一种抗柯萨奇病毒的药物及其制备方法和应用
一种抗柯萨奇病毒的药物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药领域，特别涉及一种抗柯萨奇病毒的药物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 柯萨奇病毒（Coxsachievirus)是一种小RNA病毒科的肠病毒（Enteroviruses)， 可分为A和B两类。现代医学已证实柯萨奇病毒与多种疾病有着密切关系，如胰腺炎、心肌 炎、心肌衰竭和扩张性心肌病等。其中，柯萨奇CVB3病毒，即柯萨奇B组病毒感染中以3型 (CVB3)，是一种常见的典型的溶细胞病毒，也是病毒性心肌炎的主要致病因素。虽然，今年 来新的抗病毒药不断出现，但对于CVB3尚无理想的化学药物，病毒唑虽然可以在一定程度 上抑制CVB3病毒，但由于毒副作用大而难以实施。
[0003] 裸花紫珠（CallicarpaNudiflora)是马鞭草科紫珠属植物。其中的有效成分有 黄酮类、缩合鞣酸、酚类、多糖、二萜和三萜类化合物、羟基化合物以及镁、钙、铁盐等，其中， 黄酮类包括木犀草素、芹菜素、槲皮素等；酚类化合物主要有酚苷类如毛蕊花糖苷、连翘酯 苷等，酚酸类如香草酸、阿魏酸、原儿茶酸等；萜类成分包括齐墩果酸和熊果酸，在裸花紫珠 中的含量很高。枝叶入药有抗菌止血、消炎解毒、驱风祛湿、增强免疫的功效。
[0004] 木麻黄系木麻黄科木麻黄属乔木，另Ij名为骨松（CasuarinaequisetifoliaLinn)。 原产澳大利亚、太平洋诸岛，中国引种约有80多年历史。广东、广西、福建、台湾及南海诸岛 均有栽培。性味苦温，有祛风通络益胃安神的功效，常用木麻黄的枝叶来治疗腹泻、痢疾，疗 效显著。木麻黄的主要成分有三萜成分、留醇、黄酮类、多种氨基酸、鞣质、多糖等。
[0005] 在现有技术中，裸花紫珠和木麻黄常用于细菌性感染引起的炎症，但是对病毒的 抑制研宄还有很大空间。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种抗柯萨奇病毒的药物及其制备方法和应用。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种抗柯萨奇病毒的药物，包括裸花紫珠和木麻黄中的 至少一种。
[0008] 优选地，所述的木麻黄包括但不限于木麻黄的原粉、或者木麻黄的水和/或醇的 提取物中的至少一种。
[0009] 优选地，所述的裸花紫珠包括但不限于裸花紫珠的原粉、或者裸花紫珠水和/或 醇的提取物的至少一种。
[0010] 优选地，所述的抗柯萨奇病毒的药物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄提取物组 成。
[0011] 进一步优选地，所述的抗柯萨奇病毒的药物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄提 取物按照质量比为1:3~3:1组成。
[0012] 更进一步优选地，所述的抗柯萨奇病毒的药物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄 提取物按照质量比为1:1组成。更进一步优选地，所述裸花紫珠提取物和木麻黄提取物的 浓度均优选为不低于200ug/ml(进一步优选为200-300ug/ml)。
[0013] 如本发明所述的，所述"裸花紫珠提取物"和"木麻黄提取物"为采用行业内常规 提取方法（包括但不限于中药干浸膏成分提取方法）所制备的提取物。
[0014] 如本发明所述的，所述的木麻黄提取物优选通过以下方法制备：取木麻黄枝梢，加 6~10倍量的水，煎煮1-5次，每次煎煮1~2小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度 为1. 19~1. 21(50~60°C)的清膏，喷雾干燥，粉碎后备用。
[0015] 进一步优选地，所述的木麻黄提取物优选通过以下方法制备：取木麻黄枝梢，切成 3~5cm的段，分别加10、8、6倍量的水，煎煮三次，第一次煎煮2小时，第二、三次各1小时， 滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1. 19~1. 21 (50~60°C)的清膏，喷雾干燥，粉碎 后过80目筛备用。
[0016] 如本发明所述的，所述的裸花紫珠提取物优选通过以下方法制备：取裸花紫珠，加 乙醇，回流提取1~3次，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1. 30~1. 33(70~80°C) 的稠膏，减压干燥后，粉碎成细粉备用（优选地，药渣加6~10倍量的水，煎煮1-3次，每次 煎煮1~2小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1. 19~1. 21(50~60°C)的清膏，喷 雾干燥，与上述乙醇提取物合并，混匀，粉碎后备用）。
[0017] 进一步优选地，所述的裸花紫珠提取物优选通过以下方法制备：取裸花紫珠，切成 1~2cm片，加10倍量的90%乙醇，回流提取两次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，滤 液回收乙醇并浓缩至相对密度1. 30~1. 33(70~80°C)的稠膏，70~80°C减压干燥后， 粉碎成细粉备用；药渣分别加8倍，6倍水量，煎煮2次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩 至相对密度为1. 19~1. 21(50~60°C)的清膏，喷雾干燥，与上述乙醇提取物合并，混匀， 粉碎后过80目筛备用。
[0018] 优选地，所述抗柯萨奇病毒的药物还包含医学上认可的任何一种载体或赋形剂。
[0019] 进一步优选地，所述抗柯萨奇病毒的药物的剂型是粉剂、或者注射液、或者胶囊、 或者片剂、或者口服液。
[0020] 第二方面，本发明提供了一种制备如第一方面所述的抗柯萨奇病毒的药物的方 法。
[0021] 第三方面，本发明提供了一种制备如第一方面所述的抗柯萨奇病毒的药物在制备 预防、治疗柯萨奇病毒疾病的药物中的应用，或在制备诊断柯萨奇病毒的药物中的应用。
[0022] 优选地，所述柯萨奇病毒为柯萨奇CVB3病毒。
[0023] 优选地，所述抗柯萨奇病毒的药物为木麻黄、裸花紫珠、或者木麻黄和裸花紫珠的 组合物。
[0024] 优选地，所述的木麻黄包括但不限于木麻黄的原粉、或者木麻黄的水和/或醇的 提取物中的至少一种。
[0025] 优选地，所述的裸花紫珠包括但不限于裸花紫珠的原粉、或者裸花紫珠水和/或 醇的提取物，或上述中的一种或多种。
[0026] 本发明提供的药物能抑制柯萨奇病毒，且效果显著，无毒副作用，易于生产，具有 较好的市场开发前景。特别地，本发明的提供的抗柯萨奇病毒的药物组合物，经过优化组 合，具有协同增效的作用，抗病毒效果明显优于单一的裸花紫珠或者木麻黄用药效果。
[0027] 本发明提供的抗柯萨奇病毒的药物的制备方法简单，为行业内常规手段，且药材 成本低。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例提供的MMH、LH以及50 %MMH/50 %LH对HeIa细胞存活率-浓 度曲线；
[0029] 图2为本发明实施例提供的MMH、LH以及25%MMH/75%LH的病毒抑制率-浓度 曲线；
[0030] 图3为本发明实施例提供的MMH、LH以及50%MMH/50%LH的病毒抑制率-浓度 曲线；
[0031] 图4为本发明实施例提供的MMH、LH以及75%MMH/25%LH的病毒抑制率-浓度 曲线。
【具体实施方式】
[0032] 以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 实施例1
[0035] 裸花紫珠提取物（裸花紫珠干浸膏）的制备：
[0036] 所述的裸花紫珠提取物优选通过以下方法制备：取裸花紫珠，切成1~2cm片，加 10倍量的90%乙醇，回流提取两次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，滤液回收乙醇并浓 缩至相对密度1. 30~1. 33(70~80°C)的稠膏，70~80°C减压干燥后，粉碎成细粉备 用；药渣分别加8倍，6倍水量，煎煮2次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为 1. 19~1. 21 (50~60°C)的清膏，喷雾干燥，与上述乙醇提取 物合并，混匀，粉碎后过80目 筛备用。
[0037] 木麻黄提取物（木麻黄干浸膏）的制备：
[0038] 所述的木麻黄提取物优选通过以下方法制备：取木麻黄枝梢，切成3~5cm的段， 分别加1〇、8、6倍量的水，煎煮三次，第一次煎煮2小时，第二、三次各1小时，滤过，合并滤 液，滤液浓缩至相对密度为1. 19~1. 21 (50~60°C)的清膏，喷雾干燥，粉碎后过80目筛 备用。
[0039] 实施例2
[0040] 药物毒性实验
[0041] 复苏待试的细胞并铺96孔板，细胞密度为1*105个/ml。细胞长成单层后，将待试 药物倍比稀释配成8个浓度（6-7个浓度也可以，即IO6-IO8)，加入96孔板内，每孔100y1， 各设6个复孔，同时设正常细胞对照。每天显微镜下观察，根据细胞形态确定药物的最大无 毒浓度（与正常细胞组比较）。细胞毒性一般状态为细胞变圆，脱落等。培养结束（48或72 小时后），加入MTT溶液（噻唑兰溶液）IOul/孔，继续培养4h。小心吸出MTT，加入DMSO(二 甲基亚砜）IOOul/孔，振荡孵育15min(此过程注意避光），酶标仪预热至少15min后，酶标 读数仪比色（波长570nm，参考波长630nm)，测吸光度A值。通过A值与活细胞的数量呈正 相关，计算细胞存活率、药物的半数毒性浓度（TC50)。计算公式：细胞存活率（％)=实验 组A57tl/ 对照组A57tlX100 %。
[0042] 实验结果如图1所示。图1为本发明实施例提供的MMH、LH以及50%MMH/50 %LH 对Hela细胞存活率-浓度曲线，在图1中，以药物浓度为横坐标，病毒抑制率为纵坐标。三 种药物都是以〇.lmg/ml作为起始浓度，从实验结果得到：在浓度为0-350ug/mL的浓度范围 内，木麻黄提取物（MMH)、裸花紫珠提取物（LH)和50%MMH/50 %LH对Hela细胞基本无毒 (所有浓度下细胞存活率都大于80% )。
[0043] 实施例3
[0044] 抗柯萨奇病毒药物抗病毒实验
[0045] 当Hela细胞生长至对数期后，感染病毒，然后加入不同浓度的药物溶液（从最大 无毒浓度开始倍比稀释），放培养箱培养。实验分为五个处理组：
[0046]
[0047] 如本发明所述的，如上实验中，药物溶液的配置方法如下：
[0048] 1)处理组1和2
[0049] 以300ug/mL的MMH为例：取300ug的MMH干浸膏粉（实施例1制备），溶于ImL纯 净水中，即可获得300ug/mL的MMH溶液。其他浓度0-300 (ug/mL)组溶液用此高浓度组溶 液用水稀释相应倍数得到。
[0050] 2)处理组 3-5
[0051]以 25%MMH:75%LH(1:3)为例：其高浓度组（300ug/mL)由 75ug的MMH加 225ug 的LH用Iml水溶解后制成，其它浓度的溶液用该高浓度溶液用水稀释相应倍数得到。其它 几组溶液的配制参照此法配制。同时，每个处理组同时设空白对照组（不加试药也不加病 毒）、病毒对照组（不加试药加病毒）。
[0052] 每24小时在光镜下观察一次细胞生长情况，与对照组比较，观察和估计不同浓度 药物组细胞的生长状态和破坏率，并做记录。待病毒对照组的细胞病变达到75%以上而正 常细胞对照组正常时，观察并记录各孔的CPE。CPE的记录方法为：无细胞病变；1 %~ 25%细胞出现病变为" + " ；26%~50%细胞病变为"++" ；51%~75%细胞病变为"+++" ； 76%~100%的细胞病变为"++++"。48h后，采用与"药物毒性实验"同样的MTT法检测细 胞活性。
[0053] 通过酶标仪A值与活细胞的数量呈正相关，计算半数抑制浓度（IC50)和病毒抑制 率，计算公式：病毒抑制率=(药物处理组吸光度-病毒对照组吸光度）八细胞对照组吸光 度-病毒对照组吸光度）X100%。
[0054] 实验结果如图2-图4所示。图2为MMH、LH以及25%MMH/75 %LH的病毒抑制 率-浓度曲线；图3为MMH、LH以及50 %MMH/50 %LH的病毒抑制率-浓度曲线；图4为 MMH、LH以及75%MMH/25%LH的病毒抑制率-浓度曲线。
[0055] 由图2-4可知，在高浓度下三个药对CVB3(科萨奇病毒CVB3型）均有抑制作用， 且具有如下规律：
[0056] 1)在低浓度下（如图2所示，约0-55ug/mL)，25 %MMH/75 %LH的药物组合，对 CVB3的抑制作用高于任意单一MMH和LH用药组，但是抑制效果均低于20%。
[0057] 2)在一定浓度下（如图3所示，约200-350ug/mL)，50%MMH/50%LH的药物组合， 对CVB3的抑制作用高于任意单一MMH和LH用药组，且抑制效果高于50%。由图3可知， MMH对CVB3 的IC50 (半数抑制浓度）为 259. 5ug/ml，LH对CVB3 的IC50 为 123. 2ug/ml，两 种药对半混合后对CVB3的IC50为175.Oug/ml。
[0058] 3)75%MMH/25%LH的药物组合，对CVB3的抑制作用低于任意单一MMH和LH用药 组。如图4所示。
[0059] 从上述实验结果可以看出，本发明提供的药物组合物，MMH和LH单独使用均具有 一定的抗CVB3作用，MMH和LH用药浓度分别为259. 5ug/mL和123. 2ug/mL时，抑制率分别 可达到50%以上。
[0060] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，包括裸花紫珠和木麻黄中的至少一种。2. 如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述的木麻黄包括木麻黄 的原粉、或者木麻黄的水和/或醇的提取物中的至少一种。3. 如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述的裸花紫珠包括裸花 紫珠的原粉、或者裸花紫珠水和/或醇的提取物，或上述中的一种或多种。4. 如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述的抗柯萨奇病毒的药 物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄提取物组成。5. 如权利要求1或4所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述的抗柯萨奇病毒的 药物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄提取物按照质量比为1:3~3:1组成。6. 如权利要求1或5所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述抗柯萨奇病毒的药 物还包含医学上认可的任何一种载体或赋形剂。7. -种制备如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物的方法。8. -种如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物在制备预防、治疗柯萨奇病毒疾病的 药物中的应用，或在制备诊断柯萨奇病毒的药物中的应用。9. 如权利要求8所述抗柯萨奇病毒的药物的应用，其特征在于，所述柯萨奇病毒为柯 萨奇CVB3病毒。10. 如权利要求8所述抗柯萨奇病毒的药物的应用，其特征在于，所述抗柯萨奇病毒的 药物为木麻黄、裸花紫珠、或者木麻黄和裸花紫珠的组合物。
【专利摘要】本发明公开了一种抗柯萨奇病毒的药物及其制备方法和应用。本发明提供的药物能抑制柯萨奇病毒，且效果显著，无毒副作用，易于生产，具有较好的市场开发前景。特别地，本发明提供的抗柯萨奇病毒的药物组合物，经过优化组合，具有协同增效的作用，抗病毒效果明显优于单一的裸花紫珠或者木麻黄用药效果。
【IPC分类】A61K36/185, A61P31/14, A61K36/85
【公开号】CN104906266
【申请号】CN201510305257
【发明人】蒲含林, 李秀峰, 赖潜, 李武
【申请人】海南制药厂有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月5日
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药领域，特别涉及一种抗柯萨奇病毒的药物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 柯萨奇病毒（Coxsachievirus)是一种小RNA病毒科的肠病毒（Enteroviruses)， 可分为A和B两类。现代医学已证实柯萨奇病毒与多种疾病有着密切关系，如胰腺炎、心肌 炎、心肌衰竭和扩张性心肌病等。其中，柯萨奇CVB3病毒，即柯萨奇B组病毒感染中以3型 (CVB3)，是一种常见的典型的溶细胞病毒，也是病毒性心肌炎的主要致病因素。虽然，今年 来新的抗病毒药不断出现，但对于CVB3尚无理想的化学药物，病毒唑虽然可以在一定程度 上抑制CVB3病毒，但由于毒副作用大而难以实施。
[0003] 裸花紫珠（CallicarpaNudiflora)是马鞭草科紫珠属植物。其中的有效成分有 黄酮类、缩合鞣酸、酚类、多糖、二萜和三萜类化合物、羟基化合物以及镁、钙、铁盐等，其中， 黄酮类包括木犀草素、芹菜素、槲皮素等；酚类化合物主要有酚苷类如毛蕊花糖苷、连翘酯 苷等，酚酸类如香草酸、阿魏酸、原儿茶酸等；萜类成分包括齐墩果酸和熊果酸，在裸花紫珠 中的含量很高。枝叶入药有抗菌止血、消炎解毒、驱风祛湿、增强免疫的功效。
[0004] 木麻黄系木麻黄科木麻黄属乔木，另Ij名为骨松（CasuarinaequisetifoliaLinn)。 原产澳大利亚、太平洋诸岛，中国引种约有80多年历史。广东、广西、福建、台湾及南海诸岛 均有栽培。性味苦温，有祛风通络益胃安神的功效，常用木麻黄的枝叶来治疗腹泻、痢疾，疗 效显著。木麻黄的主要成分有三萜成分、留醇、黄酮类、多种氨基酸、鞣质、多糖等。
[0005] 在现有技术中，裸花紫珠和木麻黄常用于细菌性感染引起的炎症，但是对病毒的 抑制研宄还有很大空间。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种抗柯萨奇病毒的药物及其制备方法和应用。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种抗柯萨奇病毒的药物，包括裸花紫珠和木麻黄中的 至少一种。
[0008] 优选地，所述的木麻黄包括但不限于木麻黄的原粉、或者木麻黄的水和/或醇的 提取物中的至少一种。
[0009] 优选地，所述的裸花紫珠包括但不限于裸花紫珠的原粉、或者裸花紫珠水和/或 醇的提取物的至少一种。
[0010] 优选地，所述的抗柯萨奇病毒的药物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄提取物组 成。
[0011] 进一步优选地，所述的抗柯萨奇病毒的药物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄提 取物按照质量比为1:3~3:1组成。
[0012] 更进一步优选地，所述的抗柯萨奇病毒的药物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄 提取物按照质量比为1:1组成。更进一步优选地，所述裸花紫珠提取物和木麻黄提取物的 浓度均优选为不低于200ug/ml(进一步优选为200-300ug/ml)。
[0013] 如本发明所述的，所述"裸花紫珠提取物"和"木麻黄提取物"为采用行业内常规 提取方法（包括但不限于中药干浸膏成分提取方法）所制备的提取物。
[0014] 如本发明所述的，所述的木麻黄提取物优选通过以下方法制备：取木麻黄枝梢，加 6~10倍量的水，煎煮1-5次，每次煎煮1~2小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度 为1. 19~1. 21(50~60°C)的清膏，喷雾干燥，粉碎后备用。
[0015] 进一步优选地，所述的木麻黄提取物优选通过以下方法制备：取木麻黄枝梢，切成 3~5cm的段，分别加10、8、6倍量的水，煎煮三次，第一次煎煮2小时，第二、三次各1小时， 滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1. 19~1. 21 (50~60°C)的清膏，喷雾干燥，粉碎 后过80目筛备用。
[0016] 如本发明所述的，所述的裸花紫珠提取物优选通过以下方法制备：取裸花紫珠，加 乙醇，回流提取1~3次，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1. 30~1. 33(70~80°C) 的稠膏，减压干燥后，粉碎成细粉备用（优选地，药渣加6~10倍量的水，煎煮1-3次，每次 煎煮1~2小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1. 19~1. 21(50~60°C)的清膏，喷 雾干燥，与上述乙醇提取物合并，混匀，粉碎后备用）。
[0017] 进一步优选地，所述的裸花紫珠提取物优选通过以下方法制备：取裸花紫珠，切成 1~2cm片，加10倍量的90%乙醇，回流提取两次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，滤 液回收乙醇并浓缩至相对密度1. 30~1. 33(70~80°C)的稠膏，70~80°C减压干燥后， 粉碎成细粉备用；药渣分别加8倍，6倍水量，煎煮2次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩 至相对密度为1. 19~1. 21(50~60°C)的清膏，喷雾干燥，与上述乙醇提取物合并，混匀， 粉碎后过80目筛备用。
[0018] 优选地，所述抗柯萨奇病毒的药物还包含医学上认可的任何一种载体或赋形剂。
[0019] 进一步优选地，所述抗柯萨奇病毒的药物的剂型是粉剂、或者注射液、或者胶囊、 或者片剂、或者口服液。
[0020] 第二方面，本发明提供了一种制备如第一方面所述的抗柯萨奇病毒的药物的方 法。
[0021] 第三方面，本发明提供了一种制备如第一方面所述的抗柯萨奇病毒的药物在制备 预防、治疗柯萨奇病毒疾病的药物中的应用，或在制备诊断柯萨奇病毒的药物中的应用。
[0022] 优选地，所述柯萨奇病毒为柯萨奇CVB3病毒。
[0023] 优选地，所述抗柯萨奇病毒的药物为木麻黄、裸花紫珠、或者木麻黄和裸花紫珠的 组合物。
[0024] 优选地，所述的木麻黄包括但不限于木麻黄的原粉、或者木麻黄的水和/或醇的 提取物中的至少一种。
[0025] 优选地，所述的裸花紫珠包括但不限于裸花紫珠的原粉、或者裸花紫珠水和/或 醇的提取物，或上述中的一种或多种。
[0026] 本发明提供的药物能抑制柯萨奇病毒，且效果显著，无毒副作用，易于生产，具有 较好的市场开发前景。特别地，本发明的提供的抗柯萨奇病毒的药物组合物，经过优化组 合，具有协同增效的作用，抗病毒效果明显优于单一的裸花紫珠或者木麻黄用药效果。
[0027] 本发明提供的抗柯萨奇病毒的药物的制备方法简单，为行业内常规手段，且药材 成本低。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例提供的MMH、LH以及50 %MMH/50 %LH对HeIa细胞存活率-浓 度曲线；
[0029] 图2为本发明实施例提供的MMH、LH以及25%MMH/75%LH的病毒抑制率-浓度 曲线；
[0030] 图3为本发明实施例提供的MMH、LH以及50%MMH/50%LH的病毒抑制率-浓度 曲线；
[0031] 图4为本发明实施例提供的MMH、LH以及75%MMH/25%LH的病毒抑制率-浓度 曲线。
【具体实施方式】
[0032] 以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 实施例1
[0035] 裸花紫珠提取物（裸花紫珠干浸膏）的制备：
[0036] 所述的裸花紫珠提取物优选通过以下方法制备：取裸花紫珠，切成1~2cm片，加 10倍量的90%乙醇，回流提取两次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，滤液回收乙醇并浓 缩至相对密度1. 30~1. 33(70~80°C)的稠膏，70~80°C减压干燥后，粉碎成细粉备 用；药渣分别加8倍，6倍水量，煎煮2次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为 1. 19~1. 21 (50~60°C)的清膏，喷雾干燥，与上述乙醇提取 物合并，混匀，粉碎后过80目 筛备用。
[0037] 木麻黄提取物（木麻黄干浸膏）的制备：
[0038] 所述的木麻黄提取物优选通过以下方法制备：取木麻黄枝梢，切成3~5cm的段， 分别加1〇、8、6倍量的水，煎煮三次，第一次煎煮2小时，第二、三次各1小时，滤过，合并滤 液，滤液浓缩至相对密度为1. 19~1. 21 (50~60°C)的清膏，喷雾干燥，粉碎后过80目筛 备用。
[0039] 实施例2
[0040] 药物毒性实验
[0041] 复苏待试的细胞并铺96孔板，细胞密度为1*105个/ml。细胞长成单层后，将待试 药物倍比稀释配成8个浓度（6-7个浓度也可以，即IO6-IO8)，加入96孔板内，每孔100y1， 各设6个复孔，同时设正常细胞对照。每天显微镜下观察，根据细胞形态确定药物的最大无 毒浓度（与正常细胞组比较）。细胞毒性一般状态为细胞变圆，脱落等。培养结束（48或72 小时后），加入MTT溶液（噻唑兰溶液）IOul/孔，继续培养4h。小心吸出MTT，加入DMSO(二 甲基亚砜）IOOul/孔，振荡孵育15min(此过程注意避光），酶标仪预热至少15min后，酶标 读数仪比色（波长570nm，参考波长630nm)，测吸光度A值。通过A值与活细胞的数量呈正 相关，计算细胞存活率、药物的半数毒性浓度（TC50)。计算公式：细胞存活率（％)=实验 组A57tl/ 对照组A57tlX100 %。
[0042] 实验结果如图1所示。图1为本发明实施例提供的MMH、LH以及50%MMH/50 %LH 对Hela细胞存活率-浓度曲线，在图1中，以药物浓度为横坐标，病毒抑制率为纵坐标。三 种药物都是以〇.lmg/ml作为起始浓度，从实验结果得到：在浓度为0-350ug/mL的浓度范围 内，木麻黄提取物（MMH)、裸花紫珠提取物（LH)和50%MMH/50 %LH对Hela细胞基本无毒 (所有浓度下细胞存活率都大于80% )。
[0043] 实施例3
[0044] 抗柯萨奇病毒药物抗病毒实验
[0045] 当Hela细胞生长至对数期后，感染病毒，然后加入不同浓度的药物溶液（从最大 无毒浓度开始倍比稀释），放培养箱培养。实验分为五个处理组：
[0046]
[0047] 如本发明所述的，如上实验中，药物溶液的配置方法如下：
[0048] 1)处理组1和2
[0049] 以300ug/mL的MMH为例：取300ug的MMH干浸膏粉（实施例1制备），溶于ImL纯 净水中，即可获得300ug/mL的MMH溶液。其他浓度0-300 (ug/mL)组溶液用此高浓度组溶 液用水稀释相应倍数得到。
[0050] 2)处理组 3-5
[0051]以 25%MMH:75%LH(1:3)为例：其高浓度组（300ug/mL)由 75ug的MMH加 225ug 的LH用Iml水溶解后制成，其它浓度的溶液用该高浓度溶液用水稀释相应倍数得到。其它 几组溶液的配制参照此法配制。同时，每个处理组同时设空白对照组（不加试药也不加病 毒）、病毒对照组（不加试药加病毒）。
[0052] 每24小时在光镜下观察一次细胞生长情况，与对照组比较，观察和估计不同浓度 药物组细胞的生长状态和破坏率，并做记录。待病毒对照组的细胞病变达到75%以上而正 常细胞对照组正常时，观察并记录各孔的CPE。CPE的记录方法为：无细胞病变；1 %~ 25%细胞出现病变为" + " ；26%~50%细胞病变为"++" ；51%~75%细胞病变为"+++" ； 76%~100%的细胞病变为"++++"。48h后，采用与"药物毒性实验"同样的MTT法检测细 胞活性。
[0053] 通过酶标仪A值与活细胞的数量呈正相关，计算半数抑制浓度（IC50)和病毒抑制 率，计算公式：病毒抑制率=(药物处理组吸光度-病毒对照组吸光度）八细胞对照组吸光 度-病毒对照组吸光度）X100%。
[0054] 实验结果如图2-图4所示。图2为MMH、LH以及25%MMH/75 %LH的病毒抑制 率-浓度曲线；图3为MMH、LH以及50 %MMH/50 %LH的病毒抑制率-浓度曲线；图4为 MMH、LH以及75%MMH/25%LH的病毒抑制率-浓度曲线。
[0055] 由图2-4可知，在高浓度下三个药对CVB3(科萨奇病毒CVB3型）均有抑制作用， 且具有如下规律：
[0056] 1)在低浓度下（如图2所示，约0-55ug/mL)，25 %MMH/75 %LH的药物组合，对 CVB3的抑制作用高于任意单一MMH和LH用药组，但是抑制效果均低于20%。
[0057] 2)在一定浓度下（如图3所示，约200-350ug/mL)，50%MMH/50%LH的药物组合， 对CVB3的抑制作用高于任意单一MMH和LH用药组，且抑制效果高于50%。由图3可知， MMH对CVB3 的IC50 (半数抑制浓度）为 259. 5ug/ml，LH对CVB3 的IC50 为 123. 2ug/ml，两 种药对半混合后对CVB3的IC50为175.Oug/ml。
[0058] 3)75%MMH/25%LH的药物组合，对CVB3的抑制作用低于任意单一MMH和LH用药 组。如图4所示。
[0059] 从上述实验结果可以看出，本发明提供的药物组合物，MMH和LH单独使用均具有 一定的抗CVB3作用，MMH和LH用药浓度分别为259. 5ug/mL和123. 2ug/mL时，抑制率分别 可达到50%以上。
[0060] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，包括裸花紫珠和木麻黄中的至少一种。2. 如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述的木麻黄包括木麻黄 的原粉、或者木麻黄的水和/或醇的提取物中的至少一种。3. 如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述的裸花紫珠包括裸花 紫珠的原粉、或者裸花紫珠水和/或醇的提取物，或上述中的一种或多种。4. 如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述的抗柯萨奇病毒的药 物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄提取物组成。5. 如权利要求1或4所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述的抗柯萨奇病毒的 药物组合物由裸花紫珠提取物和木麻黄提取物按照质量比为1:3~3:1组成。6. 如权利要求1或5所述的抗柯萨奇病毒的药物，其特征在于，所述抗柯萨奇病毒的药 物还包含医学上认可的任何一种载体或赋形剂。7. -种制备如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物的方法。8. -种如权利要求1所述的抗柯萨奇病毒的药物在制备预防、治疗柯萨奇病毒疾病的 药物中的应用，或在制备诊断柯萨奇病毒的药物中的应用。9. 如权利要求8所述抗柯萨奇病毒的药物的应用，其特征在于，所述柯萨奇病毒为柯 萨奇CVB3病毒。10. 如权利要求8所述抗柯萨奇病毒的药物的应用，其特征在于，所述抗柯萨奇病毒的 药物为木麻黄、裸花紫珠、或者木麻黄和裸花紫珠的组合物。
【专利摘要】本发明公开了一种抗柯萨奇病毒的药物及其制备方法和应用。本发明提供的药物能抑制柯萨奇病毒，且效果显著，无毒副作用，易于生产，具有较好的市场开发前景。特别地，本发明提供的抗柯萨奇病毒的药物组合物，经过优化组合，具有协同增效的作用，抗病毒效果明显优于单一的裸花紫珠或者木麻黄用药效果。
【IPC分类】A61K36/185, A61P31/14, A61K36/85
【公开号】CN104906266
【申请号】CN201510305257
【发明人】蒲含林, 李秀峰, 赖潜, 李武
【申请人】海南制药厂有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月5日
最新回复(0)