一种橘红枇杷片的制备方法及应用
一种橘红枇杷片的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种橘红枇杷片的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 橘红枇杷片记载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第四册第216 页，标准号WS3-B-0866-91，由化橘红14g，陈皮76g，枇杷叶222g，桔梗21g，紫苏子69g，甘草 14g作为原料药制成，以上六味，陈皮、化橘红先提取挥发油，药渣与其余各药混合，加水煎 煮二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏，加蔗糖200g各辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥， 喷加陈皮等挥发油，混匀，压制成1000片，即得。能止咳祛痰。用于咳嗽痰多。
[0003]现有技术中，尚未有橘红枇杷片在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道， 而采用提取挥发油和水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，不能将某些高沸点，低挥发度的成分 全部提取出来，而且长时间处于高温状态下，药物的挥发性成分容易逸散，某些易热解的物 质或化学不稳定性成分也易被破坏，药材的有效成分损失巨大，严重影响了药物的疗效，导 致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。因此，需要开发一种有效成 分高、质量稳定可靠，适用于现代化生产的橘红枇杷片。
【发明内容】
[0004]发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种有效成分高、质量稳定 可靠，适用于现代化生产的橘红枇杷片的制备方法。本发明的另一个目的在于提供一种橘 红枇杷片在制备抑制大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞增殖药物中的应用。
[0005]技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的： 一种橘红枇杷片的制备方法，由其特征在于，由以下重量百分比的原料组成化橘红 14g，陈皮76g，枇杷叶222g，桔梗21g，紫苏子69g，甘草14g作为原料药制成，其特征在于 所述的方法由下列步骤组成：取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为3 - 5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力10 - 20MPa，萃取时间30-60min，第二次萃取压力20 - 30Mpa，萃取时间45-75min，第三次萃取压 力 40 - 50Mpa，萃取时间 45-75min，温度 45 - 55°C，CO2流量 3 - 5ml/g生药?min，得超 临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进 行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次8-12分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸 附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波 提取物，备用；其余药材加入6-8倍水煎煮两次，每次2h，合并煎液，真空减压浓缩至相对密 度1. 05-1. 15 (50°C)，0. 22-1ym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波 提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0. 5g。
[0006]上述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃 取溶剂的体积百分比为4%。
[0007]上述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取 10分钟。
[0008] 上述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述C02超临界萃取的萃取采用 等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间45min，第二次萃取压力25Mpa，萃 取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间60min，萃取温度50°C，CO2流量4ml/g生 药?min〇
[0009] 上述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述水煎煮工艺取8倍水煎煮两 次，每次2h，真空减压浓缩至相对密度1. 10 (50°C)，0. 45ym微孔滤膜滤过。
[0010] 上述一种橘红枇杷片在制备抑制大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞增殖药物中的应 用。
[0011] 现有技术中，橘红枇杷片一次2~3片，一日3~4次，采用本发明制备成的橘红 枇杷片每次2片，一日服用2次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。
【具体实施方式】
[0012] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0013] 实施例1 取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为3%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力lOMPa，萃取时间30min，第二次萃 取压力20Mpa，萃取时间45min，第三次萃取压力40Mpa，萃取时间45min，温度45°C，CO2流量 3ml/g生药?min，得超临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓 缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇， 浓缩并干燥，得微波提取物，备用；其余药材加入6倍水煎煮两次，每次2h，合并煎液，真空 减压浓缩至相对密度1.05 (50°C)，0.22ym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃 取物、微波提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重 0. 5g〇
[0014] 实施例2 取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力20MPa，萃取时间60min，第二次萃 取压力30Mpa，萃取时间75min，第三次萃取压力50Mpa，萃取时间75min，温度55°C，0)2流 量5ml/g生药?min，得超临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙 醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次12分钟，合并萃取 液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收 乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；其余药材加入6-8倍水煎煮两次，每次2h，合并煎 液，真空减压浓缩至相对密度1. 15 (50°C)，Iym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临 界萃取物、微波提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每 片重〇. 5g。
[0015] 实施例3 取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为4%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间45min，第二次萃 取压力25Mpa，萃取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间60min，温度50°C，0)2流 量4ml/g生药?min，得超临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙 醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取 液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收 乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；其余药材加入8倍水煎煮两次，每次2h，合并煎液， 真空减压浓缩至相对密度1. 10 (50°C)，0. 45ym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临 界萃取物、微波提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每 片重〇. 5g。
[0016] 实施例4:橘红枇 杷片抑制大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞增殖实验研宄资料 1实验材料 I. 1实验用细胞株 大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞，上海酶联检测技术有限公司，DMEM+10%FBS常规培养。
[0017] 1.2实验药物 研宄药物：本发明橘红枇杷片：按实施例3方法制备。
[0018] 药液储液：称取IOOmg橘红枇杷片，溶于5ml无水乙醇中，0. 2ym滤器过滤， 500yIdoff管分装，-20°C存储，同时0. 2ym滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0019] 1.3实验试剂 DMEM(卡迈舒(上海）生物科技有限公司批号：20141102);胎牛血清FBS(广州蕊特 生物科技有限公司批号：20141005) ;NaHC03 (广州市昱浩贸易有限公司批号：20140505); Trypsin(上海雅心生物技术有限公司批号：20140401);EDTA(广州崇骏化工有限公司批 号：2012/10);PenicillinGSodiumSalt(大连美仑生物技术有限公司批号：20110214); StreptomycinSulfate(上海浩然生物技术有限公司批号：20130809);无水乙醇（南 阳市恒鑫光电物资有限公司批号：140910145);MTT(上海博谷生物科技有限公司批号： 20141023);PBS(实验室自配）； 1. 4实验器材 金相倒置显微镜（SEEPACK型号：L-323);可见-紫外光微孔板检测仪(德国Eppendorf型号：PlateReaderAF2200) ;C02培养箱（启前型号：QQ-80A-II);超净台（东莞市利安达环 境科技有限公司型号：LCJT-2A);纯水仪(超康型号：CK);精密移液器（BG-easyPIPET移 液器S1000);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号：BP211D);全自动高压灭菌锅(上海 博迅公司型号：YXQ-LS-75SII);台式电热鼓风干燥箱(苏州江东精密仪器有限公司型号： DHG-9123A);液氮罐（四川山立低温设备有限公司型号：CMSH100);低速离心机上海家舜玻 璃仪器有限公司型号：TDL-40B);0. 2ym滤器(密理博：MPGP02001);10cm培养皿（泰州市建 军医疗用品厂）、96孔培养板(泰州市建军医疗用品厂）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips 若干。
[0020] 2实验方法 I)RLl细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养（IOcm培养皿)，当细胞生长 至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋白酶-0. 04%EDTA， 37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000 rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。
[0021] 2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180y1，培养板放入细胞培养箱 中（37 °C，5%C02 )常规培养。
[0022] 3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入橘红枇杷片溶液，继续培养24h。
[0023] 4 ) 24h后加入 20yIMTT溶液（5mg/ml，即 0? 5%MTT)，继续培养 4h。
[0024] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200y1二甲基亚砜，置摇 床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0025] 6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0026] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示： 细胞增值抑制率（％)=(对照孔OD值-给药孔OD值）/对照孔OD值X100%。实验重 复3次。
[0027] 3统计处理 采用MicrosoftExcel2003软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean土S.D?表不。
[0028] 4实验结果 MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对RLl细胞增殖抑 制有差异（P〈〇. 05)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂量达到15-20mg/ ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
5实验结论 橘红枇杷片可以抑制RLl细胞增殖，减少RLl细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖 性。
【主权项】
1. 一种橘红枇杷片的制备方法，由其特征在于，由以下重量百分比的原料组成化橘红 14g，陈皮76g，枇杷叶222g，桔梗21g，紫苏子69g，甘草14g作为原料药制成，其特征在于 所述的方法由下列步骤组成：取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为3 - 5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力10 - 20MPa，萃取时间30-60min，第二次萃取压力20 - 30Mpa，萃取时间45-75min，第三次萃取压 力 40 - 50Mpa，萃取时间 45-75min，温度 45 - 55°C，CO2流量 3 - 5ml/g生药?min，得超 临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进 行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次8-12分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸 附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波 提取物，备用；其余药材加入6-8倍水煎煮两次，每次2h，合并煎液，真空减压浓缩至相对密 度1. 05-1. 15 (50°C)，0. 22-1ym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波 提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0. 5g。2. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%。3. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率 500W，每次萃取10分钟。4. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述C02超临界萃取 的萃取采用等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间45min，第二次萃取压 力25Mpa，萃取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间60min，萃取温度50°C，0)2流 量 4ml/g生药?min〇5. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述水煎煮工艺取8 倍水煎煮两次，每次2h，真空减压浓缩至相对密度1.10 (50°C)，0.45ym微孔滤膜滤过。6. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片在制备抑制大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞增殖 药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种橘红枇杷片的制备方法，由化橘红14g，陈皮76g，枇杷叶222g，桔梗21g，紫苏子69g，甘草14g作为原料药制成，采用超临界萃取、微波萃取和微孔滤膜过滤而成，使得有效成分含量有很大提高，本发明还提供了橘红枇杷片在制备抑制大鼠肺成纤维样细胞RL1细胞增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61K9/20, A61P35/00, A61K36/752
【公开号】CN104906233
【申请号】CN201510321392
【发明人】张志涛, 汤小燕, 郑文彤, 陈雨, 符正南, 邓枚
【申请人】广东恒诚制药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月12日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种橘红枇杷片的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 橘红枇杷片记载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第四册第216 页，标准号WS3-B-0866-91，由化橘红14g，陈皮76g，枇杷叶222g，桔梗21g，紫苏子69g，甘草 14g作为原料药制成，以上六味，陈皮、化橘红先提取挥发油，药渣与其余各药混合，加水煎 煮二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏，加蔗糖200g各辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥， 喷加陈皮等挥发油，混匀，压制成1000片，即得。能止咳祛痰。用于咳嗽痰多。
[0003]现有技术中，尚未有橘红枇杷片在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道， 而采用提取挥发油和水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，不能将某些高沸点，低挥发度的成分 全部提取出来，而且长时间处于高温状态下，药物的挥发性成分容易逸散，某些易热解的物 质或化学不稳定性成分也易被破坏，药材的有效成分损失巨大，严重影响了药物的疗效，导 致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。因此，需要开发一种有效成 分高、质量稳定可靠，适用于现代化生产的橘红枇杷片。
【发明内容】
[0004]发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种有效成分高、质量稳定 可靠，适用于现代化生产的橘红枇杷片的制备方法。本发明的另一个目的在于提供一种橘 红枇杷片在制备抑制大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞增殖药物中的应用。
[0005]技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的： 一种橘红枇杷片的制备方法，由其特征在于，由以下重量百分比的原料组成化橘红 14g，陈皮76g，枇杷叶222g，桔梗21g，紫苏子69g，甘草14g作为原料药制成，其特征在于 所述的方法由下列步骤组成：取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为3 - 5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力10 - 20MPa，萃取时间30-60min，第二次萃取压力20 - 30Mpa，萃取时间45-75min，第三次萃取压 力 40 - 50Mpa，萃取时间 45-75min，温度 45 - 55°C，CO2流量 3 - 5ml/g生药?min，得超 临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进 行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次8-12分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸 附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波 提取物，备用；其余药材加入6-8倍水煎煮两次，每次2h，合并煎液，真空减压浓缩至相对密 度1. 05-1. 15 (50°C)，0. 22-1ym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波 提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0. 5g。
[0006]上述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃 取溶剂的体积百分比为4%。
[0007]上述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取 10分钟。
[0008] 上述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述C02超临界萃取的萃取采用 等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间45min，第二次萃取压力25Mpa，萃 取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间60min，萃取温度50°C，CO2流量4ml/g生 药?min〇
[0009] 上述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述水煎煮工艺取8倍水煎煮两 次，每次2h，真空减压浓缩至相对密度1. 10 (50°C)，0. 45ym微孔滤膜滤过。
[0010] 上述一种橘红枇杷片在制备抑制大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞增殖药物中的应 用。
[0011] 现有技术中，橘红枇杷片一次2~3片，一日3~4次，采用本发明制备成的橘红 枇杷片每次2片，一日服用2次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。
【具体实施方式】
[0012] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0013] 实施例1 取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为3%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力lOMPa，萃取时间30min，第二次萃 取压力20Mpa，萃取时间45min，第三次萃取压力40Mpa，萃取时间45min，温度45°C，CO2流量 3ml/g生药?min，得超临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓 缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇， 浓缩并干燥，得微波提取物，备用；其余药材加入6倍水煎煮两次，每次2h，合并煎液，真空 减压浓缩至相对密度1.05 (50°C)，0.22ym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃 取物、微波提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重 0. 5g〇
[0014] 实施例2 取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力20MPa，萃取时间60min，第二次萃 取压力30Mpa，萃取时间75min，第三次萃取压力50Mpa，萃取时间75min，温度55°C，0)2流 量5ml/g生药?min，得超临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙 醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次12分钟，合并萃取 液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收 乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；其余药材加入6-8倍水煎煮两次，每次2h，合并煎 液，真空减压浓缩至相对密度1. 15 (50°C)，Iym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临 界萃取物、微波提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每 片重〇. 5g。
[0015] 实施例3 取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为4%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间45min，第二次萃 取压力25Mpa，萃取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间60min，温度50°C，0)2流 量4ml/g生药?min，得超临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙 醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取 液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收 乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；其余药材加入8倍水煎煮两次，每次2h，合并煎液， 真空减压浓缩至相对密度1. 10 (50°C)，0. 45ym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临 界萃取物、微波提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每 片重〇. 5g。
[0016] 实施例4:橘红枇 杷片抑制大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞增殖实验研宄资料 1实验材料 I. 1实验用细胞株 大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞，上海酶联检测技术有限公司，DMEM+10%FBS常规培养。
[0017] 1.2实验药物 研宄药物：本发明橘红枇杷片：按实施例3方法制备。
[0018] 药液储液：称取IOOmg橘红枇杷片，溶于5ml无水乙醇中，0. 2ym滤器过滤， 500yIdoff管分装，-20°C存储，同时0. 2ym滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0019] 1.3实验试剂 DMEM(卡迈舒(上海）生物科技有限公司批号：20141102);胎牛血清FBS(广州蕊特 生物科技有限公司批号：20141005) ;NaHC03 (广州市昱浩贸易有限公司批号：20140505); Trypsin(上海雅心生物技术有限公司批号：20140401);EDTA(广州崇骏化工有限公司批 号：2012/10);PenicillinGSodiumSalt(大连美仑生物技术有限公司批号：20110214); StreptomycinSulfate(上海浩然生物技术有限公司批号：20130809);无水乙醇（南 阳市恒鑫光电物资有限公司批号：140910145);MTT(上海博谷生物科技有限公司批号： 20141023);PBS(实验室自配）； 1. 4实验器材 金相倒置显微镜（SEEPACK型号：L-323);可见-紫外光微孔板检测仪(德国Eppendorf型号：PlateReaderAF2200) ;C02培养箱（启前型号：QQ-80A-II);超净台（东莞市利安达环 境科技有限公司型号：LCJT-2A);纯水仪(超康型号：CK);精密移液器（BG-easyPIPET移 液器S1000);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号：BP211D);全自动高压灭菌锅(上海 博迅公司型号：YXQ-LS-75SII);台式电热鼓风干燥箱(苏州江东精密仪器有限公司型号： DHG-9123A);液氮罐（四川山立低温设备有限公司型号：CMSH100);低速离心机上海家舜玻 璃仪器有限公司型号：TDL-40B);0. 2ym滤器(密理博：MPGP02001);10cm培养皿（泰州市建 军医疗用品厂）、96孔培养板(泰州市建军医疗用品厂）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips 若干。
[0020] 2实验方法 I)RLl细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养（IOcm培养皿)，当细胞生长 至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋白酶-0. 04%EDTA， 37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000 rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。
[0021] 2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180y1，培养板放入细胞培养箱 中（37 °C，5%C02 )常规培养。
[0022] 3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入橘红枇杷片溶液，继续培养24h。
[0023] 4 ) 24h后加入 20yIMTT溶液（5mg/ml，即 0? 5%MTT)，继续培养 4h。
[0024] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200y1二甲基亚砜，置摇 床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0025] 6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0026] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示： 细胞增值抑制率（％)=(对照孔OD值-给药孔OD值）/对照孔OD值X100%。实验重 复3次。
[0027] 3统计处理 采用MicrosoftExcel2003软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean土S.D?表不。
[0028] 4实验结果 MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对RLl细胞增殖抑 制有差异（P〈〇. 05)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂量达到15-20mg/ ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
5实验结论 橘红枇杷片可以抑制RLl细胞增殖，减少RLl细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖 性。
【主权项】
1. 一种橘红枇杷片的制备方法，由其特征在于，由以下重量百分比的原料组成化橘红 14g，陈皮76g，枇杷叶222g，桔梗21g，紫苏子69g，甘草14g作为原料药制成，其特征在于 所述的方法由下列步骤组成：取化橘红、陈皮加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为3 - 5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力10 - 20MPa，萃取时间30-60min，第二次萃取压力20 - 30Mpa，萃取时间45-75min，第三次萃取压 力 40 - 50Mpa，萃取时间 45-75min，温度 45 - 55°C，CO2流量 3 - 5ml/g生药?min，得超 临界萃取物，备用；取紫苏子、桔梗、甘草，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进 行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次8-12分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸 附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波 提取物，备用；其余药材加入6-8倍水煎煮两次，每次2h，合并煎液，真空减压浓缩至相对密 度1. 05-1. 15 (50°C)，0. 22-1ym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波 提取物和滤液混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0. 5g。2. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%。3. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率 500W，每次萃取10分钟。4. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述C02超临界萃取 的萃取采用等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间45min，第二次萃取压 力25Mpa，萃取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间60min，萃取温度50°C，0)2流 量 4ml/g生药?min〇5. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片的制备方法，其特征在于所述水煎煮工艺取8 倍水煎煮两次，每次2h，真空减压浓缩至相对密度1.10 (50°C)，0.45ym微孔滤膜滤过。6. 根据权利要求1所述一种橘红枇杷片在制备抑制大鼠肺成纤维样细胞RLl细胞增殖 药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种橘红枇杷片的制备方法，由化橘红14g，陈皮76g，枇杷叶222g，桔梗21g，紫苏子69g，甘草14g作为原料药制成，采用超临界萃取、微波萃取和微孔滤膜过滤而成，使得有效成分含量有很大提高，本发明还提供了橘红枇杷片在制备抑制大鼠肺成纤维样细胞RL1细胞增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61K9/20, A61P35/00, A61K36/752
【公开号】CN104906233
【申请号】CN201510321392
【发明人】张志涛, 汤小燕, 郑文彤, 陈雨, 符正南, 邓枚
【申请人】广东恒诚制药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月12日
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