1,6-二磷酸果糖在制备防治包膜病毒感染的药物及病毒灭活剂中的应用
1,6-二磷酸果糖在制备防治包膜病毒感染的药物及病毒灭活剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，更具体涉及一种1，6-二磷酸果糖及其所形成的盐在 制备防治人类包膜病毒感染的药物及体外病毒灭活剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 包膜病毒的核衣壳外有一层来源于宿主细胞的囊膜。囊膜是包裹在基质蛋白之外 的一层磷脂双分子层膜，这层膜来源于宿主的细胞膜，其上还镶嵌着病毒特异性的包膜蛋 白。黄病毒科的登革病毒（DENV)和日本乙型脑炎病毒（JEV)、弹状病毒科的水泡性口炎病 毒（VSV)以及副粘病毒科的呼吸道合胞病毒（RSV)均为有包膜的病毒，都是常见的威胁人 类健康的重要病原体。
[0003] 登革病毒广泛流行于全球热带及亚热带的60多个国家和地区，每年超过1亿人受 感染，25亿以上的人受到威胁。登革热（denguefever)是登革热病毒引起、伊蚊传播的一 种急性传染病。临床特征为起病急骤，高热，全身肌肉、骨髓及关节痛，极度疲乏，部分患可 有皮瘆、出血倾向和淋巴结肿大。日本乙型脑炎（乙脑）是由日本乙型脑炎病毒引起的急性 人畜共患传染病，临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征等症状体征为特 点，病死率约为25%。登革热和乙脑由蚊虫媒介传播，流行于整个亚洲，主要在亚洲东部热 带、亚热带和温带国家。乙脑主要发生于夏秋季，儿童易患，发病率占80%以上，多为10岁 以下儿童。针对乙型脑炎病毒，目前虽有疫苗，但并没有特异的抗病毒治疗。乙型脑炎病毒 感染仍然是人类健康的一大威胁。流感病毒的传播速度快、传染性强以及短时间内即可引 起局部爆发甚至全球大流行，从发现至今一直都是全球关注的重点。20世纪，IAV共造成三 次大流行。其中1918-1920爆发的西班牙大流感影响最大，造成全球5000万人死亡。1997 年，高致病性禽流感出现在香港，因为家禽毁灭性的的爆发死亡和人类散在的感染，同时伴 随很高的死亡率，使人类陷入了极大的恐慌。这两类病原体虽然在传染源、传播途径以及致 病机理等方面完全不同，但都使人类健康受到威胁并带来经济损失。
[0004] 目前，临床上针对这些包膜病毒导致的疾病主要采用干扰素和利巴韦林进行抗 病毒治疗。然而，药物存在一定的副作用，并且不能完全治愈相关疾病。此外，这些药物的 长期使用致使病毒产生了许多耐药突变株。因此，急需开发新型安全有效的药物来预防或 灭活病毒感染。
[0005] 1，6_二磷酸果糖是糖酵解代谢途径重要的中间产物，同时对糖类、脂类的代谢又 可以起到调节作用，被视为一种代谢调节物和高能磷酸底物。在临床方面，1，6_二磷酸果 糖应用广泛，可用于心肌炎、心绞痛、心肌梗塞、休克、局部缺血缺氧的环境和肝炎的辅助治 疗。但是1，6-二磷酸果糖在病毒学领域的研宄仍然是一片空白。1，6-二磷酸果糖结构如 下：
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于弥补现有技术的不足，是在于提供了一种1，6_二磷酸果糖及 其所形成的盐在制备防治人类包膜病毒感染的药物及体外病毒灭活剂中的应用，从而为临 床上人类包膜病毒感染所致相关疾病的防治提供安全有效的措施。1，6_二磷酸果糖及其所 形成的盐在无毒性范围内能够有效地灭活包膜病毒的感染，可进一步开发为防治包膜病毒 引起的相关疾病的药物及体外病毒灭活剂，具有广泛的应用前景。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是： 一种1，6-二磷酸果糖及其所形成的盐在制备防治人类包膜病毒感染的药物及病毒灭 活剂中的应用。
[0008] 优选地，所述的包膜病毒为日本乙型脑炎病毒（JEV)、登革病毒（DENV)、呼吸道合 胞病毒（RSV)和甲型流感病毒（IAV)各亚型。
[0009] 包括以下步骤： 1. 1，6-二磷酸果糖钠盐杀包膜病毒活性检测，其步骤是： A. 1，6-二磷酸果糖钠盐对MDCK细胞、VERO细胞、BHhK-21细胞和H印-2细胞毒性实 验： MDCK细胞、VERO细胞、BHhK-21细胞和Ifep-2细胞按8XIO3个细胞/孔接种于96孔细 胞培养板中，细胞贴壁后备用。用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/mL开始，2倍梯度 依次稀释成9个浓度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的各种细胞中，每组重复三个孔， 置于37°C、5%CO2培养箱中培养。将加有药物的细胞置于37°C、5%CO2培养箱中培养48~96 小时后，采用Alamarblue活性检测试剂盒检测细胞的存活率。
[0010] 结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐对这些细胞的毒性很低，半数毒性浓度（CC5tl)在 2000yg/mL以上，安全性很好。
[0011] 1，6-二磷酸果糖钠盐对包膜病毒的杀病毒活性检测： (1)流感病毒液（6. 5XIO5TCID5Q/mL)与3倍梯度稀释的1，6-二磷酸果糖钠盐（终浓 度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、111yg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、1. 37yg/ mL)在37°C预孵育4小时，然后将混合物稀释100倍后感染MDCK细胞；对照组则是病毒储 存液与各药物分别在37°C预孵育4小时，各稀释50倍后混匀感染MDCK细胞。病毒感染细 胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的药物。然后换为新鲜培养 基在37°C继续培养24小时后，收集上清测定神经氨酸酶（NA)活性，计算抑制率。
[0012] (2)日本乙型脑炎病毒JEV-Luc液（8XIO6pfu/mL)和登革病毒DENV-Luc液 (4XIO7Pfu/mL)分别与3倍梯度稀释的1，6_二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为1000yg/mL、 333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、l. 37yg/mL)在 37°C预孵育 4 小时，再将病毒和药物混合样品稀释100倍后感染BHK-21细胞，37°C培养I小时。同样，细 胞用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的药物后，换为新鲜培养基继续培养48小时，检 测细胞荧光素酶活性，计算抑制率。
[0013] (3)水泡口膜炎病毒VSV-GFP病毒液（4X107pfu/mL)与3倍梯度稀释的1，6_二 磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、 4.Iyg/mL、l. 37yg/mL)在37°C预孵育4小时。将病毒和药物混合液稀释100倍后感染 BhK-21细胞，37°C培养1小时后撤掉上清。细胞用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的 药物，然后换为新鲜培养基。继续培养12小时后，通过高内涵成像检测并定量分析绿色荧 光蛋白的荧光强度，计算抑制率。
[0014] (4)人腺病毒（ADV)、肠道病毒71型（EV71-GFP)分别与3倍梯度稀释的1，6-二 磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、 4.Iyg/mL、l. 37yg/mL)在37°C预孵育4小时后，稀释100倍后以MOI=I和MOI=O. 2感染 VERO细胞。37°C培养1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的药物。 然后换为新鲜培养基继续培养48小时后，通过高内涵检成像系统测并定量分析细胞病变 (cytopathiceffect,CPE)或是绿色焚光蛋白的焚光强度，计算抑制率。
[0015] (5)呼吸道合胞病毒RSV与稀释好的1，6-二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、111yg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、I. 37yg/mL)在 37°C预孵育3小时后，稀释100倍后以IOOTCID5ci感染H印-2细胞。33°C培养I小时后撤掉 上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的药物。然后换为新鲜培养基在33°C继续培 养96小时后，通过CellTiter-Gl0试剂盒检测细胞活性，计算细胞保护率和药物对病毒的 抑制率。
[0016] 结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐对JEV、DENV、RSV和流感病毒等包膜病毒有剂量 依赖的杀病毒活性。然而，1，6_二磷酸果糖钠盐对无包膜病毒ADV和EV71却没有表现出 杀病毒活性。说明1，6_二磷酸果糖钠盐对包膜病毒具有广谱的杀病毒作用。
[0017] 2. 1，6-二磷酸果糖钠盐温度依赖的杀流感病毒活性检测，其步骤是： 甲型流感病毒[A/PuertoRico/8/34 (HlNl)]液（6. 5XIO5TCID5Q/mL)与 3 倍梯度稀 释的1，6-二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、 12. 3yg/mL)分别在4°C、25°C、37°C和42°C孵育4小时，然后将病毒与药物的混合物稀 释100倍后感染MDCK细胞。病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附 的病毒和残留的药物。然后换为新鲜培养基在37°C继续培养24小时后，收集上清测定NA 活性，计算抑制率。
[0018] 结果表明1，6-二磷酸果糖钠盐对流感病毒的杀病毒作用是温度依赖的。1，6-二 磷酸果糖钠盐在37°C和42°C灭活流感病毒效果强于4°C和25°C的灭活效果。
[0019] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 1.在临床上，1，6_二磷酸果糖钠盐被广泛用于心肌炎、心绞痛、心肌梗塞、局部缺血缺 氧和肝炎的辅助治疗，且为人体糖代谢途径的中间产物，对人体的毒副作用小。
[0020] 2. 1，6-二磷酸果糖钠盐在无毒性的条件下，能有效地灭活JEV、DENV、RSV和流感 病毒各亚型的感染，可制成广谱的抗病毒药物。
[0021] 3.利用现代常用药物制剂手段，可将1，6_二磷酸果糖钠盐作为活性成分制成片 剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂等任何一种药学上可接 受的剂型。
[0022] 4. 1，6-二磷酸果糖钠盐具有灭活病毒的功能，能制备成体外病毒灭活剂。
【附图说明】
[0023] 图1为1，6-二磷酸果糖化学结构式。
[0024] 图2为1，6-二磷酸果糖钠盐温度依 赖地杀流感病毒活性检测示意图。
【具体实施方式】
[0025] 为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本
【发明内容】
作进一步说 明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
[0026] 实施例1: 1，6_二磷酸果糖钠盐对各亚型流感病毒的杀病毒活性检测。
[0027] 1 ?实验材料 1. 1细胞、病毒 狗肾细胞MDCK(ATCCCCL-34)由本实验室保存。A型流感病毒HlNl亚型（A/PuertoRico/8/1934 和A/human/Hubei/1/2009)、H3N2 亚型（A/Human/Hubei/3/2005)、 H6N6 亚型（A/Duck/Hubei/5/2010)、H7N8 亚型（A/Duck/Hubei/ 216/ 1983)和HlNl亚型金 刚烷胺耐药株以/1111111&11/15以33(53謂)）均为本实验室保存，通过鸡胚扩增而得。10日龄鸡 胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
[0028] 1.2 试剂 DMEM培养基购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司；神经氨 酸酶底物MUNANA购自Sigma-Aldrich。1，6_二磷酸果糖钠盐购自阿拉丁。
[0029] 1.3实验仪器 多标记微孔板读取仪（PerkinElmer)为伯乐公司产品；细胞培养箱为Thermo公司产 品。
[0030] 2?实验方法与结果 2. I1，6-二磷酸果糖钠盐对MDCK细胞的细胞毒性检测。
[0031] (1)将MDCK细胞按照8XIO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用含有10% 胎牛血清（FBS)、lOOU/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞在37°C，5%C02加湿培 养箱中培养。
[0032] (2)用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/ml开始，2倍梯度依次稀释成9个浓 度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的MDCK细胞中，每组重复三个孔，置于37°C、5%CO2 培养箱中培养。
[0033] (3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性。用 PerkinElmer多标记读板仪（Envison2102MultilabelReader)读取焚光信号。
[0034] (4)各组数据以不含药物对照组作为标准组进行计算，计算公式=药物组/未加药 物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。
[0035] 利用步骤（4)中的计算结果，通过软件统计，统计结果见表1。结果显示1，6_二磷 酸果糖钠盐对MDCK细胞的细胞毒性的CC5tl为2800yg/mL。
[0036] 2.2 1，6_二磷酸果糖钠盐对各亚型流感病毒灭活效果的检测。
[0037] (I)A型流感病毒HlNl亚型（A/PuertoRico/8/1934 和A/Human/Hubei/1/2009)、 H3N2 亚型（A/Human/Hubei/3/2005)、H6N6 亚型（A/Duck/Hubei/5/2010)、H7N8 亚型（A/ Duck/Hubei/ 216/ 1983)和HlNl亚型金刚烷胺耐药株（A/Human/WSN/33(S31N))病毒储 存液分别与3倍梯度稀释的1，6_二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为1000yg/mL、333yg/mL、 111yg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、L37yg/mL)在 37°C预孵育 4 小时。然后将 病毒与药物的混合物稀释100倍后感染MDCK细胞；对照组则是病毒储存液与各浓度药物分 别在37°C预孵育4小时，各稀释50倍后混匀立即感染MDCK细胞。
[0038] (2)病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍去掉未吸附的病毒和残留的药 物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0039] (3)培养24小时后，收集上清测定NA(神经氨酸酶）活性，计算抑制率。
[0040] 结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐能剂量依赖地灭活流感病毒各亚型，通过软件统 计，1，6_二磷酸果糖对流感病毒各亚型的IC5tl为45~130yg/mL，结果见表1。
[0041] 实施例2 : 1，6_二磷酸果糖钠盐对登革病毒和日本乙型脑炎病毒的杀病毒活性 检测。
[0042] 1?实验材料 1. 1细胞和病毒 仓鼠肾细胞（BHK-21)为本实验室保存。
[0043] 日本乙型脑炎病毒（JEV-Luc)和登革病毒（DENV-Luc):为带有Rellina Iuciferase报告基因的日本乙型脑炎病毒和登革病毒，由中科院武汉病毒研宄所张波研宄 员馈赠。
[0044] 1.2 试剂 DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司； 焚光素酶检测试剂盒购自Promega公司。
[0045] 1. 3实验仪器 多标记微孔板读取仪（PerkinElmer);高内涵细胞分析仪（PerkinElmer);Megafuge?l.OR型冷冻离心机和细胞培养箱均为Thermo公司产品。
[0046] 2?实验方法与结果 2. 1 1，6-二磷酸果糖钠盐对BHK-21细胞的细胞毒性检测。
[0047] (1)将BHK-21细胞按照8XIO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，使用含有 10%FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基在37°C，5%C02的加湿培养箱中培养。
[0048] (2)用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/ml开始，2倍梯度依次稀释成9个 浓度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的BHK-21细胞中，每组重复三个孔，置于37°C、5% 〇)2培养箱中培养。
[0049] (3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性。用 PerkinElmer多标记读板仪（Envison2102MultilabelReader)读取焚光信号。
[0050] (4)各组数据以不含药物对照组作为标准组进行计算，计算公式=药物组/未加药 物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。
[0051] 步骤（4)中的计算结果，通过软件计算统计，结果见表1。结果显示1，6_二磷酸果 糖钠盐对BHK-21细胞的细胞毒性的CC5tl为7090yg/mL。 2. 2 1，6-二磷酸果糖钠盐对登革病毒和日本乙型脑炎病毒的杀病毒活性检测 (I)JEV-Luc(8X106pfu/ml)与DENV-Luc(4X106pfu/ml)分别与 3 倍梯度稀释 的 1,6-二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、 12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、I. 37yg/mL)在37°C预孵育4小时，再将病毒和药物混合样品稀 释100倍，后感染BHK-21细胞；对照组则是病毒储存液与各浓度药物分别在37°C预孵育4 小时，各稀释50倍后混匀立即感染BHK-21细胞。
[0052] (2)病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的 药物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0053] (3)在37°C培养48小时后，测定细胞内荧光素酶活性，计算抑制率。待测细胞用 PBS洗2遍，然后用Renilla荧光素酶检测试剂盒说明书的方法加入裂解液使细胞充分裂 解，然后将裂解样品加入稀释好的底物中，在荧光素酶检测仪上进行检测。计算公式为：抑 制率（％)= 100 -(样品孔-空白对照）/ (酶活对照-空白对照）* 100%。
[0054] 实验结果显示1，6_二磷酸果糖钠盐能剂量依赖地灭活日本乙型脑炎病毒和登革 病毒。1，6-二磷酸果糖钠盐对日本乙型脑炎病毒和登革病毒的IC5tl分别为112和6. 8yg/ mL,结果见表1。
[0055] 实施例3 : 1，6-二磷酸果糖钠盐对水泡性口炎病毒（VSV)的杀病毒活性检测。
[0056] 1 ?实验材料 1. 1细胞、病毒 仓鼠肾细胞（BHK-21)为本实验室保存。
[0057] VSV-GFP:为带有GFP报告基因的水泡性口炎病毒，由武汉大学陈明周教授馈赠。
[0058] 1.2 试剂 DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司。
[0059] 1. 3实验仪器 高内涵细胞分析仪（PerkinElmer);蔡司高级倒置显微镜AxioobserverAl(Carl Zeiss)〇
[0060] 2?实验方法与结果 2. 1 1，6-二磷酸果糖钠盐对BHK-21细胞的细胞毒性检测（见实施例2)。
[0061]2. 2 1，6-二磷酸果糖钠盐杀水泡性口炎病毒活性检测。
[0062] (I)VSV-GFP病毒储存液（4XIO7pfu/mL)与3倍梯度稀释的1，6-二磷酸果糖钠 盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、 I. 37yg/mL)在37°C预孵育4小时，再将病毒和药物混合样品稀释100倍后感染BhK-21 细胞；对照组则是病毒储存液与各浓度药物分别在37°C预孵育4小时，各稀释50倍后混匀 立即感染BHK-21细胞。
[0063] (2)病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的 药物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0064] (3)培养12小时后，通过高内涵检测并定量分析绿色荧光蛋白的荧光强度，计算 抑制率。抑制率（％)=(病毒孔荧光强度-样品孔荧光强度）/病毒孔荧光强度* 100%。 实验结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐能剂量依赖地灭活水泡性口炎病毒，1，6-二磷酸 果糖钠盐对水泡性口炎病毒的IC5tl为12yg/mL，结果见表1。
[0065] 实施例5 :1，6-二磷酸果糖钠盐对腺病毒ADV和肠道病毒EV71的杀病毒活性检 测。
[0066] 1 ?实验材料 1. 1细胞、病毒 VERO细胞为本实验室保存。 [0067] 腺病毒（Adenovirus)由中国科学院武汉病毒研宄所，微生物菌毒种资源与应用中 心馈赠。EV71-GFP病毒：以EV71-GFP质粒做模板，线性化后体外转录得到全基因组RNA，再 用脂质体转染VERO细胞后扩增得到具备感染性的病毒粒子。
[0068] 1.2 试剂 DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司。
[0069] 1.3实验仪器 高内涵细胞分析仪（PerkinElmer);蔡司高级倒置显微镜AxioobserverAl(Carl Zeiss)〇
[0070] 2?实验方法与结果 2. 1 1，6-二磷酸果糖钠盐对VERO细胞的细胞毒性检测。
[0071] (1)将VERO细胞按照8XIO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，使用含有10 % FBS、lOOU/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基在37°C，5% 0)2的加湿培养箱中培养。
[0072] (2)用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/ml开始，2倍梯度依次稀释成9个浓 度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的VERO细胞中，每组重复三个孔，置于37°C、5%CO2 培养箱中培养。
[0073] (3)培养48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性。用 PerkinElmer多标记读板仪（Envison2102MultilabelReader)读取焚光信号。
[0074] (4)各组数据以不含药物对照组作为标准组进行计算，计算公式=药物组/未加药 物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。
[0075] 实验结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐在1000yg/mL对VERO细胞是没有毒性的， 结果见表1。
[0076] 2.2 1，6-二磷酸果糖钠盐杀ADV和EV71病毒活性检测。
[0077] (I)ADV和EV71-GFP病毒储存液与3倍梯度稀释的1，6-二磷酸果糖钠盐(终浓 度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、111yg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、1. 37yg/ mL)在37°C预孵育4小时。然后将病毒和药物混合样品稀释100倍后感染VERO细胞；对 照组则是病毒储存液与各浓度药物分别在37°C预孵育4小时，各稀释50倍后混匀立即感 染VERO细胞。
[0078] (2)病毒感染细胞在37°C培养1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病 毒和残留的药物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0079] (3)在37°C培养48小时后，通过高内涵检测并定量分析细胞病变（cytopathic effect，CPE)或是绿色荧光蛋白（GFP)的荧光强度，计算抑制率。抑制率（％)=(病毒孔荧 光强度-样品孔焚光强度）/病毒孔焚光强度* 100%。
[0080] 实验结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐不能灭活ADV和EV71。
[0081]实施例6 :1，6-二磷酸果糖钠盐对呼吸道合胞病毒的杀病毒活性检测。
[0082] 1 ?实验材料 1. 1细胞、病毒 Hep-2细胞为本实验室保存。
[0083] 呼吸道合胞病毒（RSV)由武汉大学馈赠。
[0084] 1.2试剂 DMEM培养基和FBS购自GIB⑶公司；Alamarblue和CelITiterGlo细胞活性检测试剂 盒购自Promega公司。
[0085] 1. 3实验仪器 多标记微孔板读取仪（PerkinElmer);高内涵细胞分析仪（PerkinElmer);细胞培养箱 为Thermo公司产品。
[0086] 2?实验方法与结果 2. 1 1，6-二磷酸果糖钠盐对H印-2细胞的细胞毒性检测。
[0087] (1)将Ifep-2细胞按照8XIO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，使用含有 10%FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基在37°C，5% 0)2的加湿培养箱中培养。
[0088] (2)用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/ml开始，2倍梯度依次稀释成9个 浓度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的H印-2细胞中，每组重复三个孔，置于37°C、5% 〇)2培养箱中培养。
[0089] (3)培养48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性。用 PerkinElmer多标记读板仪（Envison2102MultilabelReader)读取焚光信号。
[0090] (4)各组数据以不含药物对照组作为标准组进行计算，计算公式=药物组/未加药 物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。
[0091] 结果显示1，6-二磷酸果糖在1000 y g/mL对H印-2细胞是没有毒性的。
[0092] 2.2 1，6_二磷酸果糖钠盐杀呼吸道合胞病毒（RSV)活性检测。
[0093] (I)RSV病毒储存液与3倍梯度稀释的1，6_二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000 y g/mL、333 y g/mL、111y g/mL、37 y g/mL、12. 3 y g/mL、4. Iy g/mL、I. 37 y g/mL)在 37°C预孵育3小时，再将病毒和药物混合样品稀释100倍后感染Hep-2细胞(病毒感染滴 度为IOOTCID5ci);对照组则是病毒储存液与各浓度药物分别在37°C预孵育3小时，各稀释 50倍后混匀立即感染H印-2细胞。
[0094] (2)病毒感染细胞在33°C培养1小时后撤掉上清，细胞用PBS洗两遍，去掉未吸 附的病毒和残留的药物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0095] (3) 33°C继续培养96小时后，通过CellTiter-Glo检测细胞活性，计算细胞保护 率，进而得知1，6-二磷酸果糖钠盐对RSV杀病毒活性的抑制率。抑制率（％)=(样品孔-病 毒孔）/ (细胞孔-病毒孔）* 100%。
[0096] 实验结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐能剂量依赖地灭活呼吸道合胞病毒，1，6-二 磷酸果糖杀吸道合胞病毒的IC5tl为105yg/mL，结果见表1。
[0097]表I 1，6-二磷酸果糖钠盐对包膜病毒广谱杀病毒活性检测
IC5tl:抑制率为50%的药物浓度CC5tl:细胞毒性为50 %的药物浓度 实施例7 1，6_二磷酸果糖钠盐温度依赖的杀流感病毒活性检测。
[0098] 1 ?实验材料 I. 1细胞、病毒 狗肾细胞MDCK(ATCCCCL-34)由本实验室保存。A型流感病毒HlNl亚型（A/PuertoRico/8/1934)为本实验室保存，通过鸡胚扩增而得。10日龄鸡胚购自北京梅里亚维 通实验动物技术有限公司。
[0099] 1.2 试剂 DMEM培养基购自GIBCO公司；神经氨酸酶底物MUNANA购自Sigma-Aldrich。1，6_二 磷酸果糖钠盐购自阿拉丁。
[0100] 1.3实验仪器 多标记微孔板读取仪（PerkinElmer)为伯乐公司产品；细胞培养箱为Thermo公司产 品；电热恒温水槽购自上海一恒科技有限公司。
[0101] 2.实验方法与结果 (1)甲型流感病毒HlNl亚型（A/PuertoRico/8/1934) (6.5X105TCID5Q/ml)与 3 倍梯 度稀释的1，6_二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/ 1^、12.3 11§/1^)分别在41：、251：、371：、421：孵育4小时，然后将病毒与药物的混合物稀 释100倍后感染MDCK细胞。
[0102] (2)病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍去掉未吸附的病毒和残留的药 物，然后换为新鲜培养基在37°C继续培养。
[0103] (3) 24小时后，收集上清测定NA(神经氨酸酶）活性，计算抑制率。
[0104] 实验结果如图2所示，1，6_二磷酸果糖钠盐对流感病毒的杀病毒作用是温度依赖 的。在4°C的情况下，1，6_二磷酸果糖对流感病毒没有杀病毒作用。当温度为25°C时，1， 6_二磷酸果糖表现出较弱的杀病毒作用。然而，在37°C和42°C的情况下，1，6-二磷酸果糖 的杀病毒作用显著提高。
[0105] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以 限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含 在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 1，6-二磷酸果糖及其所形成的盐在制备防治人类包膜病毒感染的药物及病毒灭活 剂中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的人类包膜病毒是日本乙型脑炎病毒 (JEV)、登革病毒（DENV)、水泡性口炎病毒（VSV)、呼吸道合胞病毒（RSV)或流感病毒。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是以1，6-二磷酸果糖或其所形 成的盐作为药物活性成分，制成任何一种药学上可接受的剂型。
【专利摘要】本发明公开了一种1,6-二磷酸果糖及其所形成的盐在制备防治人类包膜病毒感染的药物及病毒灭活剂中的应用。我们通过检测1,6-二磷酸果糖钠盐预处理的人类多种常见病毒在细胞上的复制水平，评价了1,6-二磷酸果糖钠盐对人类多种病毒的杀病毒活性。结果显示1,6-二磷酸果糖钠盐对包膜病毒具有剂量依赖的杀病毒活性。实验证实1,6-二磷酸果糖钠盐的杀病毒作用是温度依赖的。1,6-二磷酸果糖是糖酵解中间代谢产物，同时又对代谢起到调节作用。该化合物能够灭活多种包膜病毒，具有开发成防治人类包膜病毒感染的药物及病毒灭活剂的广阔前景。
【IPC分类】A61K31/7024, A61P31/14, A61P31/12, C12N7/06, A61P31/16
【公开号】CN104906117
【申请号】CN201510283694
【发明人】陈绪林, 蒋良玉
【申请人】武汉威立得生物医药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，更具体涉及一种1，6-二磷酸果糖及其所形成的盐在 制备防治人类包膜病毒感染的药物及体外病毒灭活剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 包膜病毒的核衣壳外有一层来源于宿主细胞的囊膜。囊膜是包裹在基质蛋白之外 的一层磷脂双分子层膜，这层膜来源于宿主的细胞膜，其上还镶嵌着病毒特异性的包膜蛋 白。黄病毒科的登革病毒（DENV)和日本乙型脑炎病毒（JEV)、弹状病毒科的水泡性口炎病 毒（VSV)以及副粘病毒科的呼吸道合胞病毒（RSV)均为有包膜的病毒，都是常见的威胁人 类健康的重要病原体。
[0003] 登革病毒广泛流行于全球热带及亚热带的60多个国家和地区，每年超过1亿人受 感染，25亿以上的人受到威胁。登革热（denguefever)是登革热病毒引起、伊蚊传播的一 种急性传染病。临床特征为起病急骤，高热，全身肌肉、骨髓及关节痛，极度疲乏，部分患可 有皮瘆、出血倾向和淋巴结肿大。日本乙型脑炎（乙脑）是由日本乙型脑炎病毒引起的急性 人畜共患传染病，临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征等症状体征为特 点，病死率约为25%。登革热和乙脑由蚊虫媒介传播，流行于整个亚洲，主要在亚洲东部热 带、亚热带和温带国家。乙脑主要发生于夏秋季，儿童易患，发病率占80%以上，多为10岁 以下儿童。针对乙型脑炎病毒，目前虽有疫苗，但并没有特异的抗病毒治疗。乙型脑炎病毒 感染仍然是人类健康的一大威胁。流感病毒的传播速度快、传染性强以及短时间内即可引 起局部爆发甚至全球大流行，从发现至今一直都是全球关注的重点。20世纪，IAV共造成三 次大流行。其中1918-1920爆发的西班牙大流感影响最大，造成全球5000万人死亡。1997 年，高致病性禽流感出现在香港，因为家禽毁灭性的的爆发死亡和人类散在的感染，同时伴 随很高的死亡率，使人类陷入了极大的恐慌。这两类病原体虽然在传染源、传播途径以及致 病机理等方面完全不同，但都使人类健康受到威胁并带来经济损失。
[0004] 目前，临床上针对这些包膜病毒导致的疾病主要采用干扰素和利巴韦林进行抗 病毒治疗。然而，药物存在一定的副作用，并且不能完全治愈相关疾病。此外，这些药物的 长期使用致使病毒产生了许多耐药突变株。因此，急需开发新型安全有效的药物来预防或 灭活病毒感染。
[0005] 1，6_二磷酸果糖是糖酵解代谢途径重要的中间产物，同时对糖类、脂类的代谢又 可以起到调节作用，被视为一种代谢调节物和高能磷酸底物。在临床方面，1，6_二磷酸果 糖应用广泛，可用于心肌炎、心绞痛、心肌梗塞、休克、局部缺血缺氧的环境和肝炎的辅助治 疗。但是1，6-二磷酸果糖在病毒学领域的研宄仍然是一片空白。1，6-二磷酸果糖结构如 下：
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于弥补现有技术的不足，是在于提供了一种1，6_二磷酸果糖及 其所形成的盐在制备防治人类包膜病毒感染的药物及体外病毒灭活剂中的应用，从而为临 床上人类包膜病毒感染所致相关疾病的防治提供安全有效的措施。1，6_二磷酸果糖及其所 形成的盐在无毒性范围内能够有效地灭活包膜病毒的感染，可进一步开发为防治包膜病毒 引起的相关疾病的药物及体外病毒灭活剂，具有广泛的应用前景。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是： 一种1，6-二磷酸果糖及其所形成的盐在制备防治人类包膜病毒感染的药物及病毒灭 活剂中的应用。
[0008] 优选地，所述的包膜病毒为日本乙型脑炎病毒（JEV)、登革病毒（DENV)、呼吸道合 胞病毒（RSV)和甲型流感病毒（IAV)各亚型。
[0009] 包括以下步骤： 1. 1，6-二磷酸果糖钠盐杀包膜病毒活性检测，其步骤是： A. 1，6-二磷酸果糖钠盐对MDCK细胞、VERO细胞、BHhK-21细胞和H印-2细胞毒性实 验： MDCK细胞、VERO细胞、BHhK-21细胞和Ifep-2细胞按8XIO3个细胞/孔接种于96孔细 胞培养板中，细胞贴壁后备用。用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/mL开始，2倍梯度 依次稀释成9个浓度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的各种细胞中，每组重复三个孔， 置于37°C、5%CO2培养箱中培养。将加有药物的细胞置于37°C、5%CO2培养箱中培养48~96 小时后，采用Alamarblue活性检测试剂盒检测细胞的存活率。
[0010] 结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐对这些细胞的毒性很低，半数毒性浓度（CC5tl)在 2000yg/mL以上，安全性很好。
[0011] 1，6-二磷酸果糖钠盐对包膜病毒的杀病毒活性检测： (1)流感病毒液（6. 5XIO5TCID5Q/mL)与3倍梯度稀释的1，6-二磷酸果糖钠盐（终浓 度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、111yg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、1. 37yg/ mL)在37°C预孵育4小时，然后将混合物稀释100倍后感染MDCK细胞；对照组则是病毒储 存液与各药物分别在37°C预孵育4小时，各稀释50倍后混匀感染MDCK细胞。病毒感染细 胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的药物。然后换为新鲜培养 基在37°C继续培养24小时后，收集上清测定神经氨酸酶（NA)活性，计算抑制率。
[0012] (2)日本乙型脑炎病毒JEV-Luc液（8XIO6pfu/mL)和登革病毒DENV-Luc液 (4XIO7Pfu/mL)分别与3倍梯度稀释的1，6_二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为1000yg/mL、 333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、l. 37yg/mL)在 37°C预孵育 4 小时，再将病毒和药物混合样品稀释100倍后感染BHK-21细胞，37°C培养I小时。同样，细 胞用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的药物后，换为新鲜培养基继续培养48小时，检 测细胞荧光素酶活性，计算抑制率。
[0013] (3)水泡口膜炎病毒VSV-GFP病毒液（4X107pfu/mL)与3倍梯度稀释的1，6_二 磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、 4.Iyg/mL、l. 37yg/mL)在37°C预孵育4小时。将病毒和药物混合液稀释100倍后感染 BhK-21细胞，37°C培养1小时后撤掉上清。细胞用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的 药物，然后换为新鲜培养基。继续培养12小时后，通过高内涵成像检测并定量分析绿色荧 光蛋白的荧光强度，计算抑制率。
[0014] (4)人腺病毒（ADV)、肠道病毒71型（EV71-GFP)分别与3倍梯度稀释的1，6-二 磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、 4.Iyg/mL、l. 37yg/mL)在37°C预孵育4小时后，稀释100倍后以MOI=I和MOI=O. 2感染 VERO细胞。37°C培养1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的药物。 然后换为新鲜培养基继续培养48小时后，通过高内涵检成像系统测并定量分析细胞病变 (cytopathiceffect,CPE)或是绿色焚光蛋白的焚光强度，计算抑制率。
[0015] (5)呼吸道合胞病毒RSV与稀释好的1，6-二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、111yg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、I. 37yg/mL)在 37°C预孵育3小时后，稀释100倍后以IOOTCID5ci感染H印-2细胞。33°C培养I小时后撤掉 上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的药物。然后换为新鲜培养基在33°C继续培 养96小时后，通过CellTiter-Gl0试剂盒检测细胞活性，计算细胞保护率和药物对病毒的 抑制率。
[0016] 结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐对JEV、DENV、RSV和流感病毒等包膜病毒有剂量 依赖的杀病毒活性。然而，1，6_二磷酸果糖钠盐对无包膜病毒ADV和EV71却没有表现出 杀病毒活性。说明1，6_二磷酸果糖钠盐对包膜病毒具有广谱的杀病毒作用。
[0017] 2. 1，6-二磷酸果糖钠盐温度依赖的杀流感病毒活性检测，其步骤是： 甲型流感病毒[A/PuertoRico/8/34 (HlNl)]液（6. 5XIO5TCID5Q/mL)与 3 倍梯度稀 释的1，6-二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、 12. 3yg/mL)分别在4°C、25°C、37°C和42°C孵育4小时，然后将病毒与药物的混合物稀 释100倍后感染MDCK细胞。病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附 的病毒和残留的药物。然后换为新鲜培养基在37°C继续培养24小时后，收集上清测定NA 活性，计算抑制率。
[0018] 结果表明1，6-二磷酸果糖钠盐对流感病毒的杀病毒作用是温度依赖的。1，6-二 磷酸果糖钠盐在37°C和42°C灭活流感病毒效果强于4°C和25°C的灭活效果。
[0019] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 1.在临床上，1，6_二磷酸果糖钠盐被广泛用于心肌炎、心绞痛、心肌梗塞、局部缺血缺 氧和肝炎的辅助治疗，且为人体糖代谢途径的中间产物，对人体的毒副作用小。
[0020] 2. 1，6-二磷酸果糖钠盐在无毒性的条件下，能有效地灭活JEV、DENV、RSV和流感 病毒各亚型的感染，可制成广谱的抗病毒药物。
[0021] 3.利用现代常用药物制剂手段，可将1，6_二磷酸果糖钠盐作为活性成分制成片 剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂等任何一种药学上可接 受的剂型。
[0022] 4. 1，6-二磷酸果糖钠盐具有灭活病毒的功能，能制备成体外病毒灭活剂。
【附图说明】
[0023] 图1为1，6-二磷酸果糖化学结构式。
[0024] 图2为1，6-二磷酸果糖钠盐温度依 赖地杀流感病毒活性检测示意图。
【具体实施方式】
[0025] 为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本
【发明内容】
作进一步说 明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
[0026] 实施例1: 1，6_二磷酸果糖钠盐对各亚型流感病毒的杀病毒活性检测。
[0027] 1 ?实验材料 1. 1细胞、病毒 狗肾细胞MDCK(ATCCCCL-34)由本实验室保存。A型流感病毒HlNl亚型（A/PuertoRico/8/1934 和A/human/Hubei/1/2009)、H3N2 亚型（A/Human/Hubei/3/2005)、 H6N6 亚型（A/Duck/Hubei/5/2010)、H7N8 亚型（A/Duck/Hubei/ 216/ 1983)和HlNl亚型金 刚烷胺耐药株以/1111111&11/15以33(53謂)）均为本实验室保存，通过鸡胚扩增而得。10日龄鸡 胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
[0028] 1.2 试剂 DMEM培养基购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司；神经氨 酸酶底物MUNANA购自Sigma-Aldrich。1，6_二磷酸果糖钠盐购自阿拉丁。
[0029] 1.3实验仪器 多标记微孔板读取仪（PerkinElmer)为伯乐公司产品；细胞培养箱为Thermo公司产 品。
[0030] 2?实验方法与结果 2. I1，6-二磷酸果糖钠盐对MDCK细胞的细胞毒性检测。
[0031] (1)将MDCK细胞按照8XIO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用含有10% 胎牛血清（FBS)、lOOU/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞在37°C，5%C02加湿培 养箱中培养。
[0032] (2)用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/ml开始，2倍梯度依次稀释成9个浓 度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的MDCK细胞中，每组重复三个孔，置于37°C、5%CO2 培养箱中培养。
[0033] (3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性。用 PerkinElmer多标记读板仪（Envison2102MultilabelReader)读取焚光信号。
[0034] (4)各组数据以不含药物对照组作为标准组进行计算，计算公式=药物组/未加药 物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。
[0035] 利用步骤（4)中的计算结果，通过软件统计，统计结果见表1。结果显示1，6_二磷 酸果糖钠盐对MDCK细胞的细胞毒性的CC5tl为2800yg/mL。
[0036] 2.2 1，6_二磷酸果糖钠盐对各亚型流感病毒灭活效果的检测。
[0037] (I)A型流感病毒HlNl亚型（A/PuertoRico/8/1934 和A/Human/Hubei/1/2009)、 H3N2 亚型（A/Human/Hubei/3/2005)、H6N6 亚型（A/Duck/Hubei/5/2010)、H7N8 亚型（A/ Duck/Hubei/ 216/ 1983)和HlNl亚型金刚烷胺耐药株（A/Human/WSN/33(S31N))病毒储 存液分别与3倍梯度稀释的1，6_二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为1000yg/mL、333yg/mL、 111yg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、L37yg/mL)在 37°C预孵育 4 小时。然后将 病毒与药物的混合物稀释100倍后感染MDCK细胞；对照组则是病毒储存液与各浓度药物分 别在37°C预孵育4小时，各稀释50倍后混匀立即感染MDCK细胞。
[0038] (2)病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍去掉未吸附的病毒和残留的药 物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0039] (3)培养24小时后，收集上清测定NA(神经氨酸酶）活性，计算抑制率。
[0040] 结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐能剂量依赖地灭活流感病毒各亚型，通过软件统 计，1，6_二磷酸果糖对流感病毒各亚型的IC5tl为45~130yg/mL，结果见表1。
[0041] 实施例2 : 1，6_二磷酸果糖钠盐对登革病毒和日本乙型脑炎病毒的杀病毒活性 检测。
[0042] 1?实验材料 1. 1细胞和病毒 仓鼠肾细胞（BHK-21)为本实验室保存。
[0043] 日本乙型脑炎病毒（JEV-Luc)和登革病毒（DENV-Luc):为带有Rellina Iuciferase报告基因的日本乙型脑炎病毒和登革病毒，由中科院武汉病毒研宄所张波研宄 员馈赠。
[0044] 1.2 试剂 DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司； 焚光素酶检测试剂盒购自Promega公司。
[0045] 1. 3实验仪器 多标记微孔板读取仪（PerkinElmer);高内涵细胞分析仪（PerkinElmer);Megafuge?l.OR型冷冻离心机和细胞培养箱均为Thermo公司产品。
[0046] 2?实验方法与结果 2. 1 1，6-二磷酸果糖钠盐对BHK-21细胞的细胞毒性检测。
[0047] (1)将BHK-21细胞按照8XIO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，使用含有 10%FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基在37°C，5%C02的加湿培养箱中培养。
[0048] (2)用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/ml开始，2倍梯度依次稀释成9个 浓度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的BHK-21细胞中，每组重复三个孔，置于37°C、5% 〇)2培养箱中培养。
[0049] (3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性。用 PerkinElmer多标记读板仪（Envison2102MultilabelReader)读取焚光信号。
[0050] (4)各组数据以不含药物对照组作为标准组进行计算，计算公式=药物组/未加药 物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。
[0051] 步骤（4)中的计算结果，通过软件计算统计，结果见表1。结果显示1，6_二磷酸果 糖钠盐对BHK-21细胞的细胞毒性的CC5tl为7090yg/mL。 2. 2 1，6-二磷酸果糖钠盐对登革病毒和日本乙型脑炎病毒的杀病毒活性检测 (I)JEV-Luc(8X106pfu/ml)与DENV-Luc(4X106pfu/ml)分别与 3 倍梯度稀释 的 1,6-二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、 12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、I. 37yg/mL)在37°C预孵育4小时，再将病毒和药物混合样品稀 释100倍，后感染BHK-21细胞；对照组则是病毒储存液与各浓度药物分别在37°C预孵育4 小时，各稀释50倍后混匀立即感染BHK-21细胞。
[0052] (2)病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的 药物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0053] (3)在37°C培养48小时后，测定细胞内荧光素酶活性，计算抑制率。待测细胞用 PBS洗2遍，然后用Renilla荧光素酶检测试剂盒说明书的方法加入裂解液使细胞充分裂 解，然后将裂解样品加入稀释好的底物中，在荧光素酶检测仪上进行检测。计算公式为：抑 制率（％)= 100 -(样品孔-空白对照）/ (酶活对照-空白对照）* 100%。
[0054] 实验结果显示1，6_二磷酸果糖钠盐能剂量依赖地灭活日本乙型脑炎病毒和登革 病毒。1，6-二磷酸果糖钠盐对日本乙型脑炎病毒和登革病毒的IC5tl分别为112和6. 8yg/ mL,结果见表1。
[0055] 实施例3 : 1，6-二磷酸果糖钠盐对水泡性口炎病毒（VSV)的杀病毒活性检测。
[0056] 1 ?实验材料 1. 1细胞、病毒 仓鼠肾细胞（BHK-21)为本实验室保存。
[0057] VSV-GFP:为带有GFP报告基因的水泡性口炎病毒，由武汉大学陈明周教授馈赠。
[0058] 1.2 试剂 DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司。
[0059] 1. 3实验仪器 高内涵细胞分析仪（PerkinElmer);蔡司高级倒置显微镜AxioobserverAl(Carl Zeiss)〇
[0060] 2?实验方法与结果 2. 1 1，6-二磷酸果糖钠盐对BHK-21细胞的细胞毒性检测（见实施例2)。
[0061]2. 2 1，6-二磷酸果糖钠盐杀水泡性口炎病毒活性检测。
[0062] (I)VSV-GFP病毒储存液（4XIO7pfu/mL)与3倍梯度稀释的1，6-二磷酸果糖钠 盐(终浓度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、 I. 37yg/mL)在37°C预孵育4小时，再将病毒和药物混合样品稀释100倍后感染BhK-21 细胞；对照组则是病毒储存液与各浓度药物分别在37°C预孵育4小时，各稀释50倍后混匀 立即感染BHK-21细胞。
[0063] (2)病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病毒和残留的 药物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0064] (3)培养12小时后，通过高内涵检测并定量分析绿色荧光蛋白的荧光强度，计算 抑制率。抑制率（％)=(病毒孔荧光强度-样品孔荧光强度）/病毒孔荧光强度* 100%。 实验结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐能剂量依赖地灭活水泡性口炎病毒，1，6-二磷酸 果糖钠盐对水泡性口炎病毒的IC5tl为12yg/mL，结果见表1。
[0065] 实施例5 :1，6-二磷酸果糖钠盐对腺病毒ADV和肠道病毒EV71的杀病毒活性检 测。
[0066] 1 ?实验材料 1. 1细胞、病毒 VERO细胞为本实验室保存。 [0067] 腺病毒（Adenovirus)由中国科学院武汉病毒研宄所，微生物菌毒种资源与应用中 心馈赠。EV71-GFP病毒：以EV71-GFP质粒做模板，线性化后体外转录得到全基因组RNA，再 用脂质体转染VERO细胞后扩增得到具备感染性的病毒粒子。
[0068] 1.2 试剂 DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司。
[0069] 1.3实验仪器 高内涵细胞分析仪（PerkinElmer);蔡司高级倒置显微镜AxioobserverAl(Carl Zeiss)〇
[0070] 2?实验方法与结果 2. 1 1，6-二磷酸果糖钠盐对VERO细胞的细胞毒性检测。
[0071] (1)将VERO细胞按照8XIO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，使用含有10 % FBS、lOOU/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基在37°C，5% 0)2的加湿培养箱中培养。
[0072] (2)用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/ml开始，2倍梯度依次稀释成9个浓 度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的VERO细胞中，每组重复三个孔，置于37°C、5%CO2 培养箱中培养。
[0073] (3)培养48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性。用 PerkinElmer多标记读板仪（Envison2102MultilabelReader)读取焚光信号。
[0074] (4)各组数据以不含药物对照组作为标准组进行计算，计算公式=药物组/未加药 物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。
[0075] 实验结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐在1000yg/mL对VERO细胞是没有毒性的， 结果见表1。
[0076] 2.2 1，6-二磷酸果糖钠盐杀ADV和EV71病毒活性检测。
[0077] (I)ADV和EV71-GFP病毒储存液与3倍梯度稀释的1，6-二磷酸果糖钠盐(终浓 度分别为 1000yg/mL、333yg/mL、111yg/mL、37yg/mL、12. 3yg/mL、4.Iyg/mL、1. 37yg/ mL)在37°C预孵育4小时。然后将病毒和药物混合样品稀释100倍后感染VERO细胞；对 照组则是病毒储存液与各浓度药物分别在37°C预孵育4小时，各稀释50倍后混匀立即感 染VERO细胞。
[0078] (2)病毒感染细胞在37°C培养1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍，去掉未吸附的病 毒和残留的药物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0079] (3)在37°C培养48小时后，通过高内涵检测并定量分析细胞病变（cytopathic effect，CPE)或是绿色荧光蛋白（GFP)的荧光强度，计算抑制率。抑制率（％)=(病毒孔荧 光强度-样品孔焚光强度）/病毒孔焚光强度* 100%。
[0080] 实验结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐不能灭活ADV和EV71。
[0081]实施例6 :1，6-二磷酸果糖钠盐对呼吸道合胞病毒的杀病毒活性检测。
[0082] 1 ?实验材料 1. 1细胞、病毒 Hep-2细胞为本实验室保存。
[0083] 呼吸道合胞病毒（RSV)由武汉大学馈赠。
[0084] 1.2试剂 DMEM培养基和FBS购自GIB⑶公司；Alamarblue和CelITiterGlo细胞活性检测试剂 盒购自Promega公司。
[0085] 1. 3实验仪器 多标记微孔板读取仪（PerkinElmer);高内涵细胞分析仪（PerkinElmer);细胞培养箱 为Thermo公司产品。
[0086] 2?实验方法与结果 2. 1 1，6-二磷酸果糖钠盐对H印-2细胞的细胞毒性检测。
[0087] (1)将Ifep-2细胞按照8XIO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，使用含有 10%FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基在37°C，5% 0)2的加湿培养箱中培养。
[0088] (2)用培养基将1，6-二磷酸果糖钠盐从20mg/ml开始，2倍梯度依次稀释成9个 浓度，将含药物的培养基直接添加到贴壁的H印-2细胞中，每组重复三个孔，置于37°C、5% 〇)2培养箱中培养。
[0089] (3)培养48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性。用 PerkinElmer多标记读板仪（Envison2102MultilabelReader)读取焚光信号。
[0090] (4)各组数据以不含药物对照组作为标准组进行计算，计算公式=药物组/未加药 物*100。结果通过GraphPadPrism5软件计算出平均值和标准差。
[0091] 结果显示1，6-二磷酸果糖在1000 y g/mL对H印-2细胞是没有毒性的。
[0092] 2.2 1，6_二磷酸果糖钠盐杀呼吸道合胞病毒（RSV)活性检测。
[0093] (I)RSV病毒储存液与3倍梯度稀释的1，6_二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为 1000 y g/mL、333 y g/mL、111y g/mL、37 y g/mL、12. 3 y g/mL、4. Iy g/mL、I. 37 y g/mL)在 37°C预孵育3小时，再将病毒和药物混合样品稀释100倍后感染Hep-2细胞(病毒感染滴 度为IOOTCID5ci);对照组则是病毒储存液与各浓度药物分别在37°C预孵育3小时，各稀释 50倍后混匀立即感染H印-2细胞。
[0094] (2)病毒感染细胞在33°C培养1小时后撤掉上清，细胞用PBS洗两遍，去掉未吸 附的病毒和残留的药物，然后换为新鲜培养基继续培养。
[0095] (3) 33°C继续培养96小时后，通过CellTiter-Glo检测细胞活性，计算细胞保护 率，进而得知1，6-二磷酸果糖钠盐对RSV杀病毒活性的抑制率。抑制率（％)=(样品孔-病 毒孔）/ (细胞孔-病毒孔）* 100%。
[0096] 实验结果显示1，6-二磷酸果糖钠盐能剂量依赖地灭活呼吸道合胞病毒，1，6-二 磷酸果糖杀吸道合胞病毒的IC5tl为105yg/mL，结果见表1。
[0097]表I 1，6-二磷酸果糖钠盐对包膜病毒广谱杀病毒活性检测
IC5tl:抑制率为50%的药物浓度CC5tl:细胞毒性为50 %的药物浓度 实施例7 1，6_二磷酸果糖钠盐温度依赖的杀流感病毒活性检测。
[0098] 1 ?实验材料 I. 1细胞、病毒 狗肾细胞MDCK(ATCCCCL-34)由本实验室保存。A型流感病毒HlNl亚型（A/PuertoRico/8/1934)为本实验室保存，通过鸡胚扩增而得。10日龄鸡胚购自北京梅里亚维 通实验动物技术有限公司。
[0099] 1.2 试剂 DMEM培养基购自GIBCO公司；神经氨酸酶底物MUNANA购自Sigma-Aldrich。1，6_二 磷酸果糖钠盐购自阿拉丁。
[0100] 1.3实验仪器 多标记微孔板读取仪（PerkinElmer)为伯乐公司产品；细胞培养箱为Thermo公司产 品；电热恒温水槽购自上海一恒科技有限公司。
[0101] 2.实验方法与结果 (1)甲型流感病毒HlNl亚型（A/PuertoRico/8/1934) (6.5X105TCID5Q/ml)与 3 倍梯 度稀释的1，6_二磷酸果糖钠盐(终浓度分别为1000yg/mL、333yg/mL、lllyg/mL、37yg/ 1^、12.3 11§/1^)分别在41：、251：、371：、421：孵育4小时，然后将病毒与药物的混合物稀 释100倍后感染MDCK细胞。
[0102] (2)病毒感染细胞1小时后撤掉上清，用PBS洗两遍去掉未吸附的病毒和残留的药 物，然后换为新鲜培养基在37°C继续培养。
[0103] (3) 24小时后，收集上清测定NA(神经氨酸酶）活性，计算抑制率。
[0104] 实验结果如图2所示，1，6_二磷酸果糖钠盐对流感病毒的杀病毒作用是温度依赖 的。在4°C的情况下，1，6_二磷酸果糖对流感病毒没有杀病毒作用。当温度为25°C时，1， 6_二磷酸果糖表现出较弱的杀病毒作用。然而，在37°C和42°C的情况下，1，6-二磷酸果糖 的杀病毒作用显著提高。
[0105] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以 限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含 在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 1，6-二磷酸果糖及其所形成的盐在制备防治人类包膜病毒感染的药物及病毒灭活 剂中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的人类包膜病毒是日本乙型脑炎病毒 (JEV)、登革病毒（DENV)、水泡性口炎病毒（VSV)、呼吸道合胞病毒（RSV)或流感病毒。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是以1，6-二磷酸果糖或其所形 成的盐作为药物活性成分，制成任何一种药学上可接受的剂型。
【专利摘要】本发明公开了一种1,6-二磷酸果糖及其所形成的盐在制备防治人类包膜病毒感染的药物及病毒灭活剂中的应用。我们通过检测1,6-二磷酸果糖钠盐预处理的人类多种常见病毒在细胞上的复制水平，评价了1,6-二磷酸果糖钠盐对人类多种病毒的杀病毒活性。结果显示1,6-二磷酸果糖钠盐对包膜病毒具有剂量依赖的杀病毒活性。实验证实1,6-二磷酸果糖钠盐的杀病毒作用是温度依赖的。1,6-二磷酸果糖是糖酵解中间代谢产物，同时又对代谢起到调节作用。该化合物能够灭活多种包膜病毒，具有开发成防治人类包膜病毒感染的药物及病毒灭活剂的广阔前景。
【IPC分类】A61K31/7024, A61P31/14, A61P31/12, C12N7/06, A61P31/16
【公开号】CN104906117
【申请号】CN201510283694
【发明人】陈绪林, 蒋良玉
【申请人】武汉威立得生物医药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月29日
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