一种乌鸡白凤胶囊的制备方法及应用
一种乌鸡白凤胶囊的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种乌鸡白凤胶囊的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 乌鸡白凤胶囊记载于国家药品食品监督管理局标准，处方为乌鸡（去毛爪 肠）540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、 银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，制法为以上十二味，乌鸡切成碎块，加水煎煮1 小时，趁热加石蜡250g，搅拌使其熔化，放置过夜，弃去上层石蜡及油脂固体，打成匀浆，加 入木瓜蛋白酶13. 5g，搅拌，调节pH值至6~7, 50°C水解5小时后，煮沸5分钟，离心，上清 液减压浓缩至稠膏，备用；丹参加70%乙醇浸泡过夜，加热回流二次，每次30分钟，合并提 取液，离心，上清液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1. 30~1. 35(80°C)的稠膏，备用； 丹参药渣与其余地黄等十味加水煎煮三次，第一次3小时，第二次2小时，第三次1小时，合 并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1. 30~1. 35 (80°C)的稠膏，与上述稠膏合并，真空干 燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。本品为硬胶囊，内容物为棕色的 粉末；味甜、微苦。补气养血，调经止带。用于气血两虚，身体瘦弱，腰膝酸软，月经不调，崩 漏带下。月经失调，贫血，功能性子宫出血，阴道炎。
[0003] 现有技术中，尚未有乌鸡白凤胶囊在提取制备方面采用超临界技术的报道，而采 用酶解、水煎煮等方法，工艺粗糙、复杂、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严 重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种乌鸡白凤胶囊的制备 方法。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌 P815细胞增殖药物中的应用。
[0006] 技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：
[0007] 一种乌鸡白凤胶囊的制备方法，由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋 香附l〇8g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋 鳖甲54g作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组成：取上述药材加入到C02超临界萃取 器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa， 温度30-50°C，C02流量l-3ml/g生药?min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入 淀粉20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0008] 所述乌鸡白凤胶囊的制备方法，所述C02超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积 百分比为5%。
[0009] 所述乌鸡白凤胶囊的制备方法，所述C02超临界萃取的萃取压力20MPa，温度 40°C，C02 流量 2ml/g生药?min，萃取时间 160min。
[0010] 所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物中的应用，乌 鸡白凤胶囊由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、白芍 l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g作为原料药制 成，制备方法为：取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、白 芍l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，加入到C02 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力 15-30MPa，温度30-50°C，C02流量l-3ml/g生药?min，萃取时间150-180min，得超临界萃 取物，加入淀粉20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0011] 所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物中的应用，其 特征在于乌鸡白凤胶囊的制备方法中所述C02超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百 分比为5%。
[0012] 所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物中的应用，其 特征在于乌鸡白凤胶囊的制备方法中所述C02超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C， C02流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。
[0013] 现有技术中，乌鸡白凤胶囊每粒0. 3g，口服，一次2~3粒，一日3次，采用本发明 制备成的乌鸡白凤胶囊每粒〇.3g，但含有的药材量比原来多，因此每次仅需1-2粒，一日服 用3次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。
【具体实施方式】
[0014] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0015] 实施例1 :取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、 白芍l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，加入到C02 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力 30MPa，温度30°C，C02流量lml/g生药?min，萃取时间180min，得超临界萃取物，加入淀粉 20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0016] 实施例2 :取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、 白芍l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，加入到C02 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力 15MPa，温度50°C，C02流量lml/g生药?min，萃取时间180min，得超临界萃取物，加入淀粉 20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0017] 实施例3 :取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、 白芍l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，加入到C02 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力 20MPa，温度40°C，C02流量2ml/g生药?min，萃取时间160min，得超临界萃取物，加入淀粉 20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0018] 实施例4 :乌鸡白凤胶囊抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖的实验研宄资料
[0019] 1实验材料
[0020] I. 1实验用细胞株：小鼠肥大细胞癌P815细胞，南京医科大学实验室细胞库， DMEM+10%FBS常规培养。
[0021] 1. 2实验药物：研宄药物：本发明乌鸡白凤胶囊：按实施例3方法制备。药液储液： 称取IOOmg乌鸡白凤胶囊内容物，混悬于5ml无水乙醇中，0. 2ym滤器过滤，500yIdoff 管分装，-20°C存储，同时0. 2ym滤器过滤无水乙醇以 备对照组之用。
[0022] L3 实验试剂：DMEM(GIBCO公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清 (浙江天杭生物科技有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat. No.11810-033Lot.No. 1088387)Jrypsin(AMRESC0 公司批号：2010/04) ;EDTA(AMRESCO 公司批号：2009/10);PenicillinGSodiumSalt(AMRESC0公司批号：2010242); Str印tomycinSulfate(AMRESO)公司批号：2010382);无水乙醇（南京化学试剂有限公司 批号：080310182) ;MTT(Biosharp批号：0793);PBS(实验室自配）；
[0023] 1. 4实验器材：莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMlL);可见-紫外光微孔板检 测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190) ;C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏 净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD);纯水仪（美国Spring公司型号：S/N020579);精 密移液器（法国吉尔森公司型号：P2);电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S); 全自动高压灭菌锅（日本SANK)公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密 实验设备公司型号：DHG9123A);冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号： 2001);低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000) ;0.2ym滤器（MILLIP0RE型 号：SLGP033RB) ;10cm培养皿（NEST公司）、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、 移液管、Tips若干。
[0024] 2实验方法：
[0025]1)P815 细胞用DMEM+10%FBS于 37°C、5%C02 进行常规培养（10cm培养皿）， 当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25 %胰蛋白 酶-0. 04%EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其 转入离心管中，1000 rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。2)将细胞种入96孔 培养板中，每孔加入细胞悬液180y1，培养板放入细胞培养箱中（37°C，5%C02)常规培养。 3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入乌鸡白凤胶囊溶液，继续培养24h。4) 24h 后加入20yIMTT溶液（5mg/ml，即0. 5%MTT)，继续培养4h。5) 4h后扣板法倒去上清，用 吸水纸轻轻拍干，每孔加入200y1二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶 解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6)同时设置本底（不加细胞，只加培 养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个 复孔。7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率（％) = (对照孔OD值-给药 孔OD值）/对照孔OD值X100%。实验重复3次。
[0026] 3实验结果：MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对 P815细胞增殖抑制有差异（P〈0. 05)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂 量达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
[0027] 表1乌鸡白凤胶囊对小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖抑制影响研宄（X土SD)
[0028]
[0029] 注：与对照组比较，*P〈0. 01 ;#P〈0. 001
[0030] 4实验结论：乌鸡白凤胶囊可以抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖，减少小鼠肥 大细胞癌P815细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 一种乌鸡白凤胶囊的制备方法，由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香 附108g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋 鳖甲54g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取上述药材加入到CO2 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力 15-30MPa，温度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min,萃取时间150-180min，得超临界萃取 物，加入淀粉20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。2. 根据权利要求1所述乌鸡白凤胶囊的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹 带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。3. 根据权利要求1所述乌鸡白凤胶囊的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的 萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。4. 根据权利要求1所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药 物中的应用，其特征在于乌鸡白凤胶囊由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香 附108g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋 鳖甲54g作为原料药制成，制备方法为：取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋 香附l〇8g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、 醋鳖甲54g，加入到0)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百 分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min,萃取时间 150-180min，得超临界萃取物，加入淀粉20g，70 %乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒， 每粒重0. 3g。5. 根据权利要求4所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物 中的应用，其特征在于乌鸡白凤胶囊的制备方法中所述〇)2超临界萃取夹带剂占总萃取溶 剂的体积百分比为5%。6. 根据权利要求4所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物 中的应用，其特征在于乌鸡白凤胶囊的制备方法中所述〇)2超临界萃取的萃取压力20MPa， 温度40°C，CO2流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。
【专利摘要】本发明属于中药制剂领域，具体提供一种乌鸡白凤胶囊的制备方法，由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得含量有很大提高，用量减少，本发明还提供了乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61K35/586, A61P35/00, A61K9/48, A61K35/618, A61K35/32, A61K36/8905, A61K35/57
【公开号】CN104906303
【申请号】CN201510340606
【发明人】李洋
【申请人】南京华宽信息咨询中心
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种乌鸡白凤胶囊的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 乌鸡白凤胶囊记载于国家药品食品监督管理局标准，处方为乌鸡（去毛爪 肠）540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、 银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，制法为以上十二味，乌鸡切成碎块，加水煎煮1 小时，趁热加石蜡250g，搅拌使其熔化，放置过夜，弃去上层石蜡及油脂固体，打成匀浆，加 入木瓜蛋白酶13. 5g，搅拌，调节pH值至6~7, 50°C水解5小时后，煮沸5分钟，离心，上清 液减压浓缩至稠膏，备用；丹参加70%乙醇浸泡过夜，加热回流二次，每次30分钟，合并提 取液，离心，上清液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1. 30~1. 35(80°C)的稠膏，备用； 丹参药渣与其余地黄等十味加水煎煮三次，第一次3小时，第二次2小时，第三次1小时，合 并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1. 30~1. 35 (80°C)的稠膏，与上述稠膏合并，真空干 燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。本品为硬胶囊，内容物为棕色的 粉末；味甜、微苦。补气养血，调经止带。用于气血两虚，身体瘦弱，腰膝酸软，月经不调，崩 漏带下。月经失调，贫血，功能性子宫出血，阴道炎。
[0003] 现有技术中，尚未有乌鸡白凤胶囊在提取制备方面采用超临界技术的报道，而采 用酶解、水煎煮等方法，工艺粗糙、复杂、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严 重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种乌鸡白凤胶囊的制备 方法。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌 P815细胞增殖药物中的应用。
[0006] 技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：
[0007] 一种乌鸡白凤胶囊的制备方法，由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋 香附l〇8g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋 鳖甲54g作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组成：取上述药材加入到C02超临界萃取 器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa， 温度30-50°C，C02流量l-3ml/g生药?min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入 淀粉20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0008] 所述乌鸡白凤胶囊的制备方法，所述C02超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积 百分比为5%。
[0009] 所述乌鸡白凤胶囊的制备方法，所述C02超临界萃取的萃取压力20MPa，温度 40°C，C02 流量 2ml/g生药?min，萃取时间 160min。
[0010] 所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物中的应用，乌 鸡白凤胶囊由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、白芍 l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g作为原料药制 成，制备方法为：取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、白 芍l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，加入到C02 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力 15-30MPa，温度30-50°C，C02流量l-3ml/g生药?min，萃取时间150-180min，得超临界萃 取物，加入淀粉20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0011] 所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物中的应用，其 特征在于乌鸡白凤胶囊的制备方法中所述C02超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百 分比为5%。
[0012] 所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物中的应用，其 特征在于乌鸡白凤胶囊的制备方法中所述C02超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C， C02流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。
[0013] 现有技术中，乌鸡白凤胶囊每粒0. 3g，口服，一次2~3粒，一日3次，采用本发明 制备成的乌鸡白凤胶囊每粒〇.3g，但含有的药材量比原来多，因此每次仅需1-2粒，一日服 用3次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。
【具体实施方式】
[0014] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0015] 实施例1 :取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、 白芍l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，加入到C02 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力 30MPa，温度30°C，C02流量lml/g生药?min，萃取时间180min，得超临界萃取物，加入淀粉 20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0016] 实施例2 :取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、 白芍l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，加入到C02 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力 15MPa，温度50°C，C02流量lml/g生药?min，萃取时间180min，得超临界萃取物，加入淀粉 20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0017] 实施例3 :取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、 白芍l〇8g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g，加入到C02 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力 20MPa，温度40°C，C02流量2ml/g生药?min，萃取时间160min，得超临界萃取物，加入淀粉 20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。
[0018] 实施例4 :乌鸡白凤胶囊抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖的实验研宄资料
[0019] 1实验材料
[0020] I. 1实验用细胞株：小鼠肥大细胞癌P815细胞，南京医科大学实验室细胞库， DMEM+10%FBS常规培养。
[0021] 1. 2实验药物：研宄药物：本发明乌鸡白凤胶囊：按实施例3方法制备。药液储液： 称取IOOmg乌鸡白凤胶囊内容物，混悬于5ml无水乙醇中，0. 2ym滤器过滤，500yIdoff 管分装，-20°C存储，同时0. 2ym滤器过滤无水乙醇以 备对照组之用。
[0022] L3 实验试剂：DMEM(GIBCO公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清 (浙江天杭生物科技有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat. No.11810-033Lot.No. 1088387)Jrypsin(AMRESC0 公司批号：2010/04) ;EDTA(AMRESCO 公司批号：2009/10);PenicillinGSodiumSalt(AMRESC0公司批号：2010242); Str印tomycinSulfate(AMRESO)公司批号：2010382);无水乙醇（南京化学试剂有限公司 批号：080310182) ;MTT(Biosharp批号：0793);PBS(实验室自配）；
[0023] 1. 4实验器材：莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMlL);可见-紫外光微孔板检 测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190) ;C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏 净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD);纯水仪（美国Spring公司型号：S/N020579);精 密移液器（法国吉尔森公司型号：P2);电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S); 全自动高压灭菌锅（日本SANK)公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密 实验设备公司型号：DHG9123A);冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号： 2001);低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000) ;0.2ym滤器（MILLIP0RE型 号：SLGP033RB) ;10cm培养皿（NEST公司）、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、 移液管、Tips若干。
[0024] 2实验方法：
[0025]1)P815 细胞用DMEM+10%FBS于 37°C、5%C02 进行常规培养（10cm培养皿）， 当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25 %胰蛋白 酶-0. 04%EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其 转入离心管中，1000 rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。2)将细胞种入96孔 培养板中，每孔加入细胞悬液180y1，培养板放入细胞培养箱中（37°C，5%C02)常规培养。 3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入乌鸡白凤胶囊溶液，继续培养24h。4) 24h 后加入20yIMTT溶液（5mg/ml，即0. 5%MTT)，继续培养4h。5) 4h后扣板法倒去上清，用 吸水纸轻轻拍干，每孔加入200y1二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶 解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6)同时设置本底（不加细胞，只加培 养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个 复孔。7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率（％) = (对照孔OD值-给药 孔OD值）/对照孔OD值X100%。实验重复3次。
[0026] 3实验结果：MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对 P815细胞增殖抑制有差异（P〈0. 05)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂 量达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
[0027] 表1乌鸡白凤胶囊对小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖抑制影响研宄（X土SD)
[0028]
[0029] 注：与对照组比较，*P〈0. 01 ;#P〈0. 001
[0030] 4实验结论：乌鸡白凤胶囊可以抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖，减少小鼠肥 大细胞癌P815细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 一种乌鸡白凤胶囊的制备方法，由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香 附108g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋 鳖甲54g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取上述药材加入到CO2 超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力 15-30MPa，温度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min,萃取时间150-180min，得超临界萃取 物，加入淀粉20g，70%乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒，每粒重0. 3g。2. 根据权利要求1所述乌鸡白凤胶囊的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹 带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。3. 根据权利要求1所述乌鸡白凤胶囊的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的 萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。4. 根据权利要求1所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药 物中的应用，其特征在于乌鸡白凤胶囊由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香 附108g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋 鳖甲54g作为原料药制成，制备方法为：取去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋 香附l〇8g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、 醋鳖甲54g，加入到0)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百 分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min,萃取时间 150-180min，得超临界萃取物，加入淀粉20g，70 %乙醇制颗粒，干燥，装胶囊，制成800粒， 每粒重0. 3g。5. 根据权利要求4所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物 中的应用，其特征在于乌鸡白凤胶囊的制备方法中所述〇)2超临界萃取夹带剂占总萃取溶 剂的体积百分比为5%。6. 根据权利要求4所述乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物 中的应用，其特征在于乌鸡白凤胶囊的制备方法中所述〇)2超临界萃取的萃取压力20MPa， 温度40°C，CO2流量2ml/g生药?min，萃取时间160min。
【专利摘要】本发明属于中药制剂领域，具体提供一种乌鸡白凤胶囊的制备方法，由去毛爪肠的乌鸡540g、丹参108g、地黄216g、醋香附108g、人参108g、白芍108g、煅牡蛎40g、鹿角霜40g、银柴胡22g、甘草27g、黄芪27g、醋鳖甲54g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得含量有很大提高，用量减少，本发明还提供了乌鸡白凤胶囊在制备抑制小鼠肥大细胞癌P815细胞增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61K35/586, A61P35/00, A61K9/48, A61K35/618, A61K35/32, A61K36/8905, A61K35/57
【公开号】CN104906303
【申请号】CN201510340606
【发明人】李洋
【申请人】南京华宽信息咨询中心
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月18日
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