纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用
纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及医药技术领域，是纳米银用于制备抗真菌产品的新用途，特别是纳米 银作为抗真菌药物的增效剂。
【背景技术】：
[0002] 从远古时代，人们就知道银及其复合物能够有效地对抗微生物，利用银来加速 伤口愈合、治愈感染、净化水和保存食物饮料等。在我国也有用银制器皿存放食物，防止 细菌生长的记载。有报道纳米银对白念珠菌、黄曲霉和黑曲霉有明显的抑制作用（郑 丛龙，周广任，景立新，等.纳米银体外抗真菌作用的实验研究[J].ChineseModern Medical&Clinical，2007, 6:3-4)，但纳米银与抗真菌药合用抗真菌的研究未见报道。
[0003] 纳米材料是指直径在1~IOOnm之间的粒子，其优异特性取决于独特的微观结构， 具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应、宏观量子和隧道效应等，显示出不同于常规材 料的热、光、电、磁、催化和敏感等特性。将纳米材料和技术与银的特性相结合，研制出的纳 米银材料已应用于各领域，例如建筑涂料、环境净化、医药、陶瓷、塑料、纸制品、纺织品、化 妆品等。在医疗卫生领域主要是运用纳米银独特的抗菌性能，制备抗菌凝胶和医用敷料。
[0004] 至今未见纳米银与抗真菌药协同抗真菌的相关报道。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的在于提供一种纳米银的新用途，即纳米银在制备抗真菌药物增效剂 中的应用。
[0006] 我们发现纳米银在体外单独使用能有效抑制真菌的生长增殖，与氟康唑、咪康唑 等唑类抗真菌药合用可以降低抗真菌药物的用量。
[0007] 实验证明，纳米银在体外具有抗真菌活性，对敏感菌和耐药菌有同样的活性 (MIC8(I=8iiM)。与唑类抗真菌药合用，在抑制真菌的生长增殖的同时可以降低抗真菌药物的 用量，MIC80 为 0? 125iiM-0. 5iiM。
[0008] 本发明提供了纳米银在制备抗真菌药物中的应用，纳米银对白念珠菌单独用药使 用，当纳米银的浓度为4、8iiM时，均表现出良好的抗白念珠菌作用。
[0009] 本发明还提供了纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用。
[0010] 较优的，所述的纳米银的粒径为105. 8nm。
[0011] 较优的，所述的纳米银的浓度为4~8微克/摩尔。
[0012] 较优的，所述的真菌是白色念珠菌Y0109、SC5314 ;白色念珠菌103、100。
[0013] 较优的，所述的抗真菌药物为氟康唑或咪康唑等等唑类抗真菌药。
[0014] 本发明为纳米银开辟了新用途。在临床治病真菌耐药性日趋普遍，耐药程度日趋 严重的情况下，纳米银对耐药真菌的生长有抑制作用，具有良好的临床应用前景。
【具体实施方式】：
[0015] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
[0016] 实施例1 :纳米银单用对不同白念珠菌菌株的作用。
[0017] 材料和方法
[0018] 1、试药
[0019] 纳米银：按Lee法合成，由上海材料研究所检测中心检测，纳米粒径为105. 8nm。
[0020] 氟康唑：购自Sigma公司。
[0021] 咪康唑：购自Sigma公司。
[0022] 两性霉素B:购自生工生物工程有限公司。
[0023] 二甲亚砜（DMSO):中国医药(集团）上海化学试剂公司，用前重蒸。
[0024] 2、菌株
[0025] ATCC标准株：白念珠菌（Candidaalbicans)SC5314 由William A.Fonzi(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,Georgetown University,Washington,DC)赠送。
[0026] 临床株：耐药白念珠菌（100、103)由长海医院真菌室提供，也可购自中科院药物 所，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
[0027] 所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA)划板活化，白念珠菌于35°C培 养48h后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培 养后于4°C保存备用。
[0028] 3、培养液
[0029] RPMI1640 培养液：RPMI1640(GibcoBRL) 10g，NaHC032. 0g，吗啡啉丙磺酸 (morpholinepropanesulfonicacid,MOPS) (Sigma) 34. 5g(0.165M)，加三蒸水 900ml溶 解，INNaOH调pH至7.0 (25°C)，定容至1000ml，滤过除菌，4°C保存。
[0030] 沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA):蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml 溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7. 0,定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
[0031] YEro培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解定容至 1000ml，高压灭菌后4°C保存。
[0032] 4、仪器
[0033] 隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂）；
[0034] THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂）；
[0035] 511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂）；
[0036] 5、菌液制备
[0037] 实验前，用接种圈从4°C保存的SDA培养基上挑取白念珠菌少量，接种至ImlYEH) 培养液，于30°C，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至Iml YEH)培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调 整菌液浓度至IXIO3~5X103CFU/ml。
[0038] 6、药敏板制备
[0039] 取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640培养液IOOiil作空白对照；3~12 号孔各加新鲜配制的菌液100y1 ;2号孔分别加新鲜配制的菌液187. 2iil和纳米银溶胶 12. 8ill或新鲜配制的菌液168. 5ill和氟康唑溶液31. 5ill或新鲜配制的菌液198. 4ill和两性霉素B溶液I. 6ill或新鲜配制的菌液199. 2ill和咪康唑溶液0. 8yl。2~11号 孔10级倍比稀释，使各孔的纳米银最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25和 0. 125iiM，氟康唑最终药物浓度分别为1024、512、256、128、64、32、16、8、4和2iiM，两性霉 素B和咪康唑最终药物浓度分别为16、8、4、2、1、0. 5、0. 25、0. 125、0. 0625和0. 03125UM，各 孔中DMSO含量均低于1%。各药敏板于37°C培养。
[0040] 7、MIC8tl 值判定
[0041] 在30°C恒温箱中培养48h后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照 孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC8q (真菌生长80%被抑制时 的药物浓度)。当药物的MIC8tl值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC8tl值高于 最高浓度64iig/ml时，计为">64iig/ml";MIC8(l值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区 另IJ，均计为"彡 〇. 125iig/ml"。
[0042] 上述实验均平行操作2到3次，当MIC8tl值能准确重复或只差一个浓度时才被接 受，并以较高浓度作为MIC8tl值；当MIC8tl值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合 要求为止。实验结果见表1 :
[0043] 表1 :纳米 银、两性霉素B、咪康唑与氟康唑单用对4株白念珠菌的抑制效果
[0044]
[0045] AgNPs表示纳米银，AmB表示两性霉素B，FLu表示氟康唑，MCZ表示咪康唑下同。
[0046] 结论：
[0047] 表1结果显示：纳米银对白念珠菌单独用药使用，当纳米银的浓度为4、8 时，均 表现出良好的抗白念珠菌作用。
[0048] 实施例2 :纳米银与抗真菌药联用对不同临床真菌株的作用
[0049] 材料和方法
[0050] 1、试药
[0051] 纳米银：按Lee法合成，由上海材料研究所检测中心检测，纳米粒径为105. 8nm。
[0052] 两性霉素B:购自生工生物工程有限公司。
[0053] 氟康唑：购自Sigma公司。
[0054] 咪康唑：购自Sigma公司。
[0055] 二甲亚砜（DMSO):中国医药(集团）上海化学试剂公司，用前重蒸。
[0056] 2、菌株
[0057] ATCC标准株：白念珠菌（Candidaalbicans)SC5314 由William A.Fonzi(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,Georgetown University,Washington,DC)赠送。
[0058] 临床株：耐药白念珠菌（100U03)由长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不 同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
[0059] 所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA)划板活化，白念珠菌于35°C培 养48h后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培 养后于4°C保存备用。
[0060] 3、培养液
[0061] RPMI1640 培养液：RPMI1640(GibcoBRL) 10g，NaHC032. 0g，吗啡啉丙磺酸 (morpholinepropanesulfonicacid,MOPS) (Sigma) 34. 5g(0.165M)，加三蒸水 900ml溶 解，INNaOH调pH至7.0 (25°C)，定容至1000ml，滤过除菌，4°C保存。
[0062] 沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA):蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml 溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7. 0,定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
[0063] YEro培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解定容至 1000ml，高压灭菌后4°C保存。
[0064] 4、仪器
[0065] 隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂）；
[0066] THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂）；
[0067] 511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂）；
[0068] 5、菌液制备
[0069] 实验前，用接种圈从4°C保存的SDA培养基上挑取白念珠菌少量，接种至ImlYEH) 培养液，于30°C，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至Iml YEH)培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调 整菌液浓度至IXIO3~5X103CFU/ml。
[0070] 6、药敏板制备
[0071] 取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640液体培养基100ill作空白对照；2号 孔分别加用菌液调配不同浓度的纳米银溶液199. 8ill和2mM两性霉素B0. 2ill;12号孔不 含药物，只加菌液100 作阳性生长对照。
[0072] 对2~10号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终两性霉素B浓度分别为2、1、0. 5、 0? 25、0. 125、0. 0625、0. 03125、0. 015625 和 0? 007813iiM，而纳米银的浓度分别为 8、4、2、1、 0. 5、0. 25、0. 125iiM，各孔中DMSO含量均低于1 %。将各药敏板于30°C恒温箱培养。
[0073] 7、FICI值判定
[0074] 在30°C恒温箱中培养48h后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照 孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC8q (真菌生长80%被抑制时 的药物浓度)。抑菌浓度分数（FIC)，分别为每一种药物联合抑菌时所需最低抑菌浓度（MIC) 与单用时MIC的比值。而FICI则等于两种药物FIC之和。当FICI<0.5时，两药的相互 作用为协同作用，〇. 5〈FICI=4时为无关作用；当FICIM时两药产生拮抗作用。
[0075] 上述实验均平行操作2到3次，当MIC8tl值能准确重复或只差一个浓度时才被接 受，并以较高浓度作为MIC8tl值；当MIC8tl值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合 要求为止。
[0076] 实验结果见表2、表3、表4:
[0077] 表2 :纳米银与两性霉素B合用对不同临床菌株的MIC80值（iiM)
[0078]
[0084] 结论：
[0085] 表2结果显示：纳米银与两性霉素B合用，不能降低两性霉素B的用量，FICI值大 于0. 5,可见纳米银与两性霉素B没有协同作用。由表3可见，合用0. 5yM的纳米银即可使 咪康唑对耐药的白念珠菌的MIC8tl值从4-8iiM下降到0. 25iiM;纳米银与咪康唑合用对敏 感型白念珠菌的MIC8tl明显下降。由表4可见，4yM的纳米银与氟康唑合用，即可使临床耐 药白念珠菌对氟康唑的MIC8tl值从>4096iiM下降到0. 125-0. 25iiM;0. 5-1iiM的纳米银与 氟康唑合用，使敏感菌对氟康唑的MIC8tl值从2-8iiM下降到0. 5-1iiM，说明纳米银能明显 增强氟康唑的抗真菌作用。
[0086] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于，所 述的纳米银的粒径为105. 8nm。3. 根据权利要求1或2所述的纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于， 所述的纳米银的浓度为4~8微克/摩尔。4. 根据权利要求1或2所述的纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于， 所述的真菌是白色念珠菌Y0109、SC5314 ;白色念珠菌103、100。5. 根据权利要求1或2所述的纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于， 所述的抗真菌药物为氟康唑或咪康唑。
【专利摘要】本发明涉及医药技术领域，本发明提供了纳米银在制备抗真菌药物以及抗真菌药物增效剂中的应用。本发明经实验证明，纳米银在体外单独使用能有效抑制真菌的生长增殖，与氟康唑、咪康唑等唑类抗真菌药合用可以降低抗真菌药物的用量。本发明为纳米银开辟了新用途，在临床治病真菌耐药性日趋普遍，耐药程度日趋严重的情况下，纳米银对耐药真菌的生长有抑制作用，具有良好的临床应用前景。
【IPC分类】A61K31/4196, A61K31/4174, A61P31/10, A61K33/38
【公开号】CN104906135
【申请号】CN201410086491
【发明人】张璐璐, 曹永兵, 阎澜, 姜远英, 苗琦, 叶招浇, 王彦, 曹颖瑛, 蔡同凯, 金磊
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月11日
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及医药技术领域，是纳米银用于制备抗真菌产品的新用途，特别是纳米 银作为抗真菌药物的增效剂。
【背景技术】：
[0002] 从远古时代，人们就知道银及其复合物能够有效地对抗微生物，利用银来加速 伤口愈合、治愈感染、净化水和保存食物饮料等。在我国也有用银制器皿存放食物，防止 细菌生长的记载。有报道纳米银对白念珠菌、黄曲霉和黑曲霉有明显的抑制作用（郑 丛龙，周广任，景立新，等.纳米银体外抗真菌作用的实验研究[J].ChineseModern Medical&Clinical，2007, 6:3-4)，但纳米银与抗真菌药合用抗真菌的研究未见报道。
[0003] 纳米材料是指直径在1~IOOnm之间的粒子，其优异特性取决于独特的微观结构， 具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应、宏观量子和隧道效应等，显示出不同于常规材 料的热、光、电、磁、催化和敏感等特性。将纳米材料和技术与银的特性相结合，研制出的纳 米银材料已应用于各领域，例如建筑涂料、环境净化、医药、陶瓷、塑料、纸制品、纺织品、化 妆品等。在医疗卫生领域主要是运用纳米银独特的抗菌性能，制备抗菌凝胶和医用敷料。
[0004] 至今未见纳米银与抗真菌药协同抗真菌的相关报道。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的在于提供一种纳米银的新用途，即纳米银在制备抗真菌药物增效剂 中的应用。
[0006] 我们发现纳米银在体外单独使用能有效抑制真菌的生长增殖，与氟康唑、咪康唑 等唑类抗真菌药合用可以降低抗真菌药物的用量。
[0007] 实验证明，纳米银在体外具有抗真菌活性，对敏感菌和耐药菌有同样的活性 (MIC8(I=8iiM)。与唑类抗真菌药合用，在抑制真菌的生长增殖的同时可以降低抗真菌药物的 用量，MIC80 为 0? 125iiM-0. 5iiM。
[0008] 本发明提供了纳米银在制备抗真菌药物中的应用，纳米银对白念珠菌单独用药使 用，当纳米银的浓度为4、8iiM时，均表现出良好的抗白念珠菌作用。
[0009] 本发明还提供了纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用。
[0010] 较优的，所述的纳米银的粒径为105. 8nm。
[0011] 较优的，所述的纳米银的浓度为4~8微克/摩尔。
[0012] 较优的，所述的真菌是白色念珠菌Y0109、SC5314 ;白色念珠菌103、100。
[0013] 较优的，所述的抗真菌药物为氟康唑或咪康唑等等唑类抗真菌药。
[0014] 本发明为纳米银开辟了新用途。在临床治病真菌耐药性日趋普遍，耐药程度日趋 严重的情况下，纳米银对耐药真菌的生长有抑制作用，具有良好的临床应用前景。
【具体实施方式】：
[0015] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
[0016] 实施例1 :纳米银单用对不同白念珠菌菌株的作用。
[0017] 材料和方法
[0018] 1、试药
[0019] 纳米银：按Lee法合成，由上海材料研究所检测中心检测，纳米粒径为105. 8nm。
[0020] 氟康唑：购自Sigma公司。
[0021] 咪康唑：购自Sigma公司。
[0022] 两性霉素B:购自生工生物工程有限公司。
[0023] 二甲亚砜（DMSO):中国医药(集团）上海化学试剂公司，用前重蒸。
[0024] 2、菌株
[0025] ATCC标准株：白念珠菌（Candidaalbicans)SC5314 由William A.Fonzi(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,Georgetown University,Washington,DC)赠送。
[0026] 临床株：耐药白念珠菌（100、103)由长海医院真菌室提供，也可购自中科院药物 所，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
[0027] 所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA)划板活化，白念珠菌于35°C培 养48h后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培 养后于4°C保存备用。
[0028] 3、培养液
[0029] RPMI1640 培养液：RPMI1640(GibcoBRL) 10g，NaHC032. 0g，吗啡啉丙磺酸 (morpholinepropanesulfonicacid,MOPS) (Sigma) 34. 5g(0.165M)，加三蒸水 900ml溶 解，INNaOH调pH至7.0 (25°C)，定容至1000ml，滤过除菌，4°C保存。
[0030] 沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA):蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml 溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7. 0,定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
[0031] YEro培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解定容至 1000ml，高压灭菌后4°C保存。
[0032] 4、仪器
[0033] 隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂）；
[0034] THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂）；
[0035] 511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂）；
[0036] 5、菌液制备
[0037] 实验前，用接种圈从4°C保存的SDA培养基上挑取白念珠菌少量，接种至ImlYEH) 培养液，于30°C，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至Iml YEH)培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调 整菌液浓度至IXIO3~5X103CFU/ml。
[0038] 6、药敏板制备
[0039] 取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640培养液IOOiil作空白对照；3~12 号孔各加新鲜配制的菌液100y1 ;2号孔分别加新鲜配制的菌液187. 2iil和纳米银溶胶 12. 8ill或新鲜配制的菌液168. 5ill和氟康唑溶液31. 5ill或新鲜配制的菌液198. 4ill和两性霉素B溶液I. 6ill或新鲜配制的菌液199. 2ill和咪康唑溶液0. 8yl。2~11号 孔10级倍比稀释，使各孔的纳米银最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25和 0. 125iiM，氟康唑最终药物浓度分别为1024、512、256、128、64、32、16、8、4和2iiM，两性霉 素B和咪康唑最终药物浓度分别为16、8、4、2、1、0. 5、0. 25、0. 125、0. 0625和0. 03125UM，各 孔中DMSO含量均低于1%。各药敏板于37°C培养。
[0040] 7、MIC8tl 值判定
[0041] 在30°C恒温箱中培养48h后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照 孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC8q (真菌生长80%被抑制时 的药物浓度)。当药物的MIC8tl值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC8tl值高于 最高浓度64iig/ml时，计为">64iig/ml";MIC8(l值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区 另IJ，均计为"彡 〇. 125iig/ml"。
[0042] 上述实验均平行操作2到3次，当MIC8tl值能准确重复或只差一个浓度时才被接 受，并以较高浓度作为MIC8tl值；当MIC8tl值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合 要求为止。实验结果见表1 :
[0043] 表1 :纳米 银、两性霉素B、咪康唑与氟康唑单用对4株白念珠菌的抑制效果
[0044]
[0045] AgNPs表示纳米银，AmB表示两性霉素B，FLu表示氟康唑，MCZ表示咪康唑下同。
[0046] 结论：
[0047] 表1结果显示：纳米银对白念珠菌单独用药使用，当纳米银的浓度为4、8 时，均 表现出良好的抗白念珠菌作用。
[0048] 实施例2 :纳米银与抗真菌药联用对不同临床真菌株的作用
[0049] 材料和方法
[0050] 1、试药
[0051] 纳米银：按Lee法合成，由上海材料研究所检测中心检测，纳米粒径为105. 8nm。
[0052] 两性霉素B:购自生工生物工程有限公司。
[0053] 氟康唑：购自Sigma公司。
[0054] 咪康唑：购自Sigma公司。
[0055] 二甲亚砜（DMSO):中国医药(集团）上海化学试剂公司，用前重蒸。
[0056] 2、菌株
[0057] ATCC标准株：白念珠菌（Candidaalbicans)SC5314 由William A.Fonzi(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,Georgetown University,Washington,DC)赠送。
[0058] 临床株：耐药白念珠菌（100U03)由长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不 同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
[0059] 所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA)划板活化，白念珠菌于35°C培 养48h后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培 养后于4°C保存备用。
[0060] 3、培养液
[0061] RPMI1640 培养液：RPMI1640(GibcoBRL) 10g，NaHC032. 0g，吗啡啉丙磺酸 (morpholinepropanesulfonicacid,MOPS) (Sigma) 34. 5g(0.165M)，加三蒸水 900ml溶 解，INNaOH调pH至7.0 (25°C)，定容至1000ml，滤过除菌，4°C保存。
[0062] 沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA):蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml 溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7. 0,定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
[0063] YEro培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解定容至 1000ml，高压灭菌后4°C保存。
[0064] 4、仪器
[0065] 隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂）；
[0066] THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂）；
[0067] 511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂）；
[0068] 5、菌液制备
[0069] 实验前，用接种圈从4°C保存的SDA培养基上挑取白念珠菌少量，接种至ImlYEH) 培养液，于30°C，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至Iml YEH)培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调 整菌液浓度至IXIO3~5X103CFU/ml。
[0070] 6、药敏板制备
[0071] 取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640液体培养基100ill作空白对照；2号 孔分别加用菌液调配不同浓度的纳米银溶液199. 8ill和2mM两性霉素B0. 2ill;12号孔不 含药物，只加菌液100 作阳性生长对照。
[0072] 对2~10号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终两性霉素B浓度分别为2、1、0. 5、 0? 25、0. 125、0. 0625、0. 03125、0. 015625 和 0? 007813iiM，而纳米银的浓度分别为 8、4、2、1、 0. 5、0. 25、0. 125iiM，各孔中DMSO含量均低于1 %。将各药敏板于30°C恒温箱培养。
[0073] 7、FICI值判定
[0074] 在30°C恒温箱中培养48h后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照 孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC8q (真菌生长80%被抑制时 的药物浓度)。抑菌浓度分数（FIC)，分别为每一种药物联合抑菌时所需最低抑菌浓度（MIC) 与单用时MIC的比值。而FICI则等于两种药物FIC之和。当FICI<0.5时，两药的相互 作用为协同作用，〇. 5〈FICI=4时为无关作用；当FICIM时两药产生拮抗作用。
[0075] 上述实验均平行操作2到3次，当MIC8tl值能准确重复或只差一个浓度时才被接 受，并以较高浓度作为MIC8tl值；当MIC8tl值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合 要求为止。
[0076] 实验结果见表2、表3、表4:
[0077] 表2 :纳米银与两性霉素B合用对不同临床菌株的MIC80值（iiM)
[0078]
[0084] 结论：
[0085] 表2结果显示：纳米银与两性霉素B合用，不能降低两性霉素B的用量，FICI值大 于0. 5,可见纳米银与两性霉素B没有协同作用。由表3可见，合用0. 5yM的纳米银即可使 咪康唑对耐药的白念珠菌的MIC8tl值从4-8iiM下降到0. 25iiM;纳米银与咪康唑合用对敏 感型白念珠菌的MIC8tl明显下降。由表4可见，4yM的纳米银与氟康唑合用，即可使临床耐 药白念珠菌对氟康唑的MIC8tl值从>4096iiM下降到0. 125-0. 25iiM;0. 5-1iiM的纳米银与 氟康唑合用，使敏感菌对氟康唑的MIC8tl值从2-8iiM下降到0. 5-1iiM，说明纳米银能明显 增强氟康唑的抗真菌作用。
[0086] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于，所 述的纳米银的粒径为105. 8nm。3. 根据权利要求1或2所述的纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于， 所述的纳米银的浓度为4~8微克/摩尔。4. 根据权利要求1或2所述的纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于， 所述的真菌是白色念珠菌Y0109、SC5314 ;白色念珠菌103、100。5. 根据权利要求1或2所述的纳米银在制备抗真菌药物增效剂中的应用，其特征在于， 所述的抗真菌药物为氟康唑或咪康唑。
【专利摘要】本发明涉及医药技术领域，本发明提供了纳米银在制备抗真菌药物以及抗真菌药物增效剂中的应用。本发明经实验证明，纳米银在体外单独使用能有效抑制真菌的生长增殖，与氟康唑、咪康唑等唑类抗真菌药合用可以降低抗真菌药物的用量。本发明为纳米银开辟了新用途，在临床治病真菌耐药性日趋普遍，耐药程度日趋严重的情况下，纳米银对耐药真菌的生长有抑制作用，具有良好的临床应用前景。
【IPC分类】A61K31/4196, A61K31/4174, A61P31/10, A61K33/38
【公开号】CN104906135
【申请号】CN201410086491
【发明人】张璐璐, 曹永兵, 阎澜, 姜远英, 苗琦, 叶招浇, 王彦, 曹颖瑛, 蔡同凯, 金磊
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月11日
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