一种提取花生壳总黄酮的工艺的制作方法
一种提取花生壳总黄酮的工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及提取花生壳总黄酮的工艺。
【背景技术】
[0002] 花生是豆科一年生草本植物，广泛种植在世界各地。我国是花生生产大国，年产 量达到1500万吨以上；同时也是世界上农业废弃物产出量最大的国家，每年农业生产废弃 物产量约为6. 5亿吨。农业废弃物综合利用问题，是世界各国普遍需要解决的课题。特别 是随着自然资源日趋短缺和废弃物数量剧增，农业废弃物越来越受到人们重视。农业废弃 物综合利用问题，是世界各国普遍需要解决的课题。特别是随着自然资源日趋短缺和废弃 物数量剧增，农业废弃物越来越受到人们的重视。农业废弃物资源化已成为农业循环经济 的重要内容，是改善农业生态环境的必然要求，是节约型社会的一个具体体现。对于缓解资 源不足，减少环境污染，拓展农业外部功能，提高农业综合效益，都具有重要的意义。花生壳 就是农产品加工废弃物的一种。我国年副产花生壳近4000千吨，占花生果重的30%左右。 这些花生壳除了少部分被利用做饲料和燃料外，大部分被废弃掉，造成了资源极大浪费。据 有关资料报道，花生壳中粗蛋白含量4. 8% -7. 2%，粗脂肪含量1. 2% -2. 8%，无氮浸出物 10. 6% -21. 1%，粗纤维65. 7% -70. 3%。此外，还含有钙、磷、镁、钾、铁、锰、锌、铜等矿物 质。作为药用成分，主要是黄酮类化合物，其中木犀草素是有效成分，此外还含有谷甾 醇-D-葡萄糖苷、皂苷等。因此，为花生壳找合理的应用途径，提高其利用价值具有重要意 义。
[0003] 心血管疾病是目前危害人类健康的第一杀手，以木庫草素为代表的花生壳中黄酮 类成分被认为能降低血压、改善高血脂症状，美国已开发了花生壳提取物用于降低高血压、 高血脂的药物；日本有关食品研宄部门也在进行花生壳提取物的药学研宄，这类由花生壳 提取物开发的药品将很快进入临床。此外，黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛低存在 于自然植物中，以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅数量种类繁多，而且结构类型复 杂多样，表现多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统疾病和呼吸系统疾病，具有抗炎抑 菌、降血糖，抗氧化，抗辐射、抗癌、抗肿瘤及增强免疫力等药理作用。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术不利于工业化生产的缺陷，本发明公开了一种节约成本，操作 简单的提取花生壳总黄酮的工艺，该工艺采用大孔吸附树脂富集药材中有效成分，再结合 其他方法进行定性鉴定和含量测定，得到了总黄酮含量较高的产物，为制剂研宄打下良好 基础。
[0005] 本发明的花生壳总黄酮的提取方法，包括以下步骤：
[0006] 1)取适量药材，进行粉碎，置于圆底烧瓶中，加入10倍量浓度为70%的乙醇溶液， 浸泡24h，回流提取3次，每次2h。合并提取液，回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏；
[0007] 2)将花生壳粗提取物浸膏加入适量的水，用玻璃棒搅拌至混悬，转移至萃取瓶 中；
[0008] 3)加入等体积石油醚，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，静置12h，转移石油醚层，并加入 等体积石油醚，直至石油醚层无色；
[0009] 4)向石油醚萃取后的水层加入等体积乙酸乙酯，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，静置 12h；
[0010] 5)采用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，并将得到的萃取物水浴蒸干，得到花生壳总黄 酮粉末，重复上述操作，直至乙酸乙酯层无色；
[0011] 6)大孔吸附树脂精制，条件如下：树脂柱：(65. 5cm*100cm;吸附条件：上柱液总黄 酮含量I. 4mg/ml;上柱液pH6. 5 ;上柱液体积约1600mL;上柱流速lBV/h;采用2次上样法； 洗脱条件：先用水洗至流出液无色；洗脱剂60%乙醇；洗脱剂流速3BV/h;洗脱体积：开始 时，洗脱液颜色为棕黄色，之后颜色变浅直至恒定，此时停止收集。
[0012] 本发明的有益效果为：提取精制工艺操作简单且结果稳定可靠，所需试剂器材均 可重复利用，工业能耗极低，原料成本低廉，非常适合大规模的工业化生产。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明进一步解释说明。
[0014] 实施例1
[0015] 提取方法的考察如下：将花生壳适当粉碎，称取l〇g，置于圆底烧瓶中，加入10倍 量浓度为70%乙醇，分别采用超声提取法和回流提取法，每种方法提取3次，每次lh。过滤， 精密吸取0. 4mL滤液置于IOmL量瓶中，加入2mL5%的AlCl3溶液，再加入lmol/LCH3C00K 溶液3. 2mL，最后用甲醇溶解并定容至刻度。按照紫外分光光度法在200-600nm波长范围内 进行扫描。按照标准曲线方程A= 0. 0894C-0. 022,r= 0. 9998计算出总黄酮含量。以总 黄酮提取率（提取物总黄酮含量/药材量）和转移率（提取物总黄酮含量/药材中总黄酮 含量*100% )为指标来评价提取方法优劣。结果见表1。
[0016] 表1总黄酮提取方法的考察
[0017]
[0018] 由上表可知，回流提取法和超声提取法所得总黄酮提取率和转移率相近，考虑到 工业生产，故本文最终选用回流提取法。
[0019] 实施例2
[0020] 本文采用乙醇作为提取溶剂来提起花生壳总黄酮，及保证了总黄酮含量，又减少 了有机溶剂污染。
[0021] 实施例3
[0022] 乙醇浓度的考察如下：将花生壳适当粉碎，称取10g，置于圆底烧瓶中，加入10倍 量浓度为O%、10 %、30 %、50 %、70 %、90 %乙醇溶液，回流提取2h，过滤，将滤液按照实施 例1中方法测定吸光度。再按照实施例1中的标准曲线计算出总黄酮含量。以总黄酮提取 率和转移率为指标来选择乙醇的最优浓度。结果见表2
[0023] 表2在不同乙醇浓度下总黄酮的提取率和转移率的比较
[0024]
[0025] 由上表可知，当采用浓度为70%乙醇回流提取时，提取率和转移率最高。因此选择 70%乙醇为提取溶剂。
[0026] 实施例4
[0027] 正交试验对提取工艺的优化如下：取花生壳9份，选择溶剂用量（A)、提取次数 (B)、提取时间（C)及浸泡时间（D)作为考察对象，以总黄酮提取率为指标，选用L9(34)正 交表进行试验。因素水平设计及结果见表3和表4
[0028] 表3因素水平设计正交试验设计
[0029]
[0032] 由上表可知，直观分析结果表明各因素对总黄酮提取率影响大小顺序为：A>D> C>B，最优组合为A3B3C2D1，考虑到因素D对总黄酮提取率影响较大，而因素B影响较小，故 综合考虑，确定最佳提取物工艺为A3B2C2D3,即药材浸泡24h，10倍量浓度为70%乙醇，提取 3次，每次2h。
[0033] 实施例5
[0034] 最佳提取工艺重现性试验如下：按正交试验确定的提取工艺，取花生壳3份，适当 粉碎，每份称取l〇〇g，置于圆底烧瓶中，加入10倍量浓度70%乙醇溶液，浸泡24h，回流提 取3次，每次2h。合并提取液，回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏。按实施例1中的方 法测定吸光度，再按实施例1中的标准曲线方程总黄酮含量。在以下色谱条件下，测定木 犀草素含量：色谱柱：大连江申C18-BDS柱（5ym，200mm*4. 6mm);流动相：甲醇：0. 2%磷酸 (51 ::49);流速：lmL/min;检查波长：350nm;柱温：室温；进样量：20yL。以总黄酮提取率 和转移率为目标，考察工艺重现性。并记录膏量，出膏率。结果见表5。
[0035] 表5精制结果
[0036]
[0038] 由上表可知，提取工艺重现性良好。且粗提取物中总黄酮含量约为7. 8%，木犀草 素含量为3. 7%。
[0039] 实施例6
[0040] 采用石油醚对花生壳总黄酮粗提取物萃取，意在除去提取物中小极性杂质。具体 操作方法如下：将花生壳粗提物浸膏加入适量的水，用玻璃棒搅拌至混悬，转移至萃取瓶 中；加入等体积石油醚，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，精制12h，转移石油醚层，并重新加入等 体积石油醚，重复上述操作，直至石油醚层无色。回收石油醚，将水层保留待用。最终试验 共萃取3次后，石油醚层无色。
[0041] 实施例7
[0042] 将石油醚萃取后的水层溶液用乙酸乙酯进行萃取，意在萃取水层中的黄酮类物 质，具体方法如下：向石油醚萃取后的水层加入等体积乙酸乙酯，盖上瓶塞，轻轻震荡数次， 静置12h，采用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，并将得到的萃取物水浴蒸干，得花生壳总黄酮粉 末。重复上述操作，直至乙酸乙酯层无色。最终试验共萃取5次后，乙酸乙酯层无色。合并 萃取物，称重，按照实施例1和实施例5中的方法分别测定萃取物中总黄酮含量和木犀草素 含量，并计算转移率。 结果见表6。
[0043] 表6用石油醚和乙酸乙酯萃取总黄酮的结果
[0044]
[0045] 由上表可知，经过石油醚，乙酸乙酯萃取后的花生壳总黄酮含量提高到29. 82%， 木犀草素含量提高到14. 75%。
[0046] 实施例8
[0047] DlOl型大孔树脂的预处理方法如下：取适量大孔树脂，置于水盆中，以95%乙醇 浸泡24h;再用95%乙醇淋洗，至上清液与水等体积混合不浑浊为止，再以大量水洗去乙 醇，备用。
[0048] 实施例9
[0049] 树脂对花生壳总黄酮静态吸附试验，方法如下：称取预处理后的树脂适量，置于 IOOmL锥形瓶中；加入花生壳总黄酮提取液（浓度为2. 06mg/mL，Atl= 0. 786)，不时振摇，隔 一定时间测定溶液中残余总黄酮含量，再吸取I. 5mL定容于25mL量瓶中，按照实施例1中 的方法测定吸光度，计算残留液浓度，折算树脂吸附量，结果见表7和表8。
[0050] 表7树脂吸附结果
[0054] 由上表可知，DlOl树脂最大静电吸附量为28. 5mg/g。
[0055] 实施例10
[0056] 为了对树脂吸附条件进行选择，进行了如下试验观察：
[0057] (1)样品溶液流速考察的方法如下：取15mL预处理DlOl树脂装柱，加入等体积花 生壳总黄酮提取液，调节不同流速，考察流速对树脂吸附花生壳总黄酮的影响。取IOOmL浓 度为I. 34mg/mL的花生壳总黄酮提取液，按不同流速上样，收集等体积流出液，按照实施例 1中的方法C测定吸光度，计算吸附量，结果见表9。
[0058] 表9样品流量的考察
[0059]
[0060] 由上表可知，随着上样速度增加吸附量降低，当流速为lBV/h时，吸附量最大，故 采用此流速上柱。
[0061] (2)上柱样品溶液浓度考察方法如下：取15mL预处理后DlOl树脂装柱，取不同 浓度花生壳总黄酮提取液，调节流速为lBV/h，考察样品浓度对树脂吸附花生壳总黄酮的影 响。收集等体积过柱液体，按实施例1中的方法测定过柱液的吸光度，计算吸附量，结果见 表10〇
[0062] 表10样品浓度考察
[0063]
[0064] 由上表可知，在一定浓度范围内，随样品溶液浓度增加，树脂吸附量也随着增大， 直至平衡。因此选择浓度为1.4mg/mL的样品上柱。
[0065] (3)样品溶液pH值考察的方法如下：取15mL预处理后DlOl树脂装柱，加入不同 PH值得花生壳总黄酮提取液，调节流速为lBV/h，考察酸度对树脂吸附花生壳总黄酮的影 响。收集等体积过柱液体，按照实施例1中的方法测定过柱吸光度，计算吸附量，结果见表 11、表12。表11样品pH考察
[0069] 由上述表可知，随着pH值增大，树脂对总黄酮的吸附量减小；pH< 5时，溶液中有 沉淀，该沉淀随pH值减小而增加，不利于吸附。因此选取pH6. 5为样品溶液最佳上样pH。
[0070] 实施例11
[0071] 为了对树脂洗脱条件进行选择，进行了如下试验观察：
[0072] 乙醇浓度考察的方法如下：取一定量预处理后的树脂装柱，用浓度为I. 4mg/mL的 样品溶液，以lBV/h流速上柱；而后用水冲洗，至水无色；再分别用浓度为30%、40%、50%、 60%、70 %、80%、90 %乙醇洗脱液按I. 5BV/h流速进行洗脱，至洗脱液颜色不再改变，收集 等体积过柱液，按实施例1中方法测定过柱液吸光度，计算总黄酮含量，蒸干过柱液，计算 出胃率。结果见表13。
[0073] 表13洗脱液浓度的考察
[0075] 由上表可知，当乙醇浓度范围在30% -60%时，总黄酮含量随乙醇浓度增加而增 加，且乙醇浓度为60%时，总黄酮含量最高；当乙醇浓度范围在60% -90%时，总黄酮含量 随乙醇浓度增加而减少。故选用浓度为60 %的乙醇作为洗脱剂，洗脱效果最佳。
[0076] (2)洗脱剂流速的选择：采用3BV/h流速进行洗脱，效果最好。故采用此流速进行 洗脱，试验结果证明洗脱效果较好。
[0077] 实施例12
[0078] 大孔吸附树脂纯化工艺验证的方法如下：根据上述试验筛选出放大试验条件如 下：树脂柱：〇5. 5cm*100cm;吸附条件：上柱液总黄酮含量I. 4mg/mL;上柱液pH6. 5 ;上柱 液体积约1600mL;上柱液流速lBV/h;采用2次上样法。洗脱条件：先用水洗至流出液无色； 洗脱剂60 %乙醇；洗脱剂流速3BV/h;洗脱体积；开始时，洗脱液颜色为棕黄色，之后颜色变 浅直至恒定。此时停止收集，体积约为500mL。蒸干，得到浸膏，计算出膏率。按照实施例 1中的方法测定浸膏吸光度，计算总黄酮含量；按照实施例5的方法测定浸膏中木犀草素含 量，计算转移率。重复上述验证试验2次，结果见表14。
[0079] 表14精制结果
[0080]
[0081] 由上表可知，大孔吸附树脂纯化工艺稳定，纯化后总黄酮含量达到61. 1%，木犀草 素含量达到37. 5%。
[0082] 实施例13
[0083] 最终提取精制工艺验证的方法如下：采用上述提取精制试验条件，提取花生壳药 材l〇kg，进行中试放大，以考察提取精制工艺稳定性。结果见表15。
[0084] 表15精制结果
[0085]
[0086] 由上表可知，该提取精制工艺经放大后，与小试结果基本吻合，即该工艺稳定可 与巨〇
[0087] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以进行许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内 容直接导出或者联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种提取花生壳总黄酮的工艺，其包括如下步骤： 1) 药材适量，10倍量70%乙醇，浸泡24h，回流提取3次，每次2h; 2) 回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏； 3) 石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取5次； 4) 采用大孔吸附树脂精制，条件如下：树脂柱，5. 5cm*100cm;吸附条件：上柱液总黄 酮含量I. 4mg/ml;上柱液pH6. 5 ;上柱液体积约1600mL;上柱流速lBV/h;采用2次上样法； 洗脱条件：先用水洗至流出液无色；洗脱剂60%乙醇；洗脱剂流速3BV/h;洗脱体积：开始 时，洗脱液颜色为棕黄色，之后颜色变浅直至恒定，此时停止收集。2. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤1)中，所述的乙 醇溶液浓度为70% ;乙醇溶剂用量为10倍；浸泡时间为24h;提取次数为3次；提取时间为 2h;萃取过程使用的是石油醚，萃取次数为3次。3. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤3)中，所述的萃 取方法为将花生壳粗提物浸膏加入适量的水，用玻璃棒搅拌至混悬，转移至萃取瓶中；加入 等体积石油醚，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，精制12h，转移石油醚层，并重新加入等体积石油 醚，重复上述操作，直至石油醚层无色，回收石油醚，将水层保留待用；最终试验共萃取3次 后，石油醚层无色。4. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤3)中，所述的萃 取方法为向石油醚萃取后的水层加入等体积乙酸乙酯，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，静置12h， 采用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，并将得到的萃取物水浴蒸干，得花生壳总黄酮粉末，重复上 述操作，直至乙酸乙酯层无色，最终试验共萃取5次后，乙酸乙酯层无色。5. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤4)中，所述的 大孔吸附树脂的吸附条件为上柱液总黄酮含量I. 4mg/ml;上柱液pH6. 5 ;上柱液体积约 1600mL;上柱流速lBV/h;采用2次上样法。6. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤4)中，所述的大 孔吸附树脂的洗脱条件为先用水洗至流出液无色；洗脱剂60%乙醇；洗脱剂流速3BV/h;洗 脱体积：开始时，洗脱液颜色为棕黄色，之后颜色变浅直至恒定，此时停止收集。
【专利摘要】本发明公开了一种全新且操作简单的提取方法花生壳总黄酮的工艺。粗提取方法包括将粉碎的花生壳粉末用乙醇进行粗提取，回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏。精制工艺为用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，而后采用大孔吸附树脂精制。并对大孔树脂的吸附条件和洗脱条件进行了考察。该提取精制工艺操作简单且结果稳定可靠，适于工业化生产。
【IPC分类】A61K36/48
【公开号】CN104906171
【申请号】CN201510173099
【发明人】王淑君, 郝丹妮
【申请人】沈阳北苑医药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月13日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及提取花生壳总黄酮的工艺。
【背景技术】
[0002] 花生是豆科一年生草本植物，广泛种植在世界各地。我国是花生生产大国，年产 量达到1500万吨以上；同时也是世界上农业废弃物产出量最大的国家，每年农业生产废弃 物产量约为6. 5亿吨。农业废弃物综合利用问题，是世界各国普遍需要解决的课题。特别 是随着自然资源日趋短缺和废弃物数量剧增，农业废弃物越来越受到人们重视。农业废弃 物综合利用问题，是世界各国普遍需要解决的课题。特别是随着自然资源日趋短缺和废弃 物数量剧增，农业废弃物越来越受到人们的重视。农业废弃物资源化已成为农业循环经济 的重要内容，是改善农业生态环境的必然要求，是节约型社会的一个具体体现。对于缓解资 源不足，减少环境污染，拓展农业外部功能，提高农业综合效益，都具有重要的意义。花生壳 就是农产品加工废弃物的一种。我国年副产花生壳近4000千吨，占花生果重的30%左右。 这些花生壳除了少部分被利用做饲料和燃料外，大部分被废弃掉，造成了资源极大浪费。据 有关资料报道，花生壳中粗蛋白含量4. 8% -7. 2%，粗脂肪含量1. 2% -2. 8%，无氮浸出物 10. 6% -21. 1%，粗纤维65. 7% -70. 3%。此外，还含有钙、磷、镁、钾、铁、锰、锌、铜等矿物 质。作为药用成分，主要是黄酮类化合物，其中木犀草素是有效成分，此外还含有谷甾 醇-D-葡萄糖苷、皂苷等。因此，为花生壳找合理的应用途径，提高其利用价值具有重要意 义。
[0003] 心血管疾病是目前危害人类健康的第一杀手，以木庫草素为代表的花生壳中黄酮 类成分被认为能降低血压、改善高血脂症状，美国已开发了花生壳提取物用于降低高血压、 高血脂的药物；日本有关食品研宄部门也在进行花生壳提取物的药学研宄，这类由花生壳 提取物开发的药品将很快进入临床。此外，黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛低存在 于自然植物中，以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅数量种类繁多，而且结构类型复 杂多样，表现多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统疾病和呼吸系统疾病，具有抗炎抑 菌、降血糖，抗氧化，抗辐射、抗癌、抗肿瘤及增强免疫力等药理作用。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术不利于工业化生产的缺陷，本发明公开了一种节约成本，操作 简单的提取花生壳总黄酮的工艺，该工艺采用大孔吸附树脂富集药材中有效成分，再结合 其他方法进行定性鉴定和含量测定，得到了总黄酮含量较高的产物，为制剂研宄打下良好 基础。
[0005] 本发明的花生壳总黄酮的提取方法，包括以下步骤：
[0006] 1)取适量药材，进行粉碎，置于圆底烧瓶中，加入10倍量浓度为70%的乙醇溶液， 浸泡24h，回流提取3次，每次2h。合并提取液，回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏；
[0007] 2)将花生壳粗提取物浸膏加入适量的水，用玻璃棒搅拌至混悬，转移至萃取瓶 中；
[0008] 3)加入等体积石油醚，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，静置12h，转移石油醚层，并加入 等体积石油醚，直至石油醚层无色；
[0009] 4)向石油醚萃取后的水层加入等体积乙酸乙酯，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，静置 12h；
[0010] 5)采用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，并将得到的萃取物水浴蒸干，得到花生壳总黄 酮粉末，重复上述操作，直至乙酸乙酯层无色；
[0011] 6)大孔吸附树脂精制，条件如下：树脂柱：(65. 5cm*100cm;吸附条件：上柱液总黄 酮含量I. 4mg/ml;上柱液pH6. 5 ;上柱液体积约1600mL;上柱流速lBV/h;采用2次上样法； 洗脱条件：先用水洗至流出液无色；洗脱剂60%乙醇；洗脱剂流速3BV/h;洗脱体积：开始 时，洗脱液颜色为棕黄色，之后颜色变浅直至恒定，此时停止收集。
[0012] 本发明的有益效果为：提取精制工艺操作简单且结果稳定可靠，所需试剂器材均 可重复利用，工业能耗极低，原料成本低廉，非常适合大规模的工业化生产。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明进一步解释说明。
[0014] 实施例1
[0015] 提取方法的考察如下：将花生壳适当粉碎，称取l〇g，置于圆底烧瓶中，加入10倍 量浓度为70%乙醇，分别采用超声提取法和回流提取法，每种方法提取3次，每次lh。过滤， 精密吸取0. 4mL滤液置于IOmL量瓶中，加入2mL5%的AlCl3溶液，再加入lmol/LCH3C00K 溶液3. 2mL，最后用甲醇溶解并定容至刻度。按照紫外分光光度法在200-600nm波长范围内 进行扫描。按照标准曲线方程A= 0. 0894C-0. 022,r= 0. 9998计算出总黄酮含量。以总 黄酮提取率（提取物总黄酮含量/药材量）和转移率（提取物总黄酮含量/药材中总黄酮 含量*100% )为指标来评价提取方法优劣。结果见表1。
[0016] 表1总黄酮提取方法的考察
[0017]
[0018] 由上表可知，回流提取法和超声提取法所得总黄酮提取率和转移率相近，考虑到 工业生产，故本文最终选用回流提取法。
[0019] 实施例2
[0020] 本文采用乙醇作为提取溶剂来提起花生壳总黄酮，及保证了总黄酮含量，又减少 了有机溶剂污染。
[0021] 实施例3
[0022] 乙醇浓度的考察如下：将花生壳适当粉碎，称取10g，置于圆底烧瓶中，加入10倍 量浓度为O%、10 %、30 %、50 %、70 %、90 %乙醇溶液，回流提取2h，过滤，将滤液按照实施 例1中方法测定吸光度。再按照实施例1中的标准曲线计算出总黄酮含量。以总黄酮提取 率和转移率为指标来选择乙醇的最优浓度。结果见表2
[0023] 表2在不同乙醇浓度下总黄酮的提取率和转移率的比较
[0024]
[0025] 由上表可知，当采用浓度为70%乙醇回流提取时，提取率和转移率最高。因此选择 70%乙醇为提取溶剂。
[0026] 实施例4
[0027] 正交试验对提取工艺的优化如下：取花生壳9份，选择溶剂用量（A)、提取次数 (B)、提取时间（C)及浸泡时间（D)作为考察对象，以总黄酮提取率为指标，选用L9(34)正 交表进行试验。因素水平设计及结果见表3和表4
[0028] 表3因素水平设计正交试验设计
[0029]
[0032] 由上表可知，直观分析结果表明各因素对总黄酮提取率影响大小顺序为：A>D> C>B，最优组合为A3B3C2D1，考虑到因素D对总黄酮提取率影响较大，而因素B影响较小，故 综合考虑，确定最佳提取物工艺为A3B2C2D3,即药材浸泡24h，10倍量浓度为70%乙醇，提取 3次，每次2h。
[0033] 实施例5
[0034] 最佳提取工艺重现性试验如下：按正交试验确定的提取工艺，取花生壳3份，适当 粉碎，每份称取l〇〇g，置于圆底烧瓶中，加入10倍量浓度70%乙醇溶液，浸泡24h，回流提 取3次，每次2h。合并提取液，回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏。按实施例1中的方 法测定吸光度，再按实施例1中的标准曲线方程总黄酮含量。在以下色谱条件下，测定木 犀草素含量：色谱柱：大连江申C18-BDS柱（5ym，200mm*4. 6mm);流动相：甲醇：0. 2%磷酸 (51 ::49);流速：lmL/min;检查波长：350nm;柱温：室温；进样量：20yL。以总黄酮提取率 和转移率为目标，考察工艺重现性。并记录膏量，出膏率。结果见表5。
[0035] 表5精制结果
[0036]
[0038] 由上表可知，提取工艺重现性良好。且粗提取物中总黄酮含量约为7. 8%，木犀草 素含量为3. 7%。
[0039] 实施例6
[0040] 采用石油醚对花生壳总黄酮粗提取物萃取，意在除去提取物中小极性杂质。具体 操作方法如下：将花生壳粗提物浸膏加入适量的水，用玻璃棒搅拌至混悬，转移至萃取瓶 中；加入等体积石油醚，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，精制12h，转移石油醚层，并重新加入等 体积石油醚，重复上述操作，直至石油醚层无色。回收石油醚，将水层保留待用。最终试验 共萃取3次后，石油醚层无色。
[0041] 实施例7
[0042] 将石油醚萃取后的水层溶液用乙酸乙酯进行萃取，意在萃取水层中的黄酮类物 质，具体方法如下：向石油醚萃取后的水层加入等体积乙酸乙酯，盖上瓶塞，轻轻震荡数次， 静置12h，采用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，并将得到的萃取物水浴蒸干，得花生壳总黄酮粉 末。重复上述操作，直至乙酸乙酯层无色。最终试验共萃取5次后，乙酸乙酯层无色。合并 萃取物，称重，按照实施例1和实施例5中的方法分别测定萃取物中总黄酮含量和木犀草素 含量，并计算转移率。 结果见表6。
[0043] 表6用石油醚和乙酸乙酯萃取总黄酮的结果
[0044]
[0045] 由上表可知，经过石油醚，乙酸乙酯萃取后的花生壳总黄酮含量提高到29. 82%， 木犀草素含量提高到14. 75%。
[0046] 实施例8
[0047] DlOl型大孔树脂的预处理方法如下：取适量大孔树脂，置于水盆中，以95%乙醇 浸泡24h;再用95%乙醇淋洗，至上清液与水等体积混合不浑浊为止，再以大量水洗去乙 醇，备用。
[0048] 实施例9
[0049] 树脂对花生壳总黄酮静态吸附试验，方法如下：称取预处理后的树脂适量，置于 IOOmL锥形瓶中；加入花生壳总黄酮提取液（浓度为2. 06mg/mL，Atl= 0. 786)，不时振摇，隔 一定时间测定溶液中残余总黄酮含量，再吸取I. 5mL定容于25mL量瓶中，按照实施例1中 的方法测定吸光度，计算残留液浓度，折算树脂吸附量，结果见表7和表8。
[0050] 表7树脂吸附结果
[0054] 由上表可知，DlOl树脂最大静电吸附量为28. 5mg/g。
[0055] 实施例10
[0056] 为了对树脂吸附条件进行选择，进行了如下试验观察：
[0057] (1)样品溶液流速考察的方法如下：取15mL预处理DlOl树脂装柱，加入等体积花 生壳总黄酮提取液，调节不同流速，考察流速对树脂吸附花生壳总黄酮的影响。取IOOmL浓 度为I. 34mg/mL的花生壳总黄酮提取液，按不同流速上样，收集等体积流出液，按照实施例 1中的方法C测定吸光度，计算吸附量，结果见表9。
[0058] 表9样品流量的考察
[0059]
[0060] 由上表可知，随着上样速度增加吸附量降低，当流速为lBV/h时，吸附量最大，故 采用此流速上柱。
[0061] (2)上柱样品溶液浓度考察方法如下：取15mL预处理后DlOl树脂装柱，取不同 浓度花生壳总黄酮提取液，调节流速为lBV/h，考察样品浓度对树脂吸附花生壳总黄酮的影 响。收集等体积过柱液体，按实施例1中的方法测定过柱液的吸光度，计算吸附量，结果见 表10〇
[0062] 表10样品浓度考察
[0063]
[0064] 由上表可知，在一定浓度范围内，随样品溶液浓度增加，树脂吸附量也随着增大， 直至平衡。因此选择浓度为1.4mg/mL的样品上柱。
[0065] (3)样品溶液pH值考察的方法如下：取15mL预处理后DlOl树脂装柱，加入不同 PH值得花生壳总黄酮提取液，调节流速为lBV/h，考察酸度对树脂吸附花生壳总黄酮的影 响。收集等体积过柱液体，按照实施例1中的方法测定过柱吸光度，计算吸附量，结果见表 11、表12。表11样品pH考察
[0069] 由上述表可知，随着pH值增大，树脂对总黄酮的吸附量减小；pH< 5时，溶液中有 沉淀，该沉淀随pH值减小而增加，不利于吸附。因此选取pH6. 5为样品溶液最佳上样pH。
[0070] 实施例11
[0071] 为了对树脂洗脱条件进行选择，进行了如下试验观察：
[0072] 乙醇浓度考察的方法如下：取一定量预处理后的树脂装柱，用浓度为I. 4mg/mL的 样品溶液，以lBV/h流速上柱；而后用水冲洗，至水无色；再分别用浓度为30%、40%、50%、 60%、70 %、80%、90 %乙醇洗脱液按I. 5BV/h流速进行洗脱，至洗脱液颜色不再改变，收集 等体积过柱液，按实施例1中方法测定过柱液吸光度，计算总黄酮含量，蒸干过柱液，计算 出胃率。结果见表13。
[0073] 表13洗脱液浓度的考察
[0075] 由上表可知，当乙醇浓度范围在30% -60%时，总黄酮含量随乙醇浓度增加而增 加，且乙醇浓度为60%时，总黄酮含量最高；当乙醇浓度范围在60% -90%时，总黄酮含量 随乙醇浓度增加而减少。故选用浓度为60 %的乙醇作为洗脱剂，洗脱效果最佳。
[0076] (2)洗脱剂流速的选择：采用3BV/h流速进行洗脱，效果最好。故采用此流速进行 洗脱，试验结果证明洗脱效果较好。
[0077] 实施例12
[0078] 大孔吸附树脂纯化工艺验证的方法如下：根据上述试验筛选出放大试验条件如 下：树脂柱：〇5. 5cm*100cm;吸附条件：上柱液总黄酮含量I. 4mg/mL;上柱液pH6. 5 ;上柱 液体积约1600mL;上柱液流速lBV/h;采用2次上样法。洗脱条件：先用水洗至流出液无色； 洗脱剂60 %乙醇；洗脱剂流速3BV/h;洗脱体积；开始时，洗脱液颜色为棕黄色，之后颜色变 浅直至恒定。此时停止收集，体积约为500mL。蒸干，得到浸膏，计算出膏率。按照实施例 1中的方法测定浸膏吸光度，计算总黄酮含量；按照实施例5的方法测定浸膏中木犀草素含 量，计算转移率。重复上述验证试验2次，结果见表14。
[0079] 表14精制结果
[0080]
[0081] 由上表可知，大孔吸附树脂纯化工艺稳定，纯化后总黄酮含量达到61. 1%，木犀草 素含量达到37. 5%。
[0082] 实施例13
[0083] 最终提取精制工艺验证的方法如下：采用上述提取精制试验条件，提取花生壳药 材l〇kg，进行中试放大，以考察提取精制工艺稳定性。结果见表15。
[0084] 表15精制结果
[0085]
[0086] 由上表可知，该提取精制工艺经放大后，与小试结果基本吻合，即该工艺稳定可 与巨〇
[0087] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以进行许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内 容直接导出或者联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种提取花生壳总黄酮的工艺，其包括如下步骤： 1) 药材适量，10倍量70%乙醇，浸泡24h，回流提取3次，每次2h; 2) 回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏； 3) 石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取5次； 4) 采用大孔吸附树脂精制，条件如下：树脂柱，5. 5cm*100cm;吸附条件：上柱液总黄 酮含量I. 4mg/ml;上柱液pH6. 5 ;上柱液体积约1600mL;上柱流速lBV/h;采用2次上样法； 洗脱条件：先用水洗至流出液无色；洗脱剂60%乙醇；洗脱剂流速3BV/h;洗脱体积：开始 时，洗脱液颜色为棕黄色，之后颜色变浅直至恒定，此时停止收集。2. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤1)中，所述的乙 醇溶液浓度为70% ;乙醇溶剂用量为10倍；浸泡时间为24h;提取次数为3次；提取时间为 2h;萃取过程使用的是石油醚，萃取次数为3次。3. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤3)中，所述的萃 取方法为将花生壳粗提物浸膏加入适量的水，用玻璃棒搅拌至混悬，转移至萃取瓶中；加入 等体积石油醚，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，精制12h，转移石油醚层，并重新加入等体积石油 醚，重复上述操作，直至石油醚层无色，回收石油醚，将水层保留待用；最终试验共萃取3次 后，石油醚层无色。4. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤3)中，所述的萃 取方法为向石油醚萃取后的水层加入等体积乙酸乙酯，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，静置12h， 采用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，并将得到的萃取物水浴蒸干，得花生壳总黄酮粉末，重复上 述操作，直至乙酸乙酯层无色，最终试验共萃取5次后，乙酸乙酯层无色。5. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤4)中，所述的 大孔吸附树脂的吸附条件为上柱液总黄酮含量I. 4mg/ml;上柱液pH6. 5 ;上柱液体积约 1600mL;上柱流速lBV/h;采用2次上样法。6. 根据权利要求1所述的提取花生壳总黄酮的方法，其特征在于步骤4)中，所述的大 孔吸附树脂的洗脱条件为先用水洗至流出液无色；洗脱剂60%乙醇；洗脱剂流速3BV/h;洗 脱体积：开始时，洗脱液颜色为棕黄色，之后颜色变浅直至恒定，此时停止收集。
【专利摘要】本发明公开了一种全新且操作简单的提取方法花生壳总黄酮的工艺。粗提取方法包括将粉碎的花生壳粉末用乙醇进行粗提取，回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏。精制工艺为用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，而后采用大孔吸附树脂精制。并对大孔树脂的吸附条件和洗脱条件进行了考察。该提取精制工艺操作简单且结果稳定可靠，适于工业化生产。
【IPC分类】A61K36/48
【公开号】CN104906171
【申请号】CN201510173099
【发明人】王淑君, 郝丹妮
【申请人】沈阳北苑医药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月13日
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