一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用图
一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用图
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种橙皮苷的用途，特别是涉及一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺 纤维化疾病药物中的用途。 二、【背景技术】：
[0002] 肺纤维化（pulmonaryfibrosis，PF)是多种弥漫性间质性肺疾病的共同病理改 变和最终结局，临床主要表现为进行性呼吸困难，最终患者因呼吸困难而死亡。细胞外基质 (ECM)中胶原蛋白、弹性纤维以及蛋白糖类的过量堆积是其特征性的病理组织学变化。目 前，认为成纤维细胞的增殖和活化是ECM大量形成和堆积的主要原因，肺泡上皮细胞的间 质转化、成纤维细胞的增生是成纤维细胞的主要来源。在有害刺激、细胞因子等的作用下， 成纤维细胞活化，分泌大量的ECM。在这些因素中，TGF-0是目前公认的致纤维化因子，能 够诱导肺泡上皮细胞转化为成纤维细胞；促进成纤维细胞和肌成纤维细胞大量分泌ECM。 尽管对肺纤维化的发病机制有了更深入的认识，但临床治疗仍然不能令人满意。
[0003] 肺纤维化确诊后平均存活时间为3年，或出现临床症状后，存活5年。在肺纤维化 的终末阶段，肺移植是唯一有效的治疗方法。随着近年患者数量的增加，导致合适的供体的 缺乏，此外昂贵的医疗费用和移植后出现的免疫排斥等副作用，限制了肺移植的应用。糖皮 质激素类、免疫抑制剂和细胞毒类药物是目前治疗肺纤维化的药物，10-30%的接受糖皮质 激素治疗的患者显示出一定的疗效，但没有完全或持续缓解者。而且这些药物治疗均存在 副作用严重、长期疗效不能确定等问题。中药能够在一定程度上改善肺纤维化终末期患者 的生活质量，但也存在药理作用机制和作用靶点不明确问题，阻碍了其在临床的选择应用。 因此，具有靶点和作用机制明确、长期服用安全可靠等特点的药物开发，具有重要的意义。
[0004] 橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫力、防辐射、保护心血管系统等药 理活性。橙皮苷对肺癌细胞的增殖有抑制作用，机制与干预细胞周期和诱导癌细胞的凋亡 有关。橙皮苷对肝纤维化有抑制作用，机制涉及TGF-e/Smad信号通路。另外，橙皮苷可用 于某些呼吸系统疾病的治疗，如急、慢性支气管炎等。截至目前，尚无橙皮苷防治肺纤维化 方面的相关研宄报道。 三、
【发明内容】
：
[0005] 本发明要解决的技术问题是：提供一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾 病药物中的用途。橙皮苷通过抑制肺成纤维细胞增殖、抑制肺泡上皮细胞的上皮_间质转 化、抑制肺成纤维细胞活化，具有防治肺纤维化的新用途。
[0006] 为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：
[0007] 本发明提供一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。
[0008] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，所述橙皮 苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺成纤维细胞活化或增殖的有效浓 度为 12. 5 ~200yM。
[0009] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，所述橙皮 苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转化的 有效浓度为25~IOOyM。
[0010] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，橙皮苷或 以橙皮苷为主要成分的药物组合物在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。
[0011] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，所述药物 组合物为按照药学常规方法制备成的胶囊剂、滴丸剂、片剂或颗粒剂。
[0012] 本发明所述的橙皮苷是从芸香科柑橘属药材如枳实、枳壳、柑橘、柠檬、葡萄柚、橘 红、橙等中提取出来的；或者是通过化学方法合成的橙皮苷纯品。
[0013] 本发明的橙皮苷还可以与现有技术中具有防治肺纤维化的中药、西药联合使用。 包括但不限于丹参酮、川芎嗪、汉防己甲素、大黄素、恩替卡韦、维生素E和拉米夫定等。
[0014] 为了更好的理解本发明的实质性内容，以下结合橙皮苷的药理试验实例及其结 果，说明橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。
[0015] 实验例1:橙皮苷对人胚肺成纤维细胞（MRC-5)细胞增殖的影响
[0016] 1)材料与方法:MRC-5细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。MEM培养 基（由武汉博士德生物工程有限公司提供该产品）、胎牛血清（由浙江天杭生物科技股份有 限公司提供该产品）。
[0017] 3.OXIO3的MRC-5细胞加入到96孔板的板孔中，培养24小时。吸出原培养液， 加入含有不同浓度（12. 5yM、25yM、50yM、100yM、200yM)的橙皮苷的完全培养液，以加 入不含橙皮苷的完全培养液作为正常对照。继续培养48小时，向每孔中加入20yL的含有 5mg/mL3-(4,5_二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT)的磷酸盐缓冲盐水，培养6 小时后，吸出每孔的培养液，每孔加入200yL的二甲基亚砜（DMSO)。震荡15分钟，在490nm 波长，检测各孔吸光度值，计算抑制率，即（对照组吸光度值-药物组吸光度值）/对照组吸 光度值。
[0018] 2)实验结果：详见表1。与未加药物组比较，100yM、200yM的橙皮苷组抑制率显 著增加（P〈〇. 01)。
[0019] 表1橙皮苷对人胚肺成纤维细胞（MRC-5)增殖的抑制作用（[土S)
[0020]
[0021] a'b，与 0 组比较，aP〈0. 05,bP〈0. 01。
[0022] 3)实验结论：橙皮苷对肺成纤维细胞增殖有抑制作用。
[0023] 实验例2:橙皮苷对肺泡上皮细胞（A549)上皮-间质转化的影响
[0024] 1)材料与方法:A549细胞来自于中国科学院上海生科院细胞资源中心。 1^:>]\11-1640 培养基（136；[」;[1^301&1'13；[03。1611。6&了6。11110108700.，1^(1.)、胎牛血清（浙江 天杭生物科技股份有限公司）、人转化生长因子I(HumanTGF-0 1，PeproTechInc); 纤维连接蛋白-I抗体（Fibronectin(FNl)antibody;货号BA1771)、a-平滑肌肌动蛋 白抗体（asmoothmuscleactin(a_SMA)Antibody;货号BM0002)和I型胶原蛋白抗体 (C0L1A1(CollagenI)Antibody;货号BA0325)均为武汉博士德生物工程有限公司产品。 即用型SABC-POD(小鼠IgG)试剂盒（货号SA1021)、即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒（货 号SA1022)均为武汉博士德生物工程有限公司产品。
[0025] 在24孔培养板的每个孔中加入玻璃片，然后在每个玻璃片上加入IXIO4细胞。将 培养板放入5%C02、37°C培养箱中，使细胞贴壁于玻璃片。2小时取出培养板，更换不含血 清的RPM1-1640培养液，继续培养8小时。吸除培养液，加入新的培养液；分为5组，即正 常组（加入RPM1-1640完全培养液）、TGF-M刺激组简称TGF-M组（加入含有5ng/mL TGF- 0 1的RPM1-1640完全培养液）、药物干预组（加入含有5ng/mLTGF- 0 1的RPM1-1640 完全培养液，培养液分别含有25yM、50yM、100yM的橙皮苷提取物），继续培养48小时。
[0026]Fibronectin-I(FN)、a-SMA和Collagen-I检测：取出细胞培养液后，每孔加入 4%的多聚甲醛溶液，固定然后取出孔中的玻璃片，按照试剂盒说明书分别进行FN、a-SM 和Collagen-I免疫细胞化学染色。分析上述蛋白表达，结果以阳性表达的累积光密度数值 (IOD)/细胞的面积（Area)表示。
[0027] 2)实验结果：详见表2。肺泡上皮-间质转化的特征性表现，是细胞特异性蛋白表 达的变化，特别是间质细胞特异性蛋白如FNXollagen-I和a-SMA表达量的增加。与正常 组比较，了6?-0 1组？1^显著升高（?〈〇.〇1)，(]〇1138611-1显著升高（?〈〇.〇1)，(3-5敵显著升 高（P〈0?01)。与TGF-(6l组相比，25yM橙皮苷组FN显著降低（P〈0?05)，25yM、50yM和 100UM橙皮苷组Collagen-I均显著降低（P〈0. 05或P〈0. 01)，25yM橙皮苷组a-SMA显著 降低（P〈〇. 01)。
[0028] 表2橙皮苷对TGF-M诱导A549细胞上皮-间质转化的影响（I± .s' )
[0029]
[0030]与TGF-0丨组比较，aP〈0. 05,bP〈0. 01，cKO. 001。
[0031] 3)实验结论：TGF-M诱导A549肺泡上皮细胞向间质细胞转化，橙皮苷对该转化 过程有抑制作用。
[0032] 实验例3:橙皮苷对肺成纤维细胞（MRC-5)活化的影响
[0033] 1)材料与方法:MRC-5细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。MEM培养 基（BosterBiologicalTechnologyCo. ,Ltd)、胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公 司）、人转化生长因子-0 1(HumanTGF-|3 1，PeproTechInc);人I型胶原酶联免疫检测试 剂盒（生工SangonBiotech，货号ESK5125-96T)和人纤维连接蛋白酶联免疫检测试剂盒 (生工SangonBiotech,货号ESK56OO-96T) 〇
[0034] 在96孔培养板的每个孔中加入3.OXIO3细胞。将培养板放入5%C02、37°C培养箱 中，48小时取出培养板，吸弃孔中上清，每孔加入不含血清的培养液，继续培养8小时。从每 个孔中吸除培养液，立即加入新的培养液。分组如下：正常组（加入完全培养液）JGF-h 诱导组（简称TGF-0 ^且，加入含有5ng/mLTGF-M的完全培养液）；药物干预组（加入含 有5ng/mLTGF- 0i的完全培养液，并分别含有12. 5yM、25yM和50yM的橙皮苷）。继续 培养48小时。
[0035] 培养液Collagen-I检测：吸出每孔的培养液，X1000g、4°C离心10分钟。按照试 剂盒说明书采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测上清液中的Collagen-I含量，以ng/mL表 示。实验结果详见表3。
[0036] 细胞FN检测：用IXPBS洗涤培养板板孔3次，用0. 25%胰酶消化贴壁细胞，加入 含有10%胎牛血清的MEM培养液，终止胰酶消化。X1000g、4°C离心10分钟；弃去上清，每 管中加入的IXPBS，震荡3分钟，-80°C冻存；之后，取出，37°C融化，再冻存，如此5次，涂片 显微镜下检查无细胞。X1000g、4°C离心10分钟，取上清液，按照试剂盒说明书采用双抗体 夹心酶联免疫吸附法检测细胞中的FN含量，以ng/mL表示。
[0037] 2)实验结果：详见表3。肺成纤维细胞受到TGF-M刺激、活化，合成、分泌FN和 Collagen-I的能力增强。与正常组比较，TGF-0 1组Collagen-I分泌量和FN含量均显著 增加（P〈〇. 05)。与TGF- 0 1组比较，25yM和50yM的橙皮苷组的Collagen-I分泌量显著 减少（P〈〇. 05)，12. 5yM、25yM和50yM的橙皮苷FN含量显著减少（P〈0. 05)。
[0038] 表3橙皮苷对TGF-M诱导MRC-5细胞活化的影响（^±^ )
[0039]
[0040]与TGF-0 1 组比较，aP〈0. 05。
[0041] 3)实验结论：TGF-M诱导MRC-5肺成纤维细胞活化、促进肺纤维化的形成和发 展，橙皮苷对该活化过程有抑制作用。
[0042] 综上所述，橙皮苷具有防治肺纤维化的作用。机制涉及抑制肺成纤维细胞增殖和 活化以及抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转化。因此，橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤 维化疾病药物中的应用是一种新的用途。 四、【具体实施方式】：
[0043] 以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。
[0044] 实施例1 :
[0045] 取橙皮苷50g、淀粉80g和糊精20g，首先将各种物料混合均匀，过120目筛；然后 按照软材常规制备方法加入80%乙醇适量制备成软材，所得软材过20目筛，所得湿粒置于 烘箱中，在60~70°C干燥lh，干燥后用18目筛整粒；整粒后加入羧甲淀粉钠5g、硬脂酸镁 5g混匀，制成1000片，每片含有橙皮苷50mg。每日口服2-3次，每次50mg，用于慢性阻塞性 肺疾病稳定期患者，预防肺纤维化的发生。
[0046] 实施例2 :
[0047] 以质量百分比表示，本发明以橙皮苷为主要成分的药物组合物由橙皮苷15%、丹 参酮5%、甘露醇77%、羟丙甲纤维素2. 5%和硬脂酸镁0. 5%组成；首先按照各种原料比例 称取各种原料，将各种原料混匀后过60目筛，然后加入质量百分比为75%的乙醇润湿，制 备成软材，40目筛网挤压制粒，所得湿颗粒在40°C下恒温干燥3小时，然后按照常规方法加 入适量硬脂酸镁进行整粒，得到橙皮苷颗粒。每袋含有橙皮苷60mg和40mg丹参酮，口服每 次服用1袋，每日3次，2个月为一疗程，用于长期哮喘的患者，预防肺纤维化的发生。
[0048] 实施例3 :
[0049] 本发明橙皮苷肠溶软胶囊囊材的处方为明胶：甘油：水=1 :1 :2(质量比），自微 乳软胶囊的内容物处方为："肉豆蔻酸异丙酯：聚氧乙烯醚（40)氢化蓖麻油（Cremophor RH40):聚乙二醇400(PEG400):橙皮苷=1 :4 :4 :1(质量比）"。根据上述软胶囊囊材的处方 和内容物处方，按照常规软胶囊制备方法制备成软胶囊；密封、消毒。口服每次服用l〇〇mg， 每日3次，2个月一个疗程，用于肺纤维化的预防和治疗。
[0050] 实施例4:
[0051] 称取橙皮苷60g、汉防己甲素30g、乳糖44g、羧甲淀粉钠4.5g和硬脂酸镁1.5g，将 其各种物料混合均匀，过100目筛；然后按照常规软材制备方法加入质量百分比为10%的 淀粉浆适量制备成软材，软材过20目筛，所得湿粒置于烘箱中60~70°C干燥1小时，采用 18目筛整粒，最后按照常规方法加入辅料适量硬脂酸镁和适量羧甲基淀粉钠混匀，制成片 剂，每片含有橙皮苷60mg和汉防已甲素30mg。口服每日3次，2个月一个疗程，用于肺纤维 化的治疗。
[0052] 实施例5 :
[0053] 本发明橙皮苷肠溶软胶囊囊材的处方为明胶：甘油：水=1 :1 :2(质量比），自微 乳软胶囊的内容物处方为："肉豆蔻酸异丙酯：聚氧乙烯醚（40)氢化蓖麻油（Cremophor RH40):聚乙二醇400(PEG400):三七总皂苷：橙皮苷=I:2.5 :2.5 :3 :1(质量比）"。根据上 述软胶囊囊材的处方和内容物处方，按照常规软胶囊制备工艺制备成软胶囊，密封、消毒。 口服，每次橙皮苷50mg和三七总皂苷150mg，每日2次，3个月一个疗程，用于肺纤维化的治 疗。
[0054] 上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明保护的实施范围，故 凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要 求范围之内。
【主权项】
1. 一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途， 其特征在于：所述橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺成纤维细 胞活化或增殖的有效浓度为12. 5~200yM。3. 根据权利要求1所述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途， 其特征在于：所述橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺泡上皮细 胞的上皮-间质转化的有效浓度为25~100yM。4. 根据权利要求1所述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途， 其特征在于：橙皮苷或以橙皮苷为主要成分的药物组合物在制备预防和/或治疗肺纤维化 疾病药物中的用途。5. 根据权利要求4所述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途， 其特征在于：所述药物组合物为按照药学常规方法制备成的胶囊剂、滴丸剂、片剂或颗粒 剂。
【专利摘要】本发明公开了一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。经实验验证，橙皮苷通过抑制肺成纤维细胞增殖、抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转化和抑制肺成纤维细胞活化，从而起到防治肺纤维化的作用；使其在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中起到新的用途。所述用途涉及橙皮苷制备的各种药物剂型，如胶囊剂、滴丸剂、气雾剂、喷雾剂、片剂、颗粒剂和注射剂。另外，所述用途也涉及橙皮苷作为主要成分，所形成的防治肺纤维化的组合物。
【IPC分类】A61K31/7048, A61P11/00
【公开号】CN104906120
【申请号】CN201510372390
【发明人】任周新, 陈玉龙, 吴兆宇, 冯素香, 周悌强
【申请人】河南中医学院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月29日
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种橙皮苷的用途，特别是涉及一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺 纤维化疾病药物中的用途。 二、【背景技术】：
[0002] 肺纤维化（pulmonaryfibrosis，PF)是多种弥漫性间质性肺疾病的共同病理改 变和最终结局，临床主要表现为进行性呼吸困难，最终患者因呼吸困难而死亡。细胞外基质 (ECM)中胶原蛋白、弹性纤维以及蛋白糖类的过量堆积是其特征性的病理组织学变化。目 前，认为成纤维细胞的增殖和活化是ECM大量形成和堆积的主要原因，肺泡上皮细胞的间 质转化、成纤维细胞的增生是成纤维细胞的主要来源。在有害刺激、细胞因子等的作用下， 成纤维细胞活化，分泌大量的ECM。在这些因素中，TGF-0是目前公认的致纤维化因子，能 够诱导肺泡上皮细胞转化为成纤维细胞；促进成纤维细胞和肌成纤维细胞大量分泌ECM。 尽管对肺纤维化的发病机制有了更深入的认识，但临床治疗仍然不能令人满意。
[0003] 肺纤维化确诊后平均存活时间为3年，或出现临床症状后，存活5年。在肺纤维化 的终末阶段，肺移植是唯一有效的治疗方法。随着近年患者数量的增加，导致合适的供体的 缺乏，此外昂贵的医疗费用和移植后出现的免疫排斥等副作用，限制了肺移植的应用。糖皮 质激素类、免疫抑制剂和细胞毒类药物是目前治疗肺纤维化的药物，10-30%的接受糖皮质 激素治疗的患者显示出一定的疗效，但没有完全或持续缓解者。而且这些药物治疗均存在 副作用严重、长期疗效不能确定等问题。中药能够在一定程度上改善肺纤维化终末期患者 的生活质量，但也存在药理作用机制和作用靶点不明确问题，阻碍了其在临床的选择应用。 因此，具有靶点和作用机制明确、长期服用安全可靠等特点的药物开发，具有重要的意义。
[0004] 橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫力、防辐射、保护心血管系统等药 理活性。橙皮苷对肺癌细胞的增殖有抑制作用，机制与干预细胞周期和诱导癌细胞的凋亡 有关。橙皮苷对肝纤维化有抑制作用，机制涉及TGF-e/Smad信号通路。另外，橙皮苷可用 于某些呼吸系统疾病的治疗，如急、慢性支气管炎等。截至目前，尚无橙皮苷防治肺纤维化 方面的相关研宄报道。 三、
【发明内容】
：
[0005] 本发明要解决的技术问题是：提供一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾 病药物中的用途。橙皮苷通过抑制肺成纤维细胞增殖、抑制肺泡上皮细胞的上皮_间质转 化、抑制肺成纤维细胞活化，具有防治肺纤维化的新用途。
[0006] 为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：
[0007] 本发明提供一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。
[0008] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，所述橙皮 苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺成纤维细胞活化或增殖的有效浓 度为 12. 5 ~200yM。
[0009] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，所述橙皮 苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转化的 有效浓度为25~IOOyM。
[0010] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，橙皮苷或 以橙皮苷为主要成分的药物组合物在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。
[0011] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，所述药物 组合物为按照药学常规方法制备成的胶囊剂、滴丸剂、片剂或颗粒剂。
[0012] 本发明所述的橙皮苷是从芸香科柑橘属药材如枳实、枳壳、柑橘、柠檬、葡萄柚、橘 红、橙等中提取出来的；或者是通过化学方法合成的橙皮苷纯品。
[0013] 本发明的橙皮苷还可以与现有技术中具有防治肺纤维化的中药、西药联合使用。 包括但不限于丹参酮、川芎嗪、汉防己甲素、大黄素、恩替卡韦、维生素E和拉米夫定等。
[0014] 为了更好的理解本发明的实质性内容，以下结合橙皮苷的药理试验实例及其结 果，说明橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。
[0015] 实验例1:橙皮苷对人胚肺成纤维细胞（MRC-5)细胞增殖的影响
[0016] 1)材料与方法:MRC-5细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。MEM培养 基（由武汉博士德生物工程有限公司提供该产品）、胎牛血清（由浙江天杭生物科技股份有 限公司提供该产品）。
[0017] 3.OXIO3的MRC-5细胞加入到96孔板的板孔中，培养24小时。吸出原培养液， 加入含有不同浓度（12. 5yM、25yM、50yM、100yM、200yM)的橙皮苷的完全培养液，以加 入不含橙皮苷的完全培养液作为正常对照。继续培养48小时，向每孔中加入20yL的含有 5mg/mL3-(4,5_二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT)的磷酸盐缓冲盐水，培养6 小时后，吸出每孔的培养液，每孔加入200yL的二甲基亚砜（DMSO)。震荡15分钟，在490nm 波长，检测各孔吸光度值，计算抑制率，即（对照组吸光度值-药物组吸光度值）/对照组吸 光度值。
[0018] 2)实验结果：详见表1。与未加药物组比较，100yM、200yM的橙皮苷组抑制率显 著增加（P〈〇. 01)。
[0019] 表1橙皮苷对人胚肺成纤维细胞（MRC-5)增殖的抑制作用（[土S)
[0020]
[0021] a'b，与 0 组比较，aP〈0. 05,bP〈0. 01。
[0022] 3)实验结论：橙皮苷对肺成纤维细胞增殖有抑制作用。
[0023] 实验例2:橙皮苷对肺泡上皮细胞（A549)上皮-间质转化的影响
[0024] 1)材料与方法:A549细胞来自于中国科学院上海生科院细胞资源中心。 1^:>]\11-1640 培养基（136；[」;[1^301&1'13；[03。1611。6&了6。11110108700.，1^(1.)、胎牛血清（浙江 天杭生物科技股份有限公司）、人转化生长因子I(HumanTGF-0 1，PeproTechInc); 纤维连接蛋白-I抗体（Fibronectin(FNl)antibody;货号BA1771)、a-平滑肌肌动蛋 白抗体（asmoothmuscleactin(a_SMA)Antibody;货号BM0002)和I型胶原蛋白抗体 (C0L1A1(CollagenI)Antibody;货号BA0325)均为武汉博士德生物工程有限公司产品。 即用型SABC-POD(小鼠IgG)试剂盒（货号SA1021)、即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒（货 号SA1022)均为武汉博士德生物工程有限公司产品。
[0025] 在24孔培养板的每个孔中加入玻璃片，然后在每个玻璃片上加入IXIO4细胞。将 培养板放入5%C02、37°C培养箱中，使细胞贴壁于玻璃片。2小时取出培养板，更换不含血 清的RPM1-1640培养液，继续培养8小时。吸除培养液，加入新的培养液；分为5组，即正 常组（加入RPM1-1640完全培养液）、TGF-M刺激组简称TGF-M组（加入含有5ng/mL TGF- 0 1的RPM1-1640完全培养液）、药物干预组（加入含有5ng/mLTGF- 0 1的RPM1-1640 完全培养液，培养液分别含有25yM、50yM、100yM的橙皮苷提取物），继续培养48小时。
[0026]Fibronectin-I(FN)、a-SMA和Collagen-I检测：取出细胞培养液后，每孔加入 4%的多聚甲醛溶液，固定然后取出孔中的玻璃片，按照试剂盒说明书分别进行FN、a-SM 和Collagen-I免疫细胞化学染色。分析上述蛋白表达，结果以阳性表达的累积光密度数值 (IOD)/细胞的面积（Area)表示。
[0027] 2)实验结果：详见表2。肺泡上皮-间质转化的特征性表现，是细胞特异性蛋白表 达的变化，特别是间质细胞特异性蛋白如FNXollagen-I和a-SMA表达量的增加。与正常 组比较，了6?-0 1组？1^显著升高（?〈〇.〇1)，(]〇1138611-1显著升高（?〈〇.〇1)，(3-5敵显著升 高（P〈0?01)。与TGF-(6l组相比，25yM橙皮苷组FN显著降低（P〈0?05)，25yM、50yM和 100UM橙皮苷组Collagen-I均显著降低（P〈0. 05或P〈0. 01)，25yM橙皮苷组a-SMA显著 降低（P〈〇. 01)。
[0028] 表2橙皮苷对TGF-M诱导A549细胞上皮-间质转化的影响（I± .s' )
[0029]
[0030]与TGF-0丨组比较，aP〈0. 05,bP〈0. 01，cKO. 001。
[0031] 3)实验结论：TGF-M诱导A549肺泡上皮细胞向间质细胞转化，橙皮苷对该转化 过程有抑制作用。
[0032] 实验例3:橙皮苷对肺成纤维细胞（MRC-5)活化的影响
[0033] 1)材料与方法:MRC-5细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。MEM培养 基（BosterBiologicalTechnologyCo. ,Ltd)、胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公 司）、人转化生长因子-0 1(HumanTGF-|3 1，PeproTechInc);人I型胶原酶联免疫检测试 剂盒（生工SangonBiotech，货号ESK5125-96T)和人纤维连接蛋白酶联免疫检测试剂盒 (生工SangonBiotech,货号ESK56OO-96T) 〇
[0034] 在96孔培养板的每个孔中加入3.OXIO3细胞。将培养板放入5%C02、37°C培养箱 中，48小时取出培养板，吸弃孔中上清，每孔加入不含血清的培养液，继续培养8小时。从每 个孔中吸除培养液，立即加入新的培养液。分组如下：正常组（加入完全培养液）JGF-h 诱导组（简称TGF-0 ^且，加入含有5ng/mLTGF-M的完全培养液）；药物干预组（加入含 有5ng/mLTGF- 0i的完全培养液，并分别含有12. 5yM、25yM和50yM的橙皮苷）。继续 培养48小时。
[0035] 培养液Collagen-I检测：吸出每孔的培养液，X1000g、4°C离心10分钟。按照试 剂盒说明书采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测上清液中的Collagen-I含量，以ng/mL表 示。实验结果详见表3。
[0036] 细胞FN检测：用IXPBS洗涤培养板板孔3次，用0. 25%胰酶消化贴壁细胞，加入 含有10%胎牛血清的MEM培养液，终止胰酶消化。X1000g、4°C离心10分钟；弃去上清，每 管中加入的IXPBS，震荡3分钟，-80°C冻存；之后，取出，37°C融化，再冻存，如此5次，涂片 显微镜下检查无细胞。X1000g、4°C离心10分钟，取上清液，按照试剂盒说明书采用双抗体 夹心酶联免疫吸附法检测细胞中的FN含量，以ng/mL表示。
[0037] 2)实验结果：详见表3。肺成纤维细胞受到TGF-M刺激、活化，合成、分泌FN和 Collagen-I的能力增强。与正常组比较，TGF-0 1组Collagen-I分泌量和FN含量均显著 增加（P〈〇. 05)。与TGF- 0 1组比较，25yM和50yM的橙皮苷组的Collagen-I分泌量显著 减少（P〈〇. 05)，12. 5yM、25yM和50yM的橙皮苷FN含量显著减少（P〈0. 05)。
[0038] 表3橙皮苷对TGF-M诱导MRC-5细胞活化的影响（^±^ )
[0039]
[0040]与TGF-0 1 组比较，aP〈0. 05。
[0041] 3)实验结论：TGF-M诱导MRC-5肺成纤维细胞活化、促进肺纤维化的形成和发 展，橙皮苷对该活化过程有抑制作用。
[0042] 综上所述，橙皮苷具有防治肺纤维化的作用。机制涉及抑制肺成纤维细胞增殖和 活化以及抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转化。因此，橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤 维化疾病药物中的应用是一种新的用途。 四、【具体实施方式】：
[0043] 以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。
[0044] 实施例1 :
[0045] 取橙皮苷50g、淀粉80g和糊精20g，首先将各种物料混合均匀，过120目筛；然后 按照软材常规制备方法加入80%乙醇适量制备成软材，所得软材过20目筛，所得湿粒置于 烘箱中，在60~70°C干燥lh，干燥后用18目筛整粒；整粒后加入羧甲淀粉钠5g、硬脂酸镁 5g混匀，制成1000片，每片含有橙皮苷50mg。每日口服2-3次，每次50mg，用于慢性阻塞性 肺疾病稳定期患者，预防肺纤维化的发生。
[0046] 实施例2 :
[0047] 以质量百分比表示，本发明以橙皮苷为主要成分的药物组合物由橙皮苷15%、丹 参酮5%、甘露醇77%、羟丙甲纤维素2. 5%和硬脂酸镁0. 5%组成；首先按照各种原料比例 称取各种原料，将各种原料混匀后过60目筛，然后加入质量百分比为75%的乙醇润湿，制 备成软材，40目筛网挤压制粒，所得湿颗粒在40°C下恒温干燥3小时，然后按照常规方法加 入适量硬脂酸镁进行整粒，得到橙皮苷颗粒。每袋含有橙皮苷60mg和40mg丹参酮，口服每 次服用1袋，每日3次，2个月为一疗程，用于长期哮喘的患者，预防肺纤维化的发生。
[0048] 实施例3 :
[0049] 本发明橙皮苷肠溶软胶囊囊材的处方为明胶：甘油：水=1 :1 :2(质量比），自微 乳软胶囊的内容物处方为："肉豆蔻酸异丙酯：聚氧乙烯醚（40)氢化蓖麻油（Cremophor RH40):聚乙二醇400(PEG400):橙皮苷=1 :4 :4 :1(质量比）"。根据上述软胶囊囊材的处方 和内容物处方，按照常规软胶囊制备方法制备成软胶囊；密封、消毒。口服每次服用l〇〇mg， 每日3次，2个月一个疗程，用于肺纤维化的预防和治疗。
[0050] 实施例4:
[0051] 称取橙皮苷60g、汉防己甲素30g、乳糖44g、羧甲淀粉钠4.5g和硬脂酸镁1.5g，将 其各种物料混合均匀，过100目筛；然后按照常规软材制备方法加入质量百分比为10%的 淀粉浆适量制备成软材，软材过20目筛，所得湿粒置于烘箱中60~70°C干燥1小时，采用 18目筛整粒，最后按照常规方法加入辅料适量硬脂酸镁和适量羧甲基淀粉钠混匀，制成片 剂，每片含有橙皮苷60mg和汉防已甲素30mg。口服每日3次，2个月一个疗程，用于肺纤维 化的治疗。
[0052] 实施例5 :
[0053] 本发明橙皮苷肠溶软胶囊囊材的处方为明胶：甘油：水=1 :1 :2(质量比），自微 乳软胶囊的内容物处方为："肉豆蔻酸异丙酯：聚氧乙烯醚（40)氢化蓖麻油（Cremophor RH40):聚乙二醇400(PEG400):三七总皂苷：橙皮苷=I:2.5 :2.5 :3 :1(质量比）"。根据上 述软胶囊囊材的处方和内容物处方，按照常规软胶囊制备工艺制备成软胶囊，密封、消毒。 口服，每次橙皮苷50mg和三七总皂苷150mg，每日2次，3个月一个疗程，用于肺纤维化的治 疗。
[0054] 上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明保护的实施范围，故 凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要 求范围之内。
【主权项】
1. 一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途， 其特征在于：所述橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺成纤维细 胞活化或增殖的有效浓度为12. 5~200yM。3. 根据权利要求1所述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途， 其特征在于：所述橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺泡上皮细 胞的上皮-间质转化的有效浓度为25~100yM。4. 根据权利要求1所述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途， 其特征在于：橙皮苷或以橙皮苷为主要成分的药物组合物在制备预防和/或治疗肺纤维化 疾病药物中的用途。5. 根据权利要求4所述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途， 其特征在于：所述药物组合物为按照药学常规方法制备成的胶囊剂、滴丸剂、片剂或颗粒 剂。
【专利摘要】本发明公开了一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。经实验验证，橙皮苷通过抑制肺成纤维细胞增殖、抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转化和抑制肺成纤维细胞活化，从而起到防治肺纤维化的作用；使其在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中起到新的用途。所述用途涉及橙皮苷制备的各种药物剂型，如胶囊剂、滴丸剂、气雾剂、喷雾剂、片剂、颗粒剂和注射剂。另外，所述用途也涉及橙皮苷作为主要成分，所形成的防治肺纤维化的组合物。
【IPC分类】A61K31/7048, A61P11/00
【公开号】CN104906120
【申请号】CN201510372390
【发明人】任周新, 陈玉龙, 吴兆宇, 冯素香, 周悌强
【申请人】河南中医学院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月29日
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