促进心肌细胞内Ca2+释放。以上可知，环维黄杨星D的强心 作用可能与抑制心肌细胞膜Na+-K+-ATPase的活力，促进心肌细胞外Ca2+内流和心肌细胞内 Ca2+释放有关。
[0020] (三）抗急性心肌缺血作用采用兔耳缘静脉注射垂体后叶素，造成急性心肌缺血 模型，观测心电图证明，兔耳缘静脉注射环维黄杨星DI. 2mg?kg'可使垂体后叶素诱发的 心电图S-T段变化的发生明显减少，对称直立高耸的T波明显缓解，说明环维黄杨星D具有 抗急性心肌缺血作用。
[0021] 二、抗心律失常作用 采用哇巴因、CaCl2、乌头碱、氯仿-肾上腺素、氯仿5种不同的病理模型引起心律失 常，证明环维黄杨星D能降低以上药物引起的心律失常发生，降低动物死亡率。对氯仿引 起的小白鼠心室纤颤，环维黄杨星D有很好的防治作用，证明环维黄杨星D有抗实验性心 律失常作用。有研宄报道，采用豚鼠体外室间隔作标本研宄证实，环维黄杨星D1.2~ 3. 6XKT5moI?I71能显著延长动作电位时程（APD)及有效不应期（ERP)，抑制心肌细胞的自 发活动及由哇巴因、异丙肾上腺素诱发的节律性活动，能使缺氧心肌的SPD(动作电位第2 相持续时间）与APD延长。但环维黄杨星D3. 6XKT5moI 以上心室肌自发活动明显增 加，细胞的动作电位变为类似起搏细胞的慢反应电位，心室肌细胞的自律性提高，提示环维 黄杨星D较低浓度有抗心律失常作用，浓度较高有诱发心律失常的可能。用CaCl2-Ach诱 发小鼠体内心房纤颤，静脉注射环维黄杨星D0. 55和I.Img?kg<使心房纤颤发生率分别 降低36%和20%，胺碘酮2. 8mg?kg_\iv亦有相同的保护作用。环维黄杨星D对乌头碱、 哇巴因、肾上腺素诱发的豚鼠体内心房纤颤，具有浓度依赖性抑制作用，且作用强度与胺 碘酮相似。环维黄杨星D和胺碘酮能抑制豚鼠体外右心房正常自律性，环维黄杨星D0.3 和30ymol?I71能抑制肾上腺素引起的体外左心房的异常自律性，环维黄杨星D0. 3~ 30ymol吨-1进行性延长心房肌的有效不应期和浓度依赖性延长心肌细胞APD50和APD90， 降低心肌细胞兴奋性。环维黄杨星D30ymol?I71使传导时间延长，降低0相上升最大速 率（Vmax);胺碘酮0. 3~30ymol?I71有相似的电生理作用，但对Vmax、APD50无影响，结 果显示，环维黄杨星D对心房肌细胞动作电位的影响与心室肌细胞相似，具有延长Aro的作 用，环维黄杨星D对体内和体外心房纤颤作用与胺碘酮相似，但胺碘酮对Vmax、APD50无影 响。推测环维黄杨星D同胺碘酮一样同属第三类抗心律失常药，但其延长动作电位的机理 可能与胺碘酮不同。采用麻醉家兔左心插管法记录心肌希氏束电图（HBE)，测量HBE的A-H、 P-R和H-V间期，比较环维黄杨星D与利多卡因对房室传导的抑制或阻滞作用，环维黄杨星 D延长P-R、H-V和A-H时间的剂量-效应相关线与利多卡因相比，显著强于利多卡因，环维 黄杨星D较大剂量可引起房室脱漏。环维黄杨星D与利多卡因在延长A-H时间的回归斜率 有明显差别，说明环维黄杨星D和利多卡因对房室传导阻滞的性质并不完全相同。环维黄 杨星D所致的房室传导阻滞不被阿托品或异丙肾上腺素所对抗，提示环维黄杨星D对房室 传导的抑制可能是直接作用。
[0022] 三、对冠脉流量心肌耗氧量作用 采用麻醉猫冠状窦插管插入冠状窦，描记冠状窦流量，结果显示，环维黄杨星D0. 5mg?kg'iv可增加猫冠状窦流量，降低冠状血管动、静脉氧差，心肌耗氧量增加，但低于 流量增加。对肾上腺素引起的动、静脉氧差的增加有反转作用，拮抗儿茶酚胺引起的心肌耗 氧量的增加，结果显示，环维黄杨星D具有降低心肌耗氧量，增加冠脉流量作用，提示环维 黄杨星D有抗心肌缺血作用。
[0023] 四、对血流动力学影响 采用大鼠冠脉结扎30min后，造成血流动力学异常。静脉注射环维黄杨星DI.ImgAg4 后，能明显抑制心肌缺血引起的血小板和红细胞聚集性的增加，降低血液粘度，但对正常大 鼠血流动力学无明显影响。给麻醉猪环维黄杨星D1.5mg 能使主动脉血压轻微升 高。实验中保持主动脉血压不变，发现心率减慢。保持主动脉血压和心率不变，使左心室收 缩压最大变化率（dp/dtmax)增高。同时研宄发现，环维黄杨星D心率减慢和左心室收缩压 最大变化率增高呈剂量依赖性。研宄还发现，用胆碱能受体阻滞剂阿托品及肾上腺素能受 体阻滞剂普萘洛尔、酚妥拉明并不影响环维黄杨星D对血流动力学的作用，用一氧化氮合 酶阻滞剂N-硝基-精氨酸甲基酯并不影响环维黄杨星D引起的心率减慢，但可以消除环维 黄杨星D引起的左心室收缩压最大变化率的增高及主动脉血压的升高。提示环维黄杨星D 可以直接作用于心脏，使心率减慢，对左心室收缩作用可能与一氧化氮的释放有关。
[0024] 五、延长小鼠耐缺氧时间 将小鼠分为3组，分别ip环维黄杨星D、普萘洛尔、生理氯化钠溶液，测定常压下小 鼠缺氧存活时间，氯化钠溶液组9. 3 ±0. 5min，普萘洛尔组13. 2 ±0. 7min环维黄杨星D组 14. 2±0. 6min，环维黄杨星D组与普萘洛尔组均较氯化钠溶液组有显著差异（P〈0. 01)，说 明环维黄杨星D具有延长小鼠耐缺氧时间作用。另有报道，将小鼠分别ip氯化钠溶液、环维 黄杨星D、溶剂，小鼠注射15min后，皮下注射异丙肾上腺素，15min后在低压下再进行实验， 结果证明环维黄杨星D组分别较生理氯化钠溶液及溶剂组耐缺氧时间显著延长（P〈0. 01)， 并且溶剂组与氯化钠溶液组结果无显著性差异，提示环维黄杨星D能拮抗低压条件下，异 丙肾上腺素所致的心肌损伤，延长小鼠耐缺氧时间，溶剂对药物无干扰作用。
[0025] 六、对急性实验性脑缺血的保护作用 结扎小鼠带迷走神经的两侧颈总动脉，造成急性脑缺血模型，观测小鼠平均存活时间， 生理氯化钠溶液组I. 8±0. 5min，环维黄杨星D小剂量和大剂量组分别为21. 2±8. 4min和 24. 3±8.Omin，能显著延长小鼠存活时间。急性脑缺血时，脑内有大量微血栓形成，采用血 栓法测血栓的湿重和干重，结果显示环维黄杨星D大、小两个剂量组与空白对照组比较均 可显著减少血栓的湿重和干重，环维黄杨星D大剂量的效果强于小剂量，但较阿司匹林弱。 提示环维黄杨星D对急性脑缺血、缺氧时的损害性病变有改善和保护作用，但其具体机制 需进一步研宄。
[0026] 七、对离体血管作用 对离体兔耳及离体大鼠后肢血管灌流实验显示，环维黄杨星D对处于收缩状态的兔耳 (主要为皮肤血管)和大白鼠后肢血管(肌肉血管为主)有不同程度的扩张作用。还有人研宄 环维黄杨星D对猪冠状动脉的影响，体内实验发现，在保持心率和主动脉血压不变的情况 下，环维黄杨星DI. 5mgAg'iv可引起左心室收缩压最大变化率升高及冠状血管舒张，并 呈剂量依赖性。静脉内给药一氧化氮合酶阻滞剂（L-NAME)可阻滞左心室收缩压最大变化 率升高及冠状血管舒张，冠状动脉内给药L-NAME仅能阻滞冠状血管舒张。但胆碱能受体和 肾上腺素能受体阻滞剂并不影响左心室收缩压最大变化率升高及冠状血管舒张。在体外冠 状动脉实验中发现，环维黄杨星D能明显缓解KCl诱导引起的血管收缩，通过给环加氧酶抑 制剂消炎痛或钾通道阻滞剂优降糖发现，其并不影响环维黄杨星D对血管的舒张作用。但 是给药L-NAME或去除内皮发现可阻滞环维黄杨星D对血管的舒张作用。研宄表明环维黄 杨星D可引起冠状动脉血管舒张，其作用机制可能与内皮释放一氧化氮有关。
[0027] 八、环维黄杨星D的药代动力学 小鼠尾静脉注射3H-环维黄杨星D后，根据血药浓度按二室模型计算药代动力学参数T1/2为3. 94±1.93h，分布相Tl/2a为〇. 〇6h，消除相T1/2 0为32h。对环维 黄杨星D在 小鼠体内组织分布研宄结果表明，3H-环维黄杨星Div后，被各组 织摄取较快，2~3h达高峰。高峰时以肺、肝组织分布最多，其次脾、肾、肠组织，肌和 脑组织较低。药物潴留于组织时间久，排泄缓慢。同时组织切片放射自显影实验表明，环维 黄杨星D在肝、肾、肺、肠内浓度较高，而心肌骨骼肌、脑内浓度较低，说明环维黄杨星D穿透 血脑屏障能力弱，在脑和脊髓分布少。对3H-环维黄杨星D在大鼠体内代谢过程研宄实验表 明，环维黄杨星D在脾、肺、肝、肾、心中24h达高峰，除2h组以肝组织分布最多外，其余均以 脾脏最高，肺、肝、肾、心次之；在中枢神经系统中环维黄杨星D1~3d达高峰，其较脾、肺、 肝、肾、心分布少。多次口服给药实验表明，环维黄杨星D在脾脏分布最多，多次口服给药各 脏器均出现蓄积现象。排泄实验表明，该药排泄缓慢，排泄速率与放射性在各脏器分布实验 的结果基本一致。
[0028] 环维黄杨星D的化学结构属于固醇类，和强心甙类药物的化学结构不同，但都具 有抑制Na+-K+-ATPase的作用，因此，对于它的强心机理需要深入研宄，这将为我们寻找具 有新结构的强心药物提供线索。同时环维黄杨星D具有抗心律失常的作用，对于它的一些 不良反应，也需要深入研宄其机制，提出合理的防治措施，或对其化学结构加以改造，研制 出高效，安全范围广的抗心律失常药。
[0029] 第三部分酒精性肝损伤的研宄现状 酒精性饮料在全世界各种文化及生活中都扮演着重要的角色，而饮酒与肝病的密切关 系也早已证实。在西方国家，酗酒历来是导致严重肝脏疾病的首要因素。在我国，虽然肝炎 病毒所致的肝病仍占主要地位，但随着人民生活的改善，酒精性饮料消耗量的日益增多，近 年来由酒精所致的肝损害也呈逐年上升趋势，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第 二大病因，这应引起医学界的关注。
[0030] 一、流行状况 酒精滥用和酒精依赖已成为当今世界日益严重的公共卫生问题。酒精性肝病（ALD)是 指由于过量摄入酒精而导致的肝脏损害等一系列病变，根据中华医学会肝脏病学分会提出 的ALD病理诊断标准，依病变程度分为轻症酒精性肝病（AML)、酒精性脂肪肝(AFD)、酒精性 肝炎（AH)、酒精性肝纤维化（AF)以及酒精性肝硬化（ALC)等五种类型。重度饮酒者中80% 以上有一定程度的脂肪肝，其中10%~35%可发展为酒精性肝炎，10%~20%可发展为肝硬 化。文献表明，ALD的发病率与酒精消耗量平行，饮酒量越大，病死率越高。每日饮酒精80~ 150g，连续5年以上，可导致肝损伤，持续10年以上可引起肝硬化，但存在个体差异。酒精 性肝病是发达国家肝硬化的重要病因，也是青壮年死亡的主要原因。西方国家酒精性肝病 发病率与死亡率均较高，酗酒者患肝硬化是正常人的6. 8倍。英国社区综合医院收治的各 类肝硬化患者中，酒精性肝硬化占80%。欧洲的一项调查显示，15岁以上的各类肝硬化患者 中，酒精性肝硬化所占的比例男性为8%~90%，女性为3%~56%。美国25~64岁的城市人 群中，酒精性肝硬变的死亡率是列于心血管疾病、肿瘤之后，居第三位的公共卫生问题。在 法国，平均每一居民年消耗纯酒精量达30. 8L之多，如果把酒中毒直接死亡者、滥用酒精所 致意外死亡、以及少数与酒有关胃肠道恶性肿瘤死亡者计算在一起，酒中毒每年约直接或 间接导致7万人死亡。在亚洲各国，尽管肝炎病毒所致的各种肝病占主要地位，但随着酒精 消耗量的增多，ALD的发病率亦在日益增多。在日本，酒滥用现象十分普遍，酒精性肝病的 发病率呈上升趋势。据一次大规模的调查发现，日本ALD的发病率1968~1976年为8. 2%， 而1976~1985年为14. 1%，其中酒精性肝炎和酒精性肝硬化的发病率在后十年从15. 3%和 37. 1%分别提高到17. 4%和43. 7%。1985年原发性肝癌（HCC)中近1/4是由酒精性肝硬化 发展而来。我国酿酒已有数千年历史，随着人们生活水平的提高及社交的需要，酒精性饮料 的消耗日益增加，据统计，我国的酒精性饮料年产量以纯酒精计算在1984年为711. 3万吨， 1993年为1846万吨，2001年达到了 3069. 87万吨，而一般人群的饮酒率达59. 5%，其中男性 为84. 6%，女性为29. 4%，人均年饮酒量以纯酒精量计算为3. 6L。此外，酒精中毒及酒精引 起的肝损伤发病率亦明显升高。研宄人员对浙江省18237名居民调查显示，ALD发病率为 4. 34%，其中ALC患病率为0. 68%，AFD患病率为0. 94%，AH患病率为1. 51%，酒精所致其他肝 脏损害为1. 21%。另一项对湖南省18618名居民的调查发现，ALD发病率为4. 36%。上述调 查的ALD的发病率均较20世纪80年代以前增加了 30倍左右，已成为仅次于病毒性肝炎的 第二大肝病，饮酒相关问题已成为我国面临的一大医学和社会问题。
[0031] 二、发病机理 酒精易溶于水，分子量小，能单纯扩散透过细胞膜，到达组织细胞内。酒精约70%在胃 被吸收，30%在小肠上部吸收，2~5min后开始进入血液，30~90 min后达到浓度高峰。摄入人体的酒精约90%~98%在肝脏代谢，2%~10%经肾和肺 排泄。最初，人们普遍认为ALD是由于长期摄入酒精继发营养不良引起的。但是，自1980 年代对ALD发病机制进行深入研宄以来，已证实乙醇具有直接的肝毒性。研宄发现，即使在 摄入富含蛋白质、维生素和微量元素饮食的情况下，乙醇也可以引起大鼠和人类志愿者肝 脏脂肪变性并伴有明显的超微结构改变。目前认为，乙醇在肝细胞内代谢产生的毒性代谢 产物及引起的代谢紊乱是导致酒精性肝损伤的主要原因。
[0032](一）乙醛的毒性作用 肝细胞内有3种参与乙醇代谢的酶类，S卩：乙醇/乙醛脱氢酶（ADH/ALDH)、微粒体乙醇 氧化系统（MEOS)及过氧化物酶体中的过氧化氢酶。乙醇在肝内经这些酶代谢的过程中均 可产生高毒性产物一一乙醛，乙醛在体内的毒性是乙醇的10倍，是造成肝脏和其他脏器损 害的主要元凶，其降解主要在肝脏线粒体内经ALDH脱氢氧化成乙酸，最终在外周组织中降 解生成二氧化碳、水和热量。长期摄入酒精可以使肝脏线粒体功能紊乱，氧化乙醛的能力大 大下降，而乙醇的氧化速度不变甚至提高，造成乙醛生成与降解不平衡，导致肝内乙醛含量 增加。高浓度的乙醛通过下列机制导致肝损伤。
[0033](二）氧缺乏学说 此学说强调肝小叶中央区缺氧在酒精性肝损伤中的重要作用。已有资料表明，无论是 快速或缓慢摄入酒精都可以增加肝脏的氧耗量，导致肝小叶中央区氧含量显著减少。乙醇 在肝脏内代谢需要氧，由门静脉到中央静脉氧张力又逐渐减少，因此长期饮酒理论上可以 导致小叶中央区缺氧，肝脏发生缺氧性肝坏死。但是也有报道，酒精性肝损伤中肝静脉氧含 量无明显变化。因此，关于氧缺乏学说仍有待进一步研宄。
[0034](三）自由基的损害作用 关于自由基在酒精性肝损伤中的作用已得到了反复的论证。一方面，大量 乙醇摄入破坏肠道粘膜结构和功能的完整性，增加肠粘膜的渗透性，引起肠源性细菌 内毒素（LPS)迅速进入血液循环，同时明显降低肝脏对LPS的清除能力，使血液中的LPS水 平显著增高并诱发内毒素血症。最近的研宄证实，抗生素可通过抑制肠道LPS的产生显著 减轻慢性乙醇接触引起的小鼠肝脏组织脂质过氧化。进入血循环的LPS通过Toll样受体信 号传导途径和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK)传导途径激活核因子kB(NF-kB)及其下游靶 基因，介导单核巨噬细胞的活化，刺激机体产生并释放大量的自由基，例如：活性氧（ROS) 和一氧化氮（NO)等。文献资料显示，NF-KB活性的抑制与乙醇导致的肝损伤的减轻密切 相关，而AH动物模型中可见肝细胞NF-KB活性显著增强。另一方面，乙醇在代谢过程中可 直接诱导P-4502E1的活性，产生大量自由基和R0S。自由基除直接损伤肝细胞外，还可以 通过增加肝细胞对脂质过氧化的敏感性，引起肝细胞损伤。氧自由基可以在肝细胞膜上与 P-4502E1结合引起抗依赖的细胞毒作 用，使肝细胞损伤，导致酒精性肝病的病理变化。
[0035](四）细胞因子的作用 细胞因子为小分子蛋白质，在细胞与细胞的沟通中起中介作用。单核细胞、巨噬细胞、 肝脏Kupfer细胞等均能分泌细胞因子。近年来，细胞因子在ALD发病机制中的作用越来越 受到重视。饮酒致细胞因子生成异常，导致体内环境中促炎症细胞因子与抗炎症细胞因子 平衡失调，诱导肝细胞凋亡与坏死，促进肝细胞氧耗竭和纤维化的形成，最终导致肝硬化。 细胞因子中尤以肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的过度表达与ALD密切相关。TNF-a是具有 多种生物学效应的细胞因子，在肝脏主要由激活的Kupffer细胞产生，并作为一个关键因 子参与各种肝脏疾病的发生与发展。一方面，TNF-a与酒精性肝损伤有关。最近研宄发现， 酒精性肝炎患者循环中的TNF-a水平升高，且与酒精性肝损伤的生化指标相关。在大鼠慢 性饮酒模型中的研宄也显示，肝脏TNF-amRNA增加的水平与肝脏病理损伤的程度一致。另 一方面，己酮可可碱（PTX)为一种非选择性磷脂酶抑制剂，可抑制TNF-a的基因转录和降 低血清TNF-a水平，研宄表明，酒精性肝病大鼠经PTX处理后，血清TNF-a水平显著降低， 进一步研宄发现，PTX显著减少大鼠 肝肾综合征的发生，提高短期生存率。此外，研宄发现，抗TNF-a抗体可以明显减轻乙 醇喂饲大鼠的肝脏炎症和坏死病变，但对肝脂肪变性无影响。而在敲除TNF-a受体基因的 大鼠给予酒精喂养不引起肝脏的炎症和坏死性改变。这些研宄 均证实，TNF-a在ALD发病机制中起重要作用。因此，目前认为TNF-a水平增加可作 为预测ALD患者的长期存活率较低的指标。
[0036] 三、预防 (一）戒酒 戒酒是预防ALD的首要方法。高危嗜酒者如能戒酒，则能较好地避免ALD的进展。早期ALD患者戒酒后经适当治疗，病情可以逆转。即使是中晚期ALD患者，戒酒也是控制病情进 展的重要环节。酒精引起的肝脏损伤除与饮酒的量有关外，不同的饮酒方式也会对ALD的 发生产生一定的影响。研宄发现，空腹饮酒和将不同种类的酒精饮料掺和饮用，可增加ALD 发生的危险性。其机制可能与降低胃黏膜乙醇脱氢酶(ADH)和肝脏谷胱甘肽（GSH)水平以 及加速胃排空有关。此外，酒精引起的肝损伤与性别也存在密切关系，女性对ALD的易感性 较男性为高。这可能是因为女性体内雌激素含量较高的原故。
[0037](二）合理饮食，加强锻炼，重视体检 应强调合理的饮食结构，避免高热量饮食，改变"无酒不成餐"的观念。应加强锻炼，减 少脂肪囤积，增强体质。肥胖者应注意定期体检，以早期发现 脂肪肝等疾病。
[0038](三）积极防治病毒性肝炎 目前普遍认为乙型肝炎病毒（HBV)和丙型肝炎病毒（HCV)感染可与酒精的肝脏毒性作 用产生协同效应，其中HCV感染的协同效应可能更为突出。酒精性肝损害可增加对HBV和 HCV的易感性，而慢性病毒性肝炎者对乙醇的敏感性高，容易合并酒精中毒和ALD，使慢性 肝炎加重。有研宄表明，HCV感染者酒精摄入量超过50g/d就会加速肝脏病变，即使摄入正 常量的酒精，也会加速 肝纤维化的进程。因此，开展乙型肝炎疫苗接种、加强对献血员的筛查和防止医源性传 播等也尤为重要。
[0039] 四、治疗与预后 酒精性肝病是西方国家最常见的肝病，在我国发病率有增多的趋势。酒精性肝病的治 疗原则主要是：减轻酒精性肝病的严重度；阻止或逆转肝纤维化；改善已存在的继发性营 养不良；对酒精性肝硬化进行治疗。戒酒是首要方法，其疗效与肝病的严重度有关。对于普 通的酒精性肝病可使临床和病理表现明显改善；对严重的酒精性肝病，则不一定有效；对 于酒精性脂肪肝，戒酒是唯一有效的治疗方法。皮质激素对轻中型病例无明显效果，而只有 严重病例才能从激素受益。激素能减轻肝内急、慢性炎症，但对早期或已确定的纤维化无肯 定效果。因此，酒精性肝病时激素可能仅适用于少数不伴有肝硬化的重型病例。秋水仙碱、 丙基硫氧嘧啶、胰岛素一胰高糖素、抗氧化剂、多不饱和卵磷脂/磷脂酰胆碱、降脂药、抗内 毒索剂、肝移植和中医中药等疗法有一定效果，或者仅对某一方面如改善肝功能，降低死亡 率，减少肝硬化发生等有一定疗效。
[0040] 近来，阿片受体拮抗剂一一纳洛酮被用于急性酒精中毒的治疗，似乎为治疗提供 了一条新的有效途径。但大量研宄表明，纳洛酮只是对抗酒精对中枢神经系统的抑制作用。 起到迅速的催醒效果，而对酒精本身的代谢并无明确影响。故患者醒后由于饮酒所致的各 种不适症状仍然存在，提示酒精对其它脏器的损伤没有完全解除。
[0041] 通常认为酒精性脂肪肝为良性病变，尽管急性脂肪肝可导致门脉高压，但戒酒后 其病变可逆转。如果酒精性脂肪肝患者继续饮酒，连续肝活检证实可发生更严重的肝损伤。 目前认为，酒精性肝炎具有较高的独立死亡危险因素，较非活动性肝硬化更易导致死亡。根 据肝活检组织学，一组调查研宄了酒精性肝病的自然史，发现脂肪肝患者的预后最好，4~ 5年的生存率是70%~80% ;酒精性肝硬化伴有酒精性肝炎患者的预后最差，4~5年的生 存率是30%~50% ;而酒精性肝炎或肝硬化患者的预后介于两者之间，4~5年的生存率是 50%~75%。将所有酒精性肝病患者合并统计，其1年和5年的平均生存率分别是80%和 50% 〇
[0042] 羟基酪醇与环维黄杨星D均具有多种药理活性，但在现有的研宄与实践中，均未 发现具有保肝的活性，发明人在对羟基酪醇与环维黄杨星D进行系统研宄的过程中，非常 偶然地意外发现，羟基酪醇与环维黄杨星D在特定的比例组合后，具有非常好的保肝、解酒 作用，规范的实验研宄表明，该组合物对酒精性肝损伤具有较好的治疗作用。
【发明内容】
[0043]本发明的目的是提供一种具有保肝、解酒作用的药物组合物。
[0044]本发明的另一目的是提供药物组合物的制备方法。
[0045]本发明的还提供该药物组合物在制备治疗酒精性肝损伤、肝纤维化以及乙型肝炎 药物中的应用。
[0046] 本发明的目的是通过以下方式实现的： 一种具有保肝、解酒作用的药物组合物，是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇 1~2,环维黄杨星D1~2。
[0047] 所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇1，环维黄杨星 D2〇
[0048] 所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇2,环维黄杨星 Dlo
[0049] 所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇1，环维黄杨星 Dlo
[0050] 所述药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成口服制剂。
[0051] 所述药物组合物制备成的口服制剂为片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。
[0052] 所述药物组合物优选采用如下方法制备：取羟基酪醇、环维黄杨星D，混合，干燥， 粉碎成细粉，加入辅料，混匀，装入硬胶囊，即得。
[0053] 所述药物组合物可用于制备具有保肝、解酒作用的药物或保健品。
[0054] 所述药物组合物还可用于制备治疗酒精性肝损伤的药物或保健品。
[0055] 所述药物组合物还可用于制备治疗肝纤维化的药物或保健品。
[0056] 所述药物组合物还可用于制备治疗乙型肝炎的药物或保健品。
[0057] 通过如下实验研宄验证本发明的技术效果： 实验一：本发明药物组合物对小鼠慢性酒精性肝损伤模型的影响 本实验采用与临床较为接近的小鼠慢性酒精性肝损伤模型，观察本发明药物组合物对 其肝功能相关生化指标的影响。
[0058] 1实验材料 I. 1药物和试剂 造模剂：牛栏山二锅头酒(清香型白酒，酒精度56%vol)，北京顺鑫农业股份有限公司 牛栏山酒厂，启封后4°C冷藏保存。
[0059] 受试药： 羟基酪醇：取干燥的羟基酪醇l〇〇g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药液，4°C冷 藏保存； 环维黄杨星D:取干燥的环维黄杨星D100g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药 液，4°C冷藏保存； 本发明药物组合物：按照本发明说明书实施例1制备的药物组合物100g;用蒸馏水配 制成浓度为〇. 40mg/mL的药液，4°C冷藏保存； 阳性药：联苯双酯滴丸，规格I. 5mgX250丸，浙江医药股份有限公司新昌制药，用蒸馏 水配制成浓度为0. 40mg/mL的药液，4°C冷藏保存。
[0060] 试剂：丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，胆 固醇（TC)试剂盒，上海复星长征医学科学有限公司。
[0061] 1.2实验动物ICR小鼠，雄性，18~22g。黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
[0062] 1.3实验仪器SELECTRA-E全自动生化仪：荷兰威图公司；LXJ-IIB低速大容量多 管离心机：上海安亭科学仪器厂；LP123电子天平：常熟市衡器厂。
[0063] 2实验方法 2.1动物分组雄性ICR小鼠，羟基酪醇组、环维黄杨星D组、本发明药物组合物组、正 常对照组、模型对照组、阳性对照(联苯双酯滴丸）组，共6组。
[0064] 2. 2给药与造模各组动物每日灌胃给药1次，灌胃容积均为0.lmL/lOg体重。正 常对照组和模型对照组给予水；羟基酪醇组灌胃给药0. 2g/kg的羟基酪醇；环维黄杨星D 组灌胃给药0. 2g/kg的环维黄杨星D;本发明药物组合物组灌胃给药0. 2g/kg的本发明药 物组合物；阳性对照组灌胃给药0. 004g/kg的联苯双酯滴丸。每次给药后2h，除正常对照组 外，其余各组按10mL/kg体重灌胃给予56 °白酒，连续60天造成慢性酒精性肝损伤模型。
[0065] 2. 3指标测定末次灌胃给予酒精后禁食不禁水，12h后摘眼球取血，4000r/min 离心15min，取血清备测ALT、AST、TC。
[0066] 2.4统计学处理：实验数据以平均值土标准差（Mean土SD)表示，组间差异采用t 检验。
[0067] 3 结果 对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST、TC的影响：表1结果显示，与正常对照组比较，模 型对照组小鼠血清ALT、AST、TC明显升高（K0. 05,K0. 01)。与模型对照组比较，本发明药 物组合物能降低血清ALT(K0. 05)、AST(K0. 05,K0. 01)和TC(K0. 05)。说明本发明 药物组合物对慢性酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST、TC具有不同程度的改善作用，且本发 明药物组合物对慢性酒精性肝损伤小鼠的改善作用明显优于羟基酪醇和环维黄杨星D。
[0068] 表1对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响（Mean土SD)n=10
与正常组相比：AP〈0.05，AAP〈0.01 ;与模型组相比：*P〈0.05，#P〈0.01 4结论 ALT主要存在于肝细胞浆中，当肝细胞损伤时，细胞内转氨酶可进入血中，引起血清中ALT的水平升高。AST也存在于肝细胞浆内，并分布于线粒体内，当肝细胞严重损伤时，AST 从线粒体内释放入血，使血清AST水平升高。同时进入体内的乙醇在肝脏代谢过程中可抑 制肝细胞内脂肪酶活性，肝细胞分解脂肪的能力下降而造成脂肪蓄积。本实验结果显示，模 型对照组小鼠的血清ALT、AST、TC明显升高，说明模型的制备是成功的。
[0069] 本实验结果显示，本发明药物组合物能降低血清ALT、AST、TC。说明本发明药物组 合物对慢性酒精性肝损伤模型小鼠的肝功能和肝脂代谢有一定的改善作用，且作用效果明 显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生了明 显的协调增效作用。本发明药物组合物适合保肝、解酒药物或保健品的开发。
[0070] 实验二：本发明药物组合物抗肝纤维化作用的实验研宄 1材料 1.1动物 清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量160~200g，由黑龙江中医药大学实验动物中心 提供。
[0071] 1.2 试剂 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨酸氨基转移酶（AST)、超氧化物歧化酶（S0D)、丙 二醛（MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px)、考马斯亮蓝蛋白测定、总蛋白（TP)、羟脯氨酸 (Hyp)试剂盒均为南京建成生物工程研宄所产品。白蛋白（ALB)液体试剂盒(溴甲酚氯法)， 为上海申能-德塞诊断技术有限公司产品。透明质酸（HA)放射免疫分析测定盒、层粘连蛋 白（LN)放射兔疫分析测定盒、III型前胶原（PCIII)放射免疫分析测定盒、IV型胶原（IV-C) 放射免疫分析测定盒、转化生长因子I(TGF-M)的表达检测试剂盒均为北京北方生物 技术研宄所产品。CCl4，分析纯，为天津市药通化学试剂有限公司产品，实验时用花生油配 成40%CC14溶液。
[0072] 1. 3 仪器 Biofugestrutos型高速低温离心机、JY92-2D型超声波细胞粉碎机、YKH-I型液体快速 混合器、TU-180紫外可见分光光度计、RE-52AA型旋转蒸发仪、普通电子天平、PTHW型电热 套、电热恒温水浴锅、予华SHZ-D(III)循环水式真空泵。
[0073] 2 方法 2. 1药物 秋水仙碱片，吉林省辉南辉发制药股份有限公司，国药准字H22020864,实验时用蒸馏 水配制成浓度为0. 40mg/mL混悬液，4°C冷藏保存； 羟基酪醇：取干燥的羟基酪醇l〇〇g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药液，4°C冷 藏保存； 环维黄杨星D:取干燥的环维黄杨星D100g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药 液，4°C冷藏保存； 本发明药物组合物：按照本发明说明书实施例1制备的药物组合物l〇〇g，用蒸馏水配 制成浓度为〇. 40mg/mL的药液，4°C冷藏保存； 2. 2分组、造模及给药 取清洁级大鼠90只，随机分为6组，每组各15只，即对照组，模型组，秋水仙碱组 (0? 2mg/kg)，本发明药物组（0? 2mg/kg)、羟基酪醇组（0? 2mg/kg)、环维黄杨星D组（0? 2mg/ kg)。各组每天ig给药，体积为20mL/kg，连续8周，对照组和模型组给予蒸馏水。再给药 的同时采用〇：14制备大鼠肝纤维化模型，除对照组外，其余各组每只大鼠首次于背部sc纯 CCl45mL/kg，以后sc40%CC14花生油3mL/kg，每周2次，共8周。股动脉取血，常规分离血清， 大鼠处死前禁食24h。
[0074] 2. 3检测指标 检测血清中ALT、AST活性及TP、ALB的量，计算ALB与球蛋白（GLOB)的比值（A/G);检 测血清中的肝纤维化4项指标：PCIII、IV-C、HA、LN。大鼠于平卧状态下剖腹，取肝脏、脾脏， 称质量，计算肝脏、脾脏指数；用肉眼观察大鼠肝脏的外形、体积、颜色、质地的改变，一部分 肝脏用生理盐水制成10%肝匀浆，用于检测肝组织中的S0D、GSH-Px的活性与Hyp、MDA水 平；并对肝脏中TGF-M表达进行检测。
[0075] 2. 4免疫组化方法检测肝脏组织中TGF-M表达 石蜡包埋块以4_连续切片或冰冻切片，采用ABC法进行免疫组化染色。主要步骤： 石蜡切片梯度水化或冰冻切片丙酮固定，加10%正常血清封闭20min，加特异性抗体(一抗） 40°C过夜，加生物素化二抗 37°C、3min，加ABC试剂（1 :100 )37°C、40min，1?Ommo1/LDAB-H202 显色lOmin，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
[0076] 2. 5数据处理 数据均以平均值土标准差（Mean土SD)表示，采用统计软件SPSS13. 0进行方差分析。
[0077] 3 结果 3. 1对肝纤维化大鼠肝脏、脾脏指数的影响结果见表2。与对照组比较，模型组大鼠 肝脏、脾脏质量明显增加，肝脏、脾脏指数明显升高（P< 0.05)，提示造模成功。与模型组 比较，本发明药物组大鼠肝脏、脾脏质量明显降低（P< 0.01)，肝脏、脾脏指数显著降低（P < 0. 01 )，且明显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组 合后产生了明显的协调增效作用。
[0078] 表2对0：14致肝纤维化大鼠肝脾及肝脾指数的影响（Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0.Ol； 3. 2对肝纤维化大鼠血清ALT和AST活性的影响 结果见表3。与对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST活性显著升高（P< 0. 01)，提 示造模成功。与模型组比较，本发明药物组大鼠血清中ALT、AST活性显著降低（P< 0. 01)， 且明显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生 了明显的协调增效作用。
[0079] 表3对0：14致肝纤维化大鼠血清中ALT和AST活性的影响（Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0.Ol； 3. 3对肝纤维化大鼠肝组织中SOD活性及MDA、GSH-Px和Hyp水平影响 结果见表4。与对照组比较，模型组大鼠肝组织中SOD活性和GSH-Px水平显著降低（P < 0. 01)，MDA和Hyp水平显著升高（P< 0. 01)，提示造模成功。与模型组比较，本发明药 物组大鼠肝组织中MDA和Hyp水平显著降低（P< 0. 01)，而肝组织中的SOD活性和GSH-Px 水平显著增强（P< 0. 01 )，且明显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合 物中两味药物组合后产生了明显的协调增效作用。
[0080] 表4对(：(：14致肝纤维化大鼠肝组织中SOD活性、MDA和GSH-Px水平影响 (Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0. 01 ； 3. 4对肝纤维化大鼠血清中TP、ALB、GLOB、A/G的影响 结果见表5。与对照组比较，模型组血清TP、ALB水平和A/G值远远低于对照组（P < 〇. 01)，模型组大鼠血清中ALB降低的同时GLOB相应增加，而且GLOB的量远远高于对照 组（P< 0. 01)，提示造模成功。与模型组比较，本发明药物组大鼠血清中TP、ALB的量和A/ G值明显升高（P< 0.01)，而GLOB的量明显降低（P〈0. 01)，且明显优于羟基酪醇组与环维 黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生了明显的协调增效作用。
[0081] 表5对0：14致肝纤维化大鼠血清TP、ALB、GLOB及A/G的影响（Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0. 01 ； 3. 5对肝纤维化大鼠血清中肝纤维化4项指标的影响 结果见表6。与对照组相比，模型组大鼠血清中HA、LN、PCIII、IV-C水平均显著升高 (P〈0. 01 )，提示造模成功。与模型组比较，本发明药物组大鼠血清中HA、LN、PCIII、IV-C水 平明显降低（P〈〇. 01)，且明显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物 中两味药物组合后产生了明显的协调增效作用。
[0082] 表6对0：14致肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCIII、IV-C的影响（Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0. 01 ； 3. 6对肝纤维化大鼠肝组织中TGF-M表达的影响 对照组大鼠肝组织仅在中央静脉和汇管区有少量浅淡着色，TGF-M仅微量表达。与对 照组比较，模型组TGF-M阳性表达明显增强，阳性染色分布于变性的肝细胞、纤维化区、 肝窦区、汇管区、血管壁及部分胆管细胞，而在纤维间隔仅有轻度黄染，提示造模成功。与模 型组比较，本发明药物组大鼠肝组织中TGF-M阳性染色分布区域与模型组类似，但黄染 显著减轻，稍微强于阳性组，羟基酪醇组与环维黄杨星D组改善程度较弱。结果提示，本发 明药物能明显对抗〇：14导致的肝纤维化大鼠肝组织中TGF-M表达的增强，且明显优于羟 基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生了明显的协调 增效作用。
[0083] 4 结论 本实验结果表明，本发明药物可显著抑制CCl4致肝纤维化大鼠血清ALT、AST的升高， 使ALB合成增加、A/G值升高，表示肝细胞再生和合成功能进一步加强，说明本发明药物具 有抑制肝细胞、肝损伤的作用。推测其抗肝损伤的作用，主要是通过抗肝细胞色素P450代 谢激活后生成的自由基，防止蛋白质等物质合成代谢发生障碍，从而阻止生物膜脂质过氧 化实现的。据报道血清撤、1^1(：111、1￥-(：和肝组织中办？的水平与慢性肝病的严重程度呈 相关性，随病情加重，血清肝纤维化指标和肝脏指标将升高，因此测定肝组织HA、LN、PCIII、 IV-C、Hyp水平，可反映肝纤维化程度。本实验表明，本发明药物能抑制HA、LN、PCIII、IV-C 和Hyp水平的升高，说明本发明药物可以明显抑制胶原纤维的增生，能抑制肝脏胶原纤维 合成沉淀，具有抗肝纤维化的作用。MDA、S0D、GSH-Px的变化直接或间接反映了肝损伤的程 度。本实验表明，本发明药物能明显降低肝纤维化大鼠肝组织中的MDA水平和S0D、GSH-Px 活性，说明本发明药物能提高肝组织的抗氧化酶活性，抑制自由基的产生，促进其清除，并 抑制氧自由基引起的脂质过氧化反应，使MDA生成减少，从而对肝组织起保护作用，使大鼠 肝纤维化减轻。TGF-M诱导基质产生的机制是活化产生基质的基因转录，也通过下调有 关降解基质的基因表达。正常肝细胞无法表达TGF-M，一旦肝脏受损，血小板、巨噬细胞、 Kupffer细胞等激活后释放TGF-M等细胞因子，TGF-M与星形细胞膜上的TGF-M受体 结合，使受体活化并将信号由胞浆转运至胞核，促使靶基因表达，分泌大量以胶原蛋白为主 的细胞外基质，广泛沉积在汇管区和肝小叶内，引起肝纤维化形成。本实验表明，本发明药 物能明显降低肝纤维化大鼠肝组织中TGF-M的表达，因此推测本发明药物抗纤维化、阻 止肝纤维化形成的机制，可能与其调节TGF-M水平有关，从而促进细胞外基质合成并抑 制其降解以恢复肝脏功能、消除肝纤维化诱发因素，最终抑制胶原纤维增生和促进胶原纤 维降解、减少增殖，从而达到抗肝纤维化的作用。在实验过程中，由于实验时间比较长，CCl4 的毒性又比较大，因此在实验过程中出现了大鼠死亡的现象，死亡率为14.4%。对照组大鼠 没有死亡的情况，模型组、羟基酪醇组和环维黄杨星D组均有大鼠死亡的现象，阳性对照组 和本发明药物组大鼠死亡较少。随着实验的进行，各治疗组动物的状态均有不同程度好转， 其中以阳性对照组、本发明药物组大鼠恢复程度较好，羟基酪醇组与环维黄杨星D组恢复 较差，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生了明显的协调增效作用。
[0084] 综上所述，本发明药物具有良好的抗肝纤维化的作用，作用机制与抗氧化、抑制胶 原增生、调节TGF-M水平等有关，本研宄为其进一步开发提供科学依据，提示本发明药物 有望开发成为抗肝纤维化新药。
[0085] 实验三：本发明药物抗鸭乙型肝炎病毒作用的实验研宄 1材料 1. 1实验动物 黑龙江麻鸭，购自哈尔滨市太平白鹅孵化场。实验时体质量为90~105g。
[0086] 1. 2药物及试剂 羟基酪醇：取干燥的羟基酪醇l〇〇g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药液，4°C冷 藏保存； 环维黄杨星 D:取干燥的环维黄杨星D100g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药 液，4°C冷藏保存； 本发明药物组合物：按照本发明说明书实施例1制备的药物组合物100g;用蒸馏水配 制成浓度为〇. 40mg/mL的药液，4°C冷藏保存； 拉米夫定：葛兰素史克制药(苏州）有限公司生产；地高辛DNA标记与检测试剂盒，Roche公司产品；HBsAgELISA检测试剂盒，购自上海荣盛生物药业有限公司；ALT、AST试剂 盒，购自南京建成生物工程研宄所。
[0087] 2 方法 2. 1造模与给药 取健康1日龄黑龙江麻鸭，经腹腔接种0. 2mLDHBV-DNA阳性病毒血清，接种Iw后，分别 于颈外静脉取血，用地高辛标记的DHBVDNA探针经斑点杂交检测筛选出感染阳性鸭，饲养 至3周龄作为模型动物。将DHBV感染阳性的黑龙江麻鸭随机分为5组，即模型对照组、拉 米夫定组及环维黄杨星D组、羟基酪醇组及本发明药物组合物组，每组12只。模型组灌服 生理盐水，拉米夫定组按剂量50mg/kg灌服拉米夫定，环维黄杨星D组按剂量26.Omg/kg灌 服环维黄杨星D、羟基酪醇组按剂量26.Omg/kg灌服羟基酪醇、本发明药物组合物组按剂量 26.Omg/kg灌服本发明药物。1次/d，连续28d。
[0088] 2. 2指标检测参照文献方法(张喜德，朱钰叶，张恩户.桑蒂复肝胶囊抗鸭乙型 肝炎病毒的实验研宄.中国中医基础医学杂志，2008,14 (12) :915-917)，于给药前、给药 后7、14、28d、停药后7d，分别自颈外静脉取血，分离血清，采用斑点杂交法，用地高辛标记 的DHBV-DNA探针将给药前后的血清进行检测，以与探针同源的质粒DNA倍比稀释后点样于 硝酸纤维薄膜上杂交显示的斑点颜色深浅为标准，用扫描仪进行膜片扫描并进行斑点定量 分析，并按公式volume=intensityXmm2计算斑点值volume，以反映血清DHBV-DNA滴度水 平；采用ELISA法通过酶标仪读取光密度D(A)值检测血清HBsAg水平；对给药后28d与 停药后7d的血清，同时按照试剂盒进行ALT和AST活性的检测。此外，于停药后第7天分别 处死各组动物，取肝组织置于10%甲醛溶液中固定，石蜡切片后用HE染色，进行病理检查。
[0089] 2. 3统计学处理实验数据以平均值土标准差（Mean土SD)表示，采用的统计软件为 SPSS16. 0,组间比较采用One-WayANOVA统计处理。
[0090] 3 结果 3. 1本发明药物对鸭血清中DHBV-DNA滴度的影响结果如表7所示，于给药后第7天 开始，拉米夫定组动物血清中DHBV-DNA滴度与模型对照组比较，显著降低（P< 0. 05或P < 0. 01)，但在停药后第7天，血清中DHBV-DNA滴度的水平有所升高。环维黄杨星D组动物 血清中DHBV-DNA滴度与模型组比较，无显著差异（P> 0. 05)。给药后第28d及停药后第7 天，羟基酪醇组动物血清中DHBV-DNA滴度与模型组比较，差异显著（P< 0. 05)。于给药后第 7天开始，本发明药物组动物血清中DHBV-DNA滴度与模型组比较，差异极显著（P< 0. 01)， 且在停药后第7天，血清中DHBVDNA滴度的水平未见升高。
[0091] 表7本发明药物对鸭血清中DHBV-DNA滴度的影响（Mean土SD，n=12)
注：与模型组比较，*P< 0. 05,#P< 0. 01 3. 2本发明药物对鸭血清中HBsAg的影响 结果如表8所示，于给药后第7天开始，拉米夫定组动物血清HBsAg的D(X)值与模 型组比较，差异显著（P< 0. 05或P< 0. 01)，但在停药后第7天，血清中HBsAg的D(入） 值有所升高。环维黄杨星D组动物血清中HBsAg的D(A)值与模型组比较，无显著差异（P > 0. 05)。给药后第28天，羟基酪醇组动物血清中HBsAg的D(A)值与模型组比较，差异 显著（P< 0. 05)。于给药后第14天开始，本发明药物组动物血清中HBsAg的D(A)值与 模型组比较，差异极显著（P< 0.Ol)，且在停药后第7天，血清中HBsAg的D(A)值无明显 升尚。
[0092] 表8本发明药物对鸭血清中HBsAg的影响（Mean土SD，n=12)
注：与模型组比较，*P< 0. 05,#P< 0. 01 3. 3本发明药物对鸭血清AST和ALT的影响 结果如表9所示，给药后第28天及停药后第7天，拉米夫定组动物血清AST和ALT的 活性较模型组显著降低（P< 〇. 01 )，但在停药后第7天，血清AST和ALT的活性与给药后第 28天相比，略有上升。环维黄杨星D组动物血清AST和ALT的活性与模型组比较，无显著 差异（P> 0. 05)a。在给药后第28天及停药后第7天，羟基酪醇组动物血清AST和ALT的 活性较模型组显著降低（P< 〇. 01 )，但在停药后第7天，血清AST和ALT的活性略有上升。 在给药后第28天及停药后第7天，本发明药物组动物血清AST和ALT的活性较模型组有极 显著降低（P< 0. 01)，且在停药后第7天，血清AST和ALT的活性未见明显升高。
[0093] 表9本发明药物对鸭血清AST、ALT的影响（Mean土SD，n=12)
注：与模型组比较，*P< 0. 05,#P< 0. 01 3. 4本发明药物对肝组织病理变化的影响肝 组织HE染色结果显示：模型组肝小叶结构不完整，肝索紊乱，肝细胞浑浊肿大、变性， 部分组织汇管区小叶间隔有明显炎症细胞浸润及肝细胞点状或灶状坏死现象。拉米夫定组 肝组织结构基本正常，肝细胞形态未见明显异常，未见明显炎症细胞浸润及肝细胞坏死现 象。本发明药物组肝组织结构基本正常，肝血窦清晰，细胞无浑浊肿大，未见明显炎症细胞 浸润及肝细胞坏死现象。羟基酪醇组少量肝细胞轻度浑浊肿大，可见散在分布的少量点、灶 状坏死。环维黄杨星D组肝组织结构有少部分不正常，并有少量的炎症细胞浸润及肝细胞 点状或灶状坏死现象。
[0094] 4讨论与结论 鸭乙型肝炎病毒与人乙型肝炎病毒同属嗜肝病毒科，在病毒复制及致病性等方面十分 相似，故以DHBV感染的鸭作为研宄DHBV致病机理和抗乙型肝炎病毒药物评价的实验动物 模型已被国内外学者公认本研宄采用鸭乙型肝炎模型，考察本发明药物在体内抗鸭乙型肝 炎病毒的作用，结果表明：本发明药物能显著降低乙型肝炎模型鸭血清中DHBV-DNA滴度、 HBsAg水平以及AST、ALT活性，且在停药后第7天，未见反跳现象；停药后第7天时肝组织HE染色结果亦显示：本发明药物能减少肝细胞的变性与坏死及炎症细胞浸润。提示本发明药 物具有显著的抗鸭乙型肝炎病毒的作用，且作用效果明显优于对比药物环维黄杨星D和羟 基酪醇，说明本发明药物组合物的配伍组合产生了明显的一加一大于二的协同增效作用。
[0095]
【具体实施方式】： 实施例1 :本发明中药组合物 处方：羟基酪醇50g，环维黄杨星D50g。
[0096] 制法：取干燥的羟基酪醇50g、环维黄杨星D50g，混合，干燥，得到本发明中药组 合物。
[0097] 实施例2 :片剂 处方：羟基酪醇50g，环维黄杨星D50g。
[0098] 制法：取干燥的羟基酪醇50g、环维黄杨星D50g，混合，加入适量淀粉、硬脂酸镁， 混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包衣，制成1000片。
[0099] 实施例3 :硬胶囊 处方：羟基酪醇33g，环维黄杨星D66g。
[0100] 制法：取干燥的羟基酪醇33g、环维黄杨星D66g，混合，加入适量糊精，混勾，制成 颗粒，装入胶囊，制成硬胶囊剂1000粒。
[0101] 实施例4: 口服液 处方：羟基酪醇66g，环维黄杨星D33g。
[0102] 制法：取干燥的羟基酪醇66g、环维黄杨星D33g，混合，水调整总量至lOOOOmL， 灌装，每支10mL，灭菌，制成口服液1000支。
【主权项】
1. 在一种具有保肝作用的药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的 原料制成的：羟基酪醇1~2重量份，环维黄杨星D1~2重量份。2. 如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成 的：羟基酪醇1重量份，环维黄杨星D2重量份。3. 如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成 的：羟基酪醇2重量份，环维黄杨星D1重量份。4. 如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成 的：羟基酪醇1重量份，环维黄杨星D1重量份。5. 如权利要求1~4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用药学 中常规的制药方法制备成口服制剂。6. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用药学中常规的制 药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。7. 如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用如下方法制备：取 羟基酪醇、环维黄杨星D，混合，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，装入硬胶囊，即得。8. 如权利要求1~4任意一项所述的药物组合物在制备具有保肝、解酒作用的药物或 保健品中的应用。9. 如权利要求1~4任意一项所述的药物组合物在制备治疗酒精性肝损伤药物或保健 品中的应用。10. 如权利要求1~4任意一项所述的药物组合物在制备治疗肝纤维化、乙型肝炎药物 或保健品中的应用。
【专利摘要】本发明属于中药、天然药物领域，具体涉及一种具有保肝、解酒作用的药物组合物。发明名称为由羟基酪醇制成的治疗肝损伤的药物组合物及其制备工艺。该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇1～2，环维黄杨星D 1～2。该药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。该药物组合物可用于制备具有保肝、解酒作用的药物或保健品。用于制备治疗酒精性肝损伤、肝纤维化、乙型肝炎的药物或保健品。
【IPC分类】A61K31/05, A61P39/02, A61K31/57, A61P31/20, A61P1/16
【公开号】CN104906111
【申请号】CN201510357113
【发明人】管庆霞, 李伟男
【申请人】黑龙江中医药大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月25日
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药、天然药物领域，涉及一种由羟基酪醇、环维黄杨星D组成的具有 保肝、解酒作用的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 第一部分羟基酪醇的研宄现状 羟基酪醇（hydroxytyrosol，HT)化学名：3, 4-二羟基苯乙醇，具有很强的抗氧化活性， 主要以酯类的形式存在于橄榄的果实和枝叶中。橄榄苦苷经水解后得到HT单体。HT结构 简单，分子量小，具有良好的药物和保健功能，受到国内外研宄者的广泛关注。其药理作用 及其机制如下。
[0003] 一、抗癌作用研宄 一般认为，肿瘤是由于体内多余的自由基和活性氧（ROS)破坏了DNA致使基因异常表 达造成的，如结肠癌病人体内ROS的量明显增高。HT具有邻苯二酚结构，是一个典型的抗氧 化应激物质和自由基清除剂，这就使其具有潜在的抗肿瘤活性。研宄资料表明，HT能抑制 肿瘤发生的多个阶段且具有广谱性。
[0004] 首先，HT能保护细胞内DNA和酶免受ROS与自由基的破坏以预防癌症的发生。与 其酯化物橄榄苦苷相比，HT具有更强的抗氧化应激作用，研宄证实在外周血单核细胞中HT 降低了二噁英诱导的氧化应激和DNA破坏，它通过降低过氧化脂质、ROS的量和增加抗氧化 酶的活性，抑制细胞内DNA被破坏，并减少细胞形态学的变化。另外，HT在较低浓度下即能 抑制丙二醛、H2O2脂肪酸和7-酮基胆固醇的生成，并能有效地阻断ERK和Akt/Pkb的磷酸 化状态发生改变，还能抑制外来因素(如紫外线B、苯胼芘等）所导致的DNA破坏。
[0005] 其次，HT能抑制癌细胞增殖与促进其凋亡来发挥抗癌作用。研宄发现HT在浓度 为50yg/mL时即能通过抑制增殖和促进凋亡作用使乳腺癌细胞（MCF-7)明显减少，机制可 能是增加GO~Gl期的细胞数目，阻止Gl~S期的转化。但是有科研人员却指出HT在正 常生理浓度下对人乳腺表皮细胞(MCFlOA)和乳腺癌上皮细胞(MDA-MB-2312、MCF-7)的增 殖和凋亡均没有影响，但是HT能预防3种细胞中DNA遭破坏，另有人指出HT还能促进其他 癌细胞的凋亡，如结肠癌、直肠癌等，使细胞周期停留在S期。
[0006] 再次，HT还能通过抑制癌细胞的扩散来发挥广谱的抗癌作用。HT对恶性肿瘤入侵 结肠细胞具有明显的抑制作用，当浓度为25yg/mL时，HT在人结肠癌细胞HT115中表现出 强烈抑制细胞转移的作用且呈剂量依赖关系，却没有降低细胞活性，而且对细胞的贴壁生 长状况也没有明显影响，提示HT并不是通过细胞毒性抑制癌细胞的转移。另外，有研宄者 将HT与间碘苄胍（I-MIBG)合用治疗嗜铬细胞瘤，不仅诱导了去甲肾上腺素转运蛋白（NET) 的快速表达，而且增强了NET的活性，同时还降低了去甲肾上腺素的释放，实验表明HT能影 响和NET有关的细胞膜，而不是以一种新型的去甲肾上腺素转运分子纳入到细胞中，将HT 和I-MIBG合用治疗嗜铬细胞瘤是一种新颖而有效的方法。基于以上研宄，可以将HT开发 成一种绿色的抗癌药物，它避开了传统抗癌药的固有威胁，对正常细胞没有杀伤作用，因而 大大提升了其安全性和有效性。
[0007] 最后，HT通过抑制血管的生成发挥治疗癌症的作用。美国学者提出了肿瘤血管 生成的概念，他认为只有刺激新生血管的形成，恶性肿瘤才能生长和转移，只要能阻止新血 管的形成，就能饿死肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。研宄证明HT在血管形成不 同阶段均能发挥作用，且具有多个靶点，在人工基底膜上试验中HT抑制了血管内皮细胞的 增殖、转移和"管状"结构的形成，而且改变了上皮细胞增殖周期细胞的分布，明显增加了 subGl亚群的量，提示癌细胞凋亡增加。
[0008] 通过以上抗肿瘤机制的研宄可知，HT能在多个阶段预防癌症的发生，并在肿瘤的 治疗中发挥明显作用。但是已发表文献之间也存在着一定的矛盾，以MCF-7细胞为例，有研 宄证明HT对其具有抑制增殖和促进凋亡作用，而另有研宄者认为HT仅对MCF-7细胞的活 性氧有清除作用，对细胞增殖和凋亡几乎没有影响。因此，HT的抗肿瘤作用仍然是值得深 入探讨的一个问题，可能还有别的作用机制有待发现。
[0009] 二、抗血栓、调血脂和抗动脉硬化作用研宄 研宄发现食用橄榄油能大大降低心血管疾病的发病率，其中HT发挥了重要的作用。有 研宄指出，HT抗心血管疾病的作用与抑制血小板凝集密切相关，研宄人员以水杨酸作参比 考察了HT对大鼠体外血的抗凝集作用，实验结果证明它能抑制血栓素B的合成，并能提高 氧化亚氮的生成量，从而达到抗凝作用。有科研人员则以人血细胞为研宄对象考察了HT的 抗凝集作用，当浓度为l〇〇mg/L时，蛋白质组学研宄表明它参与调节9种蛋白发挥抗凝集作 用，如血小板结构、活性和整合素allb/b3的转导等。由结果可知，HT能抑制血小板的活性 和粘连，可用于预防血栓的形成。
[0010] HT抗心血管疾病的作用可能与降低血糖和脂类氧化物浓度有关。实验证明HT 能降低糖尿病大鼠血浆中的血糖浓度和血清中三酰甘油、总胆固醇的量，并能增强肝肾内 S0D、过氧化氢酶（CAT)和谷胱甘肽（GSH)过氧化物酶活性，降低碱性磷酸酶和硫代巴比妥 酸反应物等含量，从而表现出降低肝肾器官毒性的作用，其机制可能与HT和LDL结合有关。 还有资料表明，HT可以治疗由糖尿病引起的高血糖及氧化应激病症。HT还能预防动脉粥样 硬化的发生。研宄证明HT可以降低猪肺动脉上皮细胞内过氧化氢诱导的ROS的水平，并增 强mRNA酶、蛋白质活性和细胞内转录调节因子3a(F0X03a)的水平，诱导磷酸腺苷-激活蛋 白激酶使F0X03a向细胞核转移。其中F0X03a是一种转录调节因子，主要存在于心脏组织， 其活化状态对抑制血管平滑肌增殖、心肌细胞增生肥大和抗氧化应激具有明显作用，但当 其由细胞核转运至细胞质便发生失活。HT通过诱导腺苷酸活化蛋白激酶和激活F0X03a酶 活性的表达，保护机体上皮细胞中免受氧化破坏，且可以预防动脉硬化的发生。此外，HT也 是一种强效的脑内抗氧化剂，实验证明它能降低纹状体和脑其余部位过氧化脂产物水平， 阻碍GSH的消耗，摄取含有HT的食物能降低脑神经病变的风险。以上研宄均表明HT可以 降低脑内和血管内皮细胞活性氧的量，为治疗心脑血管疾病提供了分子依据。
[0011] 三、抗病原微生物作用研宄 HT可能开发成一种治疗肠道和呼吸道感染的药物，它具有高效和广谱的特点。以幽 门螺旋杆菌为例，其在世界范围内存在多种耐抗生素的菌株，但是HT对耐药和非耐药菌株 均具有强力的杀伤作用。另有研宄HT对5种标准菌株（ATCC9006、ATCC8176、ATCC6539、 ATCC17802、ATCC25923)和临床上得到的44种菌株最低抑菌浓度分别为0. 24~7. 85yg/ mL、0. 97~31. 25yg/mL，抑菌浓度明显低于其他植物提取物，而且对抑制革兰阳性菌的活 性高于革兰阴性菌。
[0012] 值得注意的是，其抗菌活性不仅表现在肠道内有害菌种方面，还对嗜乳酸菌和双 歧杆菌具有抑制作用。HT也可以抑制多种病毒的活性，包括HIV-1、H1N1、H3N2、H5N1*H9N2 亚型和新城鸡瘟病毒等，但是对牛轮状病毒和腺病毒无效。研宄发现HT能降低HIV-I融合 酶的活性，并能通过与病毒包膜外层的疏水基团形成氢键等阻碍gp41活性核心的融合。实 验发现用HT预处理狗肾细胞（MDCK)后，不影响H9N2在MDCK上的增殖情况，但向细胞内灌 输HT和灭活H9N2后，结果显示病毒的DNA和蛋白均无法检测到，而且电镜观测HT处理后 的H9N2病毒形态学发生变化，由此可知其靶点是病毒自身的包膜或其他部位，而不是宿主 细胞。由此，HT不仅可以作为抗菌、抗病毒的药物，而且还可以增强机体的防御功能，凸显 了其开发为抗病原微生物药物的潜力。
[0013]四、对视网膜黄斑变性防治作用研宄 HT可以预防由丙烯醛、环境毒性、氧化脂肪粒和年龄增长等因素造成的视网膜上皮细 胞氧化破坏，特别适用于老年人维持眼的健康和高分辨率，改善视力。在人视网膜上皮细胞 APRE-19中，HT同时保护Nrf2细胞通路和活化辅酶PPARGC1a受体，Nrf2能激活II期的净 化酶，如y-谷酰基-半胱氨酰连接酶、NADPH-醌氧化还原酶1、红细胞合酶1等抗氧化酶， II期净化酶将和自由基"结合"并将其他毒性化合物转化为活性较弱的分子；而PPARGC1a 则对蛋白质和线粒体复合物进行解链，以增强线粒体转运因子A的表达免受线粒体功能减 退，提高细胞生存能力。因此HT能诱导II期净化酶的活性和增强线粒体的生成，从而预防 或治疗黄斑变性。
[0014]五、保护软骨和抗骨质疏松作用研宄 软骨是一种由成骨软细胞或软骨细胞等组成的致密结缔组织，包埋在细胞外基质中， 是骨骼的一种重要组成成分，因其具有低代谢的特点，所以受伤或破损后的软骨恢复较慢。 HT能诱导和增强软骨细胞增殖，提高其产生细胞外基质组分的能力，进而促进软骨修复和 再生。研宄人员以成骨细胞和破骨细胞为对象，考察了HT对骨形成以及切除卵巢后骨流失 的影响，当浓度达到10~100umol/L时，HT能刺激钙的沉积且成剂量依赖关系，但是对原 成骨细胞胶原蛋白和碱性磷酸酶没有影响，当浓度为50~100ymol/L时，HT能阻碍多核 破骨细胞的形成且成剂量依赖关系。HT在去卵巢股骨小梁骨细胞中表现出抑制骨流失的作 用，而且还能降低原成骨细胞中H202的水平，因此能预防由氧化应激造成的骨质疏松。HT 在骨的形成和维持骨健康方面起到关键的作用，可以作为治疗骨质疏松的有效药物，适用 于诱导或增强软骨修复或软骨再生，尤其适用于运动员和具有活跃生活方式的人群。
[0015]六、其他保健作用研宄 HT能减少细胞内C0X-2的生成和5-氧脂化酶的表达，降低前列腺素E-2的合成，可用 于抗炎、镇痛。HT有助于修复由于过度运动或劳累损害的线粒体，能使体能快速恢复，并能 增强抵抗力和运动能力，还能降低小鼠C3H10T1/2细胞内脂肪滴的形成，从而达到减肥的 目的。
[0016]七、展望 国外学者对HT在抗癌、抗血栓、调血脂和抗动脉硬化、抗病原微生物、防治视网膜黄斑 变性、保护软骨和抗骨质疏松等多方面的药理作用进行了很好的研宄，部分研宄还在分子 水平上探讨了HT的药理作用机制。国内对HT的研宄主要表现在保健品和食品添加剂方面， 对其药用方面研宄较少，目前有针对HT治疗前列腺癌申请了专利。随着对HT药理作用的 深入研宄，其药用价值亟待开发，不失时机地 对HT进行成药性研宄和临床研宄，将是HT研 宄的未来方向。
[0017] 第二部分环维黄杨星D的研宄现状 黄杨木在明代《本草纲目》中就有记载，主要用于行气活血，祛湿通络等。环维黄杨星D是从黄杨木中提取的有效单体，临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常、心肌缺血 等。2010版《中国药典》一部第382页对环维黄杨星D亦有详细的记载。
[0018] 一、对心肌的作用 (一）对心肌梗死心肌代谢影响结扎兔心左前降支，静脉注射环维黄杨星D大、中、小 剂量后，均能缩小心肌梗死范围，较结扎对照组分别缩小83%、81%、46%，心电图51'段上抬减 轻，但效力较心得安差。环维黄杨星D对心肌代谢作用不明显，远不及普萘洛尔。
[0019](二）正性肌力作用环维黄杨星D在有效剂量下，对体外兔和蟾蜍心脏以及麻 醉猫、犬心脏均有强心作用，切断犬的交感和副交神经并不影响环维黄杨星D的作用，从而 推测，环维黄杨星D的强心作用不是通过神经反射机制所致。采用豚鼠左心室乳头肌标本 测定心肌收缩力证实，1〇_ 7~10_5mol?I71环维黄杨星D能增加豚鼠左心室乳头肌的收缩 张力，这种正性肌力作用不被普萘洛尔阻断，和异丙肾上腺素的正性肌力作用无相互加强 作用，能抑制由异丙肾上腺素引起的心肌节律性活动。提示环维黄杨星D能加强心肌收缩 力，但并不是通过细胞膜上的e-受体而发挥正性肌力作用。分离纯化兔心肌细胞膜，测定 Na+-K+-ATPase活力，结果显示，10_7~10_5mol?I71环维黄杨星D对兔心肌细胞膜活力有抑 制作用，K+对此有对抗作用。环维黄杨星D的抑制作用的剂量-效应曲线和哇巴因相似，但 其半数抑制浓度为哇巴因的10倍左右。哇巴因不影响[%]标记的环维黄杨星D和心肌细 胞膜的结合，因此提示环维黄杨星D的正性肌力作用可能与抑制心肌细胞膜Na+-K+-ATPase 活力有关，但其抑制途径和哇巴因不同。在环维黄杨星D对另一豚鼠体外心肌标本实验中， 证实环维黄杨星D1~10ymol?I71能增强哇巴因、异丙肾上腺素、去氧肾上腺素、组胺和 氯化钙的正性肌力作用，量效曲线左移，最大反应增加，说明环维黄杨星D正性肌力的机理 与a、0和组胺受体、电压依赖性钙通道激动剂、哇巴因不同。但环维黄杨星D能对抗维拉 帕米和低浓度的乙酰胆碱（Ach)所致的负性肌力作用，提示其强心机制可能与促进心肌细 胞外Ca2+内流，抑制心肌细胞内K+外流有关。另有研宄证明，环维黄杨星D对豚鼠体外左、 右心房肌呈剂量依赖性正性变力作用，能增强正性阶梯效应。乳头肌动作电位和同步记录 的结果证实，环维黄杨星D能延长APD50和APD90,推测环维黄杨星D正性变力作用和促进 心肌细胞外Ca2+内流有关。并且，环维黄杨星D能增强左心房静息后收缩正性阶梯和成对 刺激效应，提示环维黄杨星D能促进心肌细胞内Ca2+释放。以上可知，环维黄杨星D的强心 作用可能与抑制心肌细胞膜Na+-K+-ATPase的活力，促进心肌细胞外Ca2+内流和心肌细胞内 Ca2+释放有关。
[0020] (三）抗急性心肌缺血作用采用兔耳缘静脉注射垂体后叶素，造成急性心肌缺血 模型，观测心电图证明，兔耳缘静脉注射环维黄杨星DI. 2mg?kg'可使垂体后叶素诱发的 心电图S-T段变化的发生明显减少，对称直立高耸的T波明显缓解，说明环维黄杨星D具有 抗急性心肌缺血作用。
[0021] 二、抗心律失常作用 采用哇巴因、CaCl2、乌头碱、氯仿-肾上腺素、氯仿5种不同的病理模型引起心律失 常，证明环维黄杨星D能降低以上药物引起的心律失常发生，降低动物死亡率。对氯仿引 起的小白鼠心室纤颤，环维黄杨星D有很好的防治作用，证明环维黄杨星D有抗实验性心 律失常作用。有研宄报道，采用豚鼠体外室间隔作标本研宄证实，环维黄杨星D1.2~ 3. 6XKT5moI?I71能显著延长动作电位时程（APD)及有效不应期（ERP)，抑制心肌细胞的自 发活动及由哇巴因、异丙肾上腺素诱发的节律性活动，能使缺氧心肌的SPD(动作电位第2 相持续时间）与APD延长。但环维黄杨星D3. 6XKT5moI 以上心室肌自发活动明显增 加，细胞的动作电位变为类似起搏细胞的慢反应电位，心室肌细胞的自律性提高，提示环维 黄杨星D较低浓度有抗心律失常作用，浓度较高有诱发心律失常的可能。用CaCl2-Ach诱 发小鼠体内心房纤颤，静脉注射环维黄杨星D0. 55和I.Img?kg<使心房纤颤发生率分别 降低36%和20%，胺碘酮2. 8mg?kg_\iv亦有相同的保护作用。环维黄杨星D对乌头碱、 哇巴因、肾上腺素诱发的豚鼠体内心房纤颤，具有浓度依赖性抑制作用，且作用强度与胺 碘酮相似。环维黄杨星D和胺碘酮能抑制豚鼠体外右心房正常自律性，环维黄杨星D0.3 和30ymol?I71能抑制肾上腺素引起的体外左心房的异常自律性，环维黄杨星D0. 3~ 30ymol吨-1进行性延长心房肌的有效不应期和浓度依赖性延长心肌细胞APD50和APD90， 降低心肌细胞兴奋性。环维黄杨星D30ymol?I71使传导时间延长，降低0相上升最大速 率（Vmax);胺碘酮0. 3~30ymol?I71有相似的电生理作用，但对Vmax、APD50无影响，结 果显示，环维黄杨星D对心房肌细胞动作电位的影响与心室肌细胞相似，具有延长Aro的作 用，环维黄杨星D对体内和体外心房纤颤作用与胺碘酮相似，但胺碘酮对Vmax、APD50无影 响。推测环维黄杨星D同胺碘酮一样同属第三类抗心律失常药，但其延长动作电位的机理 可能与胺碘酮不同。采用麻醉家兔左心插管法记录心肌希氏束电图（HBE)，测量HBE的A-H、 P-R和H-V间期，比较环维黄杨星D与利多卡因对房室传导的抑制或阻滞作用，环维黄杨星 D延长P-R、H-V和A-H时间的剂量-效应相关线与利多卡因相比，显著强于利多卡因，环维 黄杨星D较大剂量可引起房室脱漏。环维黄杨星D与利多卡因在延长A-H时间的回归斜率 有明显差别，说明环维黄杨星D和利多卡因对房室传导阻滞的性质并不完全相同。环维黄 杨星D所致的房室传导阻滞不被阿托品或异丙肾上腺素所对抗，提示环维黄杨星D对房室 传导的抑制可能是直接作用。
[0022] 三、对冠脉流量心肌耗氧量作用 采用麻醉猫冠状窦插管插入冠状窦，描记冠状窦流量，结果显示，环维黄杨星D0. 5mg?kg'iv可增加猫冠状窦流量，降低冠状血管动、静脉氧差，心肌耗氧量增加，但低于 流量增加。对肾上腺素引起的动、静脉氧差的增加有反转作用，拮抗儿茶酚胺引起的心肌耗 氧量的增加，结果显示，环维黄杨星D具有降低心肌耗氧量，增加冠脉流量作用，提示环维 黄杨星D有抗心肌缺血作用。
[0023] 四、对血流动力学影响 采用大鼠冠脉结扎30min后，造成血流动力学异常。静脉注射环维黄杨星DI.ImgAg4 后，能明显抑制心肌缺血引起的血小板和红细胞聚集性的增加，降低血液粘度，但对正常大 鼠血流动力学无明显影响。给麻醉猪环维黄杨星D1.5mg 能使主动脉血压轻微升 高。实验中保持主动脉血压不变，发现心率减慢。保持主动脉血压和心率不变，使左心室收 缩压最大变化率（dp/dtmax)增高。同时研宄发现，环维黄杨星D心率减慢和左心室收缩压 最大变化率增高呈剂量依赖性。研宄还发现，用胆碱能受体阻滞剂阿托品及肾上腺素能受 体阻滞剂普萘洛尔、酚妥拉明并不影响环维黄杨星D对血流动力学的作用，用一氧化氮合 酶阻滞剂N-硝基-精氨酸甲基酯并不影响环维黄杨星D引起的心率减慢，但可以消除环维 黄杨星D引起的左心室收缩压最大变化率的增高及主动脉血压的升高。提示环维黄杨星D 可以直接作用于心脏，使心率减慢，对左心室收缩作用可能与一氧化氮的释放有关。
[0024] 五、延长小鼠耐缺氧时间 将小鼠分为3组，分别ip环维黄杨星D、普萘洛尔、生理氯化钠溶液，测定常压下小 鼠缺氧存活时间，氯化钠溶液组9. 3 ±0. 5min，普萘洛尔组13. 2 ±0. 7min环维黄杨星D组 14. 2±0. 6min，环维黄杨星D组与普萘洛尔组均较氯化钠溶液组有显著差异（P〈0. 01)，说 明环维黄杨星D具有延长小鼠耐缺氧时间作用。另有报道，将小鼠分别ip氯化钠溶液、环维 黄杨星D、溶剂，小鼠注射15min后，皮下注射异丙肾上腺素，15min后在低压下再进行实验， 结果证明环维黄杨星D组分别较生理氯化钠溶液及溶剂组耐缺氧时间显著延长（P〈0. 01)， 并且溶剂组与氯化钠溶液组结果无显著性差异，提示环维黄杨星D能拮抗低压条件下，异 丙肾上腺素所致的心肌损伤，延长小鼠耐缺氧时间，溶剂对药物无干扰作用。
[0025] 六、对急性实验性脑缺血的保护作用 结扎小鼠带迷走神经的两侧颈总动脉，造成急性脑缺血模型，观测小鼠平均存活时间， 生理氯化钠溶液组I. 8±0. 5min，环维黄杨星D小剂量和大剂量组分别为21. 2±8. 4min和 24. 3±8.Omin，能显著延长小鼠存活时间。急性脑缺血时，脑内有大量微血栓形成，采用血 栓法测血栓的湿重和干重，结果显示环维黄杨星D大、小两个剂量组与空白对照组比较均 可显著减少血栓的湿重和干重，环维黄杨星D大剂量的效果强于小剂量，但较阿司匹林弱。 提示环维黄杨星D对急性脑缺血、缺氧时的损害性病变有改善和保护作用，但其具体机制 需进一步研宄。
[0026] 七、对离体血管作用 对离体兔耳及离体大鼠后肢血管灌流实验显示，环维黄杨星D对处于收缩状态的兔耳 (主要为皮肤血管)和大白鼠后肢血管(肌肉血管为主)有不同程度的扩张作用。还有人研宄 环维黄杨星D对猪冠状动脉的影响，体内实验发现，在保持心率和主动脉血压不变的情况 下，环维黄杨星DI. 5mgAg'iv可引起左心室收缩压最大变化率升高及冠状血管舒张，并 呈剂量依赖性。静脉内给药一氧化氮合酶阻滞剂（L-NAME)可阻滞左心室收缩压最大变化 率升高及冠状血管舒张，冠状动脉内给药L-NAME仅能阻滞冠状血管舒张。但胆碱能受体和 肾上腺素能受体阻滞剂并不影响左心室收缩压最大变化率升高及冠状血管舒张。在体外冠 状动脉实验中发现，环维黄杨星D能明显缓解KCl诱导引起的血管收缩，通过给环加氧酶抑 制剂消炎痛或钾通道阻滞剂优降糖发现，其并不影响环维黄杨星D对血管的舒张作用。但 是给药L-NAME或去除内皮发现可阻滞环维黄杨星D对血管的舒张作用。研宄表明环维黄 杨星D可引起冠状动脉血管舒张，其作用机制可能与内皮释放一氧化氮有关。
[0027] 八、环维黄杨星D的药代动力学 小鼠尾静脉注射3H-环维黄杨星D后，根据血药浓度按二室模型计算药代动力学参数T1/2为3. 94±1.93h，分布相Tl/2a为〇. 〇6h，消除相T1/2 0为32h。对环维 黄杨星D在 小鼠体内组织分布研宄结果表明，3H-环维黄杨星Div后，被各组 织摄取较快，2~3h达高峰。高峰时以肺、肝组织分布最多，其次脾、肾、肠组织，肌和 脑组织较低。药物潴留于组织时间久，排泄缓慢。同时组织切片放射自显影实验表明，环维 黄杨星D在肝、肾、肺、肠内浓度较高，而心肌骨骼肌、脑内浓度较低，说明环维黄杨星D穿透 血脑屏障能力弱，在脑和脊髓分布少。对3H-环维黄杨星D在大鼠体内代谢过程研宄实验表 明，环维黄杨星D在脾、肺、肝、肾、心中24h达高峰，除2h组以肝组织分布最多外，其余均以 脾脏最高，肺、肝、肾、心次之；在中枢神经系统中环维黄杨星D1~3d达高峰，其较脾、肺、 肝、肾、心分布少。多次口服给药实验表明，环维黄杨星D在脾脏分布最多，多次口服给药各 脏器均出现蓄积现象。排泄实验表明，该药排泄缓慢，排泄速率与放射性在各脏器分布实验 的结果基本一致。
[0028] 环维黄杨星D的化学结构属于固醇类，和强心甙类药物的化学结构不同，但都具 有抑制Na+-K+-ATPase的作用，因此，对于它的强心机理需要深入研宄，这将为我们寻找具 有新结构的强心药物提供线索。同时环维黄杨星D具有抗心律失常的作用，对于它的一些 不良反应，也需要深入研宄其机制，提出合理的防治措施，或对其化学结构加以改造，研制 出高效，安全范围广的抗心律失常药。
[0029] 第三部分酒精性肝损伤的研宄现状 酒精性饮料在全世界各种文化及生活中都扮演着重要的角色，而饮酒与肝病的密切关 系也早已证实。在西方国家，酗酒历来是导致严重肝脏疾病的首要因素。在我国，虽然肝炎 病毒所致的肝病仍占主要地位，但随着人民生活的改善，酒精性饮料消耗量的日益增多，近 年来由酒精所致的肝损害也呈逐年上升趋势，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第 二大病因，这应引起医学界的关注。
[0030] 一、流行状况 酒精滥用和酒精依赖已成为当今世界日益严重的公共卫生问题。酒精性肝病（ALD)是 指由于过量摄入酒精而导致的肝脏损害等一系列病变，根据中华医学会肝脏病学分会提出 的ALD病理诊断标准，依病变程度分为轻症酒精性肝病（AML)、酒精性脂肪肝(AFD)、酒精性 肝炎（AH)、酒精性肝纤维化（AF)以及酒精性肝硬化（ALC)等五种类型。重度饮酒者中80% 以上有一定程度的脂肪肝，其中10%~35%可发展为酒精性肝炎，10%~20%可发展为肝硬 化。文献表明，ALD的发病率与酒精消耗量平行，饮酒量越大，病死率越高。每日饮酒精80~ 150g，连续5年以上，可导致肝损伤，持续10年以上可引起肝硬化，但存在个体差异。酒精 性肝病是发达国家肝硬化的重要病因，也是青壮年死亡的主要原因。西方国家酒精性肝病 发病率与死亡率均较高，酗酒者患肝硬化是正常人的6. 8倍。英国社区综合医院收治的各 类肝硬化患者中，酒精性肝硬化占80%。欧洲的一项调查显示，15岁以上的各类肝硬化患者 中，酒精性肝硬化所占的比例男性为8%~90%，女性为3%~56%。美国25~64岁的城市人 群中，酒精性肝硬变的死亡率是列于心血管疾病、肿瘤之后，居第三位的公共卫生问题。在 法国，平均每一居民年消耗纯酒精量达30. 8L之多，如果把酒中毒直接死亡者、滥用酒精所 致意外死亡、以及少数与酒有关胃肠道恶性肿瘤死亡者计算在一起，酒中毒每年约直接或 间接导致7万人死亡。在亚洲各国，尽管肝炎病毒所致的各种肝病占主要地位，但随着酒精 消耗量的增多，ALD的发病率亦在日益增多。在日本，酒滥用现象十分普遍，酒精性肝病的 发病率呈上升趋势。据一次大规模的调查发现，日本ALD的发病率1968~1976年为8. 2%， 而1976~1985年为14. 1%，其中酒精性肝炎和酒精性肝硬化的发病率在后十年从15. 3%和 37. 1%分别提高到17. 4%和43. 7%。1985年原发性肝癌（HCC)中近1/4是由酒精性肝硬化 发展而来。我国酿酒已有数千年历史，随着人们生活水平的提高及社交的需要，酒精性饮料 的消耗日益增加，据统计，我国的酒精性饮料年产量以纯酒精计算在1984年为711. 3万吨， 1993年为1846万吨，2001年达到了 3069. 87万吨，而一般人群的饮酒率达59. 5%，其中男性 为84. 6%，女性为29. 4%，人均年饮酒量以纯酒精量计算为3. 6L。此外，酒精中毒及酒精引 起的肝损伤发病率亦明显升高。研宄人员对浙江省18237名居民调查显示，ALD发病率为 4. 34%，其中ALC患病率为0. 68%，AFD患病率为0. 94%，AH患病率为1. 51%，酒精所致其他肝 脏损害为1. 21%。另一项对湖南省18618名居民的调查发现，ALD发病率为4. 36%。上述调 查的ALD的发病率均较20世纪80年代以前增加了 30倍左右，已成为仅次于病毒性肝炎的 第二大肝病，饮酒相关问题已成为我国面临的一大医学和社会问题。
[0031] 二、发病机理 酒精易溶于水，分子量小，能单纯扩散透过细胞膜，到达组织细胞内。酒精约70%在胃 被吸收，30%在小肠上部吸收，2~5min后开始进入血液，30~90 min后达到浓度高峰。摄入人体的酒精约90%~98%在肝脏代谢，2%~10%经肾和肺 排泄。最初，人们普遍认为ALD是由于长期摄入酒精继发营养不良引起的。但是，自1980 年代对ALD发病机制进行深入研宄以来，已证实乙醇具有直接的肝毒性。研宄发现，即使在 摄入富含蛋白质、维生素和微量元素饮食的情况下，乙醇也可以引起大鼠和人类志愿者肝 脏脂肪变性并伴有明显的超微结构改变。目前认为，乙醇在肝细胞内代谢产生的毒性代谢 产物及引起的代谢紊乱是导致酒精性肝损伤的主要原因。
[0032](一）乙醛的毒性作用 肝细胞内有3种参与乙醇代谢的酶类，S卩：乙醇/乙醛脱氢酶（ADH/ALDH)、微粒体乙醇 氧化系统（MEOS)及过氧化物酶体中的过氧化氢酶。乙醇在肝内经这些酶代谢的过程中均 可产生高毒性产物一一乙醛，乙醛在体内的毒性是乙醇的10倍，是造成肝脏和其他脏器损 害的主要元凶，其降解主要在肝脏线粒体内经ALDH脱氢氧化成乙酸，最终在外周组织中降 解生成二氧化碳、水和热量。长期摄入酒精可以使肝脏线粒体功能紊乱，氧化乙醛的能力大 大下降，而乙醇的氧化速度不变甚至提高，造成乙醛生成与降解不平衡，导致肝内乙醛含量 增加。高浓度的乙醛通过下列机制导致肝损伤。
[0033](二）氧缺乏学说 此学说强调肝小叶中央区缺氧在酒精性肝损伤中的重要作用。已有资料表明，无论是 快速或缓慢摄入酒精都可以增加肝脏的氧耗量，导致肝小叶中央区氧含量显著减少。乙醇 在肝脏内代谢需要氧，由门静脉到中央静脉氧张力又逐渐减少，因此长期饮酒理论上可以 导致小叶中央区缺氧，肝脏发生缺氧性肝坏死。但是也有报道，酒精性肝损伤中肝静脉氧含 量无明显变化。因此，关于氧缺乏学说仍有待进一步研宄。
[0034](三）自由基的损害作用 关于自由基在酒精性肝损伤中的作用已得到了反复的论证。一方面，大量 乙醇摄入破坏肠道粘膜结构和功能的完整性，增加肠粘膜的渗透性，引起肠源性细菌 内毒素（LPS)迅速进入血液循环，同时明显降低肝脏对LPS的清除能力，使血液中的LPS水 平显著增高并诱发内毒素血症。最近的研宄证实，抗生素可通过抑制肠道LPS的产生显著 减轻慢性乙醇接触引起的小鼠肝脏组织脂质过氧化。进入血循环的LPS通过Toll样受体信 号传导途径和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK)传导途径激活核因子kB(NF-kB)及其下游靶 基因，介导单核巨噬细胞的活化，刺激机体产生并释放大量的自由基，例如：活性氧（ROS) 和一氧化氮（NO)等。文献资料显示，NF-KB活性的抑制与乙醇导致的肝损伤的减轻密切 相关，而AH动物模型中可见肝细胞NF-KB活性显著增强。另一方面，乙醇在代谢过程中可 直接诱导P-4502E1的活性，产生大量自由基和R0S。自由基除直接损伤肝细胞外，还可以 通过增加肝细胞对脂质过氧化的敏感性，引起肝细胞损伤。氧自由基可以在肝细胞膜上与 P-4502E1结合引起抗依赖的细胞毒作 用，使肝细胞损伤，导致酒精性肝病的病理变化。
[0035](四）细胞因子的作用 细胞因子为小分子蛋白质，在细胞与细胞的沟通中起中介作用。单核细胞、巨噬细胞、 肝脏Kupfer细胞等均能分泌细胞因子。近年来，细胞因子在ALD发病机制中的作用越来越 受到重视。饮酒致细胞因子生成异常，导致体内环境中促炎症细胞因子与抗炎症细胞因子 平衡失调，诱导肝细胞凋亡与坏死，促进肝细胞氧耗竭和纤维化的形成，最终导致肝硬化。 细胞因子中尤以肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的过度表达与ALD密切相关。TNF-a是具有 多种生物学效应的细胞因子，在肝脏主要由激活的Kupffer细胞产生，并作为一个关键因 子参与各种肝脏疾病的发生与发展。一方面，TNF-a与酒精性肝损伤有关。最近研宄发现， 酒精性肝炎患者循环中的TNF-a水平升高，且与酒精性肝损伤的生化指标相关。在大鼠慢 性饮酒模型中的研宄也显示，肝脏TNF-amRNA增加的水平与肝脏病理损伤的程度一致。另 一方面，己酮可可碱（PTX)为一种非选择性磷脂酶抑制剂，可抑制TNF-a的基因转录和降 低血清TNF-a水平，研宄表明，酒精性肝病大鼠经PTX处理后，血清TNF-a水平显著降低， 进一步研宄发现，PTX显著减少大鼠 肝肾综合征的发生，提高短期生存率。此外，研宄发现，抗TNF-a抗体可以明显减轻乙 醇喂饲大鼠的肝脏炎症和坏死病变，但对肝脂肪变性无影响。而在敲除TNF-a受体基因的 大鼠给予酒精喂养不引起肝脏的炎症和坏死性改变。这些研宄 均证实，TNF-a在ALD发病机制中起重要作用。因此，目前认为TNF-a水平增加可作 为预测ALD患者的长期存活率较低的指标。
[0036] 三、预防 (一）戒酒 戒酒是预防ALD的首要方法。高危嗜酒者如能戒酒，则能较好地避免ALD的进展。早期ALD患者戒酒后经适当治疗，病情可以逆转。即使是中晚期ALD患者，戒酒也是控制病情进 展的重要环节。酒精引起的肝脏损伤除与饮酒的量有关外，不同的饮酒方式也会对ALD的 发生产生一定的影响。研宄发现，空腹饮酒和将不同种类的酒精饮料掺和饮用，可增加ALD 发生的危险性。其机制可能与降低胃黏膜乙醇脱氢酶(ADH)和肝脏谷胱甘肽（GSH)水平以 及加速胃排空有关。此外，酒精引起的肝损伤与性别也存在密切关系，女性对ALD的易感性 较男性为高。这可能是因为女性体内雌激素含量较高的原故。
[0037](二）合理饮食，加强锻炼，重视体检 应强调合理的饮食结构，避免高热量饮食，改变"无酒不成餐"的观念。应加强锻炼，减 少脂肪囤积，增强体质。肥胖者应注意定期体检，以早期发现 脂肪肝等疾病。
[0038](三）积极防治病毒性肝炎 目前普遍认为乙型肝炎病毒（HBV)和丙型肝炎病毒（HCV)感染可与酒精的肝脏毒性作 用产生协同效应，其中HCV感染的协同效应可能更为突出。酒精性肝损害可增加对HBV和 HCV的易感性，而慢性病毒性肝炎者对乙醇的敏感性高，容易合并酒精中毒和ALD，使慢性 肝炎加重。有研宄表明，HCV感染者酒精摄入量超过50g/d就会加速肝脏病变，即使摄入正 常量的酒精，也会加速 肝纤维化的进程。因此，开展乙型肝炎疫苗接种、加强对献血员的筛查和防止医源性传 播等也尤为重要。
[0039] 四、治疗与预后 酒精性肝病是西方国家最常见的肝病，在我国发病率有增多的趋势。酒精性肝病的治 疗原则主要是：减轻酒精性肝病的严重度；阻止或逆转肝纤维化；改善已存在的继发性营 养不良；对酒精性肝硬化进行治疗。戒酒是首要方法，其疗效与肝病的严重度有关。对于普 通的酒精性肝病可使临床和病理表现明显改善；对严重的酒精性肝病，则不一定有效；对 于酒精性脂肪肝，戒酒是唯一有效的治疗方法。皮质激素对轻中型病例无明显效果，而只有 严重病例才能从激素受益。激素能减轻肝内急、慢性炎症，但对早期或已确定的纤维化无肯 定效果。因此，酒精性肝病时激素可能仅适用于少数不伴有肝硬化的重型病例。秋水仙碱、 丙基硫氧嘧啶、胰岛素一胰高糖素、抗氧化剂、多不饱和卵磷脂/磷脂酰胆碱、降脂药、抗内 毒索剂、肝移植和中医中药等疗法有一定效果，或者仅对某一方面如改善肝功能，降低死亡 率，减少肝硬化发生等有一定疗效。
[0040] 近来，阿片受体拮抗剂一一纳洛酮被用于急性酒精中毒的治疗，似乎为治疗提供 了一条新的有效途径。但大量研宄表明，纳洛酮只是对抗酒精对中枢神经系统的抑制作用。 起到迅速的催醒效果，而对酒精本身的代谢并无明确影响。故患者醒后由于饮酒所致的各 种不适症状仍然存在，提示酒精对其它脏器的损伤没有完全解除。
[0041] 通常认为酒精性脂肪肝为良性病变，尽管急性脂肪肝可导致门脉高压，但戒酒后 其病变可逆转。如果酒精性脂肪肝患者继续饮酒，连续肝活检证实可发生更严重的肝损伤。 目前认为，酒精性肝炎具有较高的独立死亡危险因素，较非活动性肝硬化更易导致死亡。根 据肝活检组织学，一组调查研宄了酒精性肝病的自然史，发现脂肪肝患者的预后最好，4~ 5年的生存率是70%~80% ;酒精性肝硬化伴有酒精性肝炎患者的预后最差，4~5年的生 存率是30%~50% ;而酒精性肝炎或肝硬化患者的预后介于两者之间，4~5年的生存率是 50%~75%。将所有酒精性肝病患者合并统计，其1年和5年的平均生存率分别是80%和 50% 〇
[0042] 羟基酪醇与环维黄杨星D均具有多种药理活性，但在现有的研宄与实践中，均未 发现具有保肝的活性，发明人在对羟基酪醇与环维黄杨星D进行系统研宄的过程中，非常 偶然地意外发现，羟基酪醇与环维黄杨星D在特定的比例组合后，具有非常好的保肝、解酒 作用，规范的实验研宄表明，该组合物对酒精性肝损伤具有较好的治疗作用。
【发明内容】
[0043]本发明的目的是提供一种具有保肝、解酒作用的药物组合物。
[0044]本发明的另一目的是提供药物组合物的制备方法。
[0045]本发明的还提供该药物组合物在制备治疗酒精性肝损伤、肝纤维化以及乙型肝炎 药物中的应用。
[0046] 本发明的目的是通过以下方式实现的： 一种具有保肝、解酒作用的药物组合物，是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇 1~2,环维黄杨星D1~2。
[0047] 所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇1，环维黄杨星 D2〇
[0048] 所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇2,环维黄杨星 Dlo
[0049] 所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇1，环维黄杨星 Dlo
[0050] 所述药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成口服制剂。
[0051] 所述药物组合物制备成的口服制剂为片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。
[0052] 所述药物组合物优选采用如下方法制备：取羟基酪醇、环维黄杨星D，混合，干燥， 粉碎成细粉，加入辅料，混匀，装入硬胶囊，即得。
[0053] 所述药物组合物可用于制备具有保肝、解酒作用的药物或保健品。
[0054] 所述药物组合物还可用于制备治疗酒精性肝损伤的药物或保健品。
[0055] 所述药物组合物还可用于制备治疗肝纤维化的药物或保健品。
[0056] 所述药物组合物还可用于制备治疗乙型肝炎的药物或保健品。
[0057] 通过如下实验研宄验证本发明的技术效果： 实验一：本发明药物组合物对小鼠慢性酒精性肝损伤模型的影响 本实验采用与临床较为接近的小鼠慢性酒精性肝损伤模型，观察本发明药物组合物对 其肝功能相关生化指标的影响。
[0058] 1实验材料 I. 1药物和试剂 造模剂：牛栏山二锅头酒(清香型白酒，酒精度56%vol)，北京顺鑫农业股份有限公司 牛栏山酒厂，启封后4°C冷藏保存。
[0059] 受试药： 羟基酪醇：取干燥的羟基酪醇l〇〇g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药液，4°C冷 藏保存； 环维黄杨星D:取干燥的环维黄杨星D100g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药 液，4°C冷藏保存； 本发明药物组合物：按照本发明说明书实施例1制备的药物组合物100g;用蒸馏水配 制成浓度为〇. 40mg/mL的药液，4°C冷藏保存； 阳性药：联苯双酯滴丸，规格I. 5mgX250丸，浙江医药股份有限公司新昌制药，用蒸馏 水配制成浓度为0. 40mg/mL的药液，4°C冷藏保存。
[0060] 试剂：丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，胆 固醇（TC)试剂盒，上海复星长征医学科学有限公司。
[0061] 1.2实验动物ICR小鼠，雄性，18~22g。黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
[0062] 1.3实验仪器SELECTRA-E全自动生化仪：荷兰威图公司；LXJ-IIB低速大容量多 管离心机：上海安亭科学仪器厂；LP123电子天平：常熟市衡器厂。
[0063] 2实验方法 2.1动物分组雄性ICR小鼠，羟基酪醇组、环维黄杨星D组、本发明药物组合物组、正 常对照组、模型对照组、阳性对照(联苯双酯滴丸）组，共6组。
[0064] 2. 2给药与造模各组动物每日灌胃给药1次，灌胃容积均为0.lmL/lOg体重。正 常对照组和模型对照组给予水；羟基酪醇组灌胃给药0. 2g/kg的羟基酪醇；环维黄杨星D 组灌胃给药0. 2g/kg的环维黄杨星D;本发明药物组合物组灌胃给药0. 2g/kg的本发明药 物组合物；阳性对照组灌胃给药0. 004g/kg的联苯双酯滴丸。每次给药后2h，除正常对照组 外，其余各组按10mL/kg体重灌胃给予56 °白酒，连续60天造成慢性酒精性肝损伤模型。
[0065] 2. 3指标测定末次灌胃给予酒精后禁食不禁水，12h后摘眼球取血，4000r/min 离心15min，取血清备测ALT、AST、TC。
[0066] 2.4统计学处理：实验数据以平均值土标准差（Mean土SD)表示，组间差异采用t 检验。
[0067] 3 结果 对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST、TC的影响：表1结果显示，与正常对照组比较，模 型对照组小鼠血清ALT、AST、TC明显升高（K0. 05,K0. 01)。与模型对照组比较，本发明药 物组合物能降低血清ALT(K0. 05)、AST(K0. 05,K0. 01)和TC(K0. 05)。说明本发明 药物组合物对慢性酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST、TC具有不同程度的改善作用，且本发 明药物组合物对慢性酒精性肝损伤小鼠的改善作用明显优于羟基酪醇和环维黄杨星D。
[0068] 表1对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响（Mean土SD)n=10
与正常组相比：AP〈0.05，AAP〈0.01 ;与模型组相比：*P〈0.05，#P〈0.01 4结论 ALT主要存在于肝细胞浆中，当肝细胞损伤时，细胞内转氨酶可进入血中，引起血清中ALT的水平升高。AST也存在于肝细胞浆内，并分布于线粒体内，当肝细胞严重损伤时，AST 从线粒体内释放入血，使血清AST水平升高。同时进入体内的乙醇在肝脏代谢过程中可抑 制肝细胞内脂肪酶活性，肝细胞分解脂肪的能力下降而造成脂肪蓄积。本实验结果显示，模 型对照组小鼠的血清ALT、AST、TC明显升高，说明模型的制备是成功的。
[0069] 本实验结果显示，本发明药物组合物能降低血清ALT、AST、TC。说明本发明药物组 合物对慢性酒精性肝损伤模型小鼠的肝功能和肝脂代谢有一定的改善作用，且作用效果明 显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生了明 显的协调增效作用。本发明药物组合物适合保肝、解酒药物或保健品的开发。
[0070] 实验二：本发明药物组合物抗肝纤维化作用的实验研宄 1材料 1.1动物 清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量160~200g，由黑龙江中医药大学实验动物中心 提供。
[0071] 1.2 试剂 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨酸氨基转移酶（AST)、超氧化物歧化酶（S0D)、丙 二醛（MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px)、考马斯亮蓝蛋白测定、总蛋白（TP)、羟脯氨酸 (Hyp)试剂盒均为南京建成生物工程研宄所产品。白蛋白（ALB)液体试剂盒(溴甲酚氯法)， 为上海申能-德塞诊断技术有限公司产品。透明质酸（HA)放射免疫分析测定盒、层粘连蛋 白（LN)放射兔疫分析测定盒、III型前胶原（PCIII)放射免疫分析测定盒、IV型胶原（IV-C) 放射免疫分析测定盒、转化生长因子I(TGF-M)的表达检测试剂盒均为北京北方生物 技术研宄所产品。CCl4，分析纯，为天津市药通化学试剂有限公司产品，实验时用花生油配 成40%CC14溶液。
[0072] 1. 3 仪器 Biofugestrutos型高速低温离心机、JY92-2D型超声波细胞粉碎机、YKH-I型液体快速 混合器、TU-180紫外可见分光光度计、RE-52AA型旋转蒸发仪、普通电子天平、PTHW型电热 套、电热恒温水浴锅、予华SHZ-D(III)循环水式真空泵。
[0073] 2 方法 2. 1药物 秋水仙碱片，吉林省辉南辉发制药股份有限公司，国药准字H22020864,实验时用蒸馏 水配制成浓度为0. 40mg/mL混悬液，4°C冷藏保存； 羟基酪醇：取干燥的羟基酪醇l〇〇g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药液，4°C冷 藏保存； 环维黄杨星D:取干燥的环维黄杨星D100g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药 液，4°C冷藏保存； 本发明药物组合物：按照本发明说明书实施例1制备的药物组合物l〇〇g，用蒸馏水配 制成浓度为〇. 40mg/mL的药液，4°C冷藏保存； 2. 2分组、造模及给药 取清洁级大鼠90只，随机分为6组，每组各15只，即对照组，模型组，秋水仙碱组 (0? 2mg/kg)，本发明药物组（0? 2mg/kg)、羟基酪醇组（0? 2mg/kg)、环维黄杨星D组（0? 2mg/ kg)。各组每天ig给药，体积为20mL/kg，连续8周，对照组和模型组给予蒸馏水。再给药 的同时采用〇：14制备大鼠肝纤维化模型，除对照组外，其余各组每只大鼠首次于背部sc纯 CCl45mL/kg，以后sc40%CC14花生油3mL/kg，每周2次，共8周。股动脉取血，常规分离血清， 大鼠处死前禁食24h。
[0074] 2. 3检测指标 检测血清中ALT、AST活性及TP、ALB的量，计算ALB与球蛋白（GLOB)的比值（A/G);检 测血清中的肝纤维化4项指标：PCIII、IV-C、HA、LN。大鼠于平卧状态下剖腹，取肝脏、脾脏， 称质量，计算肝脏、脾脏指数；用肉眼观察大鼠肝脏的外形、体积、颜色、质地的改变，一部分 肝脏用生理盐水制成10%肝匀浆，用于检测肝组织中的S0D、GSH-Px的活性与Hyp、MDA水 平；并对肝脏中TGF-M表达进行检测。
[0075] 2. 4免疫组化方法检测肝脏组织中TGF-M表达 石蜡包埋块以4_连续切片或冰冻切片，采用ABC法进行免疫组化染色。主要步骤： 石蜡切片梯度水化或冰冻切片丙酮固定，加10%正常血清封闭20min，加特异性抗体(一抗） 40°C过夜，加生物素化二抗 37°C、3min，加ABC试剂（1 :100 )37°C、40min，1?Ommo1/LDAB-H202 显色lOmin，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
[0076] 2. 5数据处理 数据均以平均值土标准差（Mean土SD)表示，采用统计软件SPSS13. 0进行方差分析。
[0077] 3 结果 3. 1对肝纤维化大鼠肝脏、脾脏指数的影响结果见表2。与对照组比较，模型组大鼠 肝脏、脾脏质量明显增加，肝脏、脾脏指数明显升高（P< 0.05)，提示造模成功。与模型组 比较，本发明药物组大鼠肝脏、脾脏质量明显降低（P< 0.01)，肝脏、脾脏指数显著降低（P < 0. 01 )，且明显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组 合后产生了明显的协调增效作用。
[0078] 表2对0：14致肝纤维化大鼠肝脾及肝脾指数的影响（Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0.Ol； 3. 2对肝纤维化大鼠血清ALT和AST活性的影响 结果见表3。与对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST活性显著升高（P< 0. 01)，提 示造模成功。与模型组比较，本发明药物组大鼠血清中ALT、AST活性显著降低（P< 0. 01)， 且明显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生 了明显的协调增效作用。
[0079] 表3对0：14致肝纤维化大鼠血清中ALT和AST活性的影响（Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0.Ol； 3. 3对肝纤维化大鼠肝组织中SOD活性及MDA、GSH-Px和Hyp水平影响 结果见表4。与对照组比较，模型组大鼠肝组织中SOD活性和GSH-Px水平显著降低（P < 0. 01)，MDA和Hyp水平显著升高（P< 0. 01)，提示造模成功。与模型组比较，本发明药 物组大鼠肝组织中MDA和Hyp水平显著降低（P< 0. 01)，而肝组织中的SOD活性和GSH-Px 水平显著增强（P< 0. 01 )，且明显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合 物中两味药物组合后产生了明显的协调增效作用。
[0080] 表4对(：(：14致肝纤维化大鼠肝组织中SOD活性、MDA和GSH-Px水平影响 (Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0. 01 ； 3. 4对肝纤维化大鼠血清中TP、ALB、GLOB、A/G的影响 结果见表5。与对照组比较，模型组血清TP、ALB水平和A/G值远远低于对照组（P < 〇. 01)，模型组大鼠血清中ALB降低的同时GLOB相应增加，而且GLOB的量远远高于对照 组（P< 0. 01)，提示造模成功。与模型组比较，本发明药物组大鼠血清中TP、ALB的量和A/ G值明显升高（P< 0.01)，而GLOB的量明显降低（P〈0. 01)，且明显优于羟基酪醇组与环维 黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生了明显的协调增效作用。
[0081] 表5对0：14致肝纤维化大鼠血清TP、ALB、GLOB及A/G的影响（Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0. 01 ； 3. 5对肝纤维化大鼠血清中肝纤维化4项指标的影响 结果见表6。与对照组相比，模型组大鼠血清中HA、LN、PCIII、IV-C水平均显著升高 (P〈0. 01 )，提示造模成功。与模型组比较，本发明药物组大鼠血清中HA、LN、PCIII、IV-C水 平明显降低（P〈〇. 01)，且明显优于羟基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物 中两味药物组合后产生了明显的协调增效作用。
[0082] 表6对0：14致肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCIII、IV-C的影响（Mean土SD)
注：与对照组比较：**P〈〇. 01 ;与模型组比较：AAP〈0. 01 ;与本发明药物比较： ##P<0. 01 ； 3. 6对肝纤维化大鼠肝组织中TGF-M表达的影响 对照组大鼠肝组织仅在中央静脉和汇管区有少量浅淡着色，TGF-M仅微量表达。与对 照组比较，模型组TGF-M阳性表达明显增强，阳性染色分布于变性的肝细胞、纤维化区、 肝窦区、汇管区、血管壁及部分胆管细胞，而在纤维间隔仅有轻度黄染，提示造模成功。与模 型组比较，本发明药物组大鼠肝组织中TGF-M阳性染色分布区域与模型组类似，但黄染 显著减轻，稍微强于阳性组，羟基酪醇组与环维黄杨星D组改善程度较弱。结果提示，本发 明药物能明显对抗〇：14导致的肝纤维化大鼠肝组织中TGF-M表达的增强，且明显优于羟 基酪醇组与环维黄杨星D组，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生了明显的协调 增效作用。
[0083] 4 结论 本实验结果表明，本发明药物可显著抑制CCl4致肝纤维化大鼠血清ALT、AST的升高， 使ALB合成增加、A/G值升高，表示肝细胞再生和合成功能进一步加强，说明本发明药物具 有抑制肝细胞、肝损伤的作用。推测其抗肝损伤的作用，主要是通过抗肝细胞色素P450代 谢激活后生成的自由基，防止蛋白质等物质合成代谢发生障碍，从而阻止生物膜脂质过氧 化实现的。据报道血清撤、1^1(：111、1￥-(：和肝组织中办？的水平与慢性肝病的严重程度呈 相关性，随病情加重，血清肝纤维化指标和肝脏指标将升高，因此测定肝组织HA、LN、PCIII、 IV-C、Hyp水平，可反映肝纤维化程度。本实验表明，本发明药物能抑制HA、LN、PCIII、IV-C 和Hyp水平的升高，说明本发明药物可以明显抑制胶原纤维的增生，能抑制肝脏胶原纤维 合成沉淀，具有抗肝纤维化的作用。MDA、S0D、GSH-Px的变化直接或间接反映了肝损伤的程 度。本实验表明，本发明药物能明显降低肝纤维化大鼠肝组织中的MDA水平和S0D、GSH-Px 活性，说明本发明药物能提高肝组织的抗氧化酶活性，抑制自由基的产生，促进其清除，并 抑制氧自由基引起的脂质过氧化反应，使MDA生成减少，从而对肝组织起保护作用，使大鼠 肝纤维化减轻。TGF-M诱导基质产生的机制是活化产生基质的基因转录，也通过下调有 关降解基质的基因表达。正常肝细胞无法表达TGF-M，一旦肝脏受损，血小板、巨噬细胞、 Kupffer细胞等激活后释放TGF-M等细胞因子，TGF-M与星形细胞膜上的TGF-M受体 结合，使受体活化并将信号由胞浆转运至胞核，促使靶基因表达，分泌大量以胶原蛋白为主 的细胞外基质，广泛沉积在汇管区和肝小叶内，引起肝纤维化形成。本实验表明，本发明药 物能明显降低肝纤维化大鼠肝组织中TGF-M的表达，因此推测本发明药物抗纤维化、阻 止肝纤维化形成的机制，可能与其调节TGF-M水平有关，从而促进细胞外基质合成并抑 制其降解以恢复肝脏功能、消除肝纤维化诱发因素，最终抑制胶原纤维增生和促进胶原纤 维降解、减少增殖，从而达到抗肝纤维化的作用。在实验过程中，由于实验时间比较长，CCl4 的毒性又比较大，因此在实验过程中出现了大鼠死亡的现象，死亡率为14.4%。对照组大鼠 没有死亡的情况，模型组、羟基酪醇组和环维黄杨星D组均有大鼠死亡的现象，阳性对照组 和本发明药物组大鼠死亡较少。随着实验的进行，各治疗组动物的状态均有不同程度好转， 其中以阳性对照组、本发明药物组大鼠恢复程度较好，羟基酪醇组与环维黄杨星D组恢复 较差，说明本发明药物组合物中两味药物组合后产生了明显的协调增效作用。
[0084] 综上所述，本发明药物具有良好的抗肝纤维化的作用，作用机制与抗氧化、抑制胶 原增生、调节TGF-M水平等有关，本研宄为其进一步开发提供科学依据，提示本发明药物 有望开发成为抗肝纤维化新药。
[0085] 实验三：本发明药物抗鸭乙型肝炎病毒作用的实验研宄 1材料 1. 1实验动物 黑龙江麻鸭，购自哈尔滨市太平白鹅孵化场。实验时体质量为90~105g。
[0086] 1. 2药物及试剂 羟基酪醇：取干燥的羟基酪醇l〇〇g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药液，4°C冷 藏保存； 环维黄杨星 D:取干燥的环维黄杨星D100g，用蒸馏水配制成浓度为0. 40mg/mL的药 液，4°C冷藏保存； 本发明药物组合物：按照本发明说明书实施例1制备的药物组合物100g;用蒸馏水配 制成浓度为〇. 40mg/mL的药液，4°C冷藏保存； 拉米夫定：葛兰素史克制药(苏州）有限公司生产；地高辛DNA标记与检测试剂盒，Roche公司产品；HBsAgELISA检测试剂盒，购自上海荣盛生物药业有限公司；ALT、AST试剂 盒，购自南京建成生物工程研宄所。
[0087] 2 方法 2. 1造模与给药 取健康1日龄黑龙江麻鸭，经腹腔接种0. 2mLDHBV-DNA阳性病毒血清，接种Iw后，分别 于颈外静脉取血，用地高辛标记的DHBVDNA探针经斑点杂交检测筛选出感染阳性鸭，饲养 至3周龄作为模型动物。将DHBV感染阳性的黑龙江麻鸭随机分为5组，即模型对照组、拉 米夫定组及环维黄杨星D组、羟基酪醇组及本发明药物组合物组，每组12只。模型组灌服 生理盐水，拉米夫定组按剂量50mg/kg灌服拉米夫定，环维黄杨星D组按剂量26.Omg/kg灌 服环维黄杨星D、羟基酪醇组按剂量26.Omg/kg灌服羟基酪醇、本发明药物组合物组按剂量 26.Omg/kg灌服本发明药物。1次/d，连续28d。
[0088] 2. 2指标检测参照文献方法(张喜德，朱钰叶，张恩户.桑蒂复肝胶囊抗鸭乙型 肝炎病毒的实验研宄.中国中医基础医学杂志，2008,14 (12) :915-917)，于给药前、给药 后7、14、28d、停药后7d，分别自颈外静脉取血，分离血清，采用斑点杂交法，用地高辛标记 的DHBV-DNA探针将给药前后的血清进行检测，以与探针同源的质粒DNA倍比稀释后点样于 硝酸纤维薄膜上杂交显示的斑点颜色深浅为标准，用扫描仪进行膜片扫描并进行斑点定量 分析，并按公式volume=intensityXmm2计算斑点值volume，以反映血清DHBV-DNA滴度水 平；采用ELISA法通过酶标仪读取光密度D(A)值检测血清HBsAg水平；对给药后28d与 停药后7d的血清，同时按照试剂盒进行ALT和AST活性的检测。此外，于停药后第7天分别 处死各组动物，取肝组织置于10%甲醛溶液中固定，石蜡切片后用HE染色，进行病理检查。
[0089] 2. 3统计学处理实验数据以平均值土标准差（Mean土SD)表示，采用的统计软件为 SPSS16. 0,组间比较采用One-WayANOVA统计处理。
[0090] 3 结果 3. 1本发明药物对鸭血清中DHBV-DNA滴度的影响结果如表7所示，于给药后第7天 开始，拉米夫定组动物血清中DHBV-DNA滴度与模型对照组比较，显著降低（P< 0. 05或P < 0. 01)，但在停药后第7天，血清中DHBV-DNA滴度的水平有所升高。环维黄杨星D组动物 血清中DHBV-DNA滴度与模型组比较，无显著差异（P> 0. 05)。给药后第28d及停药后第7 天，羟基酪醇组动物血清中DHBV-DNA滴度与模型组比较，差异显著（P< 0. 05)。于给药后第 7天开始，本发明药物组动物血清中DHBV-DNA滴度与模型组比较，差异极显著（P< 0. 01)， 且在停药后第7天，血清中DHBVDNA滴度的水平未见升高。
[0091] 表7本发明药物对鸭血清中DHBV-DNA滴度的影响（Mean土SD，n=12)
注：与模型组比较，*P< 0. 05,#P< 0. 01 3. 2本发明药物对鸭血清中HBsAg的影响 结果如表8所示，于给药后第7天开始，拉米夫定组动物血清HBsAg的D(X)值与模 型组比较，差异显著（P< 0. 05或P< 0. 01)，但在停药后第7天，血清中HBsAg的D(入） 值有所升高。环维黄杨星D组动物血清中HBsAg的D(A)值与模型组比较，无显著差异（P > 0. 05)。给药后第28天，羟基酪醇组动物血清中HBsAg的D(A)值与模型组比较，差异 显著（P< 0. 05)。于给药后第14天开始，本发明药物组动物血清中HBsAg的D(A)值与 模型组比较，差异极显著（P< 0.Ol)，且在停药后第7天，血清中HBsAg的D(A)值无明显 升尚。
[0092] 表8本发明药物对鸭血清中HBsAg的影响（Mean土SD，n=12)
注：与模型组比较，*P< 0. 05,#P< 0. 01 3. 3本发明药物对鸭血清AST和ALT的影响 结果如表9所示，给药后第28天及停药后第7天，拉米夫定组动物血清AST和ALT的 活性较模型组显著降低（P< 〇. 01 )，但在停药后第7天，血清AST和ALT的活性与给药后第 28天相比，略有上升。环维黄杨星D组动物血清AST和ALT的活性与模型组比较，无显著 差异（P> 0. 05)a。在给药后第28天及停药后第7天，羟基酪醇组动物血清AST和ALT的 活性较模型组显著降低（P< 〇. 01 )，但在停药后第7天，血清AST和ALT的活性略有上升。 在给药后第28天及停药后第7天，本发明药物组动物血清AST和ALT的活性较模型组有极 显著降低（P< 0. 01)，且在停药后第7天，血清AST和ALT的活性未见明显升高。
[0093] 表9本发明药物对鸭血清AST、ALT的影响（Mean土SD，n=12)
注：与模型组比较，*P< 0. 05,#P< 0. 01 3. 4本发明药物对肝组织病理变化的影响肝 组织HE染色结果显示：模型组肝小叶结构不完整，肝索紊乱，肝细胞浑浊肿大、变性， 部分组织汇管区小叶间隔有明显炎症细胞浸润及肝细胞点状或灶状坏死现象。拉米夫定组 肝组织结构基本正常，肝细胞形态未见明显异常，未见明显炎症细胞浸润及肝细胞坏死现 象。本发明药物组肝组织结构基本正常，肝血窦清晰，细胞无浑浊肿大，未见明显炎症细胞 浸润及肝细胞坏死现象。羟基酪醇组少量肝细胞轻度浑浊肿大，可见散在分布的少量点、灶 状坏死。环维黄杨星D组肝组织结构有少部分不正常，并有少量的炎症细胞浸润及肝细胞 点状或灶状坏死现象。
[0094] 4讨论与结论 鸭乙型肝炎病毒与人乙型肝炎病毒同属嗜肝病毒科，在病毒复制及致病性等方面十分 相似，故以DHBV感染的鸭作为研宄DHBV致病机理和抗乙型肝炎病毒药物评价的实验动物 模型已被国内外学者公认本研宄采用鸭乙型肝炎模型，考察本发明药物在体内抗鸭乙型肝 炎病毒的作用，结果表明：本发明药物能显著降低乙型肝炎模型鸭血清中DHBV-DNA滴度、 HBsAg水平以及AST、ALT活性，且在停药后第7天，未见反跳现象；停药后第7天时肝组织HE染色结果亦显示：本发明药物能减少肝细胞的变性与坏死及炎症细胞浸润。提示本发明药 物具有显著的抗鸭乙型肝炎病毒的作用，且作用效果明显优于对比药物环维黄杨星D和羟 基酪醇，说明本发明药物组合物的配伍组合产生了明显的一加一大于二的协同增效作用。
[0095]
【具体实施方式】： 实施例1 :本发明中药组合物 处方：羟基酪醇50g，环维黄杨星D50g。
[0096] 制法：取干燥的羟基酪醇50g、环维黄杨星D50g，混合，干燥，得到本发明中药组 合物。
[0097] 实施例2 :片剂 处方：羟基酪醇50g，环维黄杨星D50g。
[0098] 制法：取干燥的羟基酪醇50g、环维黄杨星D50g，混合，加入适量淀粉、硬脂酸镁， 混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包衣，制成1000片。
[0099] 实施例3 :硬胶囊 处方：羟基酪醇33g，环维黄杨星D66g。
[0100] 制法：取干燥的羟基酪醇33g、环维黄杨星D66g，混合，加入适量糊精，混勾，制成 颗粒，装入胶囊，制成硬胶囊剂1000粒。
[0101] 实施例4: 口服液 处方：羟基酪醇66g，环维黄杨星D33g。
[0102] 制法：取干燥的羟基酪醇66g、环维黄杨星D33g，混合，水调整总量至lOOOOmL， 灌装，每支10mL，灭菌，制成口服液1000支。
【主权项】
1. 在一种具有保肝作用的药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的 原料制成的：羟基酪醇1~2重量份，环维黄杨星D1~2重量份。2. 如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成 的：羟基酪醇1重量份，环维黄杨星D2重量份。3. 如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成 的：羟基酪醇2重量份，环维黄杨星D1重量份。4. 如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成 的：羟基酪醇1重量份，环维黄杨星D1重量份。5. 如权利要求1~4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用药学 中常规的制药方法制备成口服制剂。6. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用药学中常规的制 药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。7. 如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用如下方法制备：取 羟基酪醇、环维黄杨星D，混合，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，装入硬胶囊，即得。8. 如权利要求1~4任意一项所述的药物组合物在制备具有保肝、解酒作用的药物或 保健品中的应用。9. 如权利要求1~4任意一项所述的药物组合物在制备治疗酒精性肝损伤药物或保健 品中的应用。10. 如权利要求1~4任意一项所述的药物组合物在制备治疗肝纤维化、乙型肝炎药物 或保健品中的应用。
【专利摘要】本发明属于中药、天然药物领域，具体涉及一种具有保肝、解酒作用的药物组合物。发明名称为由羟基酪醇制成的治疗肝损伤的药物组合物及其制备工艺。该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：羟基酪醇1～2，环维黄杨星D 1～2。该药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。该药物组合物可用于制备具有保肝、解酒作用的药物或保健品。用于制备治疗酒精性肝损伤、肝纤维化、乙型肝炎的药物或保健品。
【IPC分类】A61K31/05, A61P39/02, A61K31/57, A61P31/20, A61P1/16
【公开号】CN104906111
【申请号】CN201510357113
【发明人】管庆霞, 李伟男
【申请人】黑龙江中医药大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月25日
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