一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用
一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提 取物及其应用。
【背景技术】
[0002] 燕窝是雨燕科动物金丝燕及多种同属燕类用唾液与绒羽等混合凝结所筑成的巢 窝，又称燕菜、燕根、燕蔬菜。其主要产于我国南海诸岛及东南亚各国。燕窝的营养较高，是 中国传统的名贵食品之一。
[0003] 燕窝现代医学研究发现，燕窝主要成分有；水溶性蛋白质、碳水化合物；微量元 素：巧、磯、铁、钢、钟及对促进人体活力起重要作用的氨基酸。燕窝独特的蛋白质成份含量 的生物活性分子，有助于人体组织的生长、发育及病后复原。
[0004] 碳水化合物是身体热量的主要来源，与蛋白质相辅相成，使蛋白质发挥提供热量 W外的功能，也可促进脂肪的代谢。燕窝中所含有的表皮生长因子和燕窝的水溶性物质可 直接刺激细胞分裂、再生、组织重建，使得燕窝对人体的滋补、复原起着很大的作用。巧质可 W增强血液在皮肤破损时的凝结能力，也帮助人体吸收维他命B12。燕窝中含有丰富的矿 物质、活性蛋白质与胶原质等营养，其中的表皮生长因子巧pidermalgrowth化ctor，EGF) 能够强烈刺激细胞再生、分裂和组织重建。
[0005] 据清代赵学敏的《本草纲目拾遗》载；"燕窝大养肺阴，化疲止嗽，补而能清，为调理 虚损劳疾之圣药。一切病之由于肺虚不能清肃下行者，用此者可治之。"据有关专家研究发 现，燕窝中含有EGF和辅助细胞分裂成分，有助于刺激细胞生长及繁殖，对人体组织生长、 细胞再生，W及细胞的免疫功能均有促进作用。加之燕窝还含有大量的粘蛋白、糖蛋白、巧、 磯等多种天然营养成份，有润肺燥、滋肾阴、补虚损的功效，能增强人体对疾病的抵抗力，有 助于抵抗伤风、咳嗽和感冒。因此，对吸烟和患有呼吸道疾病者最有效，协助病后的人体恢 复健康，是一种纯正高贵的天然保健品。燕窝对润肺健腰，壮脾健胃，外伤止血等有独特疗 效。
[0006] 目前，现有的提取和冻干燕窝提取物的方法主要是先超声粉碎燕窝，然后再加酶 水解，进一步离屯、、干燥后冻干。除了酶促水解步骤外，现有的技术还需要经过粉碎、浸泡、 煮沸、调节PH值等预处理步骤来提高水解的效率，化及离屯、、过滤、干燥等后续处理步骤来 对水解产物进行处理W得到燕窝提取物。工艺繁复，且产品产率低。按此方法得到的燕窝 提取物不仅美容活性成分含量低，且还可能含有各种添加剂。
[0007] 因此，提供一种燕窝活性成分纯度高、活性好的燕窝提取物的制备方法具有重要 的显不意义。
【发明内容】
[000引有鉴于此，本发明提供一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用。 该方法提高了燕窝提取物中蛋白的活性和含量，获得的燕窝提取物具有独特的美白嫩肤、 美颜保健、枯斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高了产品品质。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0010] 本发明提供了一种燕窝提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0011] 步骤1 ;取燕窝与25°C~40°C的水混合、浸泡，过滤，收集滤渣；
[001引 步骤2 ;取所述滤渣，于-80°C冷冻1~2h，再于10°C~35°C融化0. 5~比，按照 上述操作反复冻融，洗漆、过滤，收集滤液和滤渣；
[0013] 步骤3;取步骤2所述滤渣，与中性蛋白酶混合，酶解，获得消化液；
[0014] 步骤4;取步骤3所述消化液稀释、过滤后，与步骤2所述滤液混合浓缩，获得浓缩 液。
[0015] 在本发明的一些具体实施方案中，Wg/L计，步骤1中所述燕窝与所述水的质量体 积比为1: (300~500)。
[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述浸泡的时间为3~2化。为了达到 更优的提取效果，针对不同的燕窝，浸泡的时间也不相同。白燕或黄燕浸泡3~lOh，血燕浸 泡6~2化。
[0017] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述过滤采用筛网的目数为70目。
[0018] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述反复冻融的次数为3~6次。
[0019] 作为优选，Wg/L计，所述反复冻融后的滤渣与洗漆所用水的质量体积比为1 ; (4 ~5)。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述中性蛋白酶的酶活为30万U/g，所 述中性蛋白酶的浓度为0. 1%~0.5%，所述中性蛋白酶与步骤2所述滤渣的质量比为1~ 2 ;2 ~3。
[0021] 作为优选，中性蛋白酶溶液的配制方法为；取0. 1-0. 5mg的中性蛋白酶粉末溶解 在100ml的PBS溶液中，0. 22yM的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用。
[0022] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述酶解的时间为2~她。
[0023] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤4所述稀释为取所述消化液与水混合；所 述水与所述消化液的体积比为5~10:1。
[0024] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤4所述浓缩的比例为15:1，所述浓缩的温 度为2°C~8°C。
[0025] 在本发明的一些具体实施方案中，获得浓缩液后还包括冻干的步骤；所述冻干的 温度为-35°C~-20°C，所述冻干的真空度为50化~200Pa，所述冻干的时间为3化~36h。
[0026] 本发明还提供了上述制备方法制得的燕窝提取物。
[0027] 本发明还提供了上述制备方法制得的燕窝提取物在制备促进细胞再生、增强免疫 力、养颜、延缓衰老的药物、食品、化妆品中的应用。
[002引本发明提供的燕窝提取物的制备方法具有W下优点：
[0029] (1)避免用开水烛燕窝，保证了燕窝提取物中蛋白的活性和纯度；
[0030] (2)用中性蛋白酶消化。获得的燕窝提取物具有独特的美白嫩肤、美颜保健、枯斑 除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高了产品品质；
[0031] (3)将燕窝提取物的滤液先进行浓缩再进行冻干，节省成本，提高稳定性，延长有 效期。
【附图说明】
[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[003引图1示EGF标准品的吸光度值曲线；
[0034] 图2示生物素标准品的吸光度值曲线。
【具体实施方式】
[0035] 本发明公开了一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用，本领域 技术人员可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换 和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法 及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范 围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0036] 本发明提供的燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用中所用原料及 试剂均可由市场购得。其中，生物素化抗体工作液购自Bilegend公司；酶结合物工作液购 自Bilegend公司；显色底物购自北京达科为生物技术有限公司。
[0037] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[003引实施例1燕窝提取物的制备
[0039] (1)从市面上购买燕窝20g;
[0040] 似将白燕或黄燕用水（25°C，Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:450)浸泡约 3h,血燕用温水浸泡约化；
[0041] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[00创 （4)收集燕窝滤渣，在10°C和-80°c冰箱中反复冻融3次，破碎燕窝滤渣；
[0043] (5)用水洗漆两次，每次2min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[0044] (6)同时将滤渣收集起来，用0.4%的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万u/g;中性蛋白酶溶液的配制；0. 4mg的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣化；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[0045] (7)用消化液10倍体积的S蒸水稀释燕窝消化液；
[0046] (8)将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[0047] (9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件巧°C)下进行浓缩；
[0048] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-35°C，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉28yg，产率为1. 4%。
[0049] 实施例2燕窝提取物的制备
[0050] (1)从市面上购买燕窝20g;
[0化^ 似将白燕或黄燕用水（40。Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:350)浸泡约 她，血燕用温水浸泡约1她；
[0化2] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[005引 （4)收集燕窝滤渣，在10°C~35°C和-80°C冰箱中反复冻融5次，破碎燕窝滤渣；
[0054] (5)用水洗漆两次，每次5min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[0化5] (6)同时将滤渣收集起来，用0. 2 %的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0. 2mg的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣化；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[0056] (7)用消化液5倍体积的=蒸水稀释燕窝消化液；
[0057] 做将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[005引 （9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件（4°C)下进行浓缩；
[0化9] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-20°C，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉8yg，产率为1. 4%。
[0060] 实施例3燕窝提取物的制备
[0061] (1)从市面上购买燕窝20g ;
[006引似将白燕或黄燕用水（37。Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:400)浸泡约 lOh，血燕用温水浸泡约2化；
[006引 （3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[0064] (4)收集燕窝滤渣，在25°C和-80°C冰箱中反复冻融4次，破碎燕窝滤渣；
[00化](5)用水洗漆两次，每次4min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[0066] (6)同时将滤渣收集起来，用0.3%的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0. 3mg的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣化；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[0067] (7)用消化液8倍体积的S蒸水稀释燕窝消化液；
[0068] 做将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[0069] (9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件化° C)下进行浓缩；
[0070] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-25°c，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉28y g，产率为1. 4%。
[0071] 实施例4燕窝提取物的制备
[0072] (1)从市面上购买燕窝20g ;
[007引 似将白燕或黄燕用水（30°C，Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:500)浸泡约 5h,血燕用温水浸泡约化；
[0074] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[0075] (4)收集燕窝滤渣，在20°C和-80°C冰箱中反复冻融6次，破碎燕窝滤渣；
[0076] (5)用水洗漆两次，每次3min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[0077] (6)同时将滤渣收集起来，用0. 1 %的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0.Img的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣她；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[007引 （7)用消化液7倍体积的S蒸水稀释燕窝消化液；
[0079] (8)将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[0080] (9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件（2°C)下进行浓缩；
[0081] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-30°c)~（-20°c)，真空度为 50-200Pa，冻干时间为36h，即得到燕窝提取物冻干粉28yg，产率为1. 4%。
[0082] 实施例5燕窝提取物的制备
[0083] (1)从市面上购买燕窝20g ;
[0084]似将白燕或黄燕用水（28°C，Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:300)浸泡约 6h,血燕用温水浸泡约12h;
[0085] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[0086] (4)收集燕窝滤渣，在15°C和-80°C冰箱中反复冻融3次，破碎燕窝滤渣；
[0087] (5)用水洗漆两次，每次5min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[008引 （6)同时将滤渣收集起来，用0. 5 %的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0. 5mg的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣化；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[0089] (7)用消化液6倍体积的=蒸水稀释燕窝消化液；
[0090] 做将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[00川 （9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件巧°C)下进行浓缩；
[0092] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-28°C，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉28yg，产率为1. 4%。
[0093] 实施例6ELASA法定量检测EGF含量
[0094] (1)将实施例1制备获得的燕窝提取物冻干粉用透明质酸钢溶液进行溶解，为实 验品；将EGF标准品溶解，设置了 4个浓度，分别是10yg/ml，20yg/ml，30yg/ml、40yg/ ml及50yg/ml;从已恢复到室温的密封袋中取出实验所需板条；
[0095] (2)留空白孔，提前30min制备生物素化抗体工作液，于10°C~35°C下避光放置；
[0096] (3)分别将实验品或不同浓度的标准品（0yg/ml孔加试剂稀释液）加入相应孔 中，100y1/孔，用封板胶纸封住反应孔，37°C解箱解育90min;
[0097] (4)洗板 4 次；
[009引 （5)除空白孔外，加入酶结合物工作液，100y1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C解 箱避光解育60min;
[0099] 做洗版4次；
[0100] (7)除空白孔外，加入酶结合物工作液，100y1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C解 箱避光解育30min;
[0101] 做洗版4次；
[0102] (9)加入显色底物，lOOyl/孔，于37°C解箱避光解育15min;
[0103] (10)加入终止液，100y1/孔，混匀后检测其吸光度值伽4W值）。
[0104] 柄;准品结果如图1。
[01化]上述EGF标准品符合标准曲线y=0. 03X+0. 2。而我们检测到的实验品中的EGF的0〇45。平均值为1. 32,根据标准曲线图1，从而得知实验品中的EGF浓度为37. 3 y g/ml。
[0106] 将本发明实施例2至实施例5制备获得的燕窝提取物冻干粉进行上述试验，结果 与实施例1制备获得的燕窝提取物冻干粉的试验结果相近，无显著差异（P> 0. 05)。
[0107] 综合上述试验数据表明，制备获得的燕窝提取物冻干粉中的EGF浓度显著提高。
[0108] 实施例7紫外分光光度计法定量检测生物素含量
[0109] (1)标准曲线的绘制
[0110] 将生物素标准品进行溶解和稀释，分别稀释成W下浓度；200yg/ml、400yg/ml、 600yg/ml、800yg/ml、1000yg/ml，在590皿处分别测定各浓度标准品溶液的吸光度值 A(0D590)，记录所得读数如下表1。
[0111] 表1生物素标准品的吸光度值（0D590)
[0112]
[011引 0)样品的测定
[0114] 将实施例1制备的燕窝提取物冻干粉用透明质酸钢溶液进行溶解，为生物素样 品。将样品按上述方法测定在590nm处的吸光度值（0D590)，平行测定=份。记录读数，得 生物素样品的吸光度值为0. 368。
[0115] 根据表1，我们可W绘制出图2 :
[0116] 根据图2,可知生物素标准品的标准曲线符合y= 5. 4X+0. 106,检测到样品中生物 素的吸光度值为；〇. 368,由此可知，相应吸光度值的浓度为0. 0485mg/ml，即48. 5yg/ml。
[0117] 将本发明实施例2至实施例5制备获得的燕窝提取物冻干粉进行上述试验，结果 与实施例1制备获得的燕窝提取物冻干粉的试验结果相近，无显著差异（P> 0. 05)。
[0118] 综合上述试验数据表明，制备获得的燕窝提取物冻干粉中的生物素浓度显著提 局。
[0119] 实施例8效果试验
[0120] (1)设计一份燕窝提取物冻干粉的使用效果调查问卷。问卷对象为暨南大学
[0121] 经济学院国际贸易专业14级学生30人，男15,女15。调查内容如下：
[0122]
[0124] (2)将燕窝提取物冻干粉及溶媒7套，发给试用者使用，每人每年1套，连续使用7 天。
[0125] (3)7天后，将调查问卷发给试用者，要求试用者认真填写。
[01%] (4)将调查问卷收集后，进行分析和讨论。
[0127] 30份调查问卷中，其中28份调查问卷说明我们的燕窝提取物冻干粉具有美白嫩 肤、枯斑除污垢、改善皮肤的功效。
[0128] 对比例1用ELASA法定量检测现有技术与本发明中的EGF含量
[0129] ELASA法具体的实验步骤如实施例6,检测到现有方法和本发明中的EGF的0〇45。值 分别为1. 08和1. 32,根据标准曲线图1，得知现有技术体与本发明中的的EGF浓度分别为 2. 68yg/ml和37. 3yg/ml，其差异具有统计学意义。
[0130] 对比例2用紫外分光光度计法定量检测现有技术与本发明中的生物素含量
[0131] 紫外分光光度计法具体的实验步骤如实施例7,检测到现有方法和本发明中的生 物素的吸光度分别为0. 284和0. 368,根据标准曲线图2,得知现有技术体与本发明中的的 生物素浓度分别为32. 9yg/ml和48. 5yg/ml，其差异具有统计学意义。
[0132] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，该些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种燕窝提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1 :取燕窝与25°C~40°C的水混合、浸泡，过滤，收集滤渣； 步骤2 :取所述滤渣，于-80°C冷冻1~2h，再于10°C~35°C融化0. 5~lh，按照上述 操作反复冻融，洗涤、过滤，收集滤液和滤渣； 步骤3 :取步骤2所述滤渣，与中性蛋白酶混合，酶解，获得消化液； 步骤4 :取步骤3所述消化液稀释、过滤后，与步骤2所述滤液混合浓缩，获得浓缩液。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，以g/L计，所述燕窝与所述 水的质量体积比为1: (300~500)。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述浸泡的时间为3~ 24h〇4. 根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述过滤采用筛 网的目数为70目。5. 根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述反复冻融的 次数为3~6次。6. 根据权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述中性蛋白酶 的酶活为30万U/g，所述中性蛋白酶的浓度为0. 1 %~0. 5%，所述中性蛋白酶与步骤2所 述滤渣的质量比为1~2 :2~3。7. 根据权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述酶解的时间 为2~8h。8. 根据权利要求1至7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述稀释为取所述 消化液与水混合；所述水与所述消化液的体积比为5~10:1。9. 根据权利要求1至8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述浓缩的比例为 15:1，所述浓缩的温度为2 °C~8 °C。10. 根据权利要求1至9任一项所述的制备方法，其特征在于，获得浓缩液后还包括冻 干的步骤；所述冻干的温度为_35°C~-20°C，所述冻干的真空度为50Pa~200Pa，所述冻 干的时间为30h~36h。11. 根据权利要求1至10任一项所述的制备方法制得的燕窝提取物。12. 根据权利要求1至10任一项所述的制备方法制得的燕窝提取物在制备促进细胞再 生、增强免疫力、养颜、延缓衰老的药物、食品、化妆品中的应用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用。该方法提高了燕窝提取物中蛋白的活性和纯度，获得的燕窝提取物具有独特的美白嫩肤、美颜保健、祛斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高了产品品质。
【IPC分类】A61P37/04, A61K38/01, A61P17/16, A61K35/57, A61Q19/00, A61P7/00, A23L1/29, A61P39/06, A61K8/98, A61Q19/08
【公开号】CN104906555
【申请号】CN201510402496
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 罗二梅, 王小燕
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月9日
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提 取物及其应用。
【背景技术】
[0002] 燕窝是雨燕科动物金丝燕及多种同属燕类用唾液与绒羽等混合凝结所筑成的巢 窝，又称燕菜、燕根、燕蔬菜。其主要产于我国南海诸岛及东南亚各国。燕窝的营养较高，是 中国传统的名贵食品之一。
[0003] 燕窝现代医学研究发现，燕窝主要成分有；水溶性蛋白质、碳水化合物；微量元 素：巧、磯、铁、钢、钟及对促进人体活力起重要作用的氨基酸。燕窝独特的蛋白质成份含量 的生物活性分子，有助于人体组织的生长、发育及病后复原。
[0004] 碳水化合物是身体热量的主要来源，与蛋白质相辅相成，使蛋白质发挥提供热量 W外的功能，也可促进脂肪的代谢。燕窝中所含有的表皮生长因子和燕窝的水溶性物质可 直接刺激细胞分裂、再生、组织重建，使得燕窝对人体的滋补、复原起着很大的作用。巧质可 W增强血液在皮肤破损时的凝结能力，也帮助人体吸收维他命B12。燕窝中含有丰富的矿 物质、活性蛋白质与胶原质等营养，其中的表皮生长因子巧pidermalgrowth化ctor，EGF) 能够强烈刺激细胞再生、分裂和组织重建。
[0005] 据清代赵学敏的《本草纲目拾遗》载；"燕窝大养肺阴，化疲止嗽，补而能清，为调理 虚损劳疾之圣药。一切病之由于肺虚不能清肃下行者，用此者可治之。"据有关专家研究发 现，燕窝中含有EGF和辅助细胞分裂成分，有助于刺激细胞生长及繁殖，对人体组织生长、 细胞再生，W及细胞的免疫功能均有促进作用。加之燕窝还含有大量的粘蛋白、糖蛋白、巧、 磯等多种天然营养成份，有润肺燥、滋肾阴、补虚损的功效，能增强人体对疾病的抵抗力，有 助于抵抗伤风、咳嗽和感冒。因此，对吸烟和患有呼吸道疾病者最有效，协助病后的人体恢 复健康，是一种纯正高贵的天然保健品。燕窝对润肺健腰，壮脾健胃，外伤止血等有独特疗 效。
[0006] 目前，现有的提取和冻干燕窝提取物的方法主要是先超声粉碎燕窝，然后再加酶 水解，进一步离屯、、干燥后冻干。除了酶促水解步骤外，现有的技术还需要经过粉碎、浸泡、 煮沸、调节PH值等预处理步骤来提高水解的效率，化及离屯、、过滤、干燥等后续处理步骤来 对水解产物进行处理W得到燕窝提取物。工艺繁复，且产品产率低。按此方法得到的燕窝 提取物不仅美容活性成分含量低，且还可能含有各种添加剂。
[0007] 因此，提供一种燕窝活性成分纯度高、活性好的燕窝提取物的制备方法具有重要 的显不意义。
【发明内容】
[000引有鉴于此，本发明提供一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用。 该方法提高了燕窝提取物中蛋白的活性和含量，获得的燕窝提取物具有独特的美白嫩肤、 美颜保健、枯斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高了产品品质。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0010] 本发明提供了一种燕窝提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0011] 步骤1 ;取燕窝与25°C~40°C的水混合、浸泡，过滤，收集滤渣；
[001引 步骤2 ;取所述滤渣，于-80°C冷冻1~2h，再于10°C~35°C融化0. 5~比，按照 上述操作反复冻融，洗漆、过滤，收集滤液和滤渣；
[0013] 步骤3;取步骤2所述滤渣，与中性蛋白酶混合，酶解，获得消化液；
[0014] 步骤4;取步骤3所述消化液稀释、过滤后，与步骤2所述滤液混合浓缩，获得浓缩 液。
[0015] 在本发明的一些具体实施方案中，Wg/L计，步骤1中所述燕窝与所述水的质量体 积比为1: (300~500)。
[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述浸泡的时间为3~2化。为了达到 更优的提取效果，针对不同的燕窝，浸泡的时间也不相同。白燕或黄燕浸泡3~lOh，血燕浸 泡6~2化。
[0017] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述过滤采用筛网的目数为70目。
[0018] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述反复冻融的次数为3~6次。
[0019] 作为优选，Wg/L计，所述反复冻融后的滤渣与洗漆所用水的质量体积比为1 ; (4 ~5)。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述中性蛋白酶的酶活为30万U/g，所 述中性蛋白酶的浓度为0. 1%~0.5%，所述中性蛋白酶与步骤2所述滤渣的质量比为1~ 2 ;2 ~3。
[0021] 作为优选，中性蛋白酶溶液的配制方法为；取0. 1-0. 5mg的中性蛋白酶粉末溶解 在100ml的PBS溶液中，0. 22yM的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用。
[0022] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述酶解的时间为2~她。
[0023] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤4所述稀释为取所述消化液与水混合；所 述水与所述消化液的体积比为5~10:1。
[0024] 在本发明的一些具体实施方案中，步骤4所述浓缩的比例为15:1，所述浓缩的温 度为2°C~8°C。
[0025] 在本发明的一些具体实施方案中，获得浓缩液后还包括冻干的步骤；所述冻干的 温度为-35°C~-20°C，所述冻干的真空度为50化~200Pa，所述冻干的时间为3化~36h。
[0026] 本发明还提供了上述制备方法制得的燕窝提取物。
[0027] 本发明还提供了上述制备方法制得的燕窝提取物在制备促进细胞再生、增强免疫 力、养颜、延缓衰老的药物、食品、化妆品中的应用。
[002引本发明提供的燕窝提取物的制备方法具有W下优点：
[0029] (1)避免用开水烛燕窝，保证了燕窝提取物中蛋白的活性和纯度；
[0030] (2)用中性蛋白酶消化。获得的燕窝提取物具有独特的美白嫩肤、美颜保健、枯斑 除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高了产品品质；
[0031] (3)将燕窝提取物的滤液先进行浓缩再进行冻干，节省成本，提高稳定性，延长有 效期。
【附图说明】
[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[003引图1示EGF标准品的吸光度值曲线；
[0034] 图2示生物素标准品的吸光度值曲线。
【具体实施方式】
[0035] 本发明公开了一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用，本领域 技术人员可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换 和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法 及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范 围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0036] 本发明提供的燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用中所用原料及 试剂均可由市场购得。其中，生物素化抗体工作液购自Bilegend公司；酶结合物工作液购 自Bilegend公司；显色底物购自北京达科为生物技术有限公司。
[0037] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[003引实施例1燕窝提取物的制备
[0039] (1)从市面上购买燕窝20g;
[0040] 似将白燕或黄燕用水（25°C，Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:450)浸泡约 3h,血燕用温水浸泡约化；
[0041] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[00创 （4)收集燕窝滤渣，在10°C和-80°c冰箱中反复冻融3次，破碎燕窝滤渣；
[0043] (5)用水洗漆两次，每次2min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[0044] (6)同时将滤渣收集起来，用0.4%的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万u/g;中性蛋白酶溶液的配制；0. 4mg的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣化；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[0045] (7)用消化液10倍体积的S蒸水稀释燕窝消化液；
[0046] (8)将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[0047] (9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件巧°C)下进行浓缩；
[0048] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-35°C，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉28yg，产率为1. 4%。
[0049] 实施例2燕窝提取物的制备
[0050] (1)从市面上购买燕窝20g;
[0化^ 似将白燕或黄燕用水（40。Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:350)浸泡约 她，血燕用温水浸泡约1她；
[0化2] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[005引 （4)收集燕窝滤渣，在10°C~35°C和-80°C冰箱中反复冻融5次，破碎燕窝滤渣；
[0054] (5)用水洗漆两次，每次5min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[0化5] (6)同时将滤渣收集起来，用0. 2 %的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0. 2mg的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣化；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[0056] (7)用消化液5倍体积的=蒸水稀释燕窝消化液；
[0057] 做将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[005引 （9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件（4°C)下进行浓缩；
[0化9] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-20°C，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉8yg，产率为1. 4%。
[0060] 实施例3燕窝提取物的制备
[0061] (1)从市面上购买燕窝20g ;
[006引似将白燕或黄燕用水（37。Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:400)浸泡约 lOh，血燕用温水浸泡约2化；
[006引 （3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[0064] (4)收集燕窝滤渣，在25°C和-80°C冰箱中反复冻融4次，破碎燕窝滤渣；
[00化](5)用水洗漆两次，每次4min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[0066] (6)同时将滤渣收集起来，用0.3%的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0. 3mg的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣化；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[0067] (7)用消化液8倍体积的S蒸水稀释燕窝消化液；
[0068] 做将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[0069] (9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件化° C)下进行浓缩；
[0070] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-25°c，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉28y g，产率为1. 4%。
[0071] 实施例4燕窝提取物的制备
[0072] (1)从市面上购买燕窝20g ;
[007引 似将白燕或黄燕用水（30°C，Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:500)浸泡约 5h,血燕用温水浸泡约化；
[0074] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[0075] (4)收集燕窝滤渣，在20°C和-80°C冰箱中反复冻融6次，破碎燕窝滤渣；
[0076] (5)用水洗漆两次，每次3min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[0077] (6)同时将滤渣收集起来，用0. 1 %的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0.Img的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣她；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[007引 （7)用消化液7倍体积的S蒸水稀释燕窝消化液；
[0079] (8)将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[0080] (9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件（2°C)下进行浓缩；
[0081] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-30°c)~（-20°c)，真空度为 50-200Pa，冻干时间为36h，即得到燕窝提取物冻干粉28yg，产率为1. 4%。
[0082] 实施例5燕窝提取物的制备
[0083] (1)从市面上购买燕窝20g ;
[0084]似将白燕或黄燕用水（28°C，Wg/L计，燕窝与水的质量体积比为1:300)浸泡约 6h,血燕用温水浸泡约12h;
[0085] (3)将浸泡在水中的燕窝用70目的筛网过滤，得到燕窝滤渣；
[0086] (4)收集燕窝滤渣，在15°C和-80°C冰箱中反复冻融3次，破碎燕窝滤渣；
[0087] (5)用水洗漆两次，每次5min，分别过滤，收集洗漆后的滤液；
[008引 （6)同时将滤渣收集起来，用0. 5 %的中性蛋白酶溶液（中性蛋白酶酶活为；30 万U/g;中性蛋白酶溶液的配制；0. 5mg的中性蛋白酶粉末溶解在100ml的PBS溶液中， 0. 22 的一次性无菌过滤器过滤后4°C保存备用）消化燕窝滤渣化；所述中性蛋白酶与 步骤2所述滤渣的质量比为1~2 ;2~3。
[0089] (7)用消化液6倍体积的=蒸水稀释燕窝消化液；
[0090] 做将稀释后的燕窝消化液用100目不诱钢筛网过滤；
[00川 （9)收集消化后的滤液，与妨中得到的滤液混合，将所有滤液按照15:1的比例 (及浓缩前后的比值为15:1)在低温条件巧°C)下进行浓缩；
[0092] (10)随后将浓缩液进行冻干，冻干温度为-28°C，真空度为50-200化，冻干时间为 36h，即得到燕窝提取物冻干粉28yg，产率为1. 4%。
[0093] 实施例6ELASA法定量检测EGF含量
[0094] (1)将实施例1制备获得的燕窝提取物冻干粉用透明质酸钢溶液进行溶解，为实 验品；将EGF标准品溶解，设置了 4个浓度，分别是10yg/ml，20yg/ml，30yg/ml、40yg/ ml及50yg/ml;从已恢复到室温的密封袋中取出实验所需板条；
[0095] (2)留空白孔，提前30min制备生物素化抗体工作液，于10°C~35°C下避光放置；
[0096] (3)分别将实验品或不同浓度的标准品（0yg/ml孔加试剂稀释液）加入相应孔 中，100y1/孔，用封板胶纸封住反应孔，37°C解箱解育90min;
[0097] (4)洗板 4 次；
[009引 （5)除空白孔外，加入酶结合物工作液，100y1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C解 箱避光解育60min;
[0099] 做洗版4次；
[0100] (7)除空白孔外，加入酶结合物工作液，100y1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C解 箱避光解育30min;
[0101] 做洗版4次；
[0102] (9)加入显色底物，lOOyl/孔，于37°C解箱避光解育15min;
[0103] (10)加入终止液，100y1/孔，混匀后检测其吸光度值伽4W值）。
[0104] 柄;准品结果如图1。
[01化]上述EGF标准品符合标准曲线y=0. 03X+0. 2。而我们检测到的实验品中的EGF的0〇45。平均值为1. 32,根据标准曲线图1，从而得知实验品中的EGF浓度为37. 3 y g/ml。
[0106] 将本发明实施例2至实施例5制备获得的燕窝提取物冻干粉进行上述试验，结果 与实施例1制备获得的燕窝提取物冻干粉的试验结果相近，无显著差异（P> 0. 05)。
[0107] 综合上述试验数据表明，制备获得的燕窝提取物冻干粉中的EGF浓度显著提高。
[0108] 实施例7紫外分光光度计法定量检测生物素含量
[0109] (1)标准曲线的绘制
[0110] 将生物素标准品进行溶解和稀释，分别稀释成W下浓度；200yg/ml、400yg/ml、 600yg/ml、800yg/ml、1000yg/ml，在590皿处分别测定各浓度标准品溶液的吸光度值 A(0D590)，记录所得读数如下表1。
[0111] 表1生物素标准品的吸光度值（0D590)
[0112]
[011引 0)样品的测定
[0114] 将实施例1制备的燕窝提取物冻干粉用透明质酸钢溶液进行溶解，为生物素样 品。将样品按上述方法测定在590nm处的吸光度值（0D590)，平行测定=份。记录读数，得 生物素样品的吸光度值为0. 368。
[0115] 根据表1，我们可W绘制出图2 :
[0116] 根据图2,可知生物素标准品的标准曲线符合y= 5. 4X+0. 106,检测到样品中生物 素的吸光度值为；〇. 368,由此可知，相应吸光度值的浓度为0. 0485mg/ml，即48. 5yg/ml。
[0117] 将本发明实施例2至实施例5制备获得的燕窝提取物冻干粉进行上述试验，结果 与实施例1制备获得的燕窝提取物冻干粉的试验结果相近，无显著差异（P> 0. 05)。
[0118] 综合上述试验数据表明，制备获得的燕窝提取物冻干粉中的生物素浓度显著提 局。
[0119] 实施例8效果试验
[0120] (1)设计一份燕窝提取物冻干粉的使用效果调查问卷。问卷对象为暨南大学
[0121] 经济学院国际贸易专业14级学生30人，男15,女15。调查内容如下：
[0122]
[0124] (2)将燕窝提取物冻干粉及溶媒7套，发给试用者使用，每人每年1套，连续使用7 天。
[0125] (3)7天后，将调查问卷发给试用者，要求试用者认真填写。
[01%] (4)将调查问卷收集后，进行分析和讨论。
[0127] 30份调查问卷中，其中28份调查问卷说明我们的燕窝提取物冻干粉具有美白嫩 肤、枯斑除污垢、改善皮肤的功效。
[0128] 对比例1用ELASA法定量检测现有技术与本发明中的EGF含量
[0129] ELASA法具体的实验步骤如实施例6,检测到现有方法和本发明中的EGF的0〇45。值 分别为1. 08和1. 32,根据标准曲线图1，得知现有技术体与本发明中的的EGF浓度分别为 2. 68yg/ml和37. 3yg/ml，其差异具有统计学意义。
[0130] 对比例2用紫外分光光度计法定量检测现有技术与本发明中的生物素含量
[0131] 紫外分光光度计法具体的实验步骤如实施例7,检测到现有方法和本发明中的生 物素的吸光度分别为0. 284和0. 368,根据标准曲线图2,得知现有技术体与本发明中的的 生物素浓度分别为32. 9yg/ml和48. 5yg/ml，其差异具有统计学意义。
[0132] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，该些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种燕窝提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1 :取燕窝与25°C~40°C的水混合、浸泡，过滤，收集滤渣； 步骤2 :取所述滤渣，于-80°C冷冻1~2h，再于10°C~35°C融化0. 5~lh，按照上述 操作反复冻融，洗涤、过滤，收集滤液和滤渣； 步骤3 :取步骤2所述滤渣，与中性蛋白酶混合，酶解，获得消化液； 步骤4 :取步骤3所述消化液稀释、过滤后，与步骤2所述滤液混合浓缩，获得浓缩液。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，以g/L计，所述燕窝与所述 水的质量体积比为1: (300~500)。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述浸泡的时间为3~ 24h〇4. 根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述过滤采用筛 网的目数为70目。5. 根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述反复冻融的 次数为3~6次。6. 根据权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述中性蛋白酶 的酶活为30万U/g，所述中性蛋白酶的浓度为0. 1 %~0. 5%，所述中性蛋白酶与步骤2所 述滤渣的质量比为1~2 :2~3。7. 根据权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述酶解的时间 为2~8h。8. 根据权利要求1至7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述稀释为取所述 消化液与水混合；所述水与所述消化液的体积比为5~10:1。9. 根据权利要求1至8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述浓缩的比例为 15:1，所述浓缩的温度为2 °C~8 °C。10. 根据权利要求1至9任一项所述的制备方法，其特征在于，获得浓缩液后还包括冻 干的步骤；所述冻干的温度为_35°C~-20°C，所述冻干的真空度为50Pa~200Pa，所述冻 干的时间为30h~36h。11. 根据权利要求1至10任一项所述的制备方法制得的燕窝提取物。12. 根据权利要求1至10任一项所述的制备方法制得的燕窝提取物在制备促进细胞再 生、增强免疫力、养颜、延缓衰老的药物、食品、化妆品中的应用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用。该方法提高了燕窝提取物中蛋白的活性和纯度，获得的燕窝提取物具有独特的美白嫩肤、美颜保健、祛斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高了产品品质。
【IPC分类】A61P37/04, A61K38/01, A61P17/16, A61K35/57, A61Q19/00, A61P7/00, A23L1/29, A61P39/06, A61K8/98, A61Q19/08
【公开号】CN104906555
【申请号】CN201510402496
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 罗二梅, 王小燕
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月9日
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