microRNA-326的抑制剂在制备治疗白内障的药物中的应用
microRNA-326的抑制剂在制备治疗白内障的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及microRNA-326的抑制剂在制备 治疗白内障的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 凡是各种原因如老化、遗传、局部营养障碍、免疫与代谢异常、外伤、中毒、辐射等， 都能引起晶状体代谢紊乱，导致晶状体蛋白质变性而发生混浊，称为白内障，此时光线被混 浊晶状体阻扰无法投射在视网膜上，导致视物模糊。多见于40岁以上，且随年龄增长而发 病率增多。
[0003] microRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后 组装进RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，通过碱基互补 配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶 mRNA的翻译。研宄表明miRNAs参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、 器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
[0004] microRNA-326在调控多种肿瘤的发病中起重要作用，有文献报道，microRNA-326 的表达与食管癌的预后相关；在结直肠癌、神经胶质瘤等肿瘤中也发挥重要作用，在多发性 硬化病人中表达上调且通过作用于CD47发挥作用，在肺纤维化病人中调控TGF-0因子的 促纤维化作用，也有报道microRNA-326能作为临床药物治疗的候选检测靶点。
[0005] betaB2晶状体蛋白（CRYBB2)与白内障的产生关系密切，有研宄表明，在白 内障病人晶状体中其表达下降（HuangCH,WangYT,TsaiCF,ChenYJ,LeeJS,Chiou SH.Phosphoproteomicscharacterizationofnovelphosphorylatedsitesoflens proteinsfromnormalandcataractoushumaneyelenses.MolecularVision2011 ； 17:186-198.)，CRYBB2基因突变常发生在外显子6上，造成氨基酸折叠异常，从而造成晶状 体结构异常，减弱了在其水溶状态下的稳定性，引起晶状体透明性发生改变，最终导致先天 性白内障的发生（ChenW，ChenX，HuZ，LinH，ZhouF，LuoL，ZhangX，ZhongX，YangY，Wu CjLinZjYeSjLiuY.AMissenseMutationinCRYBB2LeadstoProgressiveCongenital MembranousCataractbyImpactingtheSolubilityandFunctionofbB2-Crystallin. PLoS0ne.2013;8(ll):e81290.)。本课题组构建了CRYBB2基因敲除小鼠模型（张军， 黄才国，李闻捷，WeiWeng，汪佳祺.0B2晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立.第二军 医大学学报.2006 ;27 (11) : 1246-1248.)，并一直进行CRYBB2的相关研究，且在研究中发 现CRYBB2基因敲除小鼠在出生后数月内发生皮质性白内障，其程度随年龄增长而加重 (ZhangJ,LiJ,HuangC，XueL，PengY，FuQ，GaoL，ZhangJ，LiW.TargetedKnockout oftheMouse0B2_crystallinGene(BetaB2)InducesAge-RelatedCataract.Invest OphthalmolVisSci，2008 ;49 (12):5476-5483.)。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供microRNA-326的抑制剂的用途。
[0007] 本发明的再一的目的是，提供一种用于治疗白内障或晶状体浑浊的DNA序列。
[0008] 本发明的另一的目的是，提供一种用于治疗白内障或晶状体浑浊的基因载体。
[0009] 本发明的第四个目的是，提供用于检测microRNA-326含量的试剂的用途。
[0010] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0011] 第一方面，microRNA-326的抑制剂在制备治疗白内障的药物中的应用。
[0012] 第二方面，microRNA-326的抑制剂在制备治疗晶状体浑浊的药物中的应用。
[0013] 第三方面，microRNA-326的抑制剂在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗 betaB2晶状体蛋白下调引起的疾病。
[0014] 所述的microRNA-326的抑制剂选自可以降低microRNA-326含量的小干扰RNA、 dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义 核酸的构建物。
[0015] 优选地，所述的microRNA-326 的抑制剂为SEQIDNO. 10 第 6-25bp或SEQID NO. 11第6-25bp所示的DNA序列。
[0016] 优选地，所述的microRNA-326的抑制剂为包含SEQIDNO. 10第6-25bp或SEQID NO. 11第6-25bp所示DNA序列的基因载体。
[0017] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0018] 一种用于治疗白内障或晶状体浑浊的DNA序列，所述的DNA序列如SEQIDNO. 10 第 6-25bp或SEQIDNO. 11 第 6-25bp所示。
[0019] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0020] 一种基因载体，所述的基因载体含有如SEQIDNO. 10第6-25bp或SEQIDNO. 11 第6-25bp所示的DNA序列。
[0021] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0022] 用于检测microRNA-326含量的试剂在制备诊断白内障或晶状体浑浊的试剂中的 应用。
[0023] 本发明优点在于：
[0024] 1、本发明通过实验证实microRNA-326可以抑制FGFl的表达，从而下调betaB2 的表达，而betaB2晶体蛋白含量的变化是白内障发生的关键性因素，betaB2晶体蛋白表 达量的下调将导致白内障。本发明提示可通过抑制microRNA-326来治疗白内障，同时 microRNA-326可作为白内障诊断的标志物；
[0025] 2、本发明提供了一种microRNA-326的抑制剂，其抑制作用十分显著，可用于白内 障或晶体浑浊的治疗。
【附图说明】
[0026] 图1.双荧光素酶报告基因载体pmirGLO图谱。
[0027] 图2?表达载体pLKO. 1图谱。
[0028] 图3.绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Nl图谱。pEGFP-Nl载体的限制性酶切图和多 克隆位点（MCS)。（单一的限制性位点被加粗）。NotI位点位于EGFP终止子之后。XbaI位点（*)的DNA被CL0NTECH公司甲基化。如果你想要用酶消化该载体，你需要将该载体转 化入dam-型大肠杆菌制备新的DNA。
[0029] 图4.1^1?隱芯片筛选图，图片显示11111?-326、11111?-204、11111?-330-5口在新生鼠中特异 性低表达，而在成年鼠中高表达，且与小鼠视觉系统相关。
[0030] 图5.betaB2基因敲除小鼠血清中miRNA筛查，结果显示CRYBB2基因敲除后 miR-326和miR-204的表达均下降，miR-326表达差异最明显。
[0031] 图6.转基因小鼠基因型鉴定，ABC三条片段均扩增出来的为杂合子，仅扩增出B条 带的为野生型，仅扩增出A、C两条片段的为纯合子。
[0032] 图7.在白内障患者的血清中检出较高含量的miR-326。
[0033] 图8.双荧光素酶报告基因实验证实miR-326的靶基因为FGFl。
[0034] 图9.HLEC-B3细胞转染miR-326模拟物，经RT-PCR和westernblot实验验证显 示miR-326可显著抑制FGFl的表达。
[0035] 图 10.Anti-miR-326 质粒转染HLEC-B3 细胞，采用RT-PCR和westernblot进行 验证，结果显示转染miR-326抑制载体后FGFl与CRYBB2的表达显著上调。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0037] 实施例1
[0038] 1材料和方法
[0039] I. 1 材料
[0040] I.I. 1研宄对象
[0041] 人晶状体上皮细胞HLEC-B3细胞系购自武汉原生原代生物医药科技有限公司。
[0042] 小鼠C57BL/C，灰色，购自第二军医大学实验动物中心。
[0043] 1.1. 2所用载体
[0044] 双荧光素酶报告基因载体pmirGLO购自Promega公司，商品号Cat. #E1330,载体图 谱如图1所示；表达载体pLKO. 1购自Addgene公司，载体图谱如图2所示；绿色荧光蛋白表 达载体pEGFP-Nl购自Addgene公司，载体图谱如图3所示，在本研宄中作为对照质粒。
[0045] 1.1.3PCR引物序列
[0046]
[0047] I. 1. 4目的片段序列
[0048] l)miR-326模拟物的序列
[0049] CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG(SEQIDNO. 5)
[0050] 2)pmirGLO-FGFl野生载体中的FGFl片段
[0051] A-H-FGFl-miR326-WT-F：
[0052] AAACTAGCGGCCGCAAAGATACCCAGAGAGGAAATT(SEQI DNO. 6)，其中加下划线字体为 FGFl片段，两端为酶切位点。
[0053] A-H-FGFl-miR326-WT-R：
[0054] CTAGAATTTCCTCTCTGGGTATCTTTGCGGCCGCTAGTTT(SEQIDNO. 7)，其中加下划线字 体为FGFl片段，两端为酶切位点。
[0055] 3)pmirGL0-FGFl突变载体中的FGFl突变片段
[0056] A-H-FGFl-miR326-Mut-F：
[0057] AAACTAGCGGCCGCAAAGATACCAGTAGAGGAAATT(SEQIDNO. 8)，其中加下划线字体为 FGFl突变片段，两端为酶切位点。
[0058] A-H-FGFl-miR326-Mut-R：
[0059] CTAGAATTTCCTCTACTGGTATCTTTGCGGCCGCTAGTTT(SEQIDNO. 9)，其中加下划线字 体为FGFl突变片段，两端为酶切位点。
[0060] 4)Anti_miR326 即miR326 的抑制体序列
[0061]A-H-Anti-miR326-F：CCGGTCTGGAGGAAGGGCCCAGAGGG(SEQIDNO. 10)，其中加下划 线字体为抑制体序列，两端为酶切位点。
[0062] A-H-Anti-miR326-R：AATTCCCTCTGGGCCCTTCCTCCAGA(SEQIDNO. 11)，其中加下 划线字体为抑制体序列，两端为酶切位点。
[0063] I. 1. 5主要试剂
[0064]
[0068] I. 2 方法
[0069] I. 2.ImiRNA筛选与靶基因预测
[0070] 通过PicTar、SangermiRBase及TargetScanalgorithms这几个生物信息学 数据库对miRNA与betaB2的相关性进行初步筛选，发现miR-326、miR-204、miR-330-5p、 miR-491-5p与betaB2之间存在靶向性关系，然后我们应用已有的小鼠模型对筛选出来的 miRNA进行验证。
[0071] (DmiRNA提取
[0072] 1)分别取WT组和KO组（betaB2基因敲除）小鼠血清200y1，加入ImlTrizol 试剂，振荡混匀后静置5min;
[0073] 2)加入200y1氯仿，剧烈振荡混匀15s，静置5min;
[0074] 3)4°C12000g离心15min，小心吸取上层水相，转移至新的离心管中；
[0075] 4)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20°C静置过夜；
[0076] 5)4°〇1200(^离心1〇1^11，弃上清；75%乙醇洗涤沉淀，超净台内风干；
[0077] 6)加入适量的DEPC水溶解沉淀，-80 °C保存备用。
[0078] ⑵miRNA反转录
[0079] 采用TaKaRa公司的SYBRxPrimeScript?miRNART-PCRKit试剂盒。
[0080] 1)按照下列组份配制反应液（冰上进行）：
[0081]
[0082] 2)反应条件
[0083] 37°C60min(PolyA加尾和反转录反应）
[0084] 85°C5s(反转录酶的失活反应）
[0085] (3)PCR
[0086] 1)按照下列组份配制反应液（冰上进行）：
[0087]
[0088] 2)反应条件
[0089] 预变性：95°C30s
[0090] PCR反应：40cycles
[0091] 95〇C15s
[0092] 60°C30s
[0093] I. 2. 2细胞培养与传代
[0094] 人晶状体上皮细胞（HLEC-B3)培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37°C、 5%CO2条件下进行常规培养。当细胞密度达到70% -80%时进行传代培养，先弃去原细胞 培养液，PBS清洗2次后加入Iml0. 25 %的胰蛋白酶消化2-3min，显微镜观察待细胞变圆 开始脱落时弃去胰蛋白酶，加入完全培养液终止消化，并用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，按 比例稀释后传至另一培养瓶中，37°C、5% 0)2条件下继续培养，定期观察细胞生长情况。 [0095] 1. 2. 3荧光素酶报告基因实验
[0096] 将TargetScan预测出的miRNA与mRNA结合序列记录并合成，装入焚光素酶报告 基因载体PmirGLO中，然后将包含结合序列的pmirGLO质粒与miRNA共转染到HLEC-B3细 胞中，如果该miRNA确实可以通过构建在pmirGLO上的那段序列抑制基因的表达，则萤火虫 荧光素酶的发光强度会下降，而海肾荧光素酶的荧光强度则会维持不变。
[0097] (l)miR-326靶基因序列设计与合成
[0098] 基于生物信息学的方法，通过miRBaseTargets数据库查找Has-miR-326的革巴基 因序列，人工合成其DNA序列及互补序列。
[0099] (2)退火
[0100] 将合成好的单链DNA序列稀释到10yM/y1，退火形成双链DNA片段。反应体系如 下：
[0101]
[0102] 混匀后95°C加热3min，然后缓慢降温至37°C，_20°C保存备用。
[0103] (3)pmirGL0质粒酶切与鉴定
[0104] pmirGLO质粒酶切体系如下：
[0105]
[0106] 混匀后 37°C反应 40min。
[0107] 1)琼脂糖凝胶电泳
[0108] ①配胶：用TAE缓冲液配制1 %浓度的琼脂糖凝胶，加热使之充分溶解，按1:10000 加入核酸染料，倒入制胶模板中并插入梳子，自然冷却成型；
[0109] ②向上述DNA样品中加入1/6体积的LoadingBuffer，混勾后上样；
[0110] ③电泳：110V电泳 25min;
[0111] ④用凝胶成像仪观察电泳结果。
[0112] 2)胶回收
[0113] 糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgelMidiPurificationKit(DP209)说明书操作。
[0114] ①向吸附柱CA2中加入500y1平衡液BL，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0115] ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余的部分），放入干净 的离心管中，称取重量；
[0116] ③向胶块中加入等倍体积溶胶液PN，50°C水浴放置lOmin，其间不断温和地上下 翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
[0117] ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心lmin， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
[0118] ⑤向吸附柱CA2中加入600y1漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱CA2放入收集管中，重复一次；
[0119] ⑥将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液；将吸附柱 CA2置于室温放置数分钟以彻底晾干；
[0120] ⑦将吸附柱CA2置于一个干净离心管中，向吸附膜中间滴加适量洗脱缓冲液EB， 室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。
[0121] (4)连接
[0122] 1)反应体系如下：
[0123]
[0124] 2)反应条件：冰上30min
[0125] 16°CIh
[0126] (5)转化
[0127] 1)取出2管感受态细胞（50y1/管），放在冰上融化；
[0128] 2)每50y1感受态细胞中加入5y1连接产物，其中1管加连接产物，1管作为阴 性对照（不加任何DNA)，用移液器轻轻吹打混勾，冰上放置30min;
[0129] 3)热激：42°C水浴 90s;
[0130] 4)迅速转移到冰上冷却3-5min;
[0131] 5)每管加入LB培养基800yl，37°C摇床温育45min，使细菌复苏；
[0132] 6)4000rpm离心2min，保留约100y1上清液，重新混匀后将菌液均匀涂布于含有 AMP的LB琼脂平板培养基上，37°C培养箱孵育20min后，倒置平板继续培养12-16h;
[0133] 7)挑取单克隆菌落接种于5mlLB液体培养基（含抗生素）中，37°C摇床温育 16-18h〇
[0134] (6)质粒抽提
[0135] 参照质粒小抽试剂盒TIANgelMiniPlasmidKit(DP103)说明书操作。
[0136] 1)向吸附柱CP3中加入500y1平衡液BL，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0137] 2)取上述培养的菌液l-5ml，加入离心管中，12000rpm离心lmin，尽量吸除上清；
[0138] 3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250y1溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器使 沉淀彻底悬浮；加入250y1溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；加入350y1 溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀；12000rpm离心 IOmin；
[0139] 4)将上清液全部转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱放回收集管中；
[0140] 5)加入600y1漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集 管中，重复一次；
[0141] 6)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除吸附柱中残余的漂 洗液；
[0142] 7)将吸附柱CP 3置于一个干净离心管中，向吸附膜中间滴加50-100y1洗脱缓冲 液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
[0143](7)测序与序列比对
[0144] 将构建的载体送到上海生工生物工程有限公司进行测序，并进行序列比对。
[0145] (8)细胞转染
[0146] 操作方法参见1. 2. 4。
[0147] (9)报告基因检测miR-326对其靶基因的作用
[0148] 参照双荧光素酶报告基因活性检测试剂盒（Promega)说明书操作。
[0149] 1)细胞收集：吸除细胞培养液，PBS清洗2次，加入IXPLB细胞裂解液500yl，室 温放置15min，轻轻吹打后收集细胞悬液；
[0150] 2)萤火虫焚光素酶活性检测：取 100yILARII(LuciferaseAssayReagent)加 入荧光测定管底部，再加入20y1待测样品，轻轻混匀后，放入仪器进行检测，读数为Rl;
[0151] 3)海肾荧光素酶活性检测：取100y1稀释好的StopReagent加入步骤2)的测 定管中，轻轻混匀后，放入仪器进行检测，读数为R2 ;
[0152] 4)R1/R2表示相对荧光素酶活性。
[0153] L2. 4细胞转染
[0154] 采用阳离子脂质体转染法将上述重组质粒转染到HLEC-B3细胞中，参照 Invitrogen公司Lipofectamine2000转染试剂盒说明书操作。
[0155] (1)转染前一天，胰酶消化HLEC-B3细胞并计数，接种于6孔板中，加入含10%FBS 的DMEM细胞培养液，于37°C、5%CO2条件下培养，当细胞密度达到70% -80%时开始转染；
[0156] (2)配制溶液A:60yILipofectamine2000+1500yIOpti-MEM(无血清、无抗生 素），轻轻混匀后室温静置5min;
[0157] (3)配制溶液B:① 20yIpmirGL0-miR-326-WT+500yIOpti-MEM
[0158] ② 20yIpmirGL0-miR-326_Mut+500yIOpti-MEM
[0159] ③ 20yIpmirGL0-Control+500yIOpti-MEM
[0160] (4)轻轻混匀溶液A、B，将溶液A分装到溶液B中，每管500y1，轻轻混匀后室温 静置20min;
[0161] (5)等待期间开始处理细胞，吸除培养板中的原细胞培养液，用无血清的 Opti-MEM培养液洗涤2次，然后每孔加入2ml无血清Opti-MEM培养液；
[0162] (6) 20min到时，将上述3管混合液分别滴加于6孔板中，每管分2孔（500y1/ 孔）滴加，轻轻来回摇动培养板，使转染混合液均匀覆盖于细胞表面，37°C、5 %CO2条件下 培养；
[0163] (7)培养6h后换液，加入新的含10%FBS的无抗生素DMEM完全培养液继续培养；
[0164] (8)转染48h后，收集细胞进行报告基因活性检测。
[0165] L2. 5Anti-miR-326腺病毒表达载体的构建
[0166] 通过构建miR-326抑制体的腺病毒表达载体，进一步在体内外探宄miR-326对 betaB2晶体蛋白的调控作用。miR-326抑制体所采用的载体为pLKO. 1，该载体附带U6启动 子，可在真核细胞内稳定表达miRNA。由于该载体带有部分慢病毒重组酶基因，因此其表达 稳定性高于一般载体，而且其自带的重组酶框架还可以顺利组装为慢病毒使用。
[0167] (1)设计并合成miR-326抑制体寡核苷酸序列
[0168] 设计并合成miR-326抑制体寡核苷酸序列SEQIDNO. 10和SEQIDNO. 11。
[0169]⑵退火
[0170] 操作方法同前。
[0171] (3)pLK0. 1质粒酶切与鉴定
[0172] l)pLK0. 1质粒酶切体系如下：
[0173]
[0175] 混匀后 37°C反应 40min。
[0176] 2)琼脂糖凝胶电泳及胶回收
[0177] 操作方法同前。
[0178] (4)连接、转化、质粒抽提、测序与序列比对
[0179] 操作方法同前。
[0180] (5)腺病毒包装
[0181] 将构建成功的Anti-miR-326载体交由上海和元生物技术有限公司进行腺病毒包 装。
[0182] 1. 2. 6实时荧光定量PCR
[0183] (1)总RNA的提取
[0184] 1)将Anti-miR-326腺病毒转染HLEC-B3细胞，细胞培养至对数生长期，弃去细胞 培养液，加入ImlTrizol试剂，均匀覆盖细胞表面，静置5min使细胞完全裂解，反复吹打细 胞，然后全部转移到I. 5ml的EP管中；
[0185] 2)加入200y1氯仿，剧烈振荡混匀15s，静置5min;
[0186] 3)4°C12000g离心15min，小心吸取上层水相，转移至新的离心管中；
[0187] 4)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置IOmin;
[0188] 5)4°〇1200(^离心1〇1^11，弃上清；75%乙醇洗涤沉淀，超净台内风干；
[0189] 6)加入适量的DEPC水溶解沉淀，-80 °C保存备用。
[0190] (2)RT-PCR
[0191] 1)反转录合成cDNA
[0192] 米用TaKaRa公司的PrimeScript?RTReagentKit试剂盒。
[0193] ①按照下列组份配制反应液（冰上进行）：
[0194]
[0195] ②反应条件：
[0196] 37°C 15min(反转录反应），
[0197] 85°C 5s(反转录酶的失活反应）。
[0198] 2)PCR
[0199] ①按照下列组份配制反应液（冰上进行）：
[0200]
[0201] ②反应条件：
[0202] 预变性：95°C30s
[0203] PCR反应：40cycles
[0204] 95°C 5s
[0205] 60°C 30s
[0206] I. 2. 7Westernblot检测FGFl与betaB2 晶体蛋白的表达
[0207] (1)细胞总蛋白的提取
[0208] Anti-miR-326腺病毒感染HLEC-B3细胞48h后，弃培养基，PBS洗涤2次，加入 RIPA裂解液，冰上放置30min使细胞充分裂解；将细胞裂解液全部转移至I. 5mlEP管中， 4°C12000rpm离心20min，小心吸取上清液于新的EP管中，-80°C保存备用。
[0209] (2)BCA法蛋白定量
[0210] 1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量的 BCA工作液，充分混匀后备用；
[0211] 2)待蛋白标准品完全溶解，取10y1稀释至100y1，使蛋白终浓度为0. 5mg/ml;
[0212] 3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20y1加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释 液补足到20y1 ;
[0213] 4)加10y1蛋白质样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20y1，每个样 品设2个平行复孔；
[0214] 5)每孔加BCA工作液 200y1，37°C孵育 30min;
[0215] 6)用酶标仪测定562nm处的吸光度，根据标准曲线计算出样品的浓度。
[0216] (3)SDS-PAGE蛋白电泳
[0217] 1)向上述蛋白质样品中加入1/4体积的5XSDS上样缓冲液，混匀后煮沸lOmin， 短暂离心后备用；
[0218] 2)配制15%分离胶10ml，配方如下：
[0219]
[0220] 3)小心将分离胶注入准备好的制胶板空隙中，每块约4ml，用去离子水赶走气泡， 静置20min，待胶完全凝固后，倒掉上面的去离子水，用滤纸将水吸干；
[0221] 4)配制5 %浓缩胶5ml，配方如下：
[0222]
[0223] 5)小心注入浓缩胶，每块约2ml，迅速插入梳子，避免产生气泡；
[0224] 6)待胶完全凝固后，小心拔掉梳子，准备加样；两端加入IXSDS上样缓冲液，第二 孔加Maker，中间加蛋白质样品，加样量视蛋白浓度而定；
[0225] 7)电泳：恒压60V电泳至分离胶后改为120V，待溴酚蓝电泳至分离胶下边缘，停止 电泳；
[0226] (4)转膜
[0227] 先用甲醇活化PVDF膜，从转移夹的负极到正极依次为海绵垫一2层滤纸一胶一 PVDF膜一2层滤纸一海绵垫，注意不要产生气泡，整个操作在转膜缓冲液中进行，合起 夹子放入转移槽内，使夹子的黑面对应槽的黑面，白面对应槽的红面；恒流200mA转膜 40-50min，转膜过程中会产热，需在转移槽的周围放上冰块来降温。
[0228] (5)免疫反应
[0229] 1)封闭：转膜结束后将PVDF膜放入盛有5%脱脂牛奶的平皿中，封闭3h以上或过 夜；
[0230] 2) -抗：用封闭液或BSA稀释一抗（1:1000 稀释FGF1，1:500 稀释CRYBB2,1:1000 稀释0 -actin)，4°C摇床孵育过夜；
[0231]3)洗膜：TBST洗涤3次，每次IOmin;
[0232] 4)二抗：1:2000稀释二抗，室温孵育I_2h;
[0233] 5)洗膜：TBST洗涤3次，每次IOmin;
[0234] (6)曝光显影
[0235] 将ECL发光试剂盒中的A、B两种试剂等体积混合，配成工作液；在滤纸上将PVDF 膜沥干，滴加适量的工作液使 膜浸润，放入自动显影仪中进行显影并拍照。
[0236] (7)所用试剂的配制方法
[0237] 1)5X电泳缓冲液
[0238] Tris 15.Ig
[0239] Glycine 94g
[0240]SDS5.OOg
[0241] 蒸馏水定容至1000ml
[0242] 丨谷解后室温保存，用时稀释5 {首。
[0243] 2) 10X转膜缓冲液
[0244] Tris 30. 3g
[0245] Glycine 151.Ig
[0246] 蒸馏水定容至1000ml
[0247] 溶解后室温保存，用时稀释10倍，并加入甲醇至20% (先加甲醇易产生沉淀）。 3) 10XTBS缓冲液
[0248] Tris 24. 2g
[0249] NaCl 80.Og
[0250] 蒸馏水定容至1000ml
[0251] 浓盐酸调pH至7. 6,溶解后室温保存。
[0252] 4)ITBST缓冲液
[0253] 10XTBS缓冲液100mL
[0254] 蒸馏水 900ml
[0255] Tween-20 Iml
[0256] 溶解后室温保存。
[0257] 5)封闭液（5%脱脂牛奶）
[0258] IXTBST缓冲液 95-lOOml
[0259] 脱脂奶粉 5g
[0260] 溶解后4°C保存，可于一周内使用。
[0261] 6) 10 % 过硫酸胺（AP)
[0262] 过硫酸胺 0.Ig
[0263] 蒸馏水 Iml
[0264] 现用现配，溶解后，4°C保存，保存时间为1周。
[0265] 1. 2. 8统计学分析
[0266] 所有统计数据以均值土标准差表示，采用SPSS20. 0软件先对数据进行正态性分 析和方差齐性分析，然后进行均值t检验，P〈0. 05 (双侧检验）为差异具有统计学意义。
[0267] 2 结果
[0268] 2.lbetaB2基因敲除后miR-326表达显著降低
[0269] 通过对数据库的分析，我们发现了许多在小鼠出生后特异性高表达的miRNA，并对 其信号通路进行分析，最后我们筛选出了miR-326等8种在小鼠出生后表达量上升，且被认 为与小鼠视觉系统相关的miRNA进行验证（图4)。
[0270] 我们采用betaB2晶体蛋白基因敲除的小鼠进行研宄，该小鼠被特异性敲除 了betaB2基因，约在6-8周龄会高发白内障。通过PCR验证发现，在这些转基因小鼠中 miR-326呈特异性的低表达状态（图5)。这些小鼠的betaB2基因由于缺少第一、二外显子， 只能表达无意义的蛋白序列（图6)。因此我们推测，当机体betaB2基因表达发生异常时， 会启动一些机制来表达miR-326,而miR-326则可以通过某些途径调控betaB2的表达。
[0271] 另外，我们在来我院做检查的白内障患者的血清中，检测出了较高含量的 miR-326,这也暗示了miR-326的高表达可能与白内障相关（图7)。
[0272] 2. 2报告基因实验证实miR-326的靶基因为FGFl
[0273] 为阐明miR-326对betaB2的调控作用，我们对miR-326进行了生物信息学分析， 发现miR-326可能的靶基因有6个。我们将这6个靶基因与miR-326的预测结合序列分别 装到报告基因载体PmirGLO中，然后与miR-326共转染到HLEC-B3细胞中，24h后检测报告 基因的强度变化。实验结果显示，相比于转染pmirGLO-mock的对照组，转染含FGFl预测序 列（即SEQIDNO. 6和SEQIDNO. 7中加下划线的片段）的pmirGLO-miR-326-FGFl组的 相对荧光素酶强度（Luc/Rlu)发生了显著变化。
[0274] 为进一步明确两者之间的关系，我们构建了miR-326针对FGFl预测结合序列的突 变体miR-326-FGFl-Mut(突变序列如SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9所示），并装入报告基因 载体pmirGLO中。将pmirGLO-miR-326-FGFl-Mut和pmirGLO-miR-326-FGFl-WT分别转染到 HLEC-B3中，然后检测其荧光强度的变化。结果我们发现，转染pmirGLO-miR-326-FGFl-WT 组相比于转染pmirGLO-miR-326-FGFl-Mut组的荧光素酶强度显著下降（图8)。因此可以 证实miR-326的靶基因为FGF1。
[0275] 2. 3miR_326 抑制FGFl的表达
[0276] 为验证miR-326对FGFl的抑制作用，我们构建了miR-326的模拟物（序列如 SEQIDNO. 5所示），将该模拟物与作为对照的miRNA-mock(mock序列为R-H-miR-204-F， irCCCITTGTCATCCTATGCCT，SEQIDNO. 12)分别转染到HLEC-B3 中。结果发现转染miR-326 模拟物后FGFl的表达量显著下降，同时通过westernblot实验也证实miR-326可以抑制 FGFl的表达（图9)。
[0277] 2. 4miR_326通过抑制FGFl调控betaB2晶体蛋白的表达
[0278] 为验证miR-326通过FGFl调控betaB2晶体蛋白的作用机制，我们设计并构建 了miR-326的抑制载体pLK0-anti-miR-326。该载体的框架上带有U6启动子，可在真核细 胞内稳定表达多克隆位点中的RNA序列，我们在它的多克隆位点中插入了miR-326的抑制 体寡核苷酸序列，其表达产物可以和miR-326形成局部双链，从而被RNA诱导沉默复合体 (RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)识别并降解。
[0279] 我们将构建的pLK0-anti-miR-326质粒转染到HLEC-B3中，然后检测miR-326的 含量。我们发现在该细胞中miR-326的含量显著下降，证明该载体可以有效的抑制miR-326 的表达。在此基础上，我们检测了FGFl的表达量，发现转染pLK0-anti-miR-326后，FGFl的 表达升高，其蛋白表达量也明显升高。
[0280] 之后，我们又检测了betaB2的表达量，FGFl的表达上升后，betaB2的表达量也 显著上升。而直接用高表达FGFl的质粒处理细胞，也得出同样的结果。因此，我们认为 miR-326可通过FGFl抑制betaB2的表达（图10)。
[0281] 在此基础上，我们进一步将pLKO-anti-miR-326包装成慢病毒，然后转入HLEC-B3 中。结果发现当miR-326被抑制后，FGFl的表达量显著上升，而且betaB2的表达量也出现 同步变化。
[0282] 由此，我们证实在患者外周血中高含量存在的miR-326可以抑制FGFl的表达，从 而下调betaB2的表达。而betaB2晶体蛋白含量的变化是白内障发生的关键性因素，betaB2 晶体蛋白表达量的下调将导致白内障。本发明提示可通过抑制miR-326来治疗白内障，且 miR-326可作为白内障诊断的标志物。
[0283] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. microRNA-326的抑制剂在制备治疗白内障的药物中的应用。 2. microRNA-326的抑制剂在制备治疗晶状体浑浊的药物中的应用。 3. microRNA-326的抑制剂在制备药物中的应用，其特征在于，所述的药物用于治疗 betaB2晶状体蛋白下调引起的疾病。4. 根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的microRNA-326的抑制剂选 自可以降低microRNA-326含量的小干扰1?嫩、(181^、8111^、微小1^、反义核酸；或能表达 或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的microRNA-326的抑制剂为SEQID NO. 10 第 6-25bp或SEQIDNO. 11 第 6-25bp所示的DNA序列。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的microRNA-326的抑制剂为包含SEQ IDNO. 10第6-25bp或SEQIDNO. 11第6-25bp所示DNA序列的基因载体。7. -种用于治疗白内障或晶状体浑池的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列如SEQ IDNO. 10 第 6-25bp或SEQIDNO. 11 第 6-25bp所示。8. -种基因载体，其特征在于，所述的基因载体含有如SEQIDNO. 10第6-25bp或SEQ IDNO. 11第6-25bp所示的DNA序列。9. 用于检测microRNA-326含量的试剂在制备诊断白内障或晶状体浑浊的试剂中的应 用。
【专利摘要】本发明涉及microRNA-326的抑制剂在制备治疗白内障的药物中的应用。本发明通过实验证明microRNA-326可以抑制FGF1的表达，从而下调betaB2晶体蛋白的表达，而betaB2晶体蛋白含量的变化是白内障发生的关键性因素，betaB2晶体蛋白表达量的下调将导致白内障。本发明提示可通过抑制microRNA-326来治疗白内障，同时microRNA-326可作为白内障诊断的标志物。
【IPC分类】A61K31/7088, A61P27/12, C12Q1/68, C12N15/113, C12N15/861
【公开号】CN104906125
【申请号】CN201510179025
【发明人】高谦, 任含笑, 陶海波, 李闻捷, 牛紫光, 贾音, 沈炜
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月15日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及microRNA-326的抑制剂在制备 治疗白内障的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 凡是各种原因如老化、遗传、局部营养障碍、免疫与代谢异常、外伤、中毒、辐射等， 都能引起晶状体代谢紊乱，导致晶状体蛋白质变性而发生混浊，称为白内障，此时光线被混 浊晶状体阻扰无法投射在视网膜上，导致视物模糊。多见于40岁以上，且随年龄增长而发 病率增多。
[0003] microRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后 组装进RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，通过碱基互补 配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶 mRNA的翻译。研宄表明miRNAs参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、 器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
[0004] microRNA-326在调控多种肿瘤的发病中起重要作用，有文献报道，microRNA-326 的表达与食管癌的预后相关；在结直肠癌、神经胶质瘤等肿瘤中也发挥重要作用，在多发性 硬化病人中表达上调且通过作用于CD47发挥作用，在肺纤维化病人中调控TGF-0因子的 促纤维化作用，也有报道microRNA-326能作为临床药物治疗的候选检测靶点。
[0005] betaB2晶状体蛋白（CRYBB2)与白内障的产生关系密切，有研宄表明，在白 内障病人晶状体中其表达下降（HuangCH,WangYT,TsaiCF,ChenYJ,LeeJS,Chiou SH.Phosphoproteomicscharacterizationofnovelphosphorylatedsitesoflens proteinsfromnormalandcataractoushumaneyelenses.MolecularVision2011 ； 17:186-198.)，CRYBB2基因突变常发生在外显子6上，造成氨基酸折叠异常，从而造成晶状 体结构异常，减弱了在其水溶状态下的稳定性，引起晶状体透明性发生改变，最终导致先天 性白内障的发生（ChenW，ChenX，HuZ，LinH，ZhouF，LuoL，ZhangX，ZhongX，YangY，Wu CjLinZjYeSjLiuY.AMissenseMutationinCRYBB2LeadstoProgressiveCongenital MembranousCataractbyImpactingtheSolubilityandFunctionofbB2-Crystallin. PLoS0ne.2013;8(ll):e81290.)。本课题组构建了CRYBB2基因敲除小鼠模型（张军， 黄才国，李闻捷，WeiWeng，汪佳祺.0B2晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立.第二军 医大学学报.2006 ;27 (11) : 1246-1248.)，并一直进行CRYBB2的相关研究，且在研究中发 现CRYBB2基因敲除小鼠在出生后数月内发生皮质性白内障，其程度随年龄增长而加重 (ZhangJ,LiJ,HuangC，XueL，PengY，FuQ，GaoL，ZhangJ，LiW.TargetedKnockout oftheMouse0B2_crystallinGene(BetaB2)InducesAge-RelatedCataract.Invest OphthalmolVisSci，2008 ;49 (12):5476-5483.)。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供microRNA-326的抑制剂的用途。
[0007] 本发明的再一的目的是，提供一种用于治疗白内障或晶状体浑浊的DNA序列。
[0008] 本发明的另一的目的是，提供一种用于治疗白内障或晶状体浑浊的基因载体。
[0009] 本发明的第四个目的是，提供用于检测microRNA-326含量的试剂的用途。
[0010] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0011] 第一方面，microRNA-326的抑制剂在制备治疗白内障的药物中的应用。
[0012] 第二方面，microRNA-326的抑制剂在制备治疗晶状体浑浊的药物中的应用。
[0013] 第三方面，microRNA-326的抑制剂在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗 betaB2晶状体蛋白下调引起的疾病。
[0014] 所述的microRNA-326的抑制剂选自可以降低microRNA-326含量的小干扰RNA、 dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义 核酸的构建物。
[0015] 优选地，所述的microRNA-326 的抑制剂为SEQIDNO. 10 第 6-25bp或SEQID NO. 11第6-25bp所示的DNA序列。
[0016] 优选地，所述的microRNA-326的抑制剂为包含SEQIDNO. 10第6-25bp或SEQID NO. 11第6-25bp所示DNA序列的基因载体。
[0017] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0018] 一种用于治疗白内障或晶状体浑浊的DNA序列，所述的DNA序列如SEQIDNO. 10 第 6-25bp或SEQIDNO. 11 第 6-25bp所示。
[0019] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0020] 一种基因载体，所述的基因载体含有如SEQIDNO. 10第6-25bp或SEQIDNO. 11 第6-25bp所示的DNA序列。
[0021] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0022] 用于检测microRNA-326含量的试剂在制备诊断白内障或晶状体浑浊的试剂中的 应用。
[0023] 本发明优点在于：
[0024] 1、本发明通过实验证实microRNA-326可以抑制FGFl的表达，从而下调betaB2 的表达，而betaB2晶体蛋白含量的变化是白内障发生的关键性因素，betaB2晶体蛋白表 达量的下调将导致白内障。本发明提示可通过抑制microRNA-326来治疗白内障，同时 microRNA-326可作为白内障诊断的标志物；
[0025] 2、本发明提供了一种microRNA-326的抑制剂，其抑制作用十分显著，可用于白内 障或晶体浑浊的治疗。
【附图说明】
[0026] 图1.双荧光素酶报告基因载体pmirGLO图谱。
[0027] 图2?表达载体pLKO. 1图谱。
[0028] 图3.绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Nl图谱。pEGFP-Nl载体的限制性酶切图和多 克隆位点（MCS)。（单一的限制性位点被加粗）。NotI位点位于EGFP终止子之后。XbaI位点（*)的DNA被CL0NTECH公司甲基化。如果你想要用酶消化该载体，你需要将该载体转 化入dam-型大肠杆菌制备新的DNA。
[0029] 图4.1^1?隱芯片筛选图，图片显示11111?-326、11111?-204、11111?-330-5口在新生鼠中特异 性低表达，而在成年鼠中高表达，且与小鼠视觉系统相关。
[0030] 图5.betaB2基因敲除小鼠血清中miRNA筛查，结果显示CRYBB2基因敲除后 miR-326和miR-204的表达均下降，miR-326表达差异最明显。
[0031] 图6.转基因小鼠基因型鉴定，ABC三条片段均扩增出来的为杂合子，仅扩增出B条 带的为野生型，仅扩增出A、C两条片段的为纯合子。
[0032] 图7.在白内障患者的血清中检出较高含量的miR-326。
[0033] 图8.双荧光素酶报告基因实验证实miR-326的靶基因为FGFl。
[0034] 图9.HLEC-B3细胞转染miR-326模拟物，经RT-PCR和westernblot实验验证显 示miR-326可显著抑制FGFl的表达。
[0035] 图 10.Anti-miR-326 质粒转染HLEC-B3 细胞，采用RT-PCR和westernblot进行 验证，结果显示转染miR-326抑制载体后FGFl与CRYBB2的表达显著上调。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0037] 实施例1
[0038] 1材料和方法
[0039] I. 1 材料
[0040] I.I. 1研宄对象
[0041] 人晶状体上皮细胞HLEC-B3细胞系购自武汉原生原代生物医药科技有限公司。
[0042] 小鼠C57BL/C，灰色，购自第二军医大学实验动物中心。
[0043] 1.1. 2所用载体
[0044] 双荧光素酶报告基因载体pmirGLO购自Promega公司，商品号Cat. #E1330,载体图 谱如图1所示；表达载体pLKO. 1购自Addgene公司，载体图谱如图2所示；绿色荧光蛋白表 达载体pEGFP-Nl购自Addgene公司，载体图谱如图3所示，在本研宄中作为对照质粒。
[0045] 1.1.3PCR引物序列
[0046]
[0047] I. 1. 4目的片段序列
[0048] l)miR-326模拟物的序列
[0049] CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG(SEQIDNO. 5)
[0050] 2)pmirGLO-FGFl野生载体中的FGFl片段
[0051] A-H-FGFl-miR326-WT-F：
[0052] AAACTAGCGGCCGCAAAGATACCCAGAGAGGAAATT(SEQI DNO. 6)，其中加下划线字体为 FGFl片段，两端为酶切位点。
[0053] A-H-FGFl-miR326-WT-R：
[0054] CTAGAATTTCCTCTCTGGGTATCTTTGCGGCCGCTAGTTT(SEQIDNO. 7)，其中加下划线字 体为FGFl片段，两端为酶切位点。
[0055] 3)pmirGL0-FGFl突变载体中的FGFl突变片段
[0056] A-H-FGFl-miR326-Mut-F：
[0057] AAACTAGCGGCCGCAAAGATACCAGTAGAGGAAATT(SEQIDNO. 8)，其中加下划线字体为 FGFl突变片段，两端为酶切位点。
[0058] A-H-FGFl-miR326-Mut-R：
[0059] CTAGAATTTCCTCTACTGGTATCTTTGCGGCCGCTAGTTT(SEQIDNO. 9)，其中加下划线字 体为FGFl突变片段，两端为酶切位点。
[0060] 4)Anti_miR326 即miR326 的抑制体序列
[0061]A-H-Anti-miR326-F：CCGGTCTGGAGGAAGGGCCCAGAGGG(SEQIDNO. 10)，其中加下划 线字体为抑制体序列，两端为酶切位点。
[0062] A-H-Anti-miR326-R：AATTCCCTCTGGGCCCTTCCTCCAGA(SEQIDNO. 11)，其中加下 划线字体为抑制体序列，两端为酶切位点。
[0063] I. 1. 5主要试剂
[0064]
[0068] I. 2 方法
[0069] I. 2.ImiRNA筛选与靶基因预测
[0070] 通过PicTar、SangermiRBase及TargetScanalgorithms这几个生物信息学 数据库对miRNA与betaB2的相关性进行初步筛选，发现miR-326、miR-204、miR-330-5p、 miR-491-5p与betaB2之间存在靶向性关系，然后我们应用已有的小鼠模型对筛选出来的 miRNA进行验证。
[0071] (DmiRNA提取
[0072] 1)分别取WT组和KO组（betaB2基因敲除）小鼠血清200y1，加入ImlTrizol 试剂，振荡混匀后静置5min;
[0073] 2)加入200y1氯仿，剧烈振荡混匀15s，静置5min;
[0074] 3)4°C12000g离心15min，小心吸取上层水相，转移至新的离心管中；
[0075] 4)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20°C静置过夜；
[0076] 5)4°〇1200(^离心1〇1^11，弃上清；75%乙醇洗涤沉淀，超净台内风干；
[0077] 6)加入适量的DEPC水溶解沉淀，-80 °C保存备用。
[0078] ⑵miRNA反转录
[0079] 采用TaKaRa公司的SYBRxPrimeScript?miRNART-PCRKit试剂盒。
[0080] 1)按照下列组份配制反应液（冰上进行）：
[0081]
[0082] 2)反应条件
[0083] 37°C60min(PolyA加尾和反转录反应）
[0084] 85°C5s(反转录酶的失活反应）
[0085] (3)PCR
[0086] 1)按照下列组份配制反应液（冰上进行）：
[0087]
[0088] 2)反应条件
[0089] 预变性：95°C30s
[0090] PCR反应：40cycles
[0091] 95〇C15s
[0092] 60°C30s
[0093] I. 2. 2细胞培养与传代
[0094] 人晶状体上皮细胞（HLEC-B3)培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37°C、 5%CO2条件下进行常规培养。当细胞密度达到70% -80%时进行传代培养，先弃去原细胞 培养液，PBS清洗2次后加入Iml0. 25 %的胰蛋白酶消化2-3min，显微镜观察待细胞变圆 开始脱落时弃去胰蛋白酶，加入完全培养液终止消化，并用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，按 比例稀释后传至另一培养瓶中，37°C、5% 0)2条件下继续培养，定期观察细胞生长情况。 [0095] 1. 2. 3荧光素酶报告基因实验
[0096] 将TargetScan预测出的miRNA与mRNA结合序列记录并合成，装入焚光素酶报告 基因载体PmirGLO中，然后将包含结合序列的pmirGLO质粒与miRNA共转染到HLEC-B3细 胞中，如果该miRNA确实可以通过构建在pmirGLO上的那段序列抑制基因的表达，则萤火虫 荧光素酶的发光强度会下降，而海肾荧光素酶的荧光强度则会维持不变。
[0097] (l)miR-326靶基因序列设计与合成
[0098] 基于生物信息学的方法，通过miRBaseTargets数据库查找Has-miR-326的革巴基 因序列，人工合成其DNA序列及互补序列。
[0099] (2)退火
[0100] 将合成好的单链DNA序列稀释到10yM/y1，退火形成双链DNA片段。反应体系如 下：
[0101]
[0102] 混匀后95°C加热3min，然后缓慢降温至37°C，_20°C保存备用。
[0103] (3)pmirGL0质粒酶切与鉴定
[0104] pmirGLO质粒酶切体系如下：
[0105]
[0106] 混匀后 37°C反应 40min。
[0107] 1)琼脂糖凝胶电泳
[0108] ①配胶：用TAE缓冲液配制1 %浓度的琼脂糖凝胶，加热使之充分溶解，按1:10000 加入核酸染料，倒入制胶模板中并插入梳子，自然冷却成型；
[0109] ②向上述DNA样品中加入1/6体积的LoadingBuffer，混勾后上样；
[0110] ③电泳：110V电泳 25min;
[0111] ④用凝胶成像仪观察电泳结果。
[0112] 2)胶回收
[0113] 糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgelMidiPurificationKit(DP209)说明书操作。
[0114] ①向吸附柱CA2中加入500y1平衡液BL，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0115] ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余的部分），放入干净 的离心管中，称取重量；
[0116] ③向胶块中加入等倍体积溶胶液PN，50°C水浴放置lOmin，其间不断温和地上下 翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
[0117] ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心lmin， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
[0118] ⑤向吸附柱CA2中加入600y1漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱CA2放入收集管中，重复一次；
[0119] ⑥将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液；将吸附柱 CA2置于室温放置数分钟以彻底晾干；
[0120] ⑦将吸附柱CA2置于一个干净离心管中，向吸附膜中间滴加适量洗脱缓冲液EB， 室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。
[0121] (4)连接
[0122] 1)反应体系如下：
[0123]
[0124] 2)反应条件：冰上30min
[0125] 16°CIh
[0126] (5)转化
[0127] 1)取出2管感受态细胞（50y1/管），放在冰上融化；
[0128] 2)每50y1感受态细胞中加入5y1连接产物，其中1管加连接产物，1管作为阴 性对照（不加任何DNA)，用移液器轻轻吹打混勾，冰上放置30min;
[0129] 3)热激：42°C水浴 90s;
[0130] 4)迅速转移到冰上冷却3-5min;
[0131] 5)每管加入LB培养基800yl，37°C摇床温育45min，使细菌复苏；
[0132] 6)4000rpm离心2min，保留约100y1上清液，重新混匀后将菌液均匀涂布于含有 AMP的LB琼脂平板培养基上，37°C培养箱孵育20min后，倒置平板继续培养12-16h;
[0133] 7)挑取单克隆菌落接种于5mlLB液体培养基（含抗生素）中，37°C摇床温育 16-18h〇
[0134] (6)质粒抽提
[0135] 参照质粒小抽试剂盒TIANgelMiniPlasmidKit(DP103)说明书操作。
[0136] 1)向吸附柱CP3中加入500y1平衡液BL，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0137] 2)取上述培养的菌液l-5ml，加入离心管中，12000rpm离心lmin，尽量吸除上清；
[0138] 3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250y1溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器使 沉淀彻底悬浮；加入250y1溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；加入350y1 溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀；12000rpm离心 IOmin；
[0139] 4)将上清液全部转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱放回收集管中；
[0140] 5)加入600y1漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集 管中，重复一次；
[0141] 6)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除吸附柱中残余的漂 洗液；
[0142] 7)将吸附柱CP 3置于一个干净离心管中，向吸附膜中间滴加50-100y1洗脱缓冲 液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
[0143](7)测序与序列比对
[0144] 将构建的载体送到上海生工生物工程有限公司进行测序，并进行序列比对。
[0145] (8)细胞转染
[0146] 操作方法参见1. 2. 4。
[0147] (9)报告基因检测miR-326对其靶基因的作用
[0148] 参照双荧光素酶报告基因活性检测试剂盒（Promega)说明书操作。
[0149] 1)细胞收集：吸除细胞培养液，PBS清洗2次，加入IXPLB细胞裂解液500yl，室 温放置15min，轻轻吹打后收集细胞悬液；
[0150] 2)萤火虫焚光素酶活性检测：取 100yILARII(LuciferaseAssayReagent)加 入荧光测定管底部，再加入20y1待测样品，轻轻混匀后，放入仪器进行检测，读数为Rl;
[0151] 3)海肾荧光素酶活性检测：取100y1稀释好的StopReagent加入步骤2)的测 定管中，轻轻混匀后，放入仪器进行检测，读数为R2 ;
[0152] 4)R1/R2表示相对荧光素酶活性。
[0153] L2. 4细胞转染
[0154] 采用阳离子脂质体转染法将上述重组质粒转染到HLEC-B3细胞中，参照 Invitrogen公司Lipofectamine2000转染试剂盒说明书操作。
[0155] (1)转染前一天，胰酶消化HLEC-B3细胞并计数，接种于6孔板中，加入含10%FBS 的DMEM细胞培养液，于37°C、5%CO2条件下培养，当细胞密度达到70% -80%时开始转染；
[0156] (2)配制溶液A:60yILipofectamine2000+1500yIOpti-MEM(无血清、无抗生 素），轻轻混匀后室温静置5min;
[0157] (3)配制溶液B:① 20yIpmirGL0-miR-326-WT+500yIOpti-MEM
[0158] ② 20yIpmirGL0-miR-326_Mut+500yIOpti-MEM
[0159] ③ 20yIpmirGL0-Control+500yIOpti-MEM
[0160] (4)轻轻混匀溶液A、B，将溶液A分装到溶液B中，每管500y1，轻轻混匀后室温 静置20min;
[0161] (5)等待期间开始处理细胞，吸除培养板中的原细胞培养液，用无血清的 Opti-MEM培养液洗涤2次，然后每孔加入2ml无血清Opti-MEM培养液；
[0162] (6) 20min到时，将上述3管混合液分别滴加于6孔板中，每管分2孔（500y1/ 孔）滴加，轻轻来回摇动培养板，使转染混合液均匀覆盖于细胞表面，37°C、5 %CO2条件下 培养；
[0163] (7)培养6h后换液，加入新的含10%FBS的无抗生素DMEM完全培养液继续培养；
[0164] (8)转染48h后，收集细胞进行报告基因活性检测。
[0165] L2. 5Anti-miR-326腺病毒表达载体的构建
[0166] 通过构建miR-326抑制体的腺病毒表达载体，进一步在体内外探宄miR-326对 betaB2晶体蛋白的调控作用。miR-326抑制体所采用的载体为pLKO. 1，该载体附带U6启动 子，可在真核细胞内稳定表达miRNA。由于该载体带有部分慢病毒重组酶基因，因此其表达 稳定性高于一般载体，而且其自带的重组酶框架还可以顺利组装为慢病毒使用。
[0167] (1)设计并合成miR-326抑制体寡核苷酸序列
[0168] 设计并合成miR-326抑制体寡核苷酸序列SEQIDNO. 10和SEQIDNO. 11。
[0169]⑵退火
[0170] 操作方法同前。
[0171] (3)pLK0. 1质粒酶切与鉴定
[0172] l)pLK0. 1质粒酶切体系如下：
[0173]
[0175] 混匀后 37°C反应 40min。
[0176] 2)琼脂糖凝胶电泳及胶回收
[0177] 操作方法同前。
[0178] (4)连接、转化、质粒抽提、测序与序列比对
[0179] 操作方法同前。
[0180] (5)腺病毒包装
[0181] 将构建成功的Anti-miR-326载体交由上海和元生物技术有限公司进行腺病毒包 装。
[0182] 1. 2. 6实时荧光定量PCR
[0183] (1)总RNA的提取
[0184] 1)将Anti-miR-326腺病毒转染HLEC-B3细胞，细胞培养至对数生长期，弃去细胞 培养液，加入ImlTrizol试剂，均匀覆盖细胞表面，静置5min使细胞完全裂解，反复吹打细 胞，然后全部转移到I. 5ml的EP管中；
[0185] 2)加入200y1氯仿，剧烈振荡混匀15s，静置5min;
[0186] 3)4°C12000g离心15min，小心吸取上层水相，转移至新的离心管中；
[0187] 4)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置IOmin;
[0188] 5)4°〇1200(^离心1〇1^11，弃上清；75%乙醇洗涤沉淀，超净台内风干；
[0189] 6)加入适量的DEPC水溶解沉淀，-80 °C保存备用。
[0190] (2)RT-PCR
[0191] 1)反转录合成cDNA
[0192] 米用TaKaRa公司的PrimeScript?RTReagentKit试剂盒。
[0193] ①按照下列组份配制反应液（冰上进行）：
[0194]
[0195] ②反应条件：
[0196] 37°C 15min(反转录反应），
[0197] 85°C 5s(反转录酶的失活反应）。
[0198] 2)PCR
[0199] ①按照下列组份配制反应液（冰上进行）：
[0200]
[0201] ②反应条件：
[0202] 预变性：95°C30s
[0203] PCR反应：40cycles
[0204] 95°C 5s
[0205] 60°C 30s
[0206] I. 2. 7Westernblot检测FGFl与betaB2 晶体蛋白的表达
[0207] (1)细胞总蛋白的提取
[0208] Anti-miR-326腺病毒感染HLEC-B3细胞48h后，弃培养基，PBS洗涤2次，加入 RIPA裂解液，冰上放置30min使细胞充分裂解；将细胞裂解液全部转移至I. 5mlEP管中， 4°C12000rpm离心20min，小心吸取上清液于新的EP管中，-80°C保存备用。
[0209] (2)BCA法蛋白定量
[0210] 1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量的 BCA工作液，充分混匀后备用；
[0211] 2)待蛋白标准品完全溶解，取10y1稀释至100y1，使蛋白终浓度为0. 5mg/ml;
[0212] 3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20y1加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释 液补足到20y1 ;
[0213] 4)加10y1蛋白质样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20y1，每个样 品设2个平行复孔；
[0214] 5)每孔加BCA工作液 200y1，37°C孵育 30min;
[0215] 6)用酶标仪测定562nm处的吸光度，根据标准曲线计算出样品的浓度。
[0216] (3)SDS-PAGE蛋白电泳
[0217] 1)向上述蛋白质样品中加入1/4体积的5XSDS上样缓冲液，混匀后煮沸lOmin， 短暂离心后备用；
[0218] 2)配制15%分离胶10ml，配方如下：
[0219]
[0220] 3)小心将分离胶注入准备好的制胶板空隙中，每块约4ml，用去离子水赶走气泡， 静置20min，待胶完全凝固后，倒掉上面的去离子水，用滤纸将水吸干；
[0221] 4)配制5 %浓缩胶5ml，配方如下：
[0222]
[0223] 5)小心注入浓缩胶，每块约2ml，迅速插入梳子，避免产生气泡；
[0224] 6)待胶完全凝固后，小心拔掉梳子，准备加样；两端加入IXSDS上样缓冲液，第二 孔加Maker，中间加蛋白质样品，加样量视蛋白浓度而定；
[0225] 7)电泳：恒压60V电泳至分离胶后改为120V，待溴酚蓝电泳至分离胶下边缘，停止 电泳；
[0226] (4)转膜
[0227] 先用甲醇活化PVDF膜，从转移夹的负极到正极依次为海绵垫一2层滤纸一胶一 PVDF膜一2层滤纸一海绵垫，注意不要产生气泡，整个操作在转膜缓冲液中进行，合起 夹子放入转移槽内，使夹子的黑面对应槽的黑面，白面对应槽的红面；恒流200mA转膜 40-50min，转膜过程中会产热，需在转移槽的周围放上冰块来降温。
[0228] (5)免疫反应
[0229] 1)封闭：转膜结束后将PVDF膜放入盛有5%脱脂牛奶的平皿中，封闭3h以上或过 夜；
[0230] 2) -抗：用封闭液或BSA稀释一抗（1:1000 稀释FGF1，1:500 稀释CRYBB2,1:1000 稀释0 -actin)，4°C摇床孵育过夜；
[0231]3)洗膜：TBST洗涤3次，每次IOmin;
[0232] 4)二抗：1:2000稀释二抗，室温孵育I_2h;
[0233] 5)洗膜：TBST洗涤3次，每次IOmin;
[0234] (6)曝光显影
[0235] 将ECL发光试剂盒中的A、B两种试剂等体积混合，配成工作液；在滤纸上将PVDF 膜沥干，滴加适量的工作液使 膜浸润，放入自动显影仪中进行显影并拍照。
[0236] (7)所用试剂的配制方法
[0237] 1)5X电泳缓冲液
[0238] Tris 15.Ig
[0239] Glycine 94g
[0240]SDS5.OOg
[0241] 蒸馏水定容至1000ml
[0242] 丨谷解后室温保存，用时稀释5 {首。
[0243] 2) 10X转膜缓冲液
[0244] Tris 30. 3g
[0245] Glycine 151.Ig
[0246] 蒸馏水定容至1000ml
[0247] 溶解后室温保存，用时稀释10倍，并加入甲醇至20% (先加甲醇易产生沉淀）。 3) 10XTBS缓冲液
[0248] Tris 24. 2g
[0249] NaCl 80.Og
[0250] 蒸馏水定容至1000ml
[0251] 浓盐酸调pH至7. 6,溶解后室温保存。
[0252] 4)ITBST缓冲液
[0253] 10XTBS缓冲液100mL
[0254] 蒸馏水 900ml
[0255] Tween-20 Iml
[0256] 溶解后室温保存。
[0257] 5)封闭液（5%脱脂牛奶）
[0258] IXTBST缓冲液 95-lOOml
[0259] 脱脂奶粉 5g
[0260] 溶解后4°C保存，可于一周内使用。
[0261] 6) 10 % 过硫酸胺（AP)
[0262] 过硫酸胺 0.Ig
[0263] 蒸馏水 Iml
[0264] 现用现配，溶解后，4°C保存，保存时间为1周。
[0265] 1. 2. 8统计学分析
[0266] 所有统计数据以均值土标准差表示，采用SPSS20. 0软件先对数据进行正态性分 析和方差齐性分析，然后进行均值t检验，P〈0. 05 (双侧检验）为差异具有统计学意义。
[0267] 2 结果
[0268] 2.lbetaB2基因敲除后miR-326表达显著降低
[0269] 通过对数据库的分析，我们发现了许多在小鼠出生后特异性高表达的miRNA，并对 其信号通路进行分析，最后我们筛选出了miR-326等8种在小鼠出生后表达量上升，且被认 为与小鼠视觉系统相关的miRNA进行验证（图4)。
[0270] 我们采用betaB2晶体蛋白基因敲除的小鼠进行研宄，该小鼠被特异性敲除 了betaB2基因，约在6-8周龄会高发白内障。通过PCR验证发现，在这些转基因小鼠中 miR-326呈特异性的低表达状态（图5)。这些小鼠的betaB2基因由于缺少第一、二外显子， 只能表达无意义的蛋白序列（图6)。因此我们推测，当机体betaB2基因表达发生异常时， 会启动一些机制来表达miR-326,而miR-326则可以通过某些途径调控betaB2的表达。
[0271] 另外，我们在来我院做检查的白内障患者的血清中，检测出了较高含量的 miR-326,这也暗示了miR-326的高表达可能与白内障相关（图7)。
[0272] 2. 2报告基因实验证实miR-326的靶基因为FGFl
[0273] 为阐明miR-326对betaB2的调控作用，我们对miR-326进行了生物信息学分析， 发现miR-326可能的靶基因有6个。我们将这6个靶基因与miR-326的预测结合序列分别 装到报告基因载体PmirGLO中，然后与miR-326共转染到HLEC-B3细胞中，24h后检测报告 基因的强度变化。实验结果显示，相比于转染pmirGLO-mock的对照组，转染含FGFl预测序 列（即SEQIDNO. 6和SEQIDNO. 7中加下划线的片段）的pmirGLO-miR-326-FGFl组的 相对荧光素酶强度（Luc/Rlu)发生了显著变化。
[0274] 为进一步明确两者之间的关系，我们构建了miR-326针对FGFl预测结合序列的突 变体miR-326-FGFl-Mut(突变序列如SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9所示），并装入报告基因 载体pmirGLO中。将pmirGLO-miR-326-FGFl-Mut和pmirGLO-miR-326-FGFl-WT分别转染到 HLEC-B3中，然后检测其荧光强度的变化。结果我们发现，转染pmirGLO-miR-326-FGFl-WT 组相比于转染pmirGLO-miR-326-FGFl-Mut组的荧光素酶强度显著下降（图8)。因此可以 证实miR-326的靶基因为FGF1。
[0275] 2. 3miR_326 抑制FGFl的表达
[0276] 为验证miR-326对FGFl的抑制作用，我们构建了miR-326的模拟物（序列如 SEQIDNO. 5所示），将该模拟物与作为对照的miRNA-mock(mock序列为R-H-miR-204-F， irCCCITTGTCATCCTATGCCT，SEQIDNO. 12)分别转染到HLEC-B3 中。结果发现转染miR-326 模拟物后FGFl的表达量显著下降，同时通过westernblot实验也证实miR-326可以抑制 FGFl的表达（图9)。
[0277] 2. 4miR_326通过抑制FGFl调控betaB2晶体蛋白的表达
[0278] 为验证miR-326通过FGFl调控betaB2晶体蛋白的作用机制，我们设计并构建 了miR-326的抑制载体pLK0-anti-miR-326。该载体的框架上带有U6启动子，可在真核细 胞内稳定表达多克隆位点中的RNA序列，我们在它的多克隆位点中插入了miR-326的抑制 体寡核苷酸序列，其表达产物可以和miR-326形成局部双链，从而被RNA诱导沉默复合体 (RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)识别并降解。
[0279] 我们将构建的pLK0-anti-miR-326质粒转染到HLEC-B3中，然后检测miR-326的 含量。我们发现在该细胞中miR-326的含量显著下降，证明该载体可以有效的抑制miR-326 的表达。在此基础上，我们检测了FGFl的表达量，发现转染pLK0-anti-miR-326后，FGFl的 表达升高，其蛋白表达量也明显升高。
[0280] 之后，我们又检测了betaB2的表达量，FGFl的表达上升后，betaB2的表达量也 显著上升。而直接用高表达FGFl的质粒处理细胞，也得出同样的结果。因此，我们认为 miR-326可通过FGFl抑制betaB2的表达（图10)。
[0281] 在此基础上，我们进一步将pLKO-anti-miR-326包装成慢病毒，然后转入HLEC-B3 中。结果发现当miR-326被抑制后，FGFl的表达量显著上升，而且betaB2的表达量也出现 同步变化。
[0282] 由此，我们证实在患者外周血中高含量存在的miR-326可以抑制FGFl的表达，从 而下调betaB2的表达。而betaB2晶体蛋白含量的变化是白内障发生的关键性因素，betaB2 晶体蛋白表达量的下调将导致白内障。本发明提示可通过抑制miR-326来治疗白内障，且 miR-326可作为白内障诊断的标志物。
[0283] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. microRNA-326的抑制剂在制备治疗白内障的药物中的应用。 2. microRNA-326的抑制剂在制备治疗晶状体浑浊的药物中的应用。 3. microRNA-326的抑制剂在制备药物中的应用，其特征在于，所述的药物用于治疗 betaB2晶状体蛋白下调引起的疾病。4. 根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的microRNA-326的抑制剂选 自可以降低microRNA-326含量的小干扰1?嫩、(181^、8111^、微小1^、反义核酸；或能表达 或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的microRNA-326的抑制剂为SEQID NO. 10 第 6-25bp或SEQIDNO. 11 第 6-25bp所示的DNA序列。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的microRNA-326的抑制剂为包含SEQ IDNO. 10第6-25bp或SEQIDNO. 11第6-25bp所示DNA序列的基因载体。7. -种用于治疗白内障或晶状体浑池的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列如SEQ IDNO. 10 第 6-25bp或SEQIDNO. 11 第 6-25bp所示。8. -种基因载体，其特征在于，所述的基因载体含有如SEQIDNO. 10第6-25bp或SEQ IDNO. 11第6-25bp所示的DNA序列。9. 用于检测microRNA-326含量的试剂在制备诊断白内障或晶状体浑浊的试剂中的应 用。
【专利摘要】本发明涉及microRNA-326的抑制剂在制备治疗白内障的药物中的应用。本发明通过实验证明microRNA-326可以抑制FGF1的表达，从而下调betaB2晶体蛋白的表达，而betaB2晶体蛋白含量的变化是白内障发生的关键性因素，betaB2晶体蛋白表达量的下调将导致白内障。本发明提示可通过抑制microRNA-326来治疗白内障，同时microRNA-326可作为白内障诊断的标志物。
【IPC分类】A61K31/7088, A61P27/12, C12Q1/68, C12N15/113, C12N15/861
【公开号】CN104906125
【申请号】CN201510179025
【发明人】高谦, 任含笑, 陶海波, 李闻捷, 牛紫光, 贾音, 沈炜
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月15日
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