一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构药物中的应用
一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药领域，具体涉及一种中药组合物的应用。
【背景技术】
[0002] 神经的再生对维持心衰及心肌梗死后的心功能及血流动力学的稳定起着重要作 用。当交感神经兴奋时，通过心肌细胞表面的0受体，增加心肌细胞的收缩力，加快房室传 导，增加心率等作用，最终增加心脏输出量。有关的研究显示，当敲出神经营养素的相关基 因时，其心功能明显降低。而在对心脏移植后突发性死亡的病人研究发现，其神经纤维密度 显著增加。进一步研究显示，在心肌梗死后或完全性房室传导阻止时，向左侧交感神经节注 射神经生长因子，其神经密度显著增加同时伴有心律失常的发生显著增加，并且相比对照 组猝死的动物数量显著增加。因此交感神经的过度再生可能打破原有的平衡，导致其QT间 期的延长、复极离散度的增加，最终增加猝死的风险。实验证实心肌梗死后神经纤维密度的 密度显著增加，并且增加的大部分为交感神经纤维。这可能对心肌梗死后心脏性猝死起着 重要作用。
[0003] 目前研究提示神经营养因子可能在神经再生过程中起着重要作用。而神经营养因 子主要包括神经生长因子、脑源神经生长因子、神经营养因子-3及神经营养因子_4。主要 的受体分为TrkA(tyrosinekinaseA,酪氨酸蛋白激酶A)、TrkB(tyrosinekinaseB,酪 氨酸蛋白激酶B)、TrkC(tyrosinekinaseC,酪氨酸蛋白激酶C)及低亲和力受体p75-NTR。 而脑源神经生长因子主要作用于TrkB受体，对中枢神经元的存活起着重要支持作用。而目 前关于神经营养因子-3及神经营养因子-4的研究相对较少，其作用机制可能与TrkC受体 信号通路有关。NGF主要于两种受体：一种是高亲和力受体TrkA，另一种是低亲和力受体 P75-NTR。当NGF作用于TrkA受体时导致其自身磷酸化，激活下游的Ras蛋白，活化的Ras 蛋白进一步激活MEK(丝裂原活化或细胞外信号调节激酶的激酶)家族蛋白激酶，最终使ERK (extracellularsibnal-regulatedkinase,细胞外信号调节激酶）蛋白分子上的酪氨酸 和丝氨酸磷酸化，活化的ERK蛋白激活转录因子调节相关基因的表达；另一方面通过TrkA 受体作用，激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinosit3kinase，PI3K)，激活蛋白激酶 B(ProteinKinaseB,Akt),抑制凋亡基因的活性。而作用于p75-NTR受体时，可能激活 两个信号途径：一个是NF-kB途径，另一个是JNK(Junamio-terminalkinase,氨基酸末 端激酶）途径。而JNK途径主要是启动凋亡的信号途径收，但受到TrkA活化的抑制。因此 NGF的升高一方面启动TrkA信号途径促进了神经的再生，另一方面通过TrkA受体抑制其 P75-NTR介导的凋亡信号，并且激活NF-KB(主要能与多个启动子的KB部位结合，促进相 关DNA的转录及蛋白的表达）途径，促进神经纤维的生长。
[0004] 虽然以前相关研究显示ET-I对心肌纤维化起着重要的作用，研究显示ET-I可以 通过内皮素受体A(endothelin_Areceptor)、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)及细 胞外信号途径，调节神经生长因子的表达。IL-IP主要由激活的巨噬细胞产生，具有广泛 的生物学效应。其不仅可以通过激活核因子抑制蛋白激酶（IKK,Inhibitorofnuclear factorkBkinase),增强NF-KB途径的效应，而且还可以调节神经生长因子表达，促进神 经细胞的修复。TNF-a可以由各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞及星形胶质细胞产生，同 样可以增强NF-KB效应。并且在低温条件下，TNF-a可以上调神经营养因子的表达，诱导神 经细胞轴突的生长。另一方面，NF-KB的激活可以上调TNF-a及IL-IP的表达，形成放大 效应。以前的研究认为，梗死区的心肌细胞释放神经生长因子作用于远处的神经节，导致非 梗死区及梗死周边区的神经纤维再生。目前还没有发现可以有效的抑制神经重构的药物。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构的药物中的 应用，效果好，没有明显副作用。
[0006] 本发明所采用的技术方案是： 一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构药物中的应用，所述中药组合物由 下列重量份数的原料药制成：人参45-180份、麦冬50-200份、山茱萸125-450份、丹参 125-450份、炒酸枣仁95-400份、桑寄生95-400份、赤芍45-200份、土鳖虫35-150份、甘松 45-200份、黄连25-90份、南五味子35-150份、龙骨75-300份， 优选的，所述中药组合物由下列重量份数的原料药制成： 人参89份、麦冬112份、山茱萸224份、丹参224份、炒酸枣仁186份、桑寄生186份、 赤芍89份、土鳖虫75份、甘松89份、黄连45份、南五味子67份、龙骨149份。
[0007] 或 人参180份、麦冬200份、山茱萸450份、丹参125份、炒酸枣仁95份、桑寄生95份、赤 芍45份、甘松45份、土鳖虫35份、黄连25份、南五味子35份、龙骨75份。
[0008] 或 人参45份、麦冬50份、山茱萸125份、丹参450份、炒酸枣仁400份、桑寄生400份、赤 芍200份、甘松200份、土鳖虫150份、黄连90份、南五味子150份、龙骨300份。
[0009] 为实现上述技术方案，将中药组合物的制成胶囊剂、片剂、散剂或丸剂。
[0010] 所述中药组合物的活性成分由以下步骤制成： a) 人参用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细 粉，备用； b) 南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回 收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过，浓缩得浸膏， 备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，即得该中药组合物活性成分。
[0011] 所述中药组合物的胶囊剂由以下步骤制成： a)人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过， 回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回 收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过，浓缩得浸膏， 备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，装入胶囊。
[0012] 所述中药组合物在制备降低神经纤维密度药物中的应用。
[0013] 所述中药组合物在制备抑制TNF-a、IL-IP、NF-KB、ET-I及NGFmRNA表达药物 中的应用。
[0014] 为验证本发明组合物的效果，按实施例1制得的胶囊剂做了以下实验 1材料和方法 主要试剂及仪器 ReverTraAce、RT-PCR试剂盒（T0Y0B0 公司），引物（InvitrogenBiotechnology&).1^1>中国公司合成)，64?43(神经生长相关蛋白43)多克隆抗体（413(^111公司），1'11(酪氨 酸轻化酶)多克隆抗体（Abeam公司），p75-NTR多克隆抗体（MiIlipore公司），本发明药物组 合物(石家庄以岭药业股份有限公司），实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司）， 多导电生理义，计算机图像分析系统。
[0015] 动物模型的制作及分组 新西兰大耳白兔(武汉生物研究所提供)共30只，体重2. 2kg~2. 5kg。随机分为假手术 组、心梗组及治疗组，以戊巴比妥40mg/kg耳缘静脉麻醉，并经前胸暴露心脏，结扎管状动 脉前降支。以心电监护显示I、II、avL导联ST段抬高0. 2mV为手术成功的标准，术后注释 40万单位青霉素。分别以普食(假手术组、心肌梗死组）及普食+该组合物原粉喂养8周。
[0016] 免疫组化 以GAP43及TH为标志物，采用免疫组化的方法研究心肌梗死后的神经纤维密度。首先 取心肌梗死周边区的组织标本，4%多聚甲醛固定。常规石蜡切片，脱蜡，封闭，修复及分别 滴加GAP43 (1:500)及TH(1:600)多克隆抗体。37°C孵育过夜，最后滴加生物素化二抗，DAB 显色，封片。神经密度的测量采用显微镜组成的计算机图像处理系统及image-proplus软 件，以阳性纤维(棕黄色）所占的面积（Mffl2) /图片的面积（_2)为标准。
[0017] 取匀楽器，加入Iml的TrizolReagent至冰山预冷，再取IOOmg的心肌组织至匀 浆器中充分研磨，提取RNA。提取RNA后，分别加入Buffer，dNTPs，RNA抑制酶及反转录酶， 以42 °C保温30min。按照RT-PCR试剂盒说明，以95 °C预变性Imin后进入PCR循环，95 °C变 性15s，58°C退火20s，72°C延伸20s，循环40次。计算标准为AACT法：A=CT(目的基因， 待测样本）_CT(内标基因，待测样本），B=CT(目的基因，对照样本）-CT(内标基因，对照 样本），K=A-B,表达倍数=2_K。CT值定义为：每个反映管内的荧光信号达到设定的阈值所 经历的循环次数。
[0018] 引物序列相关信息见表1。
[0019] 表1各目的基因及引物的相关信息表
Westernblot分析 取少量心肌组织放入匀浆中，用眼科剪将其剪碎，加入400沿的裂解液，离心，取上清 液，提取胞浆蛋白。经上样，电泳，转膜，脱脂奶粉封闭后，在4°C温度下，以1:1000稀释的 P75-NTR抗体孵育过夜。经TBST洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:1500) 37°C避光孵育lh，TBST洗膜3次，最后曝光、显影、定影。
[0020] 统计学处理 应用SPSS13. 0软件进行统计学处理，采用独立样本T检验，以/^ < 0. 05表示差异具有 统计学意义。
[0021] 结果 免疫组化结果显示，心梗组中的GAP43及TH阳性纤维的密度显著高于假手术组(产 < 0. 05)。而通过本发明药物组合物的干预，其神经纤维密度有所降低0° < 0. 05)。其结 果分别见图1-2和表2 表2假手术组、心梗组、治疗组GAP43和TH阳性纤维的密度值(均数土标准差）
与假手术组相比，心梗组中TNF-a、IL-IP、NF-KB、ET-I及NGFmRNA的相对表达量 显著增高0° <〇.〇5)，并且本发明药物组合物可抑制其表达0° <0.05)(图3-7)。NGF可 以作用于神经营养素受体P75-NTR，激活下游信号途径，促进神经的生长，而本发明药物组 合物可抑制其在MI后的表达（图8)。
[0022] 与胺碘酮的比较 使用本发明药物组合物的治疗组降低GAP43和TH阳性神经纤维密度的作用优于胺碘 酮，具体见图9。
[0023] 本发明药物组合主要由人参、龙骨、甘松、黄连、丹参等多种中药组成。相关研究显 示，其多种成分具有调节炎症介质的作用，而在本实验研究结果显示，其可以降低心肌梗死 后神经纤维的密度,抑制心肌梗死后的神经重构。并且通过RT-PCR及Westernblot检测 发现，NGF、ET-1、TNF-a、[email protected]、NF-kB的mRNA以及p75-NTR蛋白的表达成同步降低，从 而调节神经生长因子的表达，最终抑制神经纤维的生长。
【附图说明】
[0024] 图1是家兔梗死周边区GAP43及TH的免疫组化染色，DAB显色X400(阳性纤维， 如箭头所示)，A为假手术组，B为心梗对照组，C为治疗组； 图2是本发明药物降低GAP43及TH的比较图； 图3是各组TNF-a的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图4是各组IL-IP的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图5是各组NF-KB的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图6是各组ET-I的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图7是各组NGF的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图8是各组P-75NTR蛋白的表达量； 图9是本发明药物与胺碘酮的比较图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明： 实施例1 该中药组合物由下列原料药制成： 人参89g、麦冬112g、山茱萸224g、丹参224g、炒酸枣仁186g、桑寄生186g、赤芍89g、土 鳖虫75g、甘松89g、黄连45g、南五味子67g、龙骨149g。
[0026] 制备方法： a) 上述处方中，人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 上述处方中，南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 上述处方中，土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 上述处方中，麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，浓缩得 浸膏，备用； e)将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，装入1000粒胶囊。
[0027] 实施例2 该中药组合物由下列原料药制成： 人参45g、麦冬112g、山茱萸200g、丹参225g、炒酸枣仁300g、桑寄生186g、赤芍 1〇〇g、甘松45g、土鳖虫35g、黄连75g、南五味子67g、龙骨189g。
[0028] 制备方法： a) 上述处方中，人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 上述处方中，南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 上述处方中，土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 上述处方中，麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过， 浓缩得浸膏，备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，按照常规方法制成片剂。
[0029] 实施例3 该中药组合物由下列原料药制成： 人参180g、麦冬200g、山茱萸450g、丹参125g、炒酸枣仁95g、桑寄生95g、赤芍45g、甘松45g、土鳖虫35g、黄连25g、南五味子35g、龙骨75g。
[0030] 制备方法： a) 上述处方中，人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 上述处方中，南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 上述处方中，土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 上述处方中，麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过， 浓缩得浸膏，备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，按照常规方法制成冲剂。
[0031] 实施例4 该中药组合物由下列原料药制成： 人参45g、麦冬50g、山茱萸125g、丹参450g、炒酸枣仁400g、桑寄生400g、赤芍 200g、甘松200g、土鳖虫150g、黄连90g、南五味子150g、龙骨300g。
[0032] 制备方法： a) 上述处方中，人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 上述处方中，南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩得浸膏，备用； C)上述处方中，土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 上述处方中，麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过， 浓缩得浸膏，备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，按照常规方法制成胶囊。
【主权项】
1. 一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构药物中的应用，该中药组合物由 下列重量份数的原料药制成：人参45-180份、麦冬50-200份、山茱萸125-450份、丹参 125-450份、炒酸枣仁95-400份、桑寄生95-400份、赤芍45-200份、土鳖虫35-150份、甘松 45-200份、黄连25-90份、南五味子35-150份、龙骨75-300份。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由下列重量份数的原料药 制成： 人参89份、麦冬112份、山茱萸224份、丹参224份、炒酸枣仁186份、桑寄生186份、 赤芍89份、土鳖虫75份、甘松89份、黄连45份、南五味子67份、龙骨149份。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由下列重量份数的原料药 制成： 人参180份、麦冬200份、山茱萸450份、丹参125份、炒酸枣仁95份、桑寄生95份、赤 芍45份、甘松45份、土鳖虫35份、黄连25份、南五味子35份、龙骨75份。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由下列重量份数的原料药 制成： 人参45份、麦冬50份、山茱萸125份、丹参450份、炒酸枣仁400份、桑寄生400份、赤 芍200份、甘松200份、土鳖虫150份、黄连90份、南五味子150份、龙骨300份。5. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物的制剂剂型为胶 囊剂、片剂、散剂或丸剂。6. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物的活性成分由以 下步骤制成： a) 人参用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细 粉，备用； b) 南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回 收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过，浓缩得浸膏， 备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，即得该中药组合物活性成分。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述中药组合物的胶囊剂由以下步骤制 成： a) 人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过， 回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回 收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过，浓缩得浸膏， 备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，装入胶囊。8. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备抑制 TNF-a、IL-IP、NF-KB、ET-I及NGFmRNA表达药物中的应用。9. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备降低神经 纤维密度药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构药物中的应用，属于中药应用领域，该中药组合物由人参、麦冬、山茱萸、丹参、炒酸枣仁、桑寄生等原料药制成，本发明的中药组合物可以降低心肌梗死后神经纤维的密度，抑制心肌梗死后的神经重构。
【IPC分类】A61K35/64, A61K9/14, A61K35/02, A61K9/48, A61K9/20, A61P25/00, A61K36/8968
【公开号】CN104906342
【申请号】CN201410086105
【发明人】黄从新, 王晞, 党松, 周家蓬
【申请人】河北以岭医药研究院有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月11日
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药领域，具体涉及一种中药组合物的应用。
【背景技术】
[0002] 神经的再生对维持心衰及心肌梗死后的心功能及血流动力学的稳定起着重要作 用。当交感神经兴奋时，通过心肌细胞表面的0受体，增加心肌细胞的收缩力，加快房室传 导，增加心率等作用，最终增加心脏输出量。有关的研究显示，当敲出神经营养素的相关基 因时，其心功能明显降低。而在对心脏移植后突发性死亡的病人研究发现，其神经纤维密度 显著增加。进一步研究显示，在心肌梗死后或完全性房室传导阻止时，向左侧交感神经节注 射神经生长因子，其神经密度显著增加同时伴有心律失常的发生显著增加，并且相比对照 组猝死的动物数量显著增加。因此交感神经的过度再生可能打破原有的平衡，导致其QT间 期的延长、复极离散度的增加，最终增加猝死的风险。实验证实心肌梗死后神经纤维密度的 密度显著增加，并且增加的大部分为交感神经纤维。这可能对心肌梗死后心脏性猝死起着 重要作用。
[0003] 目前研究提示神经营养因子可能在神经再生过程中起着重要作用。而神经营养因 子主要包括神经生长因子、脑源神经生长因子、神经营养因子-3及神经营养因子_4。主要 的受体分为TrkA(tyrosinekinaseA,酪氨酸蛋白激酶A)、TrkB(tyrosinekinaseB,酪 氨酸蛋白激酶B)、TrkC(tyrosinekinaseC,酪氨酸蛋白激酶C)及低亲和力受体p75-NTR。 而脑源神经生长因子主要作用于TrkB受体，对中枢神经元的存活起着重要支持作用。而目 前关于神经营养因子-3及神经营养因子-4的研究相对较少，其作用机制可能与TrkC受体 信号通路有关。NGF主要于两种受体：一种是高亲和力受体TrkA，另一种是低亲和力受体 P75-NTR。当NGF作用于TrkA受体时导致其自身磷酸化，激活下游的Ras蛋白，活化的Ras 蛋白进一步激活MEK(丝裂原活化或细胞外信号调节激酶的激酶)家族蛋白激酶，最终使ERK (extracellularsibnal-regulatedkinase,细胞外信号调节激酶）蛋白分子上的酪氨酸 和丝氨酸磷酸化，活化的ERK蛋白激活转录因子调节相关基因的表达；另一方面通过TrkA 受体作用，激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinosit3kinase，PI3K)，激活蛋白激酶 B(ProteinKinaseB,Akt),抑制凋亡基因的活性。而作用于p75-NTR受体时，可能激活 两个信号途径：一个是NF-kB途径，另一个是JNK(Junamio-terminalkinase,氨基酸末 端激酶）途径。而JNK途径主要是启动凋亡的信号途径收，但受到TrkA活化的抑制。因此 NGF的升高一方面启动TrkA信号途径促进了神经的再生，另一方面通过TrkA受体抑制其 P75-NTR介导的凋亡信号，并且激活NF-KB(主要能与多个启动子的KB部位结合，促进相 关DNA的转录及蛋白的表达）途径，促进神经纤维的生长。
[0004] 虽然以前相关研究显示ET-I对心肌纤维化起着重要的作用，研究显示ET-I可以 通过内皮素受体A(endothelin_Areceptor)、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)及细 胞外信号途径，调节神经生长因子的表达。IL-IP主要由激活的巨噬细胞产生，具有广泛 的生物学效应。其不仅可以通过激活核因子抑制蛋白激酶（IKK,Inhibitorofnuclear factorkBkinase),增强NF-KB途径的效应，而且还可以调节神经生长因子表达，促进神 经细胞的修复。TNF-a可以由各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞及星形胶质细胞产生，同 样可以增强NF-KB效应。并且在低温条件下，TNF-a可以上调神经营养因子的表达，诱导神 经细胞轴突的生长。另一方面，NF-KB的激活可以上调TNF-a及IL-IP的表达，形成放大 效应。以前的研究认为，梗死区的心肌细胞释放神经生长因子作用于远处的神经节，导致非 梗死区及梗死周边区的神经纤维再生。目前还没有发现可以有效的抑制神经重构的药物。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构的药物中的 应用，效果好，没有明显副作用。
[0006] 本发明所采用的技术方案是： 一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构药物中的应用，所述中药组合物由 下列重量份数的原料药制成：人参45-180份、麦冬50-200份、山茱萸125-450份、丹参 125-450份、炒酸枣仁95-400份、桑寄生95-400份、赤芍45-200份、土鳖虫35-150份、甘松 45-200份、黄连25-90份、南五味子35-150份、龙骨75-300份， 优选的，所述中药组合物由下列重量份数的原料药制成： 人参89份、麦冬112份、山茱萸224份、丹参224份、炒酸枣仁186份、桑寄生186份、 赤芍89份、土鳖虫75份、甘松89份、黄连45份、南五味子67份、龙骨149份。
[0007] 或 人参180份、麦冬200份、山茱萸450份、丹参125份、炒酸枣仁95份、桑寄生95份、赤 芍45份、甘松45份、土鳖虫35份、黄连25份、南五味子35份、龙骨75份。
[0008] 或 人参45份、麦冬50份、山茱萸125份、丹参450份、炒酸枣仁400份、桑寄生400份、赤 芍200份、甘松200份、土鳖虫150份、黄连90份、南五味子150份、龙骨300份。
[0009] 为实现上述技术方案，将中药组合物的制成胶囊剂、片剂、散剂或丸剂。
[0010] 所述中药组合物的活性成分由以下步骤制成： a) 人参用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细 粉，备用； b) 南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回 收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过，浓缩得浸膏， 备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，即得该中药组合物活性成分。
[0011] 所述中药组合物的胶囊剂由以下步骤制成： a)人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过， 回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回 收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过，浓缩得浸膏， 备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，装入胶囊。
[0012] 所述中药组合物在制备降低神经纤维密度药物中的应用。
[0013] 所述中药组合物在制备抑制TNF-a、IL-IP、NF-KB、ET-I及NGFmRNA表达药物 中的应用。
[0014] 为验证本发明组合物的效果，按实施例1制得的胶囊剂做了以下实验 1材料和方法 主要试剂及仪器 ReverTraAce、RT-PCR试剂盒（T0Y0B0 公司），引物（InvitrogenBiotechnology&).1^1>中国公司合成)，64?43(神经生长相关蛋白43)多克隆抗体（413(^111公司），1'11(酪氨 酸轻化酶)多克隆抗体（Abeam公司），p75-NTR多克隆抗体（MiIlipore公司），本发明药物组 合物(石家庄以岭药业股份有限公司），实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司）， 多导电生理义，计算机图像分析系统。
[0015] 动物模型的制作及分组 新西兰大耳白兔(武汉生物研究所提供)共30只，体重2. 2kg~2. 5kg。随机分为假手术 组、心梗组及治疗组，以戊巴比妥40mg/kg耳缘静脉麻醉，并经前胸暴露心脏，结扎管状动 脉前降支。以心电监护显示I、II、avL导联ST段抬高0. 2mV为手术成功的标准，术后注释 40万单位青霉素。分别以普食(假手术组、心肌梗死组）及普食+该组合物原粉喂养8周。
[0016] 免疫组化 以GAP43及TH为标志物，采用免疫组化的方法研究心肌梗死后的神经纤维密度。首先 取心肌梗死周边区的组织标本，4%多聚甲醛固定。常规石蜡切片，脱蜡，封闭，修复及分别 滴加GAP43 (1:500)及TH(1:600)多克隆抗体。37°C孵育过夜，最后滴加生物素化二抗，DAB 显色，封片。神经密度的测量采用显微镜组成的计算机图像处理系统及image-proplus软 件，以阳性纤维(棕黄色）所占的面积（Mffl2) /图片的面积（_2)为标准。
[0017] 取匀楽器，加入Iml的TrizolReagent至冰山预冷，再取IOOmg的心肌组织至匀 浆器中充分研磨，提取RNA。提取RNA后，分别加入Buffer，dNTPs，RNA抑制酶及反转录酶， 以42 °C保温30min。按照RT-PCR试剂盒说明，以95 °C预变性Imin后进入PCR循环，95 °C变 性15s，58°C退火20s，72°C延伸20s，循环40次。计算标准为AACT法：A=CT(目的基因， 待测样本）_CT(内标基因，待测样本），B=CT(目的基因，对照样本）-CT(内标基因，对照 样本），K=A-B,表达倍数=2_K。CT值定义为：每个反映管内的荧光信号达到设定的阈值所 经历的循环次数。
[0018] 引物序列相关信息见表1。
[0019] 表1各目的基因及引物的相关信息表
Westernblot分析 取少量心肌组织放入匀浆中，用眼科剪将其剪碎，加入400沿的裂解液，离心，取上清 液，提取胞浆蛋白。经上样，电泳，转膜，脱脂奶粉封闭后，在4°C温度下，以1:1000稀释的 P75-NTR抗体孵育过夜。经TBST洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:1500) 37°C避光孵育lh，TBST洗膜3次，最后曝光、显影、定影。
[0020] 统计学处理 应用SPSS13. 0软件进行统计学处理，采用独立样本T检验，以/^ < 0. 05表示差异具有 统计学意义。
[0021] 结果 免疫组化结果显示，心梗组中的GAP43及TH阳性纤维的密度显著高于假手术组(产 < 0. 05)。而通过本发明药物组合物的干预，其神经纤维密度有所降低0° < 0. 05)。其结 果分别见图1-2和表2 表2假手术组、心梗组、治疗组GAP43和TH阳性纤维的密度值(均数土标准差）
与假手术组相比，心梗组中TNF-a、IL-IP、NF-KB、ET-I及NGFmRNA的相对表达量 显著增高0° <〇.〇5)，并且本发明药物组合物可抑制其表达0° <0.05)(图3-7)。NGF可 以作用于神经营养素受体P75-NTR，激活下游信号途径，促进神经的生长，而本发明药物组 合物可抑制其在MI后的表达（图8)。
[0022] 与胺碘酮的比较 使用本发明药物组合物的治疗组降低GAP43和TH阳性神经纤维密度的作用优于胺碘 酮，具体见图9。
[0023] 本发明药物组合主要由人参、龙骨、甘松、黄连、丹参等多种中药组成。相关研究显 示，其多种成分具有调节炎症介质的作用，而在本实验研究结果显示，其可以降低心肌梗死 后神经纤维的密度,抑制心肌梗死后的神经重构。并且通过RT-PCR及Westernblot检测 发现，NGF、ET-1、TNF-a、[email protected]、NF-kB的mRNA以及p75-NTR蛋白的表达成同步降低，从 而调节神经生长因子的表达，最终抑制神经纤维的生长。
【附图说明】
[0024] 图1是家兔梗死周边区GAP43及TH的免疫组化染色，DAB显色X400(阳性纤维， 如箭头所示)，A为假手术组，B为心梗对照组，C为治疗组； 图2是本发明药物降低GAP43及TH的比较图； 图3是各组TNF-a的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图4是各组IL-IP的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图5是各组NF-KB的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图6是各组ET-I的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图7是各组NGF的mRNA相对表达量，*与假手术组比较P〈0. 05, #与心梗组比较P<0.05 ； 图8是各组P-75NTR蛋白的表达量； 图9是本发明药物与胺碘酮的比较图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明： 实施例1 该中药组合物由下列原料药制成： 人参89g、麦冬112g、山茱萸224g、丹参224g、炒酸枣仁186g、桑寄生186g、赤芍89g、土 鳖虫75g、甘松89g、黄连45g、南五味子67g、龙骨149g。
[0026] 制备方法： a) 上述处方中，人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 上述处方中，南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 上述处方中，土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 上述处方中，麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，浓缩得 浸膏，备用； e)将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，装入1000粒胶囊。
[0027] 实施例2 该中药组合物由下列原料药制成： 人参45g、麦冬112g、山茱萸200g、丹参225g、炒酸枣仁300g、桑寄生186g、赤芍 1〇〇g、甘松45g、土鳖虫35g、黄连75g、南五味子67g、龙骨189g。
[0028] 制备方法： a) 上述处方中，人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 上述处方中，南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 上述处方中，土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 上述处方中，麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过， 浓缩得浸膏，备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，按照常规方法制成片剂。
[0029] 实施例3 该中药组合物由下列原料药制成： 人参180g、麦冬200g、山茱萸450g、丹参125g、炒酸枣仁95g、桑寄生95g、赤芍45g、甘松45g、土鳖虫35g、黄连25g、南五味子35g、龙骨75g。
[0030] 制备方法： a) 上述处方中，人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 上述处方中，南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 上述处方中，土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 上述处方中，麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过， 浓缩得浸膏，备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，按照常规方法制成冲剂。
[0031] 实施例4 该中药组合物由下列原料药制成： 人参45g、麦冬50g、山茱萸125g、丹参450g、炒酸枣仁400g、桑寄生400g、赤芍 200g、甘松200g、土鳖虫150g、黄连90g、南五味子150g、龙骨300g。
[0032] 制备方法： a) 上述处方中，人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 上述处方中，南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提 取液，滤过，回收乙醇，浓缩得浸膏，备用； C)上述处方中，土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 上述处方中，麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过， 浓缩得浸膏，备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，按照常规方法制成胶囊。
【主权项】
1. 一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构药物中的应用，该中药组合物由 下列重量份数的原料药制成：人参45-180份、麦冬50-200份、山茱萸125-450份、丹参 125-450份、炒酸枣仁95-400份、桑寄生95-400份、赤芍45-200份、土鳖虫35-150份、甘松 45-200份、黄连25-90份、南五味子35-150份、龙骨75-300份。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由下列重量份数的原料药 制成： 人参89份、麦冬112份、山茱萸224份、丹参224份、炒酸枣仁186份、桑寄生186份、 赤芍89份、土鳖虫75份、甘松89份、黄连45份、南五味子67份、龙骨149份。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由下列重量份数的原料药 制成： 人参180份、麦冬200份、山茱萸450份、丹参125份、炒酸枣仁95份、桑寄生95份、赤 芍45份、甘松45份、土鳖虫35份、黄连25份、南五味子35份、龙骨75份。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由下列重量份数的原料药 制成： 人参45份、麦冬50份、山茱萸125份、丹参450份、炒酸枣仁400份、桑寄生400份、赤 芍200份、甘松200份、土鳖虫150份、黄连90份、南五味子150份、龙骨300份。5. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物的制剂剂型为胶 囊剂、片剂、散剂或丸剂。6. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物的活性成分由以 下步骤制成： a) 人参用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细 粉，备用； b) 南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回 收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过，浓缩得浸膏， 备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，即得该中药组合物活性成分。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述中药组合物的胶囊剂由以下步骤制 成： a) 人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，以后每次2小时，合并提取液，滤过， 回收乙醇，浓缩，烘干，粉碎成细粉，备用； b) 南五味子、山茱萸、丹参、黄连、甘松用70%乙醇回流提取三次，合并提取液，滤过，回 收乙醇，浓缩得浸膏，备用； c) 土鳖虫粉碎成细粉，备用； d) 麦冬、炒酸枣仁、桑寄生、赤芍、龙骨加水煎煮二次，合并提取液，滤过，浓缩得浸膏， 备用； e) 将步骤b)与d)所得浸膏合并，加入步骤c)所得的药物细粉烘干，粉碎成细粉，加入 步骤a)所得药物细粉，混匀，装入胶囊。8. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备抑制 TNF-a、IL-IP、NF-KB、ET-I及NGFmRNA表达药物中的应用。9. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备降低神经 纤维密度药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种中药组合物在制备抑制心肌梗死后神经重构药物中的应用，属于中药应用领域，该中药组合物由人参、麦冬、山茱萸、丹参、炒酸枣仁、桑寄生等原料药制成，本发明的中药组合物可以降低心肌梗死后神经纤维的密度，抑制心肌梗死后的神经重构。
【IPC分类】A61K35/64, A61K9/14, A61K35/02, A61K9/48, A61K9/20, A61P25/00, A61K36/8968
【公开号】CN104906342
【申请号】CN201410086105
【发明人】黄从新, 王晞, 党松, 周家蓬
【申请人】河北以岭医药研究院有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月11日
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