乌司他丁在制备治疗宫颈癌药物中的用途及药物组合物的制作方法
乌司他丁在制备治疗宫颈癌药物中的用途及药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体设及乌司他了在制备治疗宫颈癌药物中的用途， W及一种含有乌司他了的用于治疗宫颈癌的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是指发生在宫颈阴道部或移行带的鱗状上皮细胞及颈管内膜的柱状上皮 细胞交界处的恶性肿瘤，宫颈癌是女性生殖系统肿瘤中最为常见的子宫颈部恶性肿瘤，主 要的临床表现为月经或白带过多，阴道不规则出血、腰腹部疼痛，贫血、消瘦等全身衰竭性 症状。近年来，宫颈癌的发病率持续上升，发病人群也逐渐向年轻化发展。长期的临床观点 认为宫颈癌化疗的敏感度较差，有效率都低于15%，目前宫颈癌的化疗药物可采用5-氣尿 喀晚、阿霉素等进行静脉或局部注射，然而阿霉素毒性反应较重，且在动物实验中发现致癌 作用，在人体内也存在潜在的致癌、致突变作用，对生殖功能有重大影响。因此急需寻求一 种低毒、效果显著的宫颈癌治疗药物。
[0003] 乌司他了是从健康男性尿中分离纯化而得，分子量约为67000Da的酸性糖蛋白， 是一种广谱的蛋白酶抑制制剂，能够抑制多种蛋白、糖和脂类水解酶的活性。其主要在肝脏 中合成，由肾脏代谢随尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶 的作用。1985年由日本首先开发上市，目前常用于治疗急性膜腺炎，慢性复发性膜腺炎，亦 可用于急性循环衰竭的抢救辅助用药。也有研究表明乌司他了对肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌 等癌症细胞有较好的抑制作用，但经检索，尚无发现有乌司他了在治疗宫颈癌的相关研究。
[0004] 青富班醋是一种常用的抗寄生虫药，为还原青富素班巧酸单醋，是具有倍半祗内 醋结构的青富素的衍生物。青富班醋作用于追原虫红内期裂殖体，通过还原青富素抑制细 胞色素氧化酶，达到抑制追原虫表膜一食物泡膜、线粒体膜系细胞色素氧化酶的功能，从而 阻断W宿主细胞浆为营养的供给。对追原虫的无性体有较强的杀灭作用，奏效快，能迅速控 制追疾发作，对脑型追、恶性追和间日追都有较好的疗效，对恶性追的耐氯嗟株同样有效。 尤其对脑型追的效果更显著，其能迅速控制追疾发作。目前尚未发现青富班醋在抗癌方面 的研究。中国专利CN103784942B公开了青富班醋与乌司他了联合治疗膜腺炎的用途。
[0005] 紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，是一种可W促进微管聚合 和稳定已聚合微管的药物。通过II-III临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺 癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋己瘤、脑瘤也都有一定疗效。马丽华等在《紫杉醇在子宫 颈癌及子宫内膜癌治疗中的应用》（中国现代医生，2013年第02期，第55-58页）公开了紫 杉醇在子宫颈癌及子宫内膜癌的临床治疗之中的疗效显著。然而使用紫杉醇治疗癌症的不 良反应如过敏反应、周围神经病变、脱发等发生率高，加重了患者的痛苦。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的在于提供乌司他了在制备治疗宫颈癌药物中的用途。
[0007] 本发明将乌司他了进行抗人宫颈癌化la细胞株活性测试W及人宫颈癌化La细胞 裸鼠移植瘤生长抑制试验，发现乌司他了对人宫颈癌化la细胞具有较强的增殖抑制作用。 为此本发明提供了乌司他了在医药领域的一种新应用，即乌司他了可W作为治疗宫颈癌的 药物使用。
[000引本发明的另一目的在于提供一种治疗宫颈癌的药物组合物，所述药物组合物包括 乌司他了和青富班醋。其中乌司他了和青富班醋的重量比1: (0.01~0.8)，此时乌司他了 和青富班醋的组合物在抑制宫颈癌方面效果显著，与单独给药乌司他了或青富班醋相比， 在抑制宫颈癌方面具有协同作用。优选的，所述药物组合物中乌司他了和青富班醋的重量 比1 : 0.4,此时乌司他了和青富班醋的组合物在抑制人宫颈癌化la细胞增殖作用最强。
[0009] 优选的，所述药物组合物还包括紫杉醇类药物。所述紫杉醇类药物具体为紫杉醇。 所述紫杉醇与乌司他了的重量比为（0.01~0.5): 1。此时乌司他了、青富班醋和的紫杉醇 组合物在抑制宫颈癌方面效果极其显著，与司他了和青富班醋的组合物相比，在抑制宫颈 癌方面具有更显著的协同作用。再优选的，所述紫杉醇与乌司他了的重量比为0.26 :1，此 时乌司他了、青富班醋和紫杉醇的组合物在抑制人宫颈癌化la细胞增殖作用最强。
[0010] 另外，本发明考察了乌司他了和青富班醋的药物组合物W及乌司他了、青富班醋 和紫杉醇的药物组合物的不良反应发生率，通过对试验小鼠毒副作用诸如腹泻、精神萎靡 等观察发现，与单独给药同剂量的乌司他了、青富班醋或紫杉醇相比，乌司他了和青富班醋 的药物组合物W及乌司他了、青富班醋和紫杉醇的药物组合物的不良反应发生率降低约 159(^20%。该为临床上降低紫杉醇药物剂量提供了一种途径，即联合乌司他了和青富班醋同 时给药。
[0011] 为了更好的表达该治疗宫颈癌的药物组合物的形式，本发明所述药物组合物为注 射剂，所述的注射制剂可W按照常规制剂进行制备。
[0012] 总之，与现有技术相比，本发明的优势在于： 第一，本发明提供了乌司他了在医药领域的一种新应用，即乌司他了可W作为治疗宫 颈癌的药物使用，开拓了乌司他了的应用方向，同时也给广大宫颈癌患者提供一种新药。
[0013] 第二，本发明提供了一种治疗宫颈癌的药物组合物，该组合物包括乌司他了和青 富班醋，还可包括紫杉醇，本发明将乌司他了和青富班醋、或乌司他了、青富班醋和紫杉醇 的药物组合物或药物制剂同时给药治疗宫颈癌，极大地方便患者的使用，提高了癌症治疗 的顺应性。同时与单独使用乌司他了、青富班醋或紫杉醇相比，本发明提供的药物组合物在 治疗宫颈癌方面具有显著的协同抗癌作用。
[0014] 第=，本发明治疗宫颈癌的药物组合物药物组合物具有较低的毒副作用。乌司他 了、青富班醋和紫杉醇均存在一定的毒性，但是乌司他了和青富班醋，或乌司他了、青富班 醋和紫杉醇作为组合物使用，在达到同样的抗癌疗效的情况下，可W显著降低乌司他了、青 富班醋和紫杉醇带来的毒副作用。与单独给药同剂量的乌司他了、青富班醋或紫杉醇相比， 本发明药物组合物的不良反应发生率降低约159(^20%。
【具体实施方式】
[0015] W下通过【具体实施方式】进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于W下实施例。在 本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行适当改进、替换 功效相同的组分，对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的 范围之内。
[0016] 实施例1
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0017] 实施例2
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[001引 实施例3
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0019] 实施例4
制备工艺；取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0020] 实施例5
制备工艺；取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0021] 实施例6
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[002引 实施例7 _
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0.9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0023] 试验例一、乌司他了抗人宫颈癌化la细胞株活性测试 测试方法；体外抗肿瘤活性测试方法 A、原理；活细胞粒体中的班巧脱氨酶能使外源性唾挫藍（MTT)还原为水不溶性的藍紫 色结晶甲琐并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚讽能溶解细胞中的甲琐，用酶联 免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
[0024] B、细胞；人宫颈癌化la细胞株（中国科学院上海生命科学院细胞库）。
[0025] C、实验步骤； (1)样品的准备；将乌司他了Img用40yL的DMSO溶解配置成25mg/mL的母液，再用DMEM培养基(每lOOOmL培养基中含80万单位青霉素，1.Og链霉素，10%灭活胎牛血清）连 续稀释成乌司他了浓度为 1000yg/mL、100yg/mL、10yg/mL、lyg/mL、0. 1yg/mL的样品 液。运用相同的方法制备5-氣尿喀晚浓度为1000yg/mL、100yg/mL、10yg/mL、lyg/mL、 0.1yg/mL的样品液。
[0026] (2)MIT试验；取对数生长期化la细胞一瓶，弃培养液，将细胞用邸TA-膜酶消化 液于37°C培养箱消化约15s，将消化后的细胞用DMEM培养基稀释成1X106个/mU加到96 孔细胞培养板中，每孔100yL。实验设空白对照组、实验对照组、阳性对照组（5-氣尿喀晚） 和乌司他了组，每组设3个平行孔，置37°C，5%C02培养箱中培养2化后，加入上述配制的样 品液，每孔100y以实验对照组只加培养液 ，与实验对照组平行不加细胞只加培养液的空白 对照组。置37°C，5%C02培养箱中培养7化后，在细胞培养孔中加入5mg/血的MTT溶液，每 孔10yL，置37°C解育化，加入DMS0,每孔150yL，用振荡器振荡，使甲膜完全溶解，用酶标 仪（XD-711，上海迅达医疗器械有限公司产品）在570nm波长下比色。W同样条件用不含样 品，含同样浓度DMS0的培养基培养的细胞作为对照。实验重复3次，取其平均值作为实验 结果。根据LOG口法计算样品对肿瘤细胞生长的半数抑制浓度（ICg。）。
[0027] 肿瘤细胞生长抑制率（CI) = [1-(乌司他了组0D值-空白对照组0D值）/( 实验对照组0D值-空白对照组0D值）]X100% D、实验结果；抗人宫颈癌化la细胞活性测试结果见表1所示。
[002引 表1
表1可W看出，按照抗肿瘤活性的评价标准(化合物ICw<10yg/mL则判断样品在体 外对肿瘤细胞有杀伤作用；ICw< 30yg/mL则判断样品在体外对肿瘤细胞有具有较强的 增殖抑制作用)，乌司他了对人宫颈癌化la细胞具有较强的增殖抑制作用，可用于治疗宫颈 癌。
[0029] 试验例二、本发明药物组合物抗人宫颈癌化la细胞活性测试 第一部分；体外抗肿瘤活性测试方法 1、细胞；人宫颈癌化la细胞株（中国科学院上海生命科学院细胞库)。
[0030] 2、样品的准备； 乌司他了组；乌司他了Img; 青富班醋组；青富班醋0. 4mg; 紫杉醇组；紫杉醇0. 26mg; 乌司他了 +青富班醋A组：乌司他了lmg+青富班醋0. 4mg; 乌司他了 +青富班醋B组：乌司他了lmg+青富班醋0.8mg; 乌司他了 +青富班醋C组：乌司他了lmg+青富班醋0. 05mg; 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇A组：乌司他了lmg+青富班醋0. 4mg+紫杉醇0. 26mg; 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇B组；乌司他了lmg+青富班醋0. 4mg+紫杉醇0. 5mg; 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇C组：乌司他了lmg+青富班醋0. 4mg+紫杉醇0.Olmg。
[0031] 参照试验例一的方法将（1)~ (9)各组配制成浓度为1000yg/mL、100yg/mL、 10yg/mL、lyg/mL、0. 1yg/mL的样品液。
[003引 3、MTT试验方法同验例一。
[0033] 4、实验结果；抗人宫颈癌化la细胞活性测试结果见表2所示。
[0034] 表 2
表1可W看出，按照抗肿瘤活性的评价标准(化合物吗。<10yg/mL则判断样品在体 外对肿瘤细胞有杀伤作用；ICw< 30yg/mL则判断样品在体外对肿瘤细胞有具有较强的增 殖抑制作用)，乌司他了 +青富班醋A组、B组和C组对人宫颈癌化la细胞具有较强的增殖 抑制作用，且明显强于乌司他了组、青富班醋组和紫杉醇组，说明乌司他了和青富班醋存在 协同作用，乌司他了 +青富班醋A组、B组和C组中W乌司他了 +青富班醋A组的增殖抑制 作用最强，说明乌司他了和青富班醋W重量比1: 0.4联用时协同作用最强，因此，乌司他 了和青富班醋的组合物可用于制备治疗宫颈癌的药物。
[0035] 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇A组、B组和C组对人宫颈癌化la细胞具有杀伤作 用，且明显强于乌司他了 +青富班醋A组、B组和C组，说明乌司他了、青富班醋和紫杉醇S 者之间存在协同作用；其中乌司他了 +青富班醋+紫杉醇A组抗人宫颈癌化la细胞活性作 用最强，说明乌司他了、青富班醋和紫杉醇W重量比1 : 0.4 : 0.26联用时协同作用最强， 因此，乌司他了、青富班醋和紫杉醇的组合物可用于制备治疗宫颈癌的药物。
[0036] 第二部分：动物实验 1材料与方法 1.1材料与试剂 人宫颈癌化la细胞株购自中国科学院上海生命科学院细胞库，RPMI-1640 (Gibco)、新 生小牛血清购自杭州四季春公司；突变系无特定病原体（SPF)级Ba化/c-nu小鼠80只，4~6 周龄、雌性、体重14~18g，由北京维痛利华实验动物技术公司提供[合格证；0093120 ;许可 证；SCXK(京）2007-0001]，于无菌屏蔽环境中饲养。
[0037] 1.2人宫颈癌裸鼠移植瘤治疗实验 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基于37°C、5%二氧化碳（C〇2)饱和湿度下培养； 细胞贴壁生长于培养基中，取对数生长期细胞用于实验。于裸鼠背部皮下注射化la细胞2Xl〇6个/只。待皮下移植瘤体积达75mm3时（约3〇d)，按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则 分为8组，每组10只。
[003引模型对照组；尾静脉注射等量的生理盐水； 乌司他了低量组；尾静脉注射Img/kg乌司他了； 乌司他了中量组；尾静脉注射5mg/kg乌司他了； 乌司他了高量组；尾静脉注射20mg/kg乌司他了； 青富班醋组；尾静脉注射8mg/kg; 紫杉醇组；尾静脉注射5. 2mg/kg; 乌司他了 +青富班醋组；尾静脉注射乌司他了20mg/kg+青富班醋8mg/kg; 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇组；尾静脉注射乌司他了20mg/kg+青富班醋8mg/kg+紫 杉醇 5. 2mg/kg。
[0039] 隔日给药1次，共计8次，给药期间每4日用游标卡尺测量移植瘤最长径（L)和 最短径（W)。末次给药48h后脱白处死小鼠，切除移植瘤，称取瘤重。瘤重抑制率（%)IR= (1-实验组瘤重均值/对照组瘤重均值）X100%。通过瘤重的比较来体现药物对人宫颈癌 化la细胞裸鼠移植瘤生长的影响。
[0040] 1. 3统计学处理 数据W均数+标准差表示，采用SPSS15. 0软件进行方差分析。
[0041] 2 结果 试验结果表明（见表3): 表3本发明药物组合物对人宫颈癌化La细胞裸鼠移植瘤生长的影响
*与模型对照组相比，p<〇. 05 ; **与模型对照组相比，p<〇. 01 ; ##与乌司他了高量组相比，p<〇. 01 ; &&与紫杉醇组相比，p<〇.〇l。
[0042] 1)与模型对照组相比，乌司他了中量组、高剂量组对人宫颈癌化La细胞裸鼠 移植瘤生长的抑制作用均具有显著性差异；乌司他了低、中、高剂量组抑瘤率为20. 46%、 24. 30%、35. 55%，说明乌司他了能抑制人宫颈癌化La细胞裸鼠移植瘤生长，并呈剂量依赖 性。
[0043] 2)与乌司他了、紫杉醇和青富班醋各单药组相比，乌司他了和青富班醋药物组合 物对人宫颈癌化La细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用具有极显著性差异（p<0.01)，并具有 显著的协同作用。
[0044] 3)与乌司他了、紫杉醇和青富班醋各单药组相比，乌司他了、青富班醋和紫杉醇药 物组合物对人宫颈癌化La细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用具有极显著性差异（p<0.01)， 且与乌司他了 +青富班醋组相比，抑瘤率提高了约17%，表明该药物组合物在治疗宫颈癌方 面效果很好，并具有协同作用。
[0045] 4)本试验同时考察了各给药组的不良反应发生率，通过对试验小鼠毒副作用诸如 腹泻、精神萎靡等观察发现，与单独给药同剂量的乌司他了、青富班醋或紫杉醇相比，乌司 他了和青富班醋的药物组合物W及乌司他了、青富班醋和紫杉醇的药物组合物的不良反应 发生率降低约15%~20%。
[0046] W上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制，本发明的保护范围应当W权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可W做出若干改进和润饰，该些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 乌司他丁在制备治疗宫颈癌药物中的用途。2. -种治疗宫颈癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括乌司他丁和青蒿 琥酯。3. 如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中乌司他丁和青蒿 琥酯的重量比1 : (0. 〇1~〇. 8)。4. 如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中乌司他丁和青蒿 琥酯的重量比1 : 0.4。5. 如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括紫杉醇类药 物。6. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述紫杉醇类药物为紫杉醇。7. 如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述紫杉醇与乌司他丁的重量比为 (0. 01-0. 5) :Io8. 如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述紫杉醇与乌司他丁的重量比为 0?26:1〇9. 如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂。
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，具体公开了乌司他丁在制备治疗宫颈癌药物中的新用途，以及一种用于治疗宫颈癌的药物组合物。本发明药物组合物包括乌司他丁和青蒿琥酯，也还可以包括紫杉醇类药物，具体为紫杉醇。本发明药物组合物在抑制宫颈癌方面具有协同作用，且具有毒副作用低，抑癌效果明显等优点。
【IPC分类】A61K38/17, A61P15/00, A61P35/00, A61K31/337, A61K31/357
【公开号】CN104906558
【申请号】CN201510395846
【发明人】王旭, 郑少亮, 许文勤, 肖益热
【申请人】广东天普生化医药股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月8日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体设及乌司他了在制备治疗宫颈癌药物中的用途， W及一种含有乌司他了的用于治疗宫颈癌的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是指发生在宫颈阴道部或移行带的鱗状上皮细胞及颈管内膜的柱状上皮 细胞交界处的恶性肿瘤，宫颈癌是女性生殖系统肿瘤中最为常见的子宫颈部恶性肿瘤，主 要的临床表现为月经或白带过多，阴道不规则出血、腰腹部疼痛，贫血、消瘦等全身衰竭性 症状。近年来，宫颈癌的发病率持续上升，发病人群也逐渐向年轻化发展。长期的临床观点 认为宫颈癌化疗的敏感度较差，有效率都低于15%，目前宫颈癌的化疗药物可采用5-氣尿 喀晚、阿霉素等进行静脉或局部注射，然而阿霉素毒性反应较重，且在动物实验中发现致癌 作用，在人体内也存在潜在的致癌、致突变作用，对生殖功能有重大影响。因此急需寻求一 种低毒、效果显著的宫颈癌治疗药物。
[0003] 乌司他了是从健康男性尿中分离纯化而得，分子量约为67000Da的酸性糖蛋白， 是一种广谱的蛋白酶抑制制剂，能够抑制多种蛋白、糖和脂类水解酶的活性。其主要在肝脏 中合成，由肾脏代谢随尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶 的作用。1985年由日本首先开发上市，目前常用于治疗急性膜腺炎，慢性复发性膜腺炎，亦 可用于急性循环衰竭的抢救辅助用药。也有研究表明乌司他了对肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌 等癌症细胞有较好的抑制作用，但经检索，尚无发现有乌司他了在治疗宫颈癌的相关研究。
[0004] 青富班醋是一种常用的抗寄生虫药，为还原青富素班巧酸单醋，是具有倍半祗内 醋结构的青富素的衍生物。青富班醋作用于追原虫红内期裂殖体，通过还原青富素抑制细 胞色素氧化酶，达到抑制追原虫表膜一食物泡膜、线粒体膜系细胞色素氧化酶的功能，从而 阻断W宿主细胞浆为营养的供给。对追原虫的无性体有较强的杀灭作用，奏效快，能迅速控 制追疾发作，对脑型追、恶性追和间日追都有较好的疗效，对恶性追的耐氯嗟株同样有效。 尤其对脑型追的效果更显著，其能迅速控制追疾发作。目前尚未发现青富班醋在抗癌方面 的研究。中国专利CN103784942B公开了青富班醋与乌司他了联合治疗膜腺炎的用途。
[0005] 紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，是一种可W促进微管聚合 和稳定已聚合微管的药物。通过II-III临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺 癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋己瘤、脑瘤也都有一定疗效。马丽华等在《紫杉醇在子宫 颈癌及子宫内膜癌治疗中的应用》（中国现代医生，2013年第02期，第55-58页）公开了紫 杉醇在子宫颈癌及子宫内膜癌的临床治疗之中的疗效显著。然而使用紫杉醇治疗癌症的不 良反应如过敏反应、周围神经病变、脱发等发生率高，加重了患者的痛苦。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的在于提供乌司他了在制备治疗宫颈癌药物中的用途。
[0007] 本发明将乌司他了进行抗人宫颈癌化la细胞株活性测试W及人宫颈癌化La细胞 裸鼠移植瘤生长抑制试验，发现乌司他了对人宫颈癌化la细胞具有较强的增殖抑制作用。 为此本发明提供了乌司他了在医药领域的一种新应用，即乌司他了可W作为治疗宫颈癌的 药物使用。
[000引本发明的另一目的在于提供一种治疗宫颈癌的药物组合物，所述药物组合物包括 乌司他了和青富班醋。其中乌司他了和青富班醋的重量比1: (0.01~0.8)，此时乌司他了 和青富班醋的组合物在抑制宫颈癌方面效果显著，与单独给药乌司他了或青富班醋相比， 在抑制宫颈癌方面具有协同作用。优选的，所述药物组合物中乌司他了和青富班醋的重量 比1 : 0.4,此时乌司他了和青富班醋的组合物在抑制人宫颈癌化la细胞增殖作用最强。
[0009] 优选的，所述药物组合物还包括紫杉醇类药物。所述紫杉醇类药物具体为紫杉醇。 所述紫杉醇与乌司他了的重量比为（0.01~0.5): 1。此时乌司他了、青富班醋和的紫杉醇 组合物在抑制宫颈癌方面效果极其显著，与司他了和青富班醋的组合物相比，在抑制宫颈 癌方面具有更显著的协同作用。再优选的，所述紫杉醇与乌司他了的重量比为0.26 :1，此 时乌司他了、青富班醋和紫杉醇的组合物在抑制人宫颈癌化la细胞增殖作用最强。
[0010] 另外，本发明考察了乌司他了和青富班醋的药物组合物W及乌司他了、青富班醋 和紫杉醇的药物组合物的不良反应发生率，通过对试验小鼠毒副作用诸如腹泻、精神萎靡 等观察发现，与单独给药同剂量的乌司他了、青富班醋或紫杉醇相比，乌司他了和青富班醋 的药物组合物W及乌司他了、青富班醋和紫杉醇的药物组合物的不良反应发生率降低约 159(^20%。该为临床上降低紫杉醇药物剂量提供了一种途径，即联合乌司他了和青富班醋同 时给药。
[0011] 为了更好的表达该治疗宫颈癌的药物组合物的形式，本发明所述药物组合物为注 射剂，所述的注射制剂可W按照常规制剂进行制备。
[0012] 总之，与现有技术相比，本发明的优势在于： 第一，本发明提供了乌司他了在医药领域的一种新应用，即乌司他了可W作为治疗宫 颈癌的药物使用，开拓了乌司他了的应用方向，同时也给广大宫颈癌患者提供一种新药。
[0013] 第二，本发明提供了一种治疗宫颈癌的药物组合物，该组合物包括乌司他了和青 富班醋，还可包括紫杉醇，本发明将乌司他了和青富班醋、或乌司他了、青富班醋和紫杉醇 的药物组合物或药物制剂同时给药治疗宫颈癌，极大地方便患者的使用，提高了癌症治疗 的顺应性。同时与单独使用乌司他了、青富班醋或紫杉醇相比，本发明提供的药物组合物在 治疗宫颈癌方面具有显著的协同抗癌作用。
[0014] 第=，本发明治疗宫颈癌的药物组合物药物组合物具有较低的毒副作用。乌司他 了、青富班醋和紫杉醇均存在一定的毒性，但是乌司他了和青富班醋，或乌司他了、青富班 醋和紫杉醇作为组合物使用，在达到同样的抗癌疗效的情况下，可W显著降低乌司他了、青 富班醋和紫杉醇带来的毒副作用。与单独给药同剂量的乌司他了、青富班醋或紫杉醇相比， 本发明药物组合物的不良反应发生率降低约159(^20%。
【具体实施方式】
[0015] W下通过【具体实施方式】进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于W下实施例。在 本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行适当改进、替换 功效相同的组分，对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的 范围之内。
[0016] 实施例1
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0017] 实施例2
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[001引 实施例3
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0019] 实施例4
制备工艺；取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0020] 实施例5
制备工艺；取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0021] 实施例6
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0. 9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[002引 实施例7 _
制备工艺:取处方量的乌司他了和青富班醋，溶于500ml0.9%生理盐水注射液中，过 滤、灌封，100摄氏度灭菌30min即得。
[0023] 试验例一、乌司他了抗人宫颈癌化la细胞株活性测试 测试方法；体外抗肿瘤活性测试方法 A、原理；活细胞粒体中的班巧脱氨酶能使外源性唾挫藍（MTT)还原为水不溶性的藍紫 色结晶甲琐并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚讽能溶解细胞中的甲琐，用酶联 免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
[0024] B、细胞；人宫颈癌化la细胞株（中国科学院上海生命科学院细胞库）。
[0025] C、实验步骤； (1)样品的准备；将乌司他了Img用40yL的DMSO溶解配置成25mg/mL的母液，再用DMEM培养基(每lOOOmL培养基中含80万单位青霉素，1.Og链霉素，10%灭活胎牛血清）连 续稀释成乌司他了浓度为 1000yg/mL、100yg/mL、10yg/mL、lyg/mL、0. 1yg/mL的样品 液。运用相同的方法制备5-氣尿喀晚浓度为1000yg/mL、100yg/mL、10yg/mL、lyg/mL、 0.1yg/mL的样品液。
[0026] (2)MIT试验；取对数生长期化la细胞一瓶，弃培养液，将细胞用邸TA-膜酶消化 液于37°C培养箱消化约15s，将消化后的细胞用DMEM培养基稀释成1X106个/mU加到96 孔细胞培养板中，每孔100yL。实验设空白对照组、实验对照组、阳性对照组（5-氣尿喀晚） 和乌司他了组，每组设3个平行孔，置37°C，5%C02培养箱中培养2化后，加入上述配制的样 品液，每孔100y以实验对照组只加培养液 ，与实验对照组平行不加细胞只加培养液的空白 对照组。置37°C，5%C02培养箱中培养7化后，在细胞培养孔中加入5mg/血的MTT溶液，每 孔10yL，置37°C解育化，加入DMS0,每孔150yL，用振荡器振荡，使甲膜完全溶解，用酶标 仪（XD-711，上海迅达医疗器械有限公司产品）在570nm波长下比色。W同样条件用不含样 品，含同样浓度DMS0的培养基培养的细胞作为对照。实验重复3次，取其平均值作为实验 结果。根据LOG口法计算样品对肿瘤细胞生长的半数抑制浓度（ICg。）。
[0027] 肿瘤细胞生长抑制率（CI) = [1-(乌司他了组0D值-空白对照组0D值）/( 实验对照组0D值-空白对照组0D值）]X100% D、实验结果；抗人宫颈癌化la细胞活性测试结果见表1所示。
[002引 表1
表1可W看出，按照抗肿瘤活性的评价标准(化合物ICw<10yg/mL则判断样品在体 外对肿瘤细胞有杀伤作用；ICw< 30yg/mL则判断样品在体外对肿瘤细胞有具有较强的 增殖抑制作用)，乌司他了对人宫颈癌化la细胞具有较强的增殖抑制作用，可用于治疗宫颈 癌。
[0029] 试验例二、本发明药物组合物抗人宫颈癌化la细胞活性测试 第一部分；体外抗肿瘤活性测试方法 1、细胞；人宫颈癌化la细胞株（中国科学院上海生命科学院细胞库)。
[0030] 2、样品的准备； 乌司他了组；乌司他了Img; 青富班醋组；青富班醋0. 4mg; 紫杉醇组；紫杉醇0. 26mg; 乌司他了 +青富班醋A组：乌司他了lmg+青富班醋0. 4mg; 乌司他了 +青富班醋B组：乌司他了lmg+青富班醋0.8mg; 乌司他了 +青富班醋C组：乌司他了lmg+青富班醋0. 05mg; 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇A组：乌司他了lmg+青富班醋0. 4mg+紫杉醇0. 26mg; 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇B组；乌司他了lmg+青富班醋0. 4mg+紫杉醇0. 5mg; 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇C组：乌司他了lmg+青富班醋0. 4mg+紫杉醇0.Olmg。
[0031] 参照试验例一的方法将（1)~ (9)各组配制成浓度为1000yg/mL、100yg/mL、 10yg/mL、lyg/mL、0. 1yg/mL的样品液。
[003引 3、MTT试验方法同验例一。
[0033] 4、实验结果；抗人宫颈癌化la细胞活性测试结果见表2所示。
[0034] 表 2
表1可W看出，按照抗肿瘤活性的评价标准(化合物吗。<10yg/mL则判断样品在体 外对肿瘤细胞有杀伤作用；ICw< 30yg/mL则判断样品在体外对肿瘤细胞有具有较强的增 殖抑制作用)，乌司他了 +青富班醋A组、B组和C组对人宫颈癌化la细胞具有较强的增殖 抑制作用，且明显强于乌司他了组、青富班醋组和紫杉醇组，说明乌司他了和青富班醋存在 协同作用，乌司他了 +青富班醋A组、B组和C组中W乌司他了 +青富班醋A组的增殖抑制 作用最强，说明乌司他了和青富班醋W重量比1: 0.4联用时协同作用最强，因此，乌司他 了和青富班醋的组合物可用于制备治疗宫颈癌的药物。
[0035] 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇A组、B组和C组对人宫颈癌化la细胞具有杀伤作 用，且明显强于乌司他了 +青富班醋A组、B组和C组，说明乌司他了、青富班醋和紫杉醇S 者之间存在协同作用；其中乌司他了 +青富班醋+紫杉醇A组抗人宫颈癌化la细胞活性作 用最强，说明乌司他了、青富班醋和紫杉醇W重量比1 : 0.4 : 0.26联用时协同作用最强， 因此，乌司他了、青富班醋和紫杉醇的组合物可用于制备治疗宫颈癌的药物。
[0036] 第二部分：动物实验 1材料与方法 1.1材料与试剂 人宫颈癌化la细胞株购自中国科学院上海生命科学院细胞库，RPMI-1640 (Gibco)、新 生小牛血清购自杭州四季春公司；突变系无特定病原体（SPF)级Ba化/c-nu小鼠80只，4~6 周龄、雌性、体重14~18g，由北京维痛利华实验动物技术公司提供[合格证；0093120 ;许可 证；SCXK(京）2007-0001]，于无菌屏蔽环境中饲养。
[0037] 1.2人宫颈癌裸鼠移植瘤治疗实验 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基于37°C、5%二氧化碳（C〇2)饱和湿度下培养； 细胞贴壁生长于培养基中，取对数生长期细胞用于实验。于裸鼠背部皮下注射化la细胞2Xl〇6个/只。待皮下移植瘤体积达75mm3时（约3〇d)，按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则 分为8组，每组10只。
[003引模型对照组；尾静脉注射等量的生理盐水； 乌司他了低量组；尾静脉注射Img/kg乌司他了； 乌司他了中量组；尾静脉注射5mg/kg乌司他了； 乌司他了高量组；尾静脉注射20mg/kg乌司他了； 青富班醋组；尾静脉注射8mg/kg; 紫杉醇组；尾静脉注射5. 2mg/kg; 乌司他了 +青富班醋组；尾静脉注射乌司他了20mg/kg+青富班醋8mg/kg; 乌司他了 +青富班醋+紫杉醇组；尾静脉注射乌司他了20mg/kg+青富班醋8mg/kg+紫 杉醇 5. 2mg/kg。
[0039] 隔日给药1次，共计8次，给药期间每4日用游标卡尺测量移植瘤最长径（L)和 最短径（W)。末次给药48h后脱白处死小鼠，切除移植瘤，称取瘤重。瘤重抑制率（%)IR= (1-实验组瘤重均值/对照组瘤重均值）X100%。通过瘤重的比较来体现药物对人宫颈癌 化la细胞裸鼠移植瘤生长的影响。
[0040] 1. 3统计学处理 数据W均数+标准差表示，采用SPSS15. 0软件进行方差分析。
[0041] 2 结果 试验结果表明（见表3): 表3本发明药物组合物对人宫颈癌化La细胞裸鼠移植瘤生长的影响
*与模型对照组相比，p<〇. 05 ; **与模型对照组相比，p<〇. 01 ; ##与乌司他了高量组相比，p<〇. 01 ; &&与紫杉醇组相比，p<〇.〇l。
[0042] 1)与模型对照组相比，乌司他了中量组、高剂量组对人宫颈癌化La细胞裸鼠 移植瘤生长的抑制作用均具有显著性差异；乌司他了低、中、高剂量组抑瘤率为20. 46%、 24. 30%、35. 55%，说明乌司他了能抑制人宫颈癌化La细胞裸鼠移植瘤生长，并呈剂量依赖 性。
[0043] 2)与乌司他了、紫杉醇和青富班醋各单药组相比，乌司他了和青富班醋药物组合 物对人宫颈癌化La细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用具有极显著性差异（p<0.01)，并具有 显著的协同作用。
[0044] 3)与乌司他了、紫杉醇和青富班醋各单药组相比，乌司他了、青富班醋和紫杉醇药 物组合物对人宫颈癌化La细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用具有极显著性差异（p<0.01)， 且与乌司他了 +青富班醋组相比，抑瘤率提高了约17%，表明该药物组合物在治疗宫颈癌方 面效果很好，并具有协同作用。
[0045] 4)本试验同时考察了各给药组的不良反应发生率，通过对试验小鼠毒副作用诸如 腹泻、精神萎靡等观察发现，与单独给药同剂量的乌司他了、青富班醋或紫杉醇相比，乌司 他了和青富班醋的药物组合物W及乌司他了、青富班醋和紫杉醇的药物组合物的不良反应 发生率降低约15%~20%。
[0046] W上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制，本发明的保护范围应当W权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可W做出若干改进和润饰，该些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 乌司他丁在制备治疗宫颈癌药物中的用途。2. -种治疗宫颈癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括乌司他丁和青蒿 琥酯。3. 如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中乌司他丁和青蒿 琥酯的重量比1 : (0. 〇1~〇. 8)。4. 如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中乌司他丁和青蒿 琥酯的重量比1 : 0.4。5. 如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括紫杉醇类药 物。6. 如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述紫杉醇类药物为紫杉醇。7. 如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述紫杉醇与乌司他丁的重量比为 (0. 01-0. 5) :Io8. 如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述紫杉醇与乌司他丁的重量比为 0?26:1〇9. 如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂。
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，具体公开了乌司他丁在制备治疗宫颈癌药物中的新用途，以及一种用于治疗宫颈癌的药物组合物。本发明药物组合物包括乌司他丁和青蒿琥酯，也还可以包括紫杉醇类药物，具体为紫杉醇。本发明药物组合物在抑制宫颈癌方面具有协同作用，且具有毒副作用低，抑癌效果明显等优点。
【IPC分类】A61K38/17, A61P15/00, A61P35/00, A61K31/337, A61K31/357
【公开号】CN104906558
【申请号】CN201510395846
【发明人】王旭, 郑少亮, 许文勤, 肖益热
【申请人】广东天普生化医药股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月8日
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