宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其组合物的医药用途和制备方法
宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其组合物的医药用途和制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其 组合物的制备方法以及它在治疗阿尔茨海默病（AD)等方面的医药用途。
【背景技术】
[0002] 宽筋藤为防已科植物中华青牛胆的干燥莖藤。 原植物中华青牛胆为落叶草质高大藤木，长达10余米或更长；茎、枝肥厚，嫩枝绿色，有条 纹，被柔毛，老枝草黄色，覆膜质的表皮，有显著凸出的皮孔。性凉，味苦。归肝、脾经。具有 祛风除湿，舒筋活络的功效。用于风湿骨痛，筋络拘挛，骨折，跌打损伤。
[0003] 本发明通过大规模、系统地活性筛选，意外地发现维吾尔药宽筋藤提取物及其部 分化学组分，具有显著地乙酰胆碱酯酶抑制活性，该活性提取物及其组合物有望应用于治 疗阿尔茨海默病（AD)等方面的医药用途。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是提供一种宽筋藤提取物。
[0005] 本发明还提供了以宽筋藤提取物为主要活性成分的组合物。
[0006] 本发明同时提供了宽筋藤提取物及其组合物的制备和在制备乙酰胆碱酯酶抑制 活性药物中的应用。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的： 维吾尔药宽筋藤经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（SiO2)柱分离，上样后的硅胶 柱，用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(氯仿-甲醇，比例见表1 )，各氯仿-甲醇比例混合溶剂 洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其乙酰胆碱酯酶抑制活性，意外地发现先用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿_甲醇，1〇〇: 1，体积比)洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:2，体积比）洗脱得到的氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2，体积比）洗脱液经 回收有机溶剂，干燥，即为乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部位，没有乙 酰胆碱酯酶抑制活性的作用。特别地，优选为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1， 体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱30 倍柱体积，洗脱液即为本发明乙酰胆碱酯酶抑制活性的提取物，其可以通过以上方法得到 富集，从而与其他杂质类成分分离开。该宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献 报道，其薄层谱色谱（TLC)分析表征如图1，TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿： 乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)显色方法：香草醛-硫酸显色。
[0008] 维吾尔药宽筋藤经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（SiO2)柱分离，上样后的 硅胶柱，用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(氯仿-甲醇，比例见表1 )，各氯仿-甲醇比例混合 溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其乙酰胆碱酯酶抑制活性，意外地发现 先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯 仿-甲醇，100:12,体积比)洗脱得到的氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比)洗 脱液经回收有机溶剂，干燥，即为乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部位， 没有乙酰胆碱酯酶抑制活性的作用。特别地，优选为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇， 100:8,体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比） 洗脱30倍柱体积，洗脱液干燥即为本发明乙酰胆碱酯酶抑制活性的提取物。乙酰胆碱酯酶 抑制活性的提取物可以通过以上方法得到富集，从而与其他杂质类成分分离开。该宽筋藤 乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其薄层谱色谱（TLC)分析表征如图2,TLC 分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)显色方法：香草醛-硫酸 显色。
[0009] 具体，发现过程如下： 1、宽筋藤经甲醇超声提取物的制备 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SN0104,样品1.4978g，留样0.0760g，上样量1.4218g，拌样硅胶1.7g，空白硅胶10g， 氯仿-甲醇系统洗脱。
[0010] 2、氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱方法和结果 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SN0104，1.4218g，上柱，甲醇溶解，共用甲醇15mL。上硅胶柱色谱，拌样硅胶1.7g，空白 硅胶10g，玻璃柱内径2.0cm，氯仿-甲醇系统梯度洗脱(条件见表1)，柱体积25mL，每个 梯度洗脱200mL，得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，氯仿：甲醇梯度洗 脱提取物，TLC分析结果见图2,图3,TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙 酯：甲醇（3:1:1)显色方法：香草醛-硫酸显色。
[0011] 表 1
3、抑制乙酰胆碱酯酶活性筛选方法和结果 1) 实验条件 a、 材料：DMSO(二甲基亚砜）（科密欧公司）；KH2P04、K2HP04WH2CK广东汕头市西陇化 工厂）；AchE酶（美国Sigma公司）；PNPG(美国Sigma公司） b、 实验仪器：多功能酶标仪Bio-RadModel680 型（Bio-RadLaboratoriesInc.) 2) 实验方法和过程 样品处理：将Img待测样品溶于20 二甲基亚砜（DMSO)作为母液，取I母液 加入249 蒸馏水配成200 .mr1的溶液。
[0012] 乙酰胆碱酯酶抑制活性测定方法： 在96孔酶标板上测定样品的AchE抑制活性。具体操作如下：在96孔酶标板中依次加 入 20yLPB(100mM，pH8. 0)，25yLAChE(0? 033U/mL，pH8. 0PB溶解稀释），25yL 样品溶液（40yg.mL_ 〇。冰浴 5min后，加 15yLATCI(0. 6mM)及 15yLDTNB(I. 5mM)。 37°C孵育60min后，用酶标仪在412nm下测定其吸光度值。根据下式计算抑制率： 酶活性抑制率％=[A空白_(A样品-A背景）]/A空白X100 式中Aee :不加样品反应后的吸收值； :加入样品反应后的吸收值； Awft :只加样品的吸收值。
[0013] 3)实验结果 表2
结果发现： 本发明的最优方案为：维吾尔药宽筋藤经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱 分离，上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，继用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该乙酰胆碱酯酶抑制活性提 取物。该乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图1。
[0014] 维吾尔药宽筋藤经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅 胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶 剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积 比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物。该乙酰胆 碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图2。
[0015] 4、乙酰胆碱酯酶抑制活性有效提取物的提取方法研宄 1)提取溶剂的种类研宄 分别用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机 溶剂提取，并测试提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性，实验结果如下： 表3
研宄结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混 合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0016] 2)提取溶剂的用量研宄 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比)有机溶剂提取，并测试提取物的乙酰 胆碱酯酶抑制活性，结果如下： 表4
活性提取物的提取所用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0017] 3)干燥方法的研宄 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的抑 制乙酰胆碱酯酶活性提取物进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、 冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物进行 干燥，其中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0018]表 5
优选地，宽筋藤乙酰胆碱 酯酶抑制活性提取物的制备方法为： 维吾尔药宽筋藤经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶 柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100: 1，体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比)洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用氯仿-甲醇 混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提 取物。以上条件最优为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积比)洗脱10倍柱 体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱30倍柱体积。
[0019] 维吾尔药宽筋藤经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅 胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8，体积比)洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用氯仿-甲 醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性 提取物。以上条件最优为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比)洗脱10倍 柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱30倍柱体积。
[0020] 其中， 1)提取物提取用溶剂可以为甲醇、石油醚、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、 乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。活性提取物提取用有机溶剂用量为药材重 量的2-50倍(重量/体积比)。
[0021] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0022] 5.宽筋藤抑制乙酰胆碱酯酶活性提取物(洗脱液为100 :2或100 :12时干燥获得 的提取物）的医药用途研宄 按优化的宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物制备方法制备的活性提取物，经测试， 其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=56. 3yg/mL。
[0023] 由于乙酰胆碱酯酶抑制剂具有治疗阿尔茨海默病等方面的医药用途。因此，我们 发现的宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物具有广泛的医药用途。
[0024] 6、宽筋藤抑制乙酰胆碱酯酶活性提取物的组合物及其制备方法研宄 1)固体分散体 处方 宽筋藤提取物 20 g Vc Ig 聚乙烯吡咯烷酮 79 g 固体分散100g制备方法： 称取宽筋藤提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放 入烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力搅拌器搅拌至宽筋藤提取物和载体完全溶解， 充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得宽筋藤有效提取 物PVP包合物。
[0025] 2)环糊精包合物 处方： 宽筋藤提取物 20 g Vc Ig 0 -环糊精 79 g 包合物100g制备方法： 将0-环糊精与1-5倍水研匀，加宽筋藤有效提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）继续充分研磨至成糊状物，低温干燥即得环糊精包合物。
[0026] 3)分散片处方： 宽筋藤提取物 100 十>烷基硫酸纳 1 Vc 1 预胶化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交联聚维酮 10 微晶纤维素 9 微分硅胶 0. 3 滑石粉 1 100片 制备方法： 1. 宽筋藤有效提取物分散体的制备，精密称取宽筋藤提取物、Vc，加入处方量的十二烷 基硫酸钠，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C 的温度下蒸干，粉碎，过100目筛； 2. 将第一步中的宽筋藤有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉， 用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置 15min后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀 后，压片即得。
[0027] 7、宽筋藤抑制乙酰胆碱酯酶活性提取物的检测方法研宄 我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性 提取物的特征。见图1、2 具体条件为：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)显色方法：香草 醛-硫酸显色。
[0028]
【附图说明】： 图1宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物的TLC色谱图； 图2宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物的TLC色谱图； 图3宽筋藤溶剂提取物的TLC色谱图。
[0029]
【具体实施方式】： 以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。
[0030] 实施例1 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2.0cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体 积比)洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比)洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，真空干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=87. 0 yg/mL〇
[0031] 实施例2: 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL乙醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积 比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=89. 0 yg/mL〇
[0032] 实施例3 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL石油醚超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积 比)洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比)洗脱，洗 脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回收 有机溶剂，旋蒸干燥法，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=82. 0 yg/mL〇
[0033] 实施例4: 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL丙酮超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积 比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，鼓风干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=83. 0 yg/mL〇
[0034] 实施例5 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL氯仿超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积 比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，离心干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=75. 0 yg/mL〇
[0035] 实施例6 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL乙酸乙酯超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱 分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体 积比)洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比)洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=63. 0 yg/mL〇
[0036] 实施例7 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇水混合溶剂（甲醇：水=1 :1)超声提取15min， 提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂 (氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗 脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:2，体积比）洗脱，洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2，体 积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯 酶抑制活性为IC5(I=87. 0yg/mL。
[0037] 实施例8 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=1 :1)超声提取15min， 提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂 (氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:2，体积比）洗脱，洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2，体 积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯 酶抑制活性为IC5(I=57. 0yg/mL。
[0038] 实施例9 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL乙醇-水混合溶剂（乙醇：水=90 :10)超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混 合溶剂(氯仿-甲醇，100: 1，体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯 仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱，洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇， 100:2,体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙 酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=70. 0yg/mL。
[0039] 实施例10 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2.0cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体 积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗 脱，洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱的洗脱液 经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提取物。收率0. 88%。
[0040] 实施例11:固体分散体 称取宽筋藤提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放 入烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力搅拌器搅拌至宽筋藤提取物和载体完全溶解， 充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得宽筋藤有效提取 物PVP包合物。
[0041] 实施例12:环糊精包合物 将0-环糊精与1-5倍水研匀，加宽筋藤有效提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）继续充分研磨至成糊状物，低温干燥即得环糊精包合物。
[0042] 实施例13 :分散片 1.宽筋藤有效提取物分散体的制备，精密称取宽筋藤提取物、Vc，加入处方量的十二烷 基硫酸钠，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C 的温度下蒸干，粉碎，过100目筛； 将第一步中的宽筋藤有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉，用 适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min 后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片 即得。
【主权项】
1. 一种宽筋藤提取物，其特征为宽筋藤经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱，先用体积比100:1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，继用体积比100:2氯 仿-甲醇混合溶剂洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱 液经回收溶剂，干燥，即为该提取物；或先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积 比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合 溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该提取物。2. 如权利要求1所述宽筋藤提取物，其特征为，提取溶剂可为甲醇、石油醚、水、丙酮、 氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。3. 如权利要求1所述宽筋藤提取物，一种宽筋藤提取物，其特征为宽筋藤经溶剂超声 提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:8,体积比)洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比)洗脱，用氯 仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比)洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该提 取物；或其特征为宽筋藤经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱， 先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯 仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱 的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物。4.如权利要求1-3任何一项所述的一种维吾尔药宽筋藤提取物，其特征为，用于洗脱 的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱体积为2-50倍柱体积。5. 权利要求1所述提取物的制备方法，其特征为：宽筋藤经溶剂超声提取，提取液浓缩 后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100: 1，体积比） 洗脱2-50倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱2-50倍 柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶 剂，干燥，即为该提取物；以上条件最优为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体 积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱30倍 柱体积；或宽筋藤经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用氯 仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比）洗脱2-50倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合 溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱2-50倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:12,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物；以上条件最优为 先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇 混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱30倍柱体积。6. -种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的维吾尔药宽筋藤 提取物和药学上可接受的载体。7. -种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的宽筋藤提取物或权 利要求6所述的药物组合物。8. 如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述的制剂为固体分散体、环糊精包合 物、分散片。9.如权利要求1-5任何一项所述提取物或权利要求6所述的组合物或权利要求7所述 的药物制剂在制备乙酰胆碱酯酶抑制活性药物中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，乙酰胆碱酯酶抑制活性可用于治疗阿尔茨 海默病（AD)等方面的医药用途。11.如权利要求1-5任何一项所述的维吾尔药宽筋藤提取物，其特征在于，用TLC法检 测，其色谱条件为：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇=3:1:1，显色方法：香草 醛浓硫酸显色。
【专利摘要】本发明属医药技术领域，具体涉及一种宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其组合物的制备方法以及它在治疗阿尔茨海默病(AD)等方面的医药用途。所述的提取物通过如下方法获得：先用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:2，体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:2，体积比）洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物，或先用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:8，体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:12，体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:12，体积比）洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物。
【IPC分类】G01N30/90, A61P25/28, A61K36/59
【公开号】CN104906191
【申请号】CN201510058772
【发明人】王金辉, 热娜·卡斯木, 黄健, 李国玉, 逄小博, 王新玲, 马庆东, 张珂
【申请人】新疆医科大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年2月4日
【技术领域】
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其 组合物的制备方法以及它在治疗阿尔茨海默病（AD)等方面的医药用途。
【背景技术】
[0002] 宽筋藤为防已科植物中华青牛胆的干燥莖藤。 原植物中华青牛胆为落叶草质高大藤木，长达10余米或更长；茎、枝肥厚，嫩枝绿色，有条 纹，被柔毛，老枝草黄色，覆膜质的表皮，有显著凸出的皮孔。性凉，味苦。归肝、脾经。具有 祛风除湿，舒筋活络的功效。用于风湿骨痛，筋络拘挛，骨折，跌打损伤。
[0003] 本发明通过大规模、系统地活性筛选，意外地发现维吾尔药宽筋藤提取物及其部 分化学组分，具有显著地乙酰胆碱酯酶抑制活性，该活性提取物及其组合物有望应用于治 疗阿尔茨海默病（AD)等方面的医药用途。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是提供一种宽筋藤提取物。
[0005] 本发明还提供了以宽筋藤提取物为主要活性成分的组合物。
[0006] 本发明同时提供了宽筋藤提取物及其组合物的制备和在制备乙酰胆碱酯酶抑制 活性药物中的应用。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的： 维吾尔药宽筋藤经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（SiO2)柱分离，上样后的硅胶 柱，用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(氯仿-甲醇，比例见表1 )，各氯仿-甲醇比例混合溶剂 洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其乙酰胆碱酯酶抑制活性，意外地发现先用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿_甲醇，1〇〇: 1，体积比)洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:2，体积比）洗脱得到的氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2，体积比）洗脱液经 回收有机溶剂，干燥，即为乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部位，没有乙 酰胆碱酯酶抑制活性的作用。特别地，优选为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1， 体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱30 倍柱体积，洗脱液即为本发明乙酰胆碱酯酶抑制活性的提取物，其可以通过以上方法得到 富集，从而与其他杂质类成分分离开。该宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献 报道，其薄层谱色谱（TLC)分析表征如图1，TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿： 乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)显色方法：香草醛-硫酸显色。
[0008] 维吾尔药宽筋藤经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（SiO2)柱分离，上样后的 硅胶柱，用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(氯仿-甲醇，比例见表1 )，各氯仿-甲醇比例混合 溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其乙酰胆碱酯酶抑制活性，意外地发现 先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯 仿-甲醇，100:12,体积比)洗脱得到的氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比)洗 脱液经回收有机溶剂，干燥，即为乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部位， 没有乙酰胆碱酯酶抑制活性的作用。特别地，优选为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇， 100:8,体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比） 洗脱30倍柱体积，洗脱液干燥即为本发明乙酰胆碱酯酶抑制活性的提取物。乙酰胆碱酯酶 抑制活性的提取物可以通过以上方法得到富集，从而与其他杂质类成分分离开。该宽筋藤 乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其薄层谱色谱（TLC)分析表征如图2,TLC 分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)显色方法：香草醛-硫酸 显色。
[0009] 具体，发现过程如下： 1、宽筋藤经甲醇超声提取物的制备 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SN0104,样品1.4978g，留样0.0760g，上样量1.4218g，拌样硅胶1.7g，空白硅胶10g， 氯仿-甲醇系统洗脱。
[0010] 2、氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱方法和结果 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SN0104，1.4218g，上柱，甲醇溶解，共用甲醇15mL。上硅胶柱色谱，拌样硅胶1.7g，空白 硅胶10g，玻璃柱内径2.0cm，氯仿-甲醇系统梯度洗脱(条件见表1)，柱体积25mL，每个 梯度洗脱200mL，得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，氯仿：甲醇梯度洗 脱提取物，TLC分析结果见图2,图3,TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙 酯：甲醇（3:1:1)显色方法：香草醛-硫酸显色。
[0011] 表 1
3、抑制乙酰胆碱酯酶活性筛选方法和结果 1) 实验条件 a、 材料：DMSO(二甲基亚砜）（科密欧公司）；KH2P04、K2HP04WH2CK广东汕头市西陇化 工厂）；AchE酶（美国Sigma公司）；PNPG(美国Sigma公司） b、 实验仪器：多功能酶标仪Bio-RadModel680 型（Bio-RadLaboratoriesInc.) 2) 实验方法和过程 样品处理：将Img待测样品溶于20 二甲基亚砜（DMSO)作为母液，取I母液 加入249 蒸馏水配成200 .mr1的溶液。
[0012] 乙酰胆碱酯酶抑制活性测定方法： 在96孔酶标板上测定样品的AchE抑制活性。具体操作如下：在96孔酶标板中依次加 入 20yLPB(100mM，pH8. 0)，25yLAChE(0? 033U/mL，pH8. 0PB溶解稀释），25yL 样品溶液（40yg.mL_ 〇。冰浴 5min后，加 15yLATCI(0. 6mM)及 15yLDTNB(I. 5mM)。 37°C孵育60min后，用酶标仪在412nm下测定其吸光度值。根据下式计算抑制率： 酶活性抑制率％=[A空白_(A样品-A背景）]/A空白X100 式中Aee :不加样品反应后的吸收值； :加入样品反应后的吸收值； Awft :只加样品的吸收值。
[0013] 3)实验结果 表2
结果发现： 本发明的最优方案为：维吾尔药宽筋藤经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱 分离，上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，继用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该乙酰胆碱酯酶抑制活性提 取物。该乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图1。
[0014] 维吾尔药宽筋藤经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅 胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶 剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积 比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物。该乙酰胆 碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图2。
[0015] 4、乙酰胆碱酯酶抑制活性有效提取物的提取方法研宄 1)提取溶剂的种类研宄 分别用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机 溶剂提取，并测试提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性，实验结果如下： 表3
研宄结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混 合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0016] 2)提取溶剂的用量研宄 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比)有机溶剂提取，并测试提取物的乙酰 胆碱酯酶抑制活性，结果如下： 表4
活性提取物的提取所用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0017] 3)干燥方法的研宄 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的抑 制乙酰胆碱酯酶活性提取物进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、 冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物进行 干燥，其中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0018]表 5
优选地，宽筋藤乙酰胆碱 酯酶抑制活性提取物的制备方法为： 维吾尔药宽筋藤经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶 柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100: 1，体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比)洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用氯仿-甲醇 混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提 取物。以上条件最优为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积比)洗脱10倍柱 体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱30倍柱体积。
[0019] 维吾尔药宽筋藤经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅 胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8，体积比)洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用 氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用氯仿-甲 醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性 提取物。以上条件最优为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比)洗脱10倍 柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱30倍柱体积。
[0020] 其中， 1)提取物提取用溶剂可以为甲醇、石油醚、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、 乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。活性提取物提取用有机溶剂用量为药材重 量的2-50倍(重量/体积比)。
[0021] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0022] 5.宽筋藤抑制乙酰胆碱酯酶活性提取物(洗脱液为100 :2或100 :12时干燥获得 的提取物）的医药用途研宄 按优化的宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物制备方法制备的活性提取物，经测试， 其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=56. 3yg/mL。
[0023] 由于乙酰胆碱酯酶抑制剂具有治疗阿尔茨海默病等方面的医药用途。因此，我们 发现的宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物具有广泛的医药用途。
[0024] 6、宽筋藤抑制乙酰胆碱酯酶活性提取物的组合物及其制备方法研宄 1)固体分散体 处方 宽筋藤提取物 20 g Vc Ig 聚乙烯吡咯烷酮 79 g 固体分散100g制备方法： 称取宽筋藤提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放 入烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力搅拌器搅拌至宽筋藤提取物和载体完全溶解， 充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得宽筋藤有效提取 物PVP包合物。
[0025] 2)环糊精包合物 处方： 宽筋藤提取物 20 g Vc Ig 0 -环糊精 79 g 包合物100g制备方法： 将0-环糊精与1-5倍水研匀，加宽筋藤有效提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）继续充分研磨至成糊状物，低温干燥即得环糊精包合物。
[0026] 3)分散片处方： 宽筋藤提取物 100 十>烷基硫酸纳 1 Vc 1 预胶化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交联聚维酮 10 微晶纤维素 9 微分硅胶 0. 3 滑石粉 1 100片 制备方法： 1. 宽筋藤有效提取物分散体的制备，精密称取宽筋藤提取物、Vc，加入处方量的十二烷 基硫酸钠，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C 的温度下蒸干，粉碎，过100目筛； 2. 将第一步中的宽筋藤有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉， 用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置 15min后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀 后，压片即得。
[0027] 7、宽筋藤抑制乙酰胆碱酯酶活性提取物的检测方法研宄 我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性 提取物的特征。见图1、2 具体条件为：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)显色方法：香草 醛-硫酸显色。
[0028]
【附图说明】： 图1宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物的TLC色谱图； 图2宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物的TLC色谱图； 图3宽筋藤溶剂提取物的TLC色谱图。
[0029]
【具体实施方式】： 以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。
[0030] 实施例1 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2.0cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体 积比)洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比)洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，真空干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=87. 0 yg/mL〇
[0031] 实施例2: 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL乙醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积 比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=89. 0 yg/mL〇
[0032] 实施例3 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL石油醚超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积 比)洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比)洗脱，洗 脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回收 有机溶剂，旋蒸干燥法，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=82. 0 yg/mL〇
[0033] 实施例4: 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL丙酮超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积 比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，鼓风干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=83. 0 yg/mL〇
[0034] 实施例5 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL氯仿超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积 比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，离心干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=75. 0 yg/mL〇
[0035] 实施例6 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL乙酸乙酯超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱 分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体 积比)洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比)洗脱， 洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=63. 0 yg/mL〇
[0036] 实施例7 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇水混合溶剂（甲醇：水=1 :1)超声提取15min， 提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂 (氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗 脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:2，体积比）洗脱，洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2，体 积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯 酶抑制活性为IC5(I=87. 0yg/mL。
[0037] 实施例8 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=1 :1)超声提取15min， 提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂 (氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:2，体积比）洗脱，洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2，体 积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙酰胆碱酯 酶抑制活性为IC5(I=57. 0yg/mL。
[0038] 实施例9 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL乙醇-水混合溶剂（乙醇：水=90 :10)超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混 合溶剂(氯仿-甲醇，100: 1，体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯 仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱，洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇， 100:2,体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其乙 酰胆碱酯酶抑制活性为IC5(I=70. 0yg/mL。
[0039] 实施例10 : 取维吾尔药宽筋藤20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2.0cm内径小柱)，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体 积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗 脱，洗脱30倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱的洗脱液 经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提取物。收率0. 88%。
[0040] 实施例11:固体分散体 称取宽筋藤提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放 入烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力搅拌器搅拌至宽筋藤提取物和载体完全溶解， 充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得宽筋藤有效提取 物PVP包合物。
[0041] 实施例12:环糊精包合物 将0-环糊精与1-5倍水研匀，加宽筋藤有效提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）继续充分研磨至成糊状物，低温干燥即得环糊精包合物。
[0042] 实施例13 :分散片 1.宽筋藤有效提取物分散体的制备，精密称取宽筋藤提取物、Vc，加入处方量的十二烷 基硫酸钠，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C 的温度下蒸干，粉碎，过100目筛； 将第一步中的宽筋藤有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉，用 适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min 后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片 即得。
【主权项】
1. 一种宽筋藤提取物，其特征为宽筋藤经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱，先用体积比100:1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，继用体积比100:2氯 仿-甲醇混合溶剂洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱 液经回收溶剂，干燥，即为该提取物；或先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积 比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合 溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该提取物。2. 如权利要求1所述宽筋藤提取物，其特征为，提取溶剂可为甲醇、石油醚、水、丙酮、 氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。3. 如权利要求1所述宽筋藤提取物，一种宽筋藤提取物，其特征为宽筋藤经溶剂超声 提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:8,体积比)洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比)洗脱，用氯 仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比)洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该提 取物；或其特征为宽筋藤经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱， 先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯 仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱 的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物。4.如权利要求1-3任何一项所述的一种维吾尔药宽筋藤提取物，其特征为，用于洗脱 的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱体积为2-50倍柱体积。5. 权利要求1所述提取物的制备方法，其特征为：宽筋藤经溶剂超声提取，提取液浓缩 后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100: 1，体积比） 洗脱2-50倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱2-50倍 柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶 剂，干燥，即为该提取物；以上条件最优为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:1，体 积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:2,体积比）洗脱30倍 柱体积；或宽筋藤经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用氯 仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比）洗脱2-50倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合 溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱2-50倍柱体积，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:12,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物；以上条件最优为 先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:8,体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇 混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱30倍柱体积。6. -种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的维吾尔药宽筋藤 提取物和药学上可接受的载体。7. -种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的宽筋藤提取物或权 利要求6所述的药物组合物。8. 如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述的制剂为固体分散体、环糊精包合 物、分散片。9.如权利要求1-5任何一项所述提取物或权利要求6所述的组合物或权利要求7所述 的药物制剂在制备乙酰胆碱酯酶抑制活性药物中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，乙酰胆碱酯酶抑制活性可用于治疗阿尔茨 海默病（AD)等方面的医药用途。11.如权利要求1-5任何一项所述的维吾尔药宽筋藤提取物，其特征在于，用TLC法检 测，其色谱条件为：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇=3:1:1，显色方法：香草 醛浓硫酸显色。
【专利摘要】本发明属医药技术领域，具体涉及一种宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其组合物的制备方法以及它在治疗阿尔茨海默病(AD)等方面的医药用途。所述的提取物通过如下方法获得：先用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:1，体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:2，体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:2，体积比）洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物，或先用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:8，体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:12，体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿-甲醇，100:12，体积比）洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥，即为该乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物。
【IPC分类】G01N30/90, A61P25/28, A61K36/59
【公开号】CN104906191
【申请号】CN201510058772
【发明人】王金辉, 热娜·卡斯木, 黄健, 李国玉, 逄小博, 王新玲, 马庆东, 张珂
【申请人】新疆医科大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年2月4日
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