二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用
二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物化学领域，具体涉及二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药 物中的应用。
【背景技术】
[0002] 脊髓损伤是一种致残率高，愈后差的疾病，发病率为每年10. 4~83. 0/100万，并 有逐渐上升的趋势。脊髓损伤导致组织中部分或者全部的神经细胞、神经胶质细胞等死亡， 同时组织中的神经传导纤维发生断裂、脱髓鞘等，从而造成了脊髓神经功能的缺失。脊髓损 伤不仅可以导致损伤平面以下感觉、运动功能的障碍活丧失，还可能导致多个器官功能的 障碍，如呼吸系统、循环系统、泌尿系统和消化系统等。由于其造成劳动力的丧失、长时间的 康复治疗、占用大量的医疗资源以及昂贵的医疗费用，给个人、家庭以及全社会带来巨大的 负担。虽然手术治疗和药物治疗（如糖皮质激素）在不同程度上使受损的脊髓得到了恢复 和再生的空间，但仍不可避免的造成了病人瘫痪乃至死亡的严重后果。
[0003] 环磷腺苷是核苷酸的衍生物，近年的研宄表明，环磷腺苷在脊髓损伤恢复中具有 重要作用。脊髓损伤后的功能恢复主要受限于损伤轴突的再生能力。轴突再生失败是由 于轴突自身生长能力丧失造成，细胞外环境中的髓鞘磷脂抑制物等也能诱导轴突生长锥塌 陷、抑制轴突再生，星形胶质细胞形成的胶质瘢痕成为轴突延伸的物理屏障。更为关键的 是，脊髓损伤会导致神经元的变性、坏死或严重萎缩，减少了神经元的数量。因而，促进轴突 再生和神经元存活能改善中枢神经系统损伤后的修复。成年生物神经元之所以丧失再生能 力，重要原因之一是细胞内环磷腺苷水平下降。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对脊髓损伤疾病，提供一种二丁酰环磷腺苷钙的 药物新用途。本发明的发明人通过反复实验研宄发现，二丁酰环磷腺苷钙能够明显提高脊 髓损伤大鼠的行为学功能恢复、增加神经元环磷腺苷浓度、促进轴突生长，尤其是钙离子与 二丁酰环磷腺苷有协同作用，与单独使用二丁酰环磷腺苷相比，二丁酰环磷腺苷钙的药效 更加突出。
[0005] 本发明提供了二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。
[0006] 本领域技术人员均知晓，本发明的二丁酰环磷腺苷钙较佳地包括 C18H23N5O8P?l/2Ca和C18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20,本发明优选C18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20。
[0007] 其中，所述的脊髓损伤较佳地包括神经元细胞变性、坏死和轴突退变。
[0008] 其中，所述的二丁酰环磷腺苷钙的给药剂量较佳地为0.6~1.0mg/kg体重/日。 [0009] 其中，所述的二丁酰环磷腺苷钙的给药方式为静脉注射、或肌肉注射。
[0010] 其中，所述的药物较佳地是以有效量的二丁酰环磷腺苷钙为活性成分，加上药学 上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物制剂。
[0011] 其中，所述的药物制剂较佳地是冻干粉针或注射剂，最佳地是冻干粉针。
[0012] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0013] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0014] 本发明的积极进步效果在于：本发明研宄发现二丁酰环磷腺苷钙可用于中枢神经 系统功能损伤的修复，如脊髓损伤的修复。在大鼠脊髓损伤后BBB检测功能恢复、神经元环 磷腺苷浓度、神经元修复三个方面，二丁酰环磷腺苷钙的功能都显著超过二丁酰环磷腺苷。 二丁酰环磷腺苷钙不仅能够抑制磷酸二酯酶、防止环磷腺苷的降解，还能通过钙离子激活 腺苷酸环化酶、增加环磷腺苷的合成。因而二丁酰环磷腺苷钙具有更加强大的活化环磷腺 苷信号途径的能力，是优良的促进脊髓损伤恢复的药物。
【附图说明】
[0015] 图1为脊髓损伤后大鼠的BBB评分变化曲线图。
[0016] 图2为脊髓损伤后大鼠的脊髓中cAMP含量变化曲线图。
[0017] 图3为脊髓损伤后大鼠的神经元数目变化图。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0019] 实验材料和方法
[0020] 清洁SD雄性大鼠，体重200-220g，购于上海实验动物中心，分为四组、每组30只 (其中又分为〇、7、14天组各10只），分别为A组：阴性对照组（无脊髓损伤造模处理），B 组：生理盐水组（脊髓损伤造模后即肌注等量生理盐水），C组：注射二丁酰环磷腺苷组（即 脊髓损伤造模后即肌注二丁酰环磷腺苷〇. 16mg/日，以市售的20mg二丁酰环磷腺苷为活性 成分溶于2ml生理盐水中配制成溶液），D组：注射二丁酰环磷腺苷钙组（即脊髓损伤造模 后即肌注二丁酰环磷腺苷钙0. 16mg/日，以20mgC18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20为活性成分溶 于2ml生理盐水中配制成溶液）。
[0021] 二丁酰环磷腺苷钙来自上海上药第一生化药业有限公司（批次1306021)
[0022] 脊髓中度损伤大鼠模型一一双侧椎板去除术（T8)
[0023] (1)大鼠腹腔注射1%戊巴比妥（50mg/kg)充分麻醉后，俯卧，背部以TlO(椎体） 为中心剌毛备皮；
[0024] (2)暴露T8椎板，背侧中线30-40mm纵行切口，切开皮肤及皮下组织，暴露T6-11 节椎板；
[0025] (3)剪开T9两侧上关节突，并将T8两侧椎弓根剪断，使T8椎板与椎骨分离，移除 T8椎板，清创后清洗暴露硬脊膜包裹下的脊髓。
[0026] 脊髓夹伤
[0027] (1)用间隙0. 5mm镊子自脊髓两侧向内匀速闭合并保持闭合状态20秒；
[0028] (2)造模成功后，分层缝合肌肉和皮肤。
[0029] 实施例IBBB检测功能恢复实验
[0030] 将动物至于表面光滑，四周封闭的开放环境中，自由运动4分钟，用录像机进行摄 像。通过评估大鼠躯干，尾巴，后肢的运动情况来评分。根据BBB评分标准21分，分早中晚 三期：
[0031] 0分：无可见后肢运动
[0032] 1分：一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节
[0033] 2分：一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动
[0034] 3分：两个关节广泛活动
[0035] 4分：后肢全部三个关节可轻微活动
[0036] 5分：两个关节轻微活动，第三个关节可广泛活动
[0037] 6分：两个关节广泛活动，第三个关节可轻微活动
[0038] 7分：后肢全部三个关节可广泛活动
[0039] 8分：非承重情况下可以爪掌面着地
[0040] 9分：间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动 [0041] 10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作
[0042] 11分：可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作
[0043] 12分：可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作
[0044] 13分：常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作
[0045] 14分：有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续 型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动
[0046] 15分：持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓 地；初接触时主动爪位置与身体平行
[0047] 16分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常 见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。
[0048] 17分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常 见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。
[0049] 18分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可 持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。
[0050] 19分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可 持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。
[0051] 20分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后 主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。
[0052] 21分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置 始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。
[00531
[0054] 图1为脊髓损伤后大鼠的BBB评分变化曲线图。取0天、7天、14天三个时间点进 行观察。从图中可见，B、C、D组损伤（SCI)O天时大鼠后肢完全瘫痪（0分）。7天后，C组 (11. 1±0. 8)恢复显著高于B组（9. 8±0. 7)，D组（12. 5±0. 6)恢复显著高于C组；p〈0. 05， 有显著差异。14天后，C组（15. 6±0. 6)恢复显著高 于B组（12. 9±0. 9)，D组（18. 6±0. 6) 恢复显著高于C组；p〈0. 05,差异显著。BBB评分显示，钙离子可以促进二丁酰环磷腺苷对 损伤运动早期功能的修复。因此，二丁酰环磷腺苷钙可以显著提升脊髓损伤后大鼠的运动 功能修复。
[0055] 实施例2ELISA(酶联免疫吸附试验）检测cAMP(环磷腺苷）含量（0、7、14天）
[0056] R&D公司cAMP免疫检测ELISA试剂盒，应用酶联免疫吸附竞争法检测cAMP含量。
[0057] 准备阶段：
[0058] 1、试剂准备：
[0059] 冲洗缓冲液：30ml浓缩缓冲冲洗液加入蒸馏水稀释为300ml。
[0060] 乙酰化试剂：1ml三乙胺中加入0. 5ml无水醋酸，备用。
[0061] cAMP标准品（非乙酰化）：取900yIED2检测缓冲液加入试管I(200pmol/ml)， 其余 4 个试管（50pmol/ml，12. 5pmol/ml，3. 12pmol/ml，0? 78pmol/ml)分别加入 750yIED2 检测缓冲液。自cAMP标准品（2000pmol/ml)中取IOOul加入试管I;自试管1取250ul加 入试管2,试管2取250ul液体加入试管3,试管3取250ul液体加入试管4,试管4取250ul 液体加入试管5。以试管1溶液为cAMP含量高标准品（200pmol/ml)，ED2检测缓冲液为零 标准品（Opmol/ml)，1小时内使用。
[0062] cAMP标准品（乙酰化）：取990yIED2检测缓冲液加入试管I(20pmol/ml)，其余 4 个试管（5pmol/ml，1.25pmol/ml，0.312pmol/ml，0.078pmol/ml)分别加入 750ylED2 检 测缓冲液。自cAMP标准品（2000pmol/ml)中取10y1加入试管1 ;自试管1取250y1加入 试管2,试管2取250ul液体加入试管3,试管3取250ul液体加入试管4,试管4取250y1 液体加入试管5。以试管1溶液为cAMP含量高标准品（20pmol/ml)，ED2检测缓冲液为零 标准品（Opmol/ml)，半小时内使用。
[0063] 2、标本准备
[0064] 实验SD大鼠分组和治疗处理同前述"实验材料和方法"。
[0065] 样本取材：吸入乙醚麻醉，剪断包含伤段脊髓脊柱及左右侧相连肋骨取下一段长 约Icm脊柱，用锡箔纸包裹浸入液氮罐保存用于ELISA测定cAMP。从液氮罐中取出标本研 磨称重，加入10倍溶剂5%三氯醋酸，离心去上清加入3倍容积水合乙醚，干燥去水后加入 ED2检测缓冲液备用。
[0066] 3、标准品及标本乙酰化
[0067] 每200ulcAMP标准品或待测标本加入IOul乙酰化试剂，每Iml零标准-ED2检测 缓冲液加入50ul乙酰化试剂乙酰化。
[0068] 实验步骤：
[0069] 加入150y1缓冲液到NSB微孔，加入IOOul缓冲液到零标准品微孔，加入100y1 标准品或样本安排其余各微孔；加入50yIcAMP偶联物到总活性及空白测定微孔外的各 微孔；加入50yIcAMP抗体溶液到除NSB微孔，总活性及空白测定微孔外的各微孔。封闭 微孔室温孵育2小时。
[0070] 洗板，倾空各微孔并用洗涤缓冲液冲洗3次，倒出残存液体。
[0071] 总活性测定微孔内加入5ylIcAMP偶联物。
[0072] 所有微孔内加入对硝基苯作用物200y1，室温孵育1小时。
[0073] 所有微孔内加入反应中止溶液50yl。
[0074] 用酶标仪（美国伯乐BIO-RAD680,检测波长450nm)测定各微孔光密度OD值。
[0075] 结果判定：
[0076] 算出各标准品及样本OD均数，减去NSB的OD均数。
[0077] 计算百分结合率B/BJ% )，用样品或标准液吸光度值（B)除以零标准吸光度值 (B0)X100%，B/BQ(% ) = (0D-NSBV(0Dq-NSB)X100,OD为给定样品吸光值，ODtl为阳性对 照的吸光值，NSB为阴性对照的吸光度值；
[0078] 以乙酰化cAMP标准液对数浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标 准曲线测出样品cAMP浓度。
[0079] 图2为脊髓损伤后大鼠的脊髓中cAMP含量变化曲线图。从图中可见：
[0080] 脊髓损伤空白对照组（即A组）cAMP为102. 3 ±9. 3pg/ml。
[0081] 脊髓损伤0天时，B组的cAMP含量降到38. 4 ± 2. 3pg/ml，C组的cAMP含量为 78. 3±4. 2pg/ml，D组的cAMP含量为 112. 3±4. 3pg/ml。
[0082]脊髓损伤7天时，B组的cAMP含量为42.I±I. 8pg/ml，C组的cAMP含量为 90. 6±3. 6pg/ml，D组的cAMP含量为 151. 3±4. 6pg/ml。
[0083] 经统计学处理，p〈0. 05,有显著性差异。
[0084] 脊髓损伤14天时，B组的cAMP含量为53. 2±I. 9pg/ml，C组的cAMP含量为 110±3. 8pg/ml，D组的cAMP含量为 148. 6±5. 2pg/ml。
[0085] 经统计学处理，p〈0. 05,有显著性差异。
[0086] 由此，可以推断，二丁酰环磷腺苷钙可以更有效提高损伤脊髓中环磷腺苷的含量 或其合成。
[0087] 实施例3二丁酰环磷腺苷钙对神经元修复的影响
[0088] 实验SD大鼠分组和治疗处理同前述"实验材料和方法"。
[0089] 大鼠脊髓损伤后选定7天和14天时间点，腹腔注射过量1 %戊巴比妥，用400ml 4%多聚甲醛经心脏灌注固定。取材时以脊髓夹伤处为中心，从头侧LOcm处剪断取Imm 的组织。浸入25%蔗糖溶液中脱水。切片室温晾干，用0. 3%TritonX-IOO的1%BSA室 温封闭 30min，然后加入一抗（mouseanti-NeuN，Abeam，1:1000)，4°C孵育过夜，0?OlM的 PBS洗涤三遍，加入和一抗匹配的荧光二抗，室温孵育2小时，0.OlM的PBS洗涤三遍，缓冲 甘油封片后在荧光显微镜（BX51，Olympus)，（40X)下检测脊髓轴突生长情况。拍照后利用 Image-Proplus5. 0软件进行图像分析计数。
[0090] 图3为脊髓损伤后大鼠的神经元数目变化图，从图中可以看出：
[0091] 7天的NeuN阳性神经元数目如下：
[0092]A组 11029±1230,B组 1501±173,C组 2418±120,D组 6321±244。
[0093]经统计学处理，P〈0. 05,有显著性差异。
[0094] 14天NeuN阳性神经元数目如下：
[0095]A组 12013±1240,B组 1291±120,C组 4230±230,D组 8430±536。
[0096] 经统计学处理，P〈0. 05,有显著性差异。
[0097] 结果显示二丁酰环磷腺苷钙可以促进损伤脊髓组织中神经元的修复。
【主权项】
1. 二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的二丁酰环磷腺苷钙包括 C18H23N5O8P?l/2Ca和C18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20,优选为C18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的脊髓损伤包括神经元细胞变性、坏 死、和轴突退变。4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是以有效量的二丁酰环磷腺苷 钙为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物制剂。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂是冻干粉针或注射液，较佳 的是冻干粉针。6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的二丁酰环磷腺苷钙的给药剂量为 0? 6 ~I.Omg/kg体重 / 日。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的二丁酰环磷腺苷钙的给药方式为肌 肉注射、或静脉注射。
【专利摘要】本发明公开了二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。该药物是以有效量的二丁酰环磷腺苷钙为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。本发明的二丁酰环磷腺苷钙在大鼠脊髓损伤后功能恢复、神经元环磷腺苷浓度、神经元修复三个方面，有显著的改善作用。二丁酰环磷腺苷钙具有更加强大的活化环磷腺苷信号途径的能力，是优良的促进脊髓损伤恢复的药物。
【IPC分类】A61P25/00, A61K31/7076, A61P25/28
【公开号】CN104906124
【申请号】CN201510378582
【发明人】黄臻辉, 刘蓓, 丁金国, 董莹
【申请人】上海上药第一生化药业有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月1日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物化学领域，具体涉及二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药 物中的应用。
【背景技术】
[0002] 脊髓损伤是一种致残率高，愈后差的疾病，发病率为每年10. 4~83. 0/100万，并 有逐渐上升的趋势。脊髓损伤导致组织中部分或者全部的神经细胞、神经胶质细胞等死亡， 同时组织中的神经传导纤维发生断裂、脱髓鞘等，从而造成了脊髓神经功能的缺失。脊髓损 伤不仅可以导致损伤平面以下感觉、运动功能的障碍活丧失，还可能导致多个器官功能的 障碍，如呼吸系统、循环系统、泌尿系统和消化系统等。由于其造成劳动力的丧失、长时间的 康复治疗、占用大量的医疗资源以及昂贵的医疗费用，给个人、家庭以及全社会带来巨大的 负担。虽然手术治疗和药物治疗（如糖皮质激素）在不同程度上使受损的脊髓得到了恢复 和再生的空间，但仍不可避免的造成了病人瘫痪乃至死亡的严重后果。
[0003] 环磷腺苷是核苷酸的衍生物，近年的研宄表明，环磷腺苷在脊髓损伤恢复中具有 重要作用。脊髓损伤后的功能恢复主要受限于损伤轴突的再生能力。轴突再生失败是由 于轴突自身生长能力丧失造成，细胞外环境中的髓鞘磷脂抑制物等也能诱导轴突生长锥塌 陷、抑制轴突再生，星形胶质细胞形成的胶质瘢痕成为轴突延伸的物理屏障。更为关键的 是，脊髓损伤会导致神经元的变性、坏死或严重萎缩，减少了神经元的数量。因而，促进轴突 再生和神经元存活能改善中枢神经系统损伤后的修复。成年生物神经元之所以丧失再生能 力，重要原因之一是细胞内环磷腺苷水平下降。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对脊髓损伤疾病，提供一种二丁酰环磷腺苷钙的 药物新用途。本发明的发明人通过反复实验研宄发现，二丁酰环磷腺苷钙能够明显提高脊 髓损伤大鼠的行为学功能恢复、增加神经元环磷腺苷浓度、促进轴突生长，尤其是钙离子与 二丁酰环磷腺苷有协同作用，与单独使用二丁酰环磷腺苷相比，二丁酰环磷腺苷钙的药效 更加突出。
[0005] 本发明提供了二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。
[0006] 本领域技术人员均知晓，本发明的二丁酰环磷腺苷钙较佳地包括 C18H23N5O8P?l/2Ca和C18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20,本发明优选C18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20。
[0007] 其中，所述的脊髓损伤较佳地包括神经元细胞变性、坏死和轴突退变。
[0008] 其中，所述的二丁酰环磷腺苷钙的给药剂量较佳地为0.6~1.0mg/kg体重/日。 [0009] 其中，所述的二丁酰环磷腺苷钙的给药方式为静脉注射、或肌肉注射。
[0010] 其中，所述的药物较佳地是以有效量的二丁酰环磷腺苷钙为活性成分，加上药学 上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物制剂。
[0011] 其中，所述的药物制剂较佳地是冻干粉针或注射剂，最佳地是冻干粉针。
[0012] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0013] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0014] 本发明的积极进步效果在于：本发明研宄发现二丁酰环磷腺苷钙可用于中枢神经 系统功能损伤的修复，如脊髓损伤的修复。在大鼠脊髓损伤后BBB检测功能恢复、神经元环 磷腺苷浓度、神经元修复三个方面，二丁酰环磷腺苷钙的功能都显著超过二丁酰环磷腺苷。 二丁酰环磷腺苷钙不仅能够抑制磷酸二酯酶、防止环磷腺苷的降解，还能通过钙离子激活 腺苷酸环化酶、增加环磷腺苷的合成。因而二丁酰环磷腺苷钙具有更加强大的活化环磷腺 苷信号途径的能力，是优良的促进脊髓损伤恢复的药物。
【附图说明】
[0015] 图1为脊髓损伤后大鼠的BBB评分变化曲线图。
[0016] 图2为脊髓损伤后大鼠的脊髓中cAMP含量变化曲线图。
[0017] 图3为脊髓损伤后大鼠的神经元数目变化图。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0019] 实验材料和方法
[0020] 清洁SD雄性大鼠，体重200-220g，购于上海实验动物中心，分为四组、每组30只 (其中又分为〇、7、14天组各10只），分别为A组：阴性对照组（无脊髓损伤造模处理），B 组：生理盐水组（脊髓损伤造模后即肌注等量生理盐水），C组：注射二丁酰环磷腺苷组（即 脊髓损伤造模后即肌注二丁酰环磷腺苷〇. 16mg/日，以市售的20mg二丁酰环磷腺苷为活性 成分溶于2ml生理盐水中配制成溶液），D组：注射二丁酰环磷腺苷钙组（即脊髓损伤造模 后即肌注二丁酰环磷腺苷钙0. 16mg/日，以20mgC18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20为活性成分溶 于2ml生理盐水中配制成溶液）。
[0021] 二丁酰环磷腺苷钙来自上海上药第一生化药业有限公司（批次1306021)
[0022] 脊髓中度损伤大鼠模型一一双侧椎板去除术（T8)
[0023] (1)大鼠腹腔注射1%戊巴比妥（50mg/kg)充分麻醉后，俯卧，背部以TlO(椎体） 为中心剌毛备皮；
[0024] (2)暴露T8椎板，背侧中线30-40mm纵行切口，切开皮肤及皮下组织，暴露T6-11 节椎板；
[0025] (3)剪开T9两侧上关节突，并将T8两侧椎弓根剪断，使T8椎板与椎骨分离，移除 T8椎板，清创后清洗暴露硬脊膜包裹下的脊髓。
[0026] 脊髓夹伤
[0027] (1)用间隙0. 5mm镊子自脊髓两侧向内匀速闭合并保持闭合状态20秒；
[0028] (2)造模成功后，分层缝合肌肉和皮肤。
[0029] 实施例IBBB检测功能恢复实验
[0030] 将动物至于表面光滑，四周封闭的开放环境中，自由运动4分钟，用录像机进行摄 像。通过评估大鼠躯干，尾巴，后肢的运动情况来评分。根据BBB评分标准21分，分早中晚 三期：
[0031] 0分：无可见后肢运动
[0032] 1分：一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节
[0033] 2分：一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动
[0034] 3分：两个关节广泛活动
[0035] 4分：后肢全部三个关节可轻微活动
[0036] 5分：两个关节轻微活动，第三个关节可广泛活动
[0037] 6分：两个关节广泛活动，第三个关节可轻微活动
[0038] 7分：后肢全部三个关节可广泛活动
[0039] 8分：非承重情况下可以爪掌面着地
[0040] 9分：间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动 [0041] 10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作
[0042] 11分：可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作
[0043] 12分：可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作
[0044] 13分：常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作
[0045] 14分：有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续 型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动
[0046] 15分：持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓 地；初接触时主动爪位置与身体平行
[0047] 16分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常 见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。
[0048] 17分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常 见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。
[0049] 18分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可 持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。
[0050] 19分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可 持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。
[0051] 20分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后 主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。
[0052] 21分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置 始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。
[00531
[0054] 图1为脊髓损伤后大鼠的BBB评分变化曲线图。取0天、7天、14天三个时间点进 行观察。从图中可见，B、C、D组损伤（SCI)O天时大鼠后肢完全瘫痪（0分）。7天后，C组 (11. 1±0. 8)恢复显著高于B组（9. 8±0. 7)，D组（12. 5±0. 6)恢复显著高于C组；p〈0. 05， 有显著差异。14天后，C组（15. 6±0. 6)恢复显著高 于B组（12. 9±0. 9)，D组（18. 6±0. 6) 恢复显著高于C组；p〈0. 05,差异显著。BBB评分显示，钙离子可以促进二丁酰环磷腺苷对 损伤运动早期功能的修复。因此，二丁酰环磷腺苷钙可以显著提升脊髓损伤后大鼠的运动 功能修复。
[0055] 实施例2ELISA(酶联免疫吸附试验）检测cAMP(环磷腺苷）含量（0、7、14天）
[0056] R&D公司cAMP免疫检测ELISA试剂盒，应用酶联免疫吸附竞争法检测cAMP含量。
[0057] 准备阶段：
[0058] 1、试剂准备：
[0059] 冲洗缓冲液：30ml浓缩缓冲冲洗液加入蒸馏水稀释为300ml。
[0060] 乙酰化试剂：1ml三乙胺中加入0. 5ml无水醋酸，备用。
[0061] cAMP标准品（非乙酰化）：取900yIED2检测缓冲液加入试管I(200pmol/ml)， 其余 4 个试管（50pmol/ml，12. 5pmol/ml，3. 12pmol/ml，0? 78pmol/ml)分别加入 750yIED2 检测缓冲液。自cAMP标准品（2000pmol/ml)中取IOOul加入试管I;自试管1取250ul加 入试管2,试管2取250ul液体加入试管3,试管3取250ul液体加入试管4,试管4取250ul 液体加入试管5。以试管1溶液为cAMP含量高标准品（200pmol/ml)，ED2检测缓冲液为零 标准品（Opmol/ml)，1小时内使用。
[0062] cAMP标准品（乙酰化）：取990yIED2检测缓冲液加入试管I(20pmol/ml)，其余 4 个试管（5pmol/ml，1.25pmol/ml，0.312pmol/ml，0.078pmol/ml)分别加入 750ylED2 检 测缓冲液。自cAMP标准品（2000pmol/ml)中取10y1加入试管1 ;自试管1取250y1加入 试管2,试管2取250ul液体加入试管3,试管3取250ul液体加入试管4,试管4取250y1 液体加入试管5。以试管1溶液为cAMP含量高标准品（20pmol/ml)，ED2检测缓冲液为零 标准品（Opmol/ml)，半小时内使用。
[0063] 2、标本准备
[0064] 实验SD大鼠分组和治疗处理同前述"实验材料和方法"。
[0065] 样本取材：吸入乙醚麻醉，剪断包含伤段脊髓脊柱及左右侧相连肋骨取下一段长 约Icm脊柱，用锡箔纸包裹浸入液氮罐保存用于ELISA测定cAMP。从液氮罐中取出标本研 磨称重，加入10倍溶剂5%三氯醋酸，离心去上清加入3倍容积水合乙醚，干燥去水后加入 ED2检测缓冲液备用。
[0066] 3、标准品及标本乙酰化
[0067] 每200ulcAMP标准品或待测标本加入IOul乙酰化试剂，每Iml零标准-ED2检测 缓冲液加入50ul乙酰化试剂乙酰化。
[0068] 实验步骤：
[0069] 加入150y1缓冲液到NSB微孔，加入IOOul缓冲液到零标准品微孔，加入100y1 标准品或样本安排其余各微孔；加入50yIcAMP偶联物到总活性及空白测定微孔外的各 微孔；加入50yIcAMP抗体溶液到除NSB微孔，总活性及空白测定微孔外的各微孔。封闭 微孔室温孵育2小时。
[0070] 洗板，倾空各微孔并用洗涤缓冲液冲洗3次，倒出残存液体。
[0071] 总活性测定微孔内加入5ylIcAMP偶联物。
[0072] 所有微孔内加入对硝基苯作用物200y1，室温孵育1小时。
[0073] 所有微孔内加入反应中止溶液50yl。
[0074] 用酶标仪（美国伯乐BIO-RAD680,检测波长450nm)测定各微孔光密度OD值。
[0075] 结果判定：
[0076] 算出各标准品及样本OD均数，减去NSB的OD均数。
[0077] 计算百分结合率B/BJ% )，用样品或标准液吸光度值（B)除以零标准吸光度值 (B0)X100%，B/BQ(% ) = (0D-NSBV(0Dq-NSB)X100,OD为给定样品吸光值，ODtl为阳性对 照的吸光值，NSB为阴性对照的吸光度值；
[0078] 以乙酰化cAMP标准液对数浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标 准曲线测出样品cAMP浓度。
[0079] 图2为脊髓损伤后大鼠的脊髓中cAMP含量变化曲线图。从图中可见：
[0080] 脊髓损伤空白对照组（即A组）cAMP为102. 3 ±9. 3pg/ml。
[0081] 脊髓损伤0天时，B组的cAMP含量降到38. 4 ± 2. 3pg/ml，C组的cAMP含量为 78. 3±4. 2pg/ml，D组的cAMP含量为 112. 3±4. 3pg/ml。
[0082]脊髓损伤7天时，B组的cAMP含量为42.I±I. 8pg/ml，C组的cAMP含量为 90. 6±3. 6pg/ml，D组的cAMP含量为 151. 3±4. 6pg/ml。
[0083] 经统计学处理，p〈0. 05,有显著性差异。
[0084] 脊髓损伤14天时，B组的cAMP含量为53. 2±I. 9pg/ml，C组的cAMP含量为 110±3. 8pg/ml，D组的cAMP含量为 148. 6±5. 2pg/ml。
[0085] 经统计学处理，p〈0. 05,有显著性差异。
[0086] 由此，可以推断，二丁酰环磷腺苷钙可以更有效提高损伤脊髓中环磷腺苷的含量 或其合成。
[0087] 实施例3二丁酰环磷腺苷钙对神经元修复的影响
[0088] 实验SD大鼠分组和治疗处理同前述"实验材料和方法"。
[0089] 大鼠脊髓损伤后选定7天和14天时间点，腹腔注射过量1 %戊巴比妥，用400ml 4%多聚甲醛经心脏灌注固定。取材时以脊髓夹伤处为中心，从头侧LOcm处剪断取Imm 的组织。浸入25%蔗糖溶液中脱水。切片室温晾干，用0. 3%TritonX-IOO的1%BSA室 温封闭 30min，然后加入一抗（mouseanti-NeuN，Abeam，1:1000)，4°C孵育过夜，0?OlM的 PBS洗涤三遍，加入和一抗匹配的荧光二抗，室温孵育2小时，0.OlM的PBS洗涤三遍，缓冲 甘油封片后在荧光显微镜（BX51，Olympus)，（40X)下检测脊髓轴突生长情况。拍照后利用 Image-Proplus5. 0软件进行图像分析计数。
[0090] 图3为脊髓损伤后大鼠的神经元数目变化图，从图中可以看出：
[0091] 7天的NeuN阳性神经元数目如下：
[0092]A组 11029±1230,B组 1501±173,C组 2418±120,D组 6321±244。
[0093]经统计学处理，P〈0. 05,有显著性差异。
[0094] 14天NeuN阳性神经元数目如下：
[0095]A组 12013±1240,B组 1291±120,C组 4230±230,D组 8430±536。
[0096] 经统计学处理，P〈0. 05,有显著性差异。
[0097] 结果显示二丁酰环磷腺苷钙可以促进损伤脊髓组织中神经元的修复。
【主权项】
1. 二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的二丁酰环磷腺苷钙包括 C18H23N5O8P?l/2Ca和C18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20,优选为C18H23N5O8P?l/2Ca? 2. 3H20。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的脊髓损伤包括神经元细胞变性、坏 死、和轴突退变。4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是以有效量的二丁酰环磷腺苷 钙为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物制剂。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂是冻干粉针或注射液，较佳 的是冻干粉针。6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的二丁酰环磷腺苷钙的给药剂量为 0? 6 ~I.Omg/kg体重 / 日。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的二丁酰环磷腺苷钙的给药方式为肌 肉注射、或静脉注射。
【专利摘要】本发明公开了二丁酰环磷腺苷钙在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。该药物是以有效量的二丁酰环磷腺苷钙为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。本发明的二丁酰环磷腺苷钙在大鼠脊髓损伤后功能恢复、神经元环磷腺苷浓度、神经元修复三个方面，有显著的改善作用。二丁酰环磷腺苷钙具有更加强大的活化环磷腺苷信号途径的能力，是优良的促进脊髓损伤恢复的药物。
【IPC分类】A61P25/00, A61K31/7076, A61P25/28
【公开号】CN104906124
【申请号】CN201510378582
【发明人】黄臻辉, 刘蓓, 丁金国, 董莹
【申请人】上海上药第一生化药业有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月1日
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