一种治疗h1n1型流感病毒感染的药物的制作方法
一种治疗h1n1型流感病毒感染的药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有机有效成分的医药制品，具体涉及含齐墩果烷型五环三萜类化合 物和酚酸类化合物的药物。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的呼吸道疾病，具有流行面广、传染性 强、发病率高等特点，在儿童、老人和高危人群中的死亡率较高。流感病毒是人类健康的一 大威胁。应对流感病毒的主要方式是疫苗和药物治疗。对可能大规模爆发的流感疫情来 讲，药物治疗是最好的控制流感病毒传播的手段。目前，抗流感病毒药物包括已在俄罗斯 上市的盐酸阿比朵尔和美国FDA批准的4个抗流感病毒药物，后者根据作用机制的不同分 为M2离子通道蛋白抑制剂和神经氨酸酶（NA)抑制剂。近年来，对抗流感病毒药物的研宄 取得了较大进展。M2离子通道蛋白抑制剂是最早上市的流感临床治疗药物，但存在神经毒 性，长期服用易产生耐药毒株和对B型流感无效等缺陷。目前抗病毒西药虽然品种较多，但 多数选择性低和不良反应较大，中药在抗病毒方面有其独特优点，不良反应相对较低，不易 形成耐药性。根据抗流感病毒途径可将中药分为两大类：一类具有直接抑制病毒作用，其中 大多数为清热解毒类中药，如金银花，鱼腥草，板蓝根，大青叶，黄芩，黄连等；而另一类通过 增强免疫细胞能力发挥间接抗流感病毒作用，如黄芪、丹参等都能诱生干扰素和免疫球蛋 白。研宄比较清楚的抗流感成分主要有两类：一是多酚类物质，不仅可抑制流感病毒蛋白质 和RNA合成，同时也可抑制流感病毒的吸附作用；另一类是黄酮类物质，能抑制流感病毒唾 液酸酶的活性和抑制膜融合作用。中药具有很好的抗病毒作用，既可直接杀死病毒而不伤 及机体组织，又可调动免疫防御系统的积极性，激发机体的主动免疫机制，增强免疫力，通 过主动防御间接发挥抗病毒作用。因而，中药在西药产生耐药性、病毒发生变异的情况下， 仍具有潜在治疗作用，具有更广泛的适应性和优越性；并且中草药在我国资源丰富，价格低 廉，展现了广阔的研宄与开发前景。因此，研制疗效确切、安全高效的治疗流感病毒感染的 药物十分必要。
[0003] 岗梅为冬青科植物梅叶冬青IlexAsprella(Hook,etArn. )Champ,exBenth?的 干燥根，主产于广东、广西等地，其性味苦、微甘，凉，有清热解毒，生津止渴，利咽消肿，散 瘀止痛之功效，用于治疗感冒发热，肺热咳嗽，热病津伤口渴，咽喉肿痛，跌打瘀痛等，也是 广东凉茶的常用原料之一。现代药理学研宄表明其有抗炎、抗病毒、强心等作用。王宁生 [ZHANGAL,QIY,LIBG,etal.PhenolicandIriterpeneglycosidesfromthestems ofIlexlitseaefolia[J].JNatProd, 2005, 68:1531-1535.]等报道，岗梅中有酚酸、皂 苷、甾体和生物碱等成分。公开还为CN101879200A的发明专利申请公开了一种岗梅抗流 感有效部位的制备方法，该方法所得到的一种岗梅抗流感有效部位为岗梅总皂苷，其中特 征性皂苷为赪酮留醇3-O-0-D-葡萄甙。但是，上述专利申请所述岗梅总皂苷治疗HlNl型 流感病毒感染的效果尚不够理想。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，该药物 可显著提高治疗HlNl型流感病毒感染的效果。
[0005] 本发明解决上述问题的技术方案为：
[0006] 一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，该药物由有效成分和医学可接受的辅料 组成，其特征在于，所述的有效成分由3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹 糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷和3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果 酸-28-0-0 -D-葡萄糖酯组成，二者的质量配比为3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡 酰氧基-芹糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷：3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟 基-齐墩果酸-28-0- 0 -D-葡萄糖酯=1:0. 5~1。
[0007] 本发明所述的3, 4, 5-三甲氧基苯酚-e-D-5-0-咖啡酰氧基-芹 糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷和3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果 酸-28-0-0-D-葡萄糖酯可以采用常规的方法从中药岗梅或其它植物中提取得到，也可以 由合成或其他方法制得。
[0008] 上述3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-0-0 -D-葡萄 糖酯的化学结构如下式（I)所示，上述3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0-D-5-O-咖啡酰氧基-芹 糖-(1- 6)-0-D-葡萄糖苷的化学结构如下式（II)所示，
[0011] 本发明所述药物的有效成分由从岗梅中分离出来的3,4, 5-三甲氧基苯 酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷和3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯 糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-0- -D-葡萄糖酯两个化合物单体组成，其抗HlNl 型流感病毒的效果显著。
【附图说明】
[0012] 图1本发明所述化合物I的IR图
[0013] 图2本发明所述化合物I的1H-NMR图
[0014] 图3本发明所述化合物I的13C-NMR图
[0015] 图4本发明所述化合物I的DEPT图
[0016] 图5本发明所述化合物I的HSQC图
[0017] 图6本发明所述化合物I的HMBC图
[0018] 图7本发明所述化合物II的1H-NMR图（500MHz)
[0019] 图8本发明所述化合物的II13C-NMR图（150MHz)
【具体实施方式】
[0020] 为了便于描述以下将化合物3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹 糖-(1 - 6) - 0 -D-葡萄糖苷简称为岗梅639酚酸，化合物3-0- 0 -L-硫酸化阿拉伯 糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-0-0 -D-葡萄糖酯简称为岗梅925皂苷。
[0021] 例1 (岗梅925皂苷的制备）
[0022] -、化合物的制备
[0023] (1)岗梅根药材20kg，粉碎成粗粉，加入8倍量体积浓度为70 %的乙醇，分4次冷 浸法提取，每次12h，合并4次提取液，减压回收乙醇，得到干燥的浸膏638g，浸膏加4L水使 悬浮，用12L的乙酸乙酯分3次萃取，每次静置lh，得乙酸乙酯萃取部位（185g)。
[0024] (2)乙酸乙酯萃取部位溶解，过AB-8大孔树脂，用蒸馏水洗脱至没有颜色，再依次 用4倍柱体积（? 15X61cm)体积浓度为20 %、50 %、70 %、95 %的乙醇梯度洗脱，收集50 % 乙醇洗脱部位减压回收溶剂，得岗梅总皂苷提取物86g，总皂苷含量89. 73%。
[0025](3)取400g0DS-C18反相硅胶，甲醇适量充分溶胀，装柱，用适量甲醇溶解，过硅胶 柱，依次用3倍柱体积的体积浓度分别为20%，30%，40%，50%，60%，70 %的甲醇梯度 洗脱，洗脱液浓缩，体积浓度为10%的硫酸乙醇TLC显色，取50%洗脱部位，反复过硅胶柱， 纯化得化合物岗梅925-皂苷（47. 2mg)，结晶反复溶解，重结晶得纯品化合物。
[0026] 二、化合物的鉴定
[0027] 本例得到的化合物，为无色针状结晶（甲醇）。UVXmax(MeoH)nm:202, 10%硫酸 乙醇溶液显紫红色（TLC)，Liebermann-Burehard及Molish反应均为阳性，推测该化合物为 三萜皂苷类化合物。IR(KBr) :Vmax3438, 2942, 2886, 1728, 1637, 1460, 1388, 1229, 1072, 1 017,913,825,589〇11'HR-ESI-MS:准分子离子峰为m/z925[M-H]-，子离子m/z845 为[M-H- 80]-结合和红外1229, 1072, 1017cm-l强吸收峰，推断含SO3，子离子m/z763为[M-H- 162]-推断出结构中含糖，元素分析测定结果显示，该化合物含硫为6. 610%，推测该 化合物的结构式为C41H66019S2。IR图见图1。
[0028] 本例得到的化合物的IH-NMR(图2)谱中显示出苷元上的七个甲基质子信号为SH I. 21，0. 96, 0? 85, 1. 13, 1. 62, 1. 15, 0? 98(各 3H，s, 7XCH3)。13CNMR(图 3)中给出 41 个C 信号，8个季碳信号，SC177. 2为酯羰基C-28,SC123.6, 144. 2为烯碳信号， 同时结合DEPT 谱（图4)是可以看出123. 6为CH信号，所以归属为C-12，SC144. 2归属为C-13，1H-NMR 谱中显示出两个糖残基质子的信号SH4. 68，d(7. 2)，6. 37，d(7. 9)，结合13CNMR和DEPT 谱中6(：106.4,73.9,82.4,74.7,63.9(仲碳）五碳糖结合文献信息除6082.4外其余与 0-D-阿拉伯糖类似，SC88. 7 为3位上苷化连氧碳，SC95.8, 74. 1，78.8, 71.0, 79. 2,62. 1 为28位羰基所连的糖与0-D-葡萄糖数据信息类似。综合以上信息，推断该化合物为还有 两个糖基的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物。
[0029] 该化合物的HSQC谱（见图5)根据IDNMR推出SC123. 6为C-12,结合HSQC有 8 115.50与8(：123.6有交叉峰，归属8 115.50为11-12，而8 115.50〇1-12)与8 111.95相 关，则可将SH1.95归属为H-11,再由HSQC归属SC24. 1为C-ll。SH1.95(H-11)与 SHL76 相关，可归属SHL76 为H-9,结合HSQC,归属SC48. 2 为C-9。SH4. 50 (H-3)与 SHL76相关，则归属SHL76为H-2,结合HSQC,有SHL76与SC26. 4有交叉峰，则归 属SC26.4 为C-2。
[0030]HMBC谱分析图谱见图 6,SH5. 50(H-12)与SC42. 0、48. 2(C-9)远程相关，结 合DEPT谱，SC24.1 归属为C-11,SC42.0 归属为C-14，。8113.52〇1-18)，3.58〇1-19)与 SC46.4(C-17)远程相关，结合DEPT谱，SC44.5 归属为C-18，SC，80.9 归属为C-19。 由HSQC中，有SHO. 96 与SC16. 7(C-24)交叉峰，可归属SHO. 96 为H-24 ;SHL21 与 SC28. 0 (C-23)交叉峰，可归属SHL21为H-23。HMBC谱显示SHL21甲基氢（H-23)与 8〇88.7、39.4、55.8、16.7远程相关，结合0￡?!'谱，8 088.7归属为〇3,8 039.4归属为 C-4。同时也可看到S〇. 96甲基氢（H-24)与C-3,C-4,C-5,C-23存在远程相关。SHO. 85 甲基氢（H-25)与SC33. 1、40. 1、48. 2、24. 1 相关，结合DEPT谱，SC33. 1，24. 1 归属为 07,011，8〇40.1、40.1可归属为08、(：-9,8(：17.5归属为(：-26。8 111.62甲基氢与 8〇40.1、144.2((：-13)、42.0、29.0远程相关，8 111.15为甲基氢〇1-29)，结合腫8(：谱，与 SC80. 9, 35. 5, 28. 9, 28. 7存在远程相关，则SC80. 9归属为C-19含磺酸基向低场移动，结 合DEPT谱SC35. 5,28. 9归属为C-20，C-21。综合以上结构信息得出该化合物的结构如式 (I)所示的岗梅925皂苷。
[0031] 例2(岗梅639酚酸的制备）
[0032] 一、化合物的制备
[0033] (1)岗梅根粗粉20kg，按照所得优化提取工艺，加入10倍量体积浓度为54%的乙 醇，分次回流提取，每次88min，取滤液，浓缩并回收乙醇得浸膏（385g)，并加水溶解；
[0034] (2)取适量经预处理的X-5大孔吸附树脂，以体积浓度为40%的乙醇为洗脱剂，洗 脱流速为2mL/min，得到40%大孔树脂洗脱部位岗梅酚酸提取物（86g)。
[0035] (3)利用ODS柱色谱进行粗分离，以体积浓度分别为30%，40%，50%，60%的甲醇 洗脱，得到24个流分。TLC及液相进行检测、合并，得到9个流分，流分4过凝胶Sephadex LH-20柱，以甲醇-0. 1%甲酸（l:lv/v)洗脱，最后采用高效半制备液相纯化得到岗梅 639-酚酸化合物（29mg)，结晶反复溶解，重结晶得纯品化合物。其中，所述的甲醇-0. 1 %甲 酸是体积浓度为〇. 1 %的甲酸与甲醇等比混合的混合溶液。
[0036] 二、化合物的鉴定
[0037] 本例得到的化合物分离为浅黄色粉末，HR-ESI-MSm/z639. 1925[M-H]_.确定其 分子式为C29H36O16，不饱和度为12。经检测，其1H-NMR、13C-NMR数据如下：
[0038]1H-Nmr(SoomHzJMSO)S /ppm:7. 50 (1H，d，J=15. 9Hz)，6.27 (1H，d，J=15. 9Hz)， 7. 06 (1H,d,J= 2. 2Hz), 7. 01 (1H,d,J= 8. 1Hz), 6. 76 (1H,dd,J= 2. 2, 8. 1Hz), 3. 73 (6H,s) and3. 57 (3H,s), 4. 86 (1H,d,J= 2. 9Hz)and4. 80 (1H,d,J= 7. 6Hz),
[0039]13C-NMR(125MHz，DMSO)S/ppm:125. 6(C-1), 116. 0(C-2), 145. 9(C-3), 148. 8(C-4) ，113.8 (C-5)，121.6 (C-6)，145.7 (C-7)，115.I(C-8)，166.7 (C-9)，154.I(C-I) ,94.6 (C-2, 6 )，153. 3 (C-3, 5)，132. 8 (C-4)，60. 3 (4-0CH3)，56. 0 (3, 5-0CH3)，101. 0 (C-I)，75. 6 (C-2)，76. 9 (C-3)，70. 2 (C-4)，76. 7 (C-5)，67. 9 (C-6)，108. 8 (C-I)，73. 3 (C-2)，77. 2 (C-3)，73. 5 (C-4) ,66. 0(C-5)
[0040] 参见附图7、8,1H-NMR中显示有一对反式烯质子7.50(1?d，J= 15. 9Hz)，6. 27 (1H,d,J= 15. 9Hz)，3 个苯环质子 7. 06 (1H,d,J= 2. 2Hz)，7. 01 (1H,d,J= 8. 1Hz), 6. 76(1H,dd,J= 2. 2, 8. 1Hz)，3个甲基质子3. 73(6H,s), 3. 57(3H,s)，2个糖端基质 子 4. 86 (1H,d,J= 2. 9Hz)，4. 80 (1H,d,J= 7. 6Hz)。由 13C-NMR中含有咖啡酰基125.6(0 1), 116. 0(C-2), 145. 9 (C-3), 148. 8 (C-4), 113. 8 (C-5), 121. 6 (C-6), 145. 7(C-7), 115.I(C-8)，166. 7(C-9)，3, 4, 5-trimethoxyphenoxy154.I(C-I)，94. 6(C-2, 6)，153. 3 (C-3, 5)，132 ? 8 (C-4)，60. 3 (4-0CH3)，56. 0 (3, 5-0CH3)，2 个苷化糖基包括D-葡萄糖基 101. 0 (C-I)，75. 6 (C-2)，76.9 (C_3)，7〇. 2 (C-4)，76.7 (C-5)，67.9 (C-6)和D-芹菜糖基 1〇8. 8 (C-I)，73.3 (C-2 )，77. 2 (C-3)，73. 5 (C-4)，66. 0 (C-5)，由上述特征初步推测此结构为酚酸类化合物。根据文 献[NobutoshiTanaka,ThreeNewHemiterpeneGlycosidesfromIlexmacropoda,Chem, Pharm，45 (9) 1533-1535 (1997)]，鉴定本例制得的化合物为结构式（II)式所示的岗梅639 酚酸，其名称为3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹糖-(1 - 6) - 0 -D-葡萄 糖昔（3, 4, 5_trimethoxyhpenol0 -D_5_0_CafTeoyl_apiofu;ranosyl_ (1 一 6) _ 0 _D_glucop yranoside)〇
[0041] 例3 :(颗粒剂）
[0042] 取实施例1制得的岗梅925皂苷8g和实施例2制得的岗梅639酚酸12g，加入 300g淀粉、200g蔗糖、混合均匀，制软材，以18目筛制粒，60°C干燥后lh，20目整粒，分装成 4g每袋的颗粒剂130袋供口服使用。
[0043] 例4:(胶囊剂）
[0044] 取实施例1制得的岗梅925皂苷155mg和实施例2制得的岗梅639酚酸155mg，加 入6000mg微晶纤维素、5000mg羧甲基淀粉钠、4000mg十二烷基硫酸钠等辅料充分混合，采 用辊压法进行干法制粒，再与适量硬脂酸镁混匀，填充入3#空心 胶囊，制成100粒的胶囊剂 供口服使用。
[0045] 例 5 :(片剂）
[0046] 取实施例1制得的岗梅925皂苷167mg和实施例2制得的岗梅639酚酸334mg，加 入4000mg淀粉、2500mg交联PVP、3000mg羧甲基淀粉钠混合均匀，用5 %PVP的75 %乙醇溶 液作为粘合剂，制软材，以18目筛制粒，60°C干燥后lh，20目整粒后加入适量滑石粉，混匀， 压片，制成规格为IOOmg/片的片剂100片供口服使用。
[0047] 例6(药理、药效实验）
[0048] 实验岗梅639酚酸联合岗梅925皂苷抑制HlNl型流感病毒的作用
[0049] 实验目的：探讨岗梅提取的酚酸和皂苷对HlNl型流感病毒感染的狗肾细胞 (MDCK)形态及生长的影响，并与不同岗梅酚酸和皂苷比例产生的药效进行比较。
[0050]1.实验材料
[0051] I. 1细胞株狗肾细胞（MDCK)，引自广医呼研所病毒室，Tll代。本室冻存保种。
[0052] 1. 2实验组及其对应的受试药物
[0053] 岗梅皂苷与酚酸分别按1:1、1:2、2:3比例进行混合。
[0054] 1. 3试剂和仪器新生小牛血清及DMEM培养基（Gibco公司）；DMSO(广州市康洋化 工有限公司）；胰蛋白酶（美国DIFCO公司；上海生工生物工程公司代理）。OlympusPM-6 倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；；E-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；BP221S 电子分析天平（上海精密仪器表有限公司）。
[0055] 2?方法
[0056] 2. 1岗梅单体组合物在MDCK细胞上毒性浓度的测定
[0057] 常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细 胞浓度为I.OXIO5个/mL，以0.ImL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单 层后，岗梅单体组合物按岗梅酚酸和岗梅皂苷不同比例分为3个组，组合物1比例为岗梅皂 苷：岗梅酚酸=1 :1 ;组合物2比例为岗梅皂苷：岗梅酚酸=1 :2 ;组合物3比例为岗梅皂 苷：岗梅酚酸=2 :3每个组合物接种4个复孔，设置酚酸组、皂苷组，同时设置正常对照组 和利巴韦林组，细胞置于35°C培养箱中继续培养4天。4天后终止实验，以显微镜观察药物 致细胞病变法（CPE法）判断待测样品对细胞的毒性作用。
[0058] 2. 2岗梅单体组合物MDCK上对HlNl型流感病毒抑制作用的测定（CPE法）
[0059] 常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细 胞浓度为I. 〇XIO5个/mL，以0.ImL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单层 后，弃上清液加入用含2%小牛血清的DMEM培养基稀释的各浓度药物0.lmL。分组如2. 1， 同时攻击IOOTCID5ci病毒悬液0.lmL，于35°C吸附2h后，弃上清。重新加入相应浓度的含药 培养基继续培养4天。终止实验后，以CPE观察法判断待测样品对病毒的抑制作用。实验 过程中同时设阳性药物利巴韦林对照、病毒对照和正常细胞对照。
[0060] 2. 3岗梅单体组合物MDCK上对HlNl型流感病毒抑制作用的测定（鸡红细胞凝集 法）
[0061] 常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细 胞浓度为I.OxIO5个/mL，以0.ImL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单层 后，弃上清液加入用含2%小牛血清的DMEM培养基稀释的各浓度药物0.lmL。分组如2. 1， 同时攻击IOOTCID5ci病毒悬液0.lmL，于35°C吸附2h后，弃上清。重新加入相应浓度的含 药培养基继续培养4天。终止实验后，以鸡红血球凝集法判断待测样品对病毒的抑制作用。 实验过程中同时设阳性药物利巴韦林对照、病毒对照和正常细胞对照。
[0062] 3?结果
[0063] 3. 1岗梅单体组合物对MDCK狗肾细胞毒性作用的测定
[0064] 表1不同岗梅单体组合物体外毒性浓度的测定
[0065]
[0066] 注：一为细胞生长正常，无病变出现；
[0067] 土为细胞病变少于整个单层细胞的10% ;
[0068] +为细胞病变约占整个单层细胞的25%;
[0069] ++为细胞病变约占整个单层细胞的50%;
[0070] +++为细胞病变约占整个单层细胞的75% ;
[0071] ++++为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。
[0072] 3. 2岗梅单体组合物对MDCK狗肾细胞抗病毒作用的测定
[0073] 表2不同岗梅单体组合物体外抗病毒作用（CPE观察法）
[0074]
[0075] 注：一为细胞生长正常，无病变出现；
[0076] 土为细胞病变少于整个单层细胞的10% ;
[0077] +为细胞病变约占整个单层细胞的25%;
[0078] ++为细胞病变约占整个单层细胞的50% ;
[0079] +++为细胞病变约占整个单层细胞的75% ;
[0080] ++++为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。
[0081] 3. 3岗梅单体组合物对HlNl型流感病毒的抑制作用
[0082] 表3不同岗梅单体组合物抗HlNl型流感病毒的抑制作用（鸡红细胞凝集法）
[0083]
[0084] 注：# :显示鸡红血球凝结程度达75%以上，表示药物对病毒无抑制作用。
[0085] +++ :表示50-75 %鸡红血球发生凝集；
[0086] ++ :表示25 % -50 %的鸡红细胞发生凝集；
[0087] + :表示小于25%的细胞发生病变；
[0088] -:显示鸡红血球不发生凝集，表示药物对病毒有抑制作用。
[0089] 4.结论
[0090] 结果表明岗梅皂苷单体和酚酸单体在药物浓度为5mg/mL及以下浓度无细胞毒 性，岗梅单体组合物1、2、3在药物浓度为lOmg/mL及以下浓度时无细胞毒性，表明药物组合 后毒性没有增加。
[0091] 由结果3. 2可以看出岗梅皂苷单体和酚酸单体抗病毒的最低有效浓度明显要高 于岗梅单体组合物1、2、3的抗病毒最低有效浓度，表明药物组合后抗病毒作用有增效。其 中组合物2的效果最好。同时红细胞凝集实验也证实了药物组合后疗效增强。
[0092] 结果表明岗梅单体组合物1、2和3即岗梅酚酸和岗梅皂苷的比值在1:0. 5~1在 无毒浓度下对HlNl型流感病毒具有很好的抑制作用。
【主权项】
1. 一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，该药物由有效成分和医学可接受的辅料 组成，其特征在于，所述的有效成分由3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹 糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷和3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果 酸-28-0-0 -D-葡萄糖酯组成，二者的质量配比为3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡 酰氧基-芹糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷：3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟 基-齐墩果酸-28-0- 0 -D-葡萄糖酯=1:0. 5~1。2. 根据权利要求1所述的一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，其特征在于，所述的 有效成分在药物中的重量百分含量为2%~5%。3. 根据权利要求1或2所述的一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，其特征在于，所 述的药物是颗粒剂、口服片剂或胶囊剂。
【专利摘要】本发明涉及含有机有效成分的医药制品，具体涉及一种治疗H1N1型流感病毒感染单体组合物，该有效成分由3,4,5-三甲氧基苯酚-β-D-5-O-咖啡酰氧基-芹糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷和3-O-β-L-硫酸化阿拉伯糖-19-O-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖酯组成，二者的质量配比为3,4,5-三甲氧基苯酚-β-D-5-O-咖啡酰氧基-芹糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷︰3-O-β-L-硫酸化阿拉伯糖-19-O-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖酯＝1:0.5～1。本发明所述的治疗H1N1型流感病毒感染的治疗效果显著。
【IPC分类】A61K31/704, A61P31/16, A61K31/7034
【公开号】CN104906118
【申请号】CN201510332559
【发明人】李耿, 赖小平
【申请人】广州中医药大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月16日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有机有效成分的医药制品，具体涉及含齐墩果烷型五环三萜类化合 物和酚酸类化合物的药物。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的呼吸道疾病，具有流行面广、传染性 强、发病率高等特点，在儿童、老人和高危人群中的死亡率较高。流感病毒是人类健康的一 大威胁。应对流感病毒的主要方式是疫苗和药物治疗。对可能大规模爆发的流感疫情来 讲，药物治疗是最好的控制流感病毒传播的手段。目前，抗流感病毒药物包括已在俄罗斯 上市的盐酸阿比朵尔和美国FDA批准的4个抗流感病毒药物，后者根据作用机制的不同分 为M2离子通道蛋白抑制剂和神经氨酸酶（NA)抑制剂。近年来，对抗流感病毒药物的研宄 取得了较大进展。M2离子通道蛋白抑制剂是最早上市的流感临床治疗药物，但存在神经毒 性，长期服用易产生耐药毒株和对B型流感无效等缺陷。目前抗病毒西药虽然品种较多，但 多数选择性低和不良反应较大，中药在抗病毒方面有其独特优点，不良反应相对较低，不易 形成耐药性。根据抗流感病毒途径可将中药分为两大类：一类具有直接抑制病毒作用，其中 大多数为清热解毒类中药，如金银花，鱼腥草，板蓝根，大青叶，黄芩，黄连等；而另一类通过 增强免疫细胞能力发挥间接抗流感病毒作用，如黄芪、丹参等都能诱生干扰素和免疫球蛋 白。研宄比较清楚的抗流感成分主要有两类：一是多酚类物质，不仅可抑制流感病毒蛋白质 和RNA合成，同时也可抑制流感病毒的吸附作用；另一类是黄酮类物质，能抑制流感病毒唾 液酸酶的活性和抑制膜融合作用。中药具有很好的抗病毒作用，既可直接杀死病毒而不伤 及机体组织，又可调动免疫防御系统的积极性，激发机体的主动免疫机制，增强免疫力，通 过主动防御间接发挥抗病毒作用。因而，中药在西药产生耐药性、病毒发生变异的情况下， 仍具有潜在治疗作用，具有更广泛的适应性和优越性；并且中草药在我国资源丰富，价格低 廉，展现了广阔的研宄与开发前景。因此，研制疗效确切、安全高效的治疗流感病毒感染的 药物十分必要。
[0003] 岗梅为冬青科植物梅叶冬青IlexAsprella(Hook,etArn. )Champ,exBenth?的 干燥根，主产于广东、广西等地，其性味苦、微甘，凉，有清热解毒，生津止渴，利咽消肿，散 瘀止痛之功效，用于治疗感冒发热，肺热咳嗽，热病津伤口渴，咽喉肿痛，跌打瘀痛等，也是 广东凉茶的常用原料之一。现代药理学研宄表明其有抗炎、抗病毒、强心等作用。王宁生 [ZHANGAL,QIY,LIBG,etal.PhenolicandIriterpeneglycosidesfromthestems ofIlexlitseaefolia[J].JNatProd, 2005, 68:1531-1535.]等报道，岗梅中有酚酸、皂 苷、甾体和生物碱等成分。公开还为CN101879200A的发明专利申请公开了一种岗梅抗流 感有效部位的制备方法，该方法所得到的一种岗梅抗流感有效部位为岗梅总皂苷，其中特 征性皂苷为赪酮留醇3-O-0-D-葡萄甙。但是，上述专利申请所述岗梅总皂苷治疗HlNl型 流感病毒感染的效果尚不够理想。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，该药物 可显著提高治疗HlNl型流感病毒感染的效果。
[0005] 本发明解决上述问题的技术方案为：
[0006] 一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，该药物由有效成分和医学可接受的辅料 组成，其特征在于，所述的有效成分由3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹 糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷和3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果 酸-28-0-0 -D-葡萄糖酯组成，二者的质量配比为3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡 酰氧基-芹糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷：3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟 基-齐墩果酸-28-0- 0 -D-葡萄糖酯=1:0. 5~1。
[0007] 本发明所述的3, 4, 5-三甲氧基苯酚-e-D-5-0-咖啡酰氧基-芹 糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷和3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果 酸-28-0-0-D-葡萄糖酯可以采用常规的方法从中药岗梅或其它植物中提取得到，也可以 由合成或其他方法制得。
[0008] 上述3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-0-0 -D-葡萄 糖酯的化学结构如下式（I)所示，上述3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0-D-5-O-咖啡酰氧基-芹 糖-(1- 6)-0-D-葡萄糖苷的化学结构如下式（II)所示，
[0011] 本发明所述药物的有效成分由从岗梅中分离出来的3,4, 5-三甲氧基苯 酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷和3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯 糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-0- -D-葡萄糖酯两个化合物单体组成，其抗HlNl 型流感病毒的效果显著。
【附图说明】
[0012] 图1本发明所述化合物I的IR图
[0013] 图2本发明所述化合物I的1H-NMR图
[0014] 图3本发明所述化合物I的13C-NMR图
[0015] 图4本发明所述化合物I的DEPT图
[0016] 图5本发明所述化合物I的HSQC图
[0017] 图6本发明所述化合物I的HMBC图
[0018] 图7本发明所述化合物II的1H-NMR图（500MHz)
[0019] 图8本发明所述化合物的II13C-NMR图（150MHz)
【具体实施方式】
[0020] 为了便于描述以下将化合物3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹 糖-(1 - 6) - 0 -D-葡萄糖苷简称为岗梅639酚酸，化合物3-0- 0 -L-硫酸化阿拉伯 糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-0-0 -D-葡萄糖酯简称为岗梅925皂苷。
[0021] 例1 (岗梅925皂苷的制备）
[0022] -、化合物的制备
[0023] (1)岗梅根药材20kg，粉碎成粗粉，加入8倍量体积浓度为70 %的乙醇，分4次冷 浸法提取，每次12h，合并4次提取液，减压回收乙醇，得到干燥的浸膏638g，浸膏加4L水使 悬浮，用12L的乙酸乙酯分3次萃取，每次静置lh，得乙酸乙酯萃取部位（185g)。
[0024] (2)乙酸乙酯萃取部位溶解，过AB-8大孔树脂，用蒸馏水洗脱至没有颜色，再依次 用4倍柱体积（? 15X61cm)体积浓度为20 %、50 %、70 %、95 %的乙醇梯度洗脱，收集50 % 乙醇洗脱部位减压回收溶剂，得岗梅总皂苷提取物86g，总皂苷含量89. 73%。
[0025](3)取400g0DS-C18反相硅胶，甲醇适量充分溶胀，装柱，用适量甲醇溶解，过硅胶 柱，依次用3倍柱体积的体积浓度分别为20%，30%，40%，50%，60%，70 %的甲醇梯度 洗脱，洗脱液浓缩，体积浓度为10%的硫酸乙醇TLC显色，取50%洗脱部位，反复过硅胶柱， 纯化得化合物岗梅925-皂苷（47. 2mg)，结晶反复溶解，重结晶得纯品化合物。
[0026] 二、化合物的鉴定
[0027] 本例得到的化合物，为无色针状结晶（甲醇）。UVXmax(MeoH)nm:202, 10%硫酸 乙醇溶液显紫红色（TLC)，Liebermann-Burehard及Molish反应均为阳性，推测该化合物为 三萜皂苷类化合物。IR(KBr) :Vmax3438, 2942, 2886, 1728, 1637, 1460, 1388, 1229, 1072, 1 017,913,825,589〇11'HR-ESI-MS:准分子离子峰为m/z925[M-H]-，子离子m/z845 为[M-H- 80]-结合和红外1229, 1072, 1017cm-l强吸收峰，推断含SO3，子离子m/z763为[M-H- 162]-推断出结构中含糖，元素分析测定结果显示，该化合物含硫为6. 610%，推测该 化合物的结构式为C41H66019S2。IR图见图1。
[0028] 本例得到的化合物的IH-NMR(图2)谱中显示出苷元上的七个甲基质子信号为SH I. 21，0. 96, 0? 85, 1. 13, 1. 62, 1. 15, 0? 98(各 3H，s, 7XCH3)。13CNMR(图 3)中给出 41 个C 信号，8个季碳信号，SC177. 2为酯羰基C-28,SC123.6, 144. 2为烯碳信号， 同时结合DEPT 谱（图4)是可以看出123. 6为CH信号，所以归属为C-12，SC144. 2归属为C-13，1H-NMR 谱中显示出两个糖残基质子的信号SH4. 68，d(7. 2)，6. 37，d(7. 9)，结合13CNMR和DEPT 谱中6(：106.4,73.9,82.4,74.7,63.9(仲碳）五碳糖结合文献信息除6082.4外其余与 0-D-阿拉伯糖类似，SC88. 7 为3位上苷化连氧碳，SC95.8, 74. 1，78.8, 71.0, 79. 2,62. 1 为28位羰基所连的糖与0-D-葡萄糖数据信息类似。综合以上信息，推断该化合物为还有 两个糖基的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物。
[0029] 该化合物的HSQC谱（见图5)根据IDNMR推出SC123. 6为C-12,结合HSQC有 8 115.50与8(：123.6有交叉峰，归属8 115.50为11-12，而8 115.50〇1-12)与8 111.95相 关，则可将SH1.95归属为H-11,再由HSQC归属SC24. 1为C-ll。SH1.95(H-11)与 SHL76 相关，可归属SHL76 为H-9,结合HSQC,归属SC48. 2 为C-9。SH4. 50 (H-3)与 SHL76相关，则归属SHL76为H-2,结合HSQC,有SHL76与SC26. 4有交叉峰，则归 属SC26.4 为C-2。
[0030]HMBC谱分析图谱见图 6,SH5. 50(H-12)与SC42. 0、48. 2(C-9)远程相关，结 合DEPT谱，SC24.1 归属为C-11,SC42.0 归属为C-14，。8113.52〇1-18)，3.58〇1-19)与 SC46.4(C-17)远程相关，结合DEPT谱，SC44.5 归属为C-18，SC，80.9 归属为C-19。 由HSQC中，有SHO. 96 与SC16. 7(C-24)交叉峰，可归属SHO. 96 为H-24 ;SHL21 与 SC28. 0 (C-23)交叉峰，可归属SHL21为H-23。HMBC谱显示SHL21甲基氢（H-23)与 8〇88.7、39.4、55.8、16.7远程相关，结合0￡?!'谱，8 088.7归属为〇3,8 039.4归属为 C-4。同时也可看到S〇. 96甲基氢（H-24)与C-3,C-4,C-5,C-23存在远程相关。SHO. 85 甲基氢（H-25)与SC33. 1、40. 1、48. 2、24. 1 相关，结合DEPT谱，SC33. 1，24. 1 归属为 07,011，8〇40.1、40.1可归属为08、(：-9,8(：17.5归属为(：-26。8 111.62甲基氢与 8〇40.1、144.2((：-13)、42.0、29.0远程相关，8 111.15为甲基氢〇1-29)，结合腫8(：谱，与 SC80. 9, 35. 5, 28. 9, 28. 7存在远程相关，则SC80. 9归属为C-19含磺酸基向低场移动，结 合DEPT谱SC35. 5,28. 9归属为C-20，C-21。综合以上结构信息得出该化合物的结构如式 (I)所示的岗梅925皂苷。
[0031] 例2(岗梅639酚酸的制备）
[0032] 一、化合物的制备
[0033] (1)岗梅根粗粉20kg，按照所得优化提取工艺，加入10倍量体积浓度为54%的乙 醇，分次回流提取，每次88min，取滤液，浓缩并回收乙醇得浸膏（385g)，并加水溶解；
[0034] (2)取适量经预处理的X-5大孔吸附树脂，以体积浓度为40%的乙醇为洗脱剂，洗 脱流速为2mL/min，得到40%大孔树脂洗脱部位岗梅酚酸提取物（86g)。
[0035] (3)利用ODS柱色谱进行粗分离，以体积浓度分别为30%，40%，50%，60%的甲醇 洗脱，得到24个流分。TLC及液相进行检测、合并，得到9个流分，流分4过凝胶Sephadex LH-20柱，以甲醇-0. 1%甲酸（l:lv/v)洗脱，最后采用高效半制备液相纯化得到岗梅 639-酚酸化合物（29mg)，结晶反复溶解，重结晶得纯品化合物。其中，所述的甲醇-0. 1 %甲 酸是体积浓度为〇. 1 %的甲酸与甲醇等比混合的混合溶液。
[0036] 二、化合物的鉴定
[0037] 本例得到的化合物分离为浅黄色粉末，HR-ESI-MSm/z639. 1925[M-H]_.确定其 分子式为C29H36O16，不饱和度为12。经检测，其1H-NMR、13C-NMR数据如下：
[0038]1H-Nmr(SoomHzJMSO)S /ppm:7. 50 (1H，d，J=15. 9Hz)，6.27 (1H，d，J=15. 9Hz)， 7. 06 (1H,d,J= 2. 2Hz), 7. 01 (1H,d,J= 8. 1Hz), 6. 76 (1H,dd,J= 2. 2, 8. 1Hz), 3. 73 (6H,s) and3. 57 (3H,s), 4. 86 (1H,d,J= 2. 9Hz)and4. 80 (1H,d,J= 7. 6Hz),
[0039]13C-NMR(125MHz，DMSO)S/ppm:125. 6(C-1), 116. 0(C-2), 145. 9(C-3), 148. 8(C-4) ，113.8 (C-5)，121.6 (C-6)，145.7 (C-7)，115.I(C-8)，166.7 (C-9)，154.I(C-I) ,94.6 (C-2, 6 )，153. 3 (C-3, 5)，132. 8 (C-4)，60. 3 (4-0CH3)，56. 0 (3, 5-0CH3)，101. 0 (C-I)，75. 6 (C-2)，76. 9 (C-3)，70. 2 (C-4)，76. 7 (C-5)，67. 9 (C-6)，108. 8 (C-I)，73. 3 (C-2)，77. 2 (C-3)，73. 5 (C-4) ,66. 0(C-5)
[0040] 参见附图7、8,1H-NMR中显示有一对反式烯质子7.50(1?d，J= 15. 9Hz)，6. 27 (1H,d,J= 15. 9Hz)，3 个苯环质子 7. 06 (1H,d,J= 2. 2Hz)，7. 01 (1H,d,J= 8. 1Hz), 6. 76(1H,dd,J= 2. 2, 8. 1Hz)，3个甲基质子3. 73(6H,s), 3. 57(3H,s)，2个糖端基质 子 4. 86 (1H,d,J= 2. 9Hz)，4. 80 (1H,d,J= 7. 6Hz)。由 13C-NMR中含有咖啡酰基125.6(0 1), 116. 0(C-2), 145. 9 (C-3), 148. 8 (C-4), 113. 8 (C-5), 121. 6 (C-6), 145. 7(C-7), 115.I(C-8)，166. 7(C-9)，3, 4, 5-trimethoxyphenoxy154.I(C-I)，94. 6(C-2, 6)，153. 3 (C-3, 5)，132 ? 8 (C-4)，60. 3 (4-0CH3)，56. 0 (3, 5-0CH3)，2 个苷化糖基包括D-葡萄糖基 101. 0 (C-I)，75. 6 (C-2)，76.9 (C_3)，7〇. 2 (C-4)，76.7 (C-5)，67.9 (C-6)和D-芹菜糖基 1〇8. 8 (C-I)，73.3 (C-2 )，77. 2 (C-3)，73. 5 (C-4)，66. 0 (C-5)，由上述特征初步推测此结构为酚酸类化合物。根据文 献[NobutoshiTanaka,ThreeNewHemiterpeneGlycosidesfromIlexmacropoda,Chem, Pharm，45 (9) 1533-1535 (1997)]，鉴定本例制得的化合物为结构式（II)式所示的岗梅639 酚酸，其名称为3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹糖-(1 - 6) - 0 -D-葡萄 糖昔（3, 4, 5_trimethoxyhpenol0 -D_5_0_CafTeoyl_apiofu;ranosyl_ (1 一 6) _ 0 _D_glucop yranoside)〇
[0041] 例3 :(颗粒剂）
[0042] 取实施例1制得的岗梅925皂苷8g和实施例2制得的岗梅639酚酸12g，加入 300g淀粉、200g蔗糖、混合均匀，制软材，以18目筛制粒，60°C干燥后lh，20目整粒，分装成 4g每袋的颗粒剂130袋供口服使用。
[0043] 例4:(胶囊剂）
[0044] 取实施例1制得的岗梅925皂苷155mg和实施例2制得的岗梅639酚酸155mg，加 入6000mg微晶纤维素、5000mg羧甲基淀粉钠、4000mg十二烷基硫酸钠等辅料充分混合，采 用辊压法进行干法制粒，再与适量硬脂酸镁混匀，填充入3#空心 胶囊，制成100粒的胶囊剂 供口服使用。
[0045] 例 5 :(片剂）
[0046] 取实施例1制得的岗梅925皂苷167mg和实施例2制得的岗梅639酚酸334mg，加 入4000mg淀粉、2500mg交联PVP、3000mg羧甲基淀粉钠混合均匀，用5 %PVP的75 %乙醇溶 液作为粘合剂，制软材，以18目筛制粒，60°C干燥后lh，20目整粒后加入适量滑石粉，混匀， 压片，制成规格为IOOmg/片的片剂100片供口服使用。
[0047] 例6(药理、药效实验）
[0048] 实验岗梅639酚酸联合岗梅925皂苷抑制HlNl型流感病毒的作用
[0049] 实验目的：探讨岗梅提取的酚酸和皂苷对HlNl型流感病毒感染的狗肾细胞 (MDCK)形态及生长的影响，并与不同岗梅酚酸和皂苷比例产生的药效进行比较。
[0050]1.实验材料
[0051] I. 1细胞株狗肾细胞（MDCK)，引自广医呼研所病毒室，Tll代。本室冻存保种。
[0052] 1. 2实验组及其对应的受试药物
[0053] 岗梅皂苷与酚酸分别按1:1、1:2、2:3比例进行混合。
[0054] 1. 3试剂和仪器新生小牛血清及DMEM培养基（Gibco公司）；DMSO(广州市康洋化 工有限公司）；胰蛋白酶（美国DIFCO公司；上海生工生物工程公司代理）。OlympusPM-6 倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；；E-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；BP221S 电子分析天平（上海精密仪器表有限公司）。
[0055] 2?方法
[0056] 2. 1岗梅单体组合物在MDCK细胞上毒性浓度的测定
[0057] 常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细 胞浓度为I.OXIO5个/mL，以0.ImL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单 层后，岗梅单体组合物按岗梅酚酸和岗梅皂苷不同比例分为3个组，组合物1比例为岗梅皂 苷：岗梅酚酸=1 :1 ;组合物2比例为岗梅皂苷：岗梅酚酸=1 :2 ;组合物3比例为岗梅皂 苷：岗梅酚酸=2 :3每个组合物接种4个复孔，设置酚酸组、皂苷组，同时设置正常对照组 和利巴韦林组，细胞置于35°C培养箱中继续培养4天。4天后终止实验，以显微镜观察药物 致细胞病变法（CPE法）判断待测样品对细胞的毒性作用。
[0058] 2. 2岗梅单体组合物MDCK上对HlNl型流感病毒抑制作用的测定（CPE法）
[0059] 常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细 胞浓度为I. 〇XIO5个/mL，以0.ImL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单层 后，弃上清液加入用含2%小牛血清的DMEM培养基稀释的各浓度药物0.lmL。分组如2. 1， 同时攻击IOOTCID5ci病毒悬液0.lmL，于35°C吸附2h后，弃上清。重新加入相应浓度的含药 培养基继续培养4天。终止实验后，以CPE观察法判断待测样品对病毒的抑制作用。实验 过程中同时设阳性药物利巴韦林对照、病毒对照和正常细胞对照。
[0060] 2. 3岗梅单体组合物MDCK上对HlNl型流感病毒抑制作用的测定（鸡红细胞凝集 法）
[0061] 常规复苏细胞后，待细胞生长够实验数目用Trypsin常规消化，用培养基调整细 胞浓度为I.OxIO5个/mL，以0.ImL/孔接种于96孔细胞培养板中。待细胞生长至紧密单层 后，弃上清液加入用含2%小牛血清的DMEM培养基稀释的各浓度药物0.lmL。分组如2. 1， 同时攻击IOOTCID5ci病毒悬液0.lmL，于35°C吸附2h后，弃上清。重新加入相应浓度的含 药培养基继续培养4天。终止实验后，以鸡红血球凝集法判断待测样品对病毒的抑制作用。 实验过程中同时设阳性药物利巴韦林对照、病毒对照和正常细胞对照。
[0062] 3?结果
[0063] 3. 1岗梅单体组合物对MDCK狗肾细胞毒性作用的测定
[0064] 表1不同岗梅单体组合物体外毒性浓度的测定
[0065]
[0066] 注：一为细胞生长正常，无病变出现；
[0067] 土为细胞病变少于整个单层细胞的10% ;
[0068] +为细胞病变约占整个单层细胞的25%;
[0069] ++为细胞病变约占整个单层细胞的50%;
[0070] +++为细胞病变约占整个单层细胞的75% ;
[0071] ++++为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。
[0072] 3. 2岗梅单体组合物对MDCK狗肾细胞抗病毒作用的测定
[0073] 表2不同岗梅单体组合物体外抗病毒作用（CPE观察法）
[0074]
[0075] 注：一为细胞生长正常，无病变出现；
[0076] 土为细胞病变少于整个单层细胞的10% ;
[0077] +为细胞病变约占整个单层细胞的25%;
[0078] ++为细胞病变约占整个单层细胞的50% ;
[0079] +++为细胞病变约占整个单层细胞的75% ;
[0080] ++++为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。
[0081] 3. 3岗梅单体组合物对HlNl型流感病毒的抑制作用
[0082] 表3不同岗梅单体组合物抗HlNl型流感病毒的抑制作用（鸡红细胞凝集法）
[0083]
[0084] 注：# :显示鸡红血球凝结程度达75%以上，表示药物对病毒无抑制作用。
[0085] +++ :表示50-75 %鸡红血球发生凝集；
[0086] ++ :表示25 % -50 %的鸡红细胞发生凝集；
[0087] + :表示小于25%的细胞发生病变；
[0088] -:显示鸡红血球不发生凝集，表示药物对病毒有抑制作用。
[0089] 4.结论
[0090] 结果表明岗梅皂苷单体和酚酸单体在药物浓度为5mg/mL及以下浓度无细胞毒 性，岗梅单体组合物1、2、3在药物浓度为lOmg/mL及以下浓度时无细胞毒性，表明药物组合 后毒性没有增加。
[0091] 由结果3. 2可以看出岗梅皂苷单体和酚酸单体抗病毒的最低有效浓度明显要高 于岗梅单体组合物1、2、3的抗病毒最低有效浓度，表明药物组合后抗病毒作用有增效。其 中组合物2的效果最好。同时红细胞凝集实验也证实了药物组合后疗效增强。
[0092] 结果表明岗梅单体组合物1、2和3即岗梅酚酸和岗梅皂苷的比值在1:0. 5~1在 无毒浓度下对HlNl型流感病毒具有很好的抑制作用。
【主权项】
1. 一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，该药物由有效成分和医学可接受的辅料 组成，其特征在于，所述的有效成分由3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡酰氧基-芹 糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷和3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟基-齐墩果 酸-28-0-0 -D-葡萄糖酯组成，二者的质量配比为3, 4, 5-三甲氧基苯酚-0 -D-5-0-咖啡 酰氧基-芹糖-(1 - 6)-0 -D-葡萄糖苷：3-0-0 -L-硫酸化阿拉伯糖-19-0-硫酸化羟 基-齐墩果酸-28-0- 0 -D-葡萄糖酯=1:0. 5~1。2. 根据权利要求1所述的一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，其特征在于，所述的 有效成分在药物中的重量百分含量为2%~5%。3. 根据权利要求1或2所述的一种治疗HlNl型流感病毒感染的药物，其特征在于，所 述的药物是颗粒剂、口服片剂或胶囊剂。
【专利摘要】本发明涉及含有机有效成分的医药制品，具体涉及一种治疗H1N1型流感病毒感染单体组合物，该有效成分由3,4,5-三甲氧基苯酚-β-D-5-O-咖啡酰氧基-芹糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷和3-O-β-L-硫酸化阿拉伯糖-19-O-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖酯组成，二者的质量配比为3,4,5-三甲氧基苯酚-β-D-5-O-咖啡酰氧基-芹糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷︰3-O-β-L-硫酸化阿拉伯糖-19-O-硫酸化羟基-齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖酯＝1:0.5～1。本发明所述的治疗H1N1型流感病毒感染的治疗效果显著。
【IPC分类】A61K31/704, A61P31/16, A61K31/7034
【公开号】CN104906118
【申请号】CN201510332559
【发明人】李耿, 赖小平
【申请人】广州中医药大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月16日
最新回复(0)