一种配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗的应用
一种配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药技术领域，是一种配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤的形成是肿瘤抗原免疫逃逸的结果，机体的免疫耐受和免疫抑制促进了肿瘤的生长和转移。如何能启动和增强肿瘤患者自身固有的免疫应答来抑制肿瘤，减少其逃逸免疫监视的可能性，是现代肿瘤治疗的主要目标。肿瘤免疫治疗是通过调动宿主的天然防卫机制，增强宿主的免疫防御效应，降低宿主的免疫抑制，来提高机体对肿瘤细胞的免疫应答能力，从而杀伤或抑制肿瘤细胞。目前该治疗方式已成为继手术、化疗、放疗之外的第四种重要的肿瘤治疗模式，具有治愈肿瘤的潜力。机体的免疫反应首先是由抗原提呈细胞(APC)捕获抗原，经其加工处理后将抗原信息传递给T、B淋巴细胞进而诱发一系列特异性免疫应答。因此，APC是机体免疫反应的首要环节，能否进行有效的抗原提呈直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导，其中树突状细胞是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞。近年来，以树突状细胞(dendritic cells, DC)为基础的肿瘤免疫治疗已成为国内外研宄的热点之一，越来越多的证据表明由DC激活的细胞免疫特别是T细胞介导的CTL反应在机体抗肿瘤中起着主导作用，而且最近DC疫苗的临床1、II期试验也取得了令人鼓舞的结果，显示出DC疫苗在肿瘤等疾病的治疗中的巨大前景，因此DC疫苗尤其是DC抗肿瘤疫苗的研宄和应用倍受人们的关注。
[0003]但现有树突状细胞肿瘤疫苗存在一定不足。用已知肿瘤抗原肽、肿瘤抗原蛋白、编码肿瘤抗原RNA、肿瘤细胞裂解液、肿瘤细胞提取物、凋亡肿瘤细胞等不同形式和来源的肿瘤抗原体外负载或冲击树突状细胞而制备的肿瘤疫苗均有报道。然而目前，已知的肿瘤特异性抗原种类非常有限，有恶性黑色素瘤细胞特异表达的MAR-Tl、MAGE-3、gplOO和酪氨酸酶，前列腺癌细胞表达前列腺特异膜抗原(PSMP)，低分化非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞表达独特型免疫球蛋白，肝癌细胞分泌的甲胎蛋白、结肠癌细胞分泌的癌胚抗原(CEA)等。应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种至荷瘤宿主，进行肿瘤免疫治疗，该方法制备的DC疫苗只针对某个个体有效，即特异性强，不具有通用性；技术难度高，且无法大量生产和保存，临床难以大规模应用；由于该方法仅能激活树突细胞活性，而不一定会完全使T细胞对肿瘤细胞有效识别，故其临床有效率并不高。另外一个潜在危险是其长期作用有可能会诱发机体的自身免疫反应，有报道，过量的DC回输会导致T细胞耗竭而免疫功能下调，或引发自身免疫病，而且这种方式也存在的MHC(主要组织相容性复合物)限制性，使得此类树突状细胞肿瘤疫苗的应用受到严重限制。要使DC肿瘤疫苗真正成为临床上能广泛应用的肿瘤疫苗还面临着各种桃战，如制备的最优方法以及接种的最佳程序还不完全清楚，这都将影响DC肿瘤疫苗的临床应用。
[0004]利用树突状细胞来进行肿瘤治疗的制剂方法已有部分报道。曾有专利(CN1340361 A)公开了一种脂质体异体、自体肿瘤疫苗的制备方法。其主要方法是取人新鲜肿瘤组织处理成细胞混悬后，进行碎裂和灭活，经过提取和纯化过程，将特定部分的多肽、蛋白作为内容物包裹在脂质体内部进行给药，预激发DC细胞。但该方法不仅处理过程繁琐，承载内容物的脂质体进入体内后，如何靶向树突状细胞并未能解决；而且即使找到该脂质体后，DC细胞能否进行有效的免疫应答的问题也未能回答。
[0005]也有专利(CN 101690805 A)公开了一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺。其采用薄膜分散法来制备纳米脂质体，以从兔红细胞膜中提取的a l，3Gal糖脂修饰脂质体，靶向树突状细胞表面的Toll样受体。该专利糖脂提取工艺复杂，对制剂表面修饰的配体和树突状细胞表面受体具有很强的限制性，不具有广泛适用性。
【发明内容】
[0006]有效的肿瘤主动免疫治疗需要将目的抗原肽靶向输送到树突状细胞内，才能诱导强烈的免疫应答，这一过程必须借助载体的协助才能完成，因此，如何构建对DC具有高度靶向性的投放载体是对提高肿瘤抗原的传递效率，启动和维持配体介导的免疫应答具有十分重要的意义。将在DC表面高度受体表达的单克隆抗体连接到纳米制剂表面，能高效地将抗原加载到MHC分子上并提呈给T淋巴细胞，从而增加其对DC的靶向性，提高肿瘤疫苗的有效性。本发明针对上述现有技术中的不足，提供了一种广泛适用、制备简单、具有高效性、通用性和靶向性的树突状细胞肿瘤疫苗的构建方法。
[0007]为解决上述问题，本发明采用的技术方案是:
[0008]通过将肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽-热休克蛋白复合物包载于Texosomes仿生体内，提高了肿瘤抗原和免疫刺激因子水平，进而改善了免疫诱导能力；通过在仿生体制备中加入正电荷脂质，提高了与细胞膜表面荷负电的树突状细胞的结合能力，进而改善了摄取率；通过对仿生体表面进行配体的修饰，提高了与树突状细胞表面DEC205受体、甘露糖受体或热休克蛋白受体的靶向效率，进而达到了增强疫苗免疫原性、克服肿瘤免疫逃逸的目的。经树突状细胞对该载体进行摄取、加工和处理后，将抗原信息提呈到细胞表面，进而实现T细胞对肿瘤抗原信息的识别，激活分化为具有特异性杀伤肿瘤细胞功能的细胞毒性T淋巴细胞，从而使机体产生主动免疫，消灭肿瘤细胞，达到对肿瘤的治疗作用。
[0009]本发明还提供了一种配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗载体的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤:
[0010](I)Texosomes 仿生体的制备。
[0011]Texosomes仿生体采用微乳-胶束层层组装法制备。W/0型微乳以质量比小于1:1的聚氧乙稀蓖麻油和磷脂为混合乳化剂，溶于乙醚中作为油相，质量浓度为Img?5mg/ml。肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽与热休克蛋白复合物溶于PBS中作为水相，质量浓度为50 μ g?lmg/ml，4°C?25°C，在磁力搅拌下将水相逐滴加入油相中，形成微乳，其中，水相与油相体积比小于1:5，优选比例是1:8?1:25。胶束层以二油酰基磷脂酰乙醇胺，氨基甲酰基胆固醇盐酸盐和胆固醇单琥珀酸酯作为脂质材料，至圆底烧瓶中，加入乙醚使之溶解，20°C?40°C减压成膜后，加入蒸馏水和乙醇的混合溶剂，于30°C?60°C水浴中水化后，制得胶束相。其中，水和乙醇体积比为1:1?8:1，优选比例是2:1?5:1。以上所述微乳中磷脂和胶束中二油酰基磷脂酰乙醇胺的质量比小于1:1，优选1:3?4:5。将胶束相加入到微乳相中，涡旋混合5-10min后，30°C?60°C减压蒸发除去有机溶剂，冰浴下探头超声2_10min，制得Texosomes仿生体，并于4°C密封保存。其中，胶束相与微乳相的体积比是1:15?1:3，优选1:10?1:5。
[0012](2) Texosomes仿生体表面配体的修饰。
[0013]Texosomes仿生体表面配体修饰的方法为:按步骤(I)方法形成Texosomes仿生体后，按胆固醇单琥珀酸酯(CHS):N-羟基丁二酰亚胺(NHS):碳二亚胺盐酸盐(EDC)=1:1?3:1?3的摩尔比进行投料，0°C?4°C反应12?24h后，透析除去过量的反应物NHS和EDC。取相等体积的透析内液与浓度为100-1000 μ g/ml的DEC205单克隆抗体的PBS溶液，在温度为0°C?4°C，孵化2?12小时，得到DEC205单克隆抗体修饰的Texosomes仿生体。其中，胆固醇单琥珀酸酯和DEC205单克隆抗体的质量比为50:1?5:1，得到配体介导的革巴向树突状细胞的Texosomes仿生体。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点如下:
[0015](I)本发明以Texosomes仿 生体作为传递载体包裹某种肿瘤的特异性或相关性抗原肽、通用型肿瘤抗原肽或其与佐剂热休克蛋白的复合物，以增强肿瘤疫苗中抗原和免疫刺激因子的水平。与游离抗原相比，可以有效避免抗原的降解和失活，具有更强的免疫原性，同时这类已知抗原肽纯度高，具有较强的免疫效率，此外没有无关抗原的存在，而减少了针对自身组织的自身免疫反应。
[0016](2)本发明所述的Texosomes仿生体表面修饰的配体为能与树突状细胞表面受体特异性结合的，如:DEC205受体、甘露糖受体、热休克蛋白受体等，能极大的提高DC对抗原的提呈能力。
[0017](3)本发明所述的配体介导的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗的传递载体能特异性靶向树突状细胞表面的特定受体，高效递呈抗原，并提供抗原递呈分子及免疫共刺激分子，从而调动、激活和扩增具有特异性杀伤肿瘤细胞功能的细胞毒性T淋巴细胞，诱发机体针对肿瘤抗原的高效免疫反应，同时可以产生长效性的记忆细胞、以达到长期、持续的抗肿瘤作用、防止肿瘤的复发。
[0018]通过下列实例举例说明本发明的具体制备方法，但本发明的保护范围，不局限于此。
[0019]说明书附图
[0020]图1:DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体模式图。
[0021]图2:DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体电镜图。
[0022]图3:DC 对 NBD-Tex 及 NBD-DEC205_Tex 摄取能力的比较。
[0023]图 4:DC 对 NBD-Tex 及 NBD-DEC205_Tex 的内化实验。
[0024]图5:经各组肿瘤疫苗治疗后荷瘤小鼠的肿瘤体积变化图。
[0025]—、配体介导的革E向树突状细胞的Texosomes仿生体的制备
[0026]实施例1:采用逆向蒸发法制备DEC205单抗耦联的纳米脂质体
[0027]精密称取30.0mg磷脂、5.0mg氨基甲酰基胆固醇盐酸盐、5.0mg胆固醇单琥珀酸酯，加入1ml 二氯甲烷使之溶解，在室温条件下缓慢滴入100 μ g/ml肿瘤抗原肽MAGE-3溶液作为水相，磁力搅拌lOmin，形成乳状液，涡旋混合3min后，在60°C水浴中旋蒸除去有机溶剂，待完全转相成水性液体后停止减压蒸发，滴加外水相搅拌30min充分水合，冰浴下探头超声5min后，按胆固醇单琥珀酸酯:N-羟基丁二酰亚胺:碳二亚胺盐酸盐摩尔比1:1.5:1.5投料，反应12h，透析除去过量的反应物。取透析内液1ml，加入100 μ g/ml的DEC-205单克隆抗体溶液Iml于0°C孵化，制得DEC205单抗耦联的纳米脂质体。得到DEC205单抗耦联的纳米脂质体平均粒径是223.lnm，包封率为32.31%。
[0028]实施例2:采用层层组装法制备DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体
[0029](I) Texosomes仿生体的制备
[0030]精密称取15.0mg磷脂和5.0mg聚氧乙烯蓖麻油，加入乙醚1ml使之溶解，25°C下缓慢滴入浓度为100 μ g/ml的通用型肿瘤抗原与热休克蛋白70的复合物hTERT-HSP70溶液1ml，制备微乳相。精密称取20.0mg 二油酰基磷脂酰乙醇胺DOPE和5.0mg DC-Chol和5.0mg胆固醇单琥珀酸酯CHS，加入乙醚5ml使之溶解，30°C减压蒸发成膜后，加入蒸馏水
1.5ml和乙醇0.5ml，并于50°C下水化，制备胶束相。将两相涡旋混合5min，50°C旋蒸除去有机溶剂，冰浴下探头超声5min后，制得Texosomes仿生体。
[0031](2) Texosomes仿生体表面配体的修饰
[0032]按CHS:NHS:EDC摩尔比1:1.5:1.5投料，4°C反应12h，透析除去过量的NHS和EDC，取透析内液1ml，加入浓度为100 μ g/ml的DEC-205单克隆抗体溶液Iml于4°C孵化4h，制得DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体，附图1为其模式图。其平均粒径是93.4nm，包封率为92.3%。可见，与逆向蒸发法制备配体介导的纳米脂质体相比，层层组装法制备的DEC205单抗親联的Texosomes仿生体具有更小的粒径和更高的包封率。
[0033]实施例3:
[0034](I) Texosomes仿生体的制备
[0035]精密称取10.0mg磷脂和8.0mg聚氧乙烯蓖麻油，加入乙醚1ml使之溶解，10°C下缓慢滴入浓度为500 μ g/ml的通用型肿瘤抗原与热休克蛋白gp96的复合物hTERT_gp96溶液0.5ml，制备微乳相。精密称取20.0mg 二油酰基磷脂酰乙醇胺DOPE和5.0mg DC-Chol和
5.0mg胆固醇单琥珀酸酯CHS，加入乙醚1ml使之溶解，20°C减压蒸发成膜后，加入蒸馏水0.8ml和乙醇0.2ml，并于40°C下水化，制备胶束相。将两相涡旋混合8min，40°C旋蒸除去有机溶剂，冰浴下探头超声3min后，制得Texosomes仿生体。
[0036](2) Texosomes仿生体表面配体的修饰
[0037]按CHS:NHS:EDC摩尔比1: 2:2投料，O°C反应24h，透析除去过量的NHS和EDC，取透析内液1ml，加入浓度为500 μ g/ml的DEC-205单克隆抗体溶液Iml于0°C孵化12h，制得DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体，包封率为89.9%。
[0038]实施例4:
[0039](I) Texosomes仿生体的制备
[0040]精密称取30.0mg磷脂和5.0mg聚氧乙烯蓖麻油，加入乙醚1ml使之溶解，4°C下缓慢滴入浓度为1000 μ g/ml的通用型肿瘤抗原hTERT溶液0.6ml，制备微乳相。精密称取90.0mg 二油酰基磷脂酰乙醇胺DOPE和10.0mg DC-Chol和5.0mg胆固醇单琥珀酸酯CHS，加入乙醚20ml使之溶解，40°C减压蒸发成膜后，加入蒸馏水1.2ml和乙醇0.6ml，并于60°C下水化，制备胶束相。将两相涡旋混合10min，60°C旋蒸除去有机溶剂，冰浴下探头超声1min后，制得Texosomes仿生体。
[0041](2) Texosomes仿生体表面配体的修饰
[0042]按CHS: NHS: EDC摩尔比1:3:3投料，4°C反应18h，透析除去过量的NHS和EDC，取透析内液1ml，加入浓度为1000 μ g/ml的DEC-205单克隆抗体溶液Iml于4°C孵化8h，制得DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体，包封率为86.8%。
[0043]二、配体介导的革El向树突状细胞的Texosomes仿生体的鉴定
[0044](以实施例2中制备的配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体进行鉴定)
[0045]1、形态考察
[0046]取DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体适量，加水稀释后滴加在覆盖碳膜的铜网表面，以质量分数2.0%的磷钨酸负染，自然干燥后于透射电子显微镜下观察仿生体形态和大小，所得仿生体粒径为90nm左右，结果如附图2所示；
[0047]2、对树突状细胞的靶向性考察
[0048]在实施例2的制备中，加入2mg荧光染色脂质NBD-PE，分别制备NBD-PE标记的Texosomes仿生体NBD-Tex及NBD-PE标记的DEC205单抗親联Texosomes仿生体NBD-DEC205-Tex。取对数生长期的DC细胞，以每孔5X 15个细胞浓度接种于6孔板，将细胞置于37°C，5% 0)2的培养箱中培养24h待细胞贴壁后，加入NBD-Tex及NBD-DEC205-Tex，37 °C下培养0.5h，lh, 4h，采用流式细胞仪检测其 荧光强度，比较NBD-Tex和NBD-DEC205-Tex对树突状细胞的靶向性。结果表明树突状细胞对NBD-Tex及NBD-DEC205-Tex的摄取量随时间的延长而增加，0.5h树突状细胞对NBD-DEC205_Tex的摄取率是NBD-Tex的5.64倍，Ih树突状细胞对NBD_DEC205_Tex的摄取率是NBD-Tex的5.32倍，4h树突状细胞对NBD-DEC205-Tex的摄取率是NBD-Tex的3.69倍，经过t检验分析，P〈0.05，两者具有显著性差异，表明DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体对树突状细胞具有靶向性。
[0049]3、细胞摄取机制考察
[0050]将DC细胞以2.5X105cells/well接种于铺有载玻片的6孔板中，置于5% 0)2培养箱37°C培养24h后，分别加入NBD-Tex及NBD-DEC205_Tex，培养0.5h、lh、4h后，取出培养板用PBS清洗，置于摇床中避光振荡1min清洗3次，用500 μ I 4%的多聚甲醛固定细胞30min后，用PBS清洗。加入Hoechst 33258染料对细胞核染色，再用PBS清洗。取干净载玻片滴加50%甘油适量，用镊子夹住轻轻取出，保证有细胞面朝下缓慢放于载玻片上，封片后于激光共聚焦显微镜下拍照观察，比较NBD-Tex及NBD-DEC205-Tex在DC内的分布情况，以此推断摄取进入DC细胞的机理(DC细胞核染色后为蓝色荧光，NBD-PE为绿色荧光)。结果表明:0.5h、lh、4h时，NBD-Tex组只见蓝色荧光和微弱绿色荧光，而NBD_DEC205_Tex组随着时间延长，DC细胞核处绿色荧光显著增强，证明DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体是以胞吞形式被DC摄取进入细胞核，且摄取量具有时间依懒性。结果如附图4所示；
[0051]4、肿瘤攻击实验
[0052]将H22肿瘤细胞悬液接种于雄性BALB/c鼠右腋皮下，建立H22实体瘤模型，7天后100%成瘤，可见并触及肿瘤。将荷瘤小鼠分4组，每组10只，分别给予生理盐水作为对照组、hTERT-HSP70复合物溶液、Texosomes仿生体及DEC205单抗親联的Texosomes仿生体为实验组，于7、14、21天皮下注射进行免疫。分别于7、11、14、18、21、25、28天用游标卡尺测量肿瘤的长径a和短径b，计算肿瘤体积V= l/2XaXb2，并绘制肿瘤生长曲线。由附图5可见，生理盐水组肿瘤生长迅速，hTERT-HSP70复合物溶液与Texosomes仿生体组均具有一定减慢肿瘤生长的作用，相对以上三组，DEC205单抗親联的Texosomes仿生体组能够明显抑制肿瘤的生长。证明本专利构建的配体介导的革G向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗载体具有明确的肿瘤治疗作用。
【主权项】
1.一种靶向树突状细胞的肿瘤疫苗，其特征在于，通过将肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽-热休克蛋白复合物包载于Texosomes仿生体内，提高了肿瘤抗原和免疫刺激因子水平，进而改善了免疫诱导能力；通过在仿生体制备中加入正电荷脂质，提高了与荷负电的树突状细胞的结合能力，进而提高了摄取率；通过对仿生体进行配体的修饰，提高了与树突状细胞表面DEC205受体、甘露糖受体或热休克蛋白受体的靶向效率，进而达到了增强疫苗免疫原性、克服肿瘤免疫逃逸的目的，经树突状细胞对该载体进行摄取、加工和处理后，将抗原信息提呈到细胞表面，进而实现T细胞对肿瘤抗原信息的识别，激活分化为具有特异性杀伤肿瘤细胞功能的细胞毒性T淋巴细胞，从而使机体产生主动免疫，消灭肿瘤细胞，达到对肿瘤的治疗作用。2.根据权利要求1所述的靶向树突状细胞的肿瘤疫苗，其特征在于，所述的肿瘤抗原是某种肿瘤的特异性或相关性抗原肽、或是通用型肿瘤抗原肽；所述的热休克蛋白具有分子伴侣活性，能够参与蛋白复合体组装、转运、抗原处理、蛋白定位等生物学过程，包括HSP110/grpl70、gp96/grp94、HSP90、HSP70/grp78、HSP65、HSP25/27 等，最佳为 HSP70。3.一种构建权利要求1或2所述的靶向树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (I)Texosomes仿生体的制备； (2)Texosomes仿生体表面配体的修饰。4.根据权利要求3所述的靶向树突状细胞肿瘤疫苗的构建方法，其特征在于， 步骤(I)中所述的Texosomes仿生体采用微乳-胶束层层组装法制备: 所述的微乳为W/0型微乳，并通过如下方法制备:以质量比小于1:1的聚氧乙烯蓖麻油和磷脂为混合乳化剂，溶于乙醚中作为油相，质量浓度为Img?5mg/ml ； 以肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽与热休克蛋白复合物，溶于PBS中作为水相，质量浓度为50μδ?lmg/ml，4°C?25°C，在磁力搅拌下将水相逐滴加入油相中，形成微乳，其中，水相与油相体积比小于1:5 ; 所述的胶束层通过如下方法制备:以二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，氨基甲酰基胆固醇盐酸盐(DC-Chol)和胆固醇单琥珀酸酯(CHS)作为脂质材料，至圆底烧瓶中，加入乙醚使之溶解，20°C?400C减压成膜后，加入蒸馏水和乙醇的混合溶剂，于30°C -60 V水浴中水化后，制得胶束相，其中，水和乙醇体积比为1:1?8:1 ; 将胶束相加入到微乳相中，涡旋混合5-10 min后，30°C _60°C减压蒸发除去有机溶剂，冰浴下探头超声2-10 min，制得Texosomes仿生体；微乳中PC和胶束中DOPE的质量比小于1: 1，优选1:3?4:5 ; 胶束相与微乳相的液体体积比是1:15?1: 3，优选1:10?1: 5。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，微乳中水相与油相体积比为1:8?1:25ο6.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，胶束中水和乙醇的体积比为2:1?5:1。7.根据权利要求4-6任何一项所述的靶向树突状细胞肿瘤疫苗的构建方法，其特征在于，Texosomes仿生体表面配体修饰的方法为:按步骤(I)方法形成Texosomes仿生体后，按胆固醇单琥珀酸酯(CHS): N-羟基丁二酰亚胺(NHS):碳二亚胺盐酸盐(EDC) =1:1?3:1?3的摩尔比进行投料，0°C?4°C反应4-24h后，透析除去过量的反应物NHS和EDC，取相等体积的透析内液与浓度为lOO-lOOOPg/ml的DEC205单克隆抗体溶液，在温度为0°C?4°C，孵化2?12小时，得到DEC205单克隆抗体修饰的Texosomes仿生体。8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，胆固醇单琥珀酸酯CHS和DEC205单克隆抗体的质量比为50:1?5:1。9.权利要求1或2所述的靶向树突状细胞的肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，是一种配体介导的靶向树突状细胞的纳米制剂作为肿瘤疫苗载体的构建方法。本发明是将肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽与热休克蛋白形成的复合物包载于配体修饰的纳米制剂中，该配体是能与树突状细胞表面受体特异性结合的抗体，从而特异性靶向树突状细胞，并通过树突状细胞对纳米制剂的摄取、加工和处理，将抗原信息提呈到细胞表面，进而实现特异性细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤抗原信息的识别，使机体产生主动免疫，消灭肿瘤细胞，达到对肿瘤的治疗作用。本发明提供的纳米制剂肿瘤疫苗的制备方法设计合理、制备简单，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61K39/00, A61K9/127, A61P35/00, A61K47/14, A61K39/39, A61K47/18, A61K47/24
【公开号】CN104906567
【申请号】CN201510305035
【发明人】李可欣, 常莎莎, 陈大为, 王中彦
【申请人】沈阳药科大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月4日
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药技术领域，是一种配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤的形成是肿瘤抗原免疫逃逸的结果，机体的免疫耐受和免疫抑制促进了肿瘤的生长和转移。如何能启动和增强肿瘤患者自身固有的免疫应答来抑制肿瘤，减少其逃逸免疫监视的可能性，是现代肿瘤治疗的主要目标。肿瘤免疫治疗是通过调动宿主的天然防卫机制，增强宿主的免疫防御效应，降低宿主的免疫抑制，来提高机体对肿瘤细胞的免疫应答能力，从而杀伤或抑制肿瘤细胞。目前该治疗方式已成为继手术、化疗、放疗之外的第四种重要的肿瘤治疗模式，具有治愈肿瘤的潜力。机体的免疫反应首先是由抗原提呈细胞(APC)捕获抗原，经其加工处理后将抗原信息传递给T、B淋巴细胞进而诱发一系列特异性免疫应答。因此，APC是机体免疫反应的首要环节，能否进行有效的抗原提呈直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导，其中树突状细胞是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞。近年来，以树突状细胞(dendritic cells, DC)为基础的肿瘤免疫治疗已成为国内外研宄的热点之一，越来越多的证据表明由DC激活的细胞免疫特别是T细胞介导的CTL反应在机体抗肿瘤中起着主导作用，而且最近DC疫苗的临床1、II期试验也取得了令人鼓舞的结果，显示出DC疫苗在肿瘤等疾病的治疗中的巨大前景，因此DC疫苗尤其是DC抗肿瘤疫苗的研宄和应用倍受人们的关注。
[0003]但现有树突状细胞肿瘤疫苗存在一定不足。用已知肿瘤抗原肽、肿瘤抗原蛋白、编码肿瘤抗原RNA、肿瘤细胞裂解液、肿瘤细胞提取物、凋亡肿瘤细胞等不同形式和来源的肿瘤抗原体外负载或冲击树突状细胞而制备的肿瘤疫苗均有报道。然而目前，已知的肿瘤特异性抗原种类非常有限，有恶性黑色素瘤细胞特异表达的MAR-Tl、MAGE-3、gplOO和酪氨酸酶，前列腺癌细胞表达前列腺特异膜抗原(PSMP)，低分化非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞表达独特型免疫球蛋白，肝癌细胞分泌的甲胎蛋白、结肠癌细胞分泌的癌胚抗原(CEA)等。应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种至荷瘤宿主，进行肿瘤免疫治疗，该方法制备的DC疫苗只针对某个个体有效，即特异性强，不具有通用性；技术难度高，且无法大量生产和保存，临床难以大规模应用；由于该方法仅能激活树突细胞活性，而不一定会完全使T细胞对肿瘤细胞有效识别，故其临床有效率并不高。另外一个潜在危险是其长期作用有可能会诱发机体的自身免疫反应，有报道，过量的DC回输会导致T细胞耗竭而免疫功能下调，或引发自身免疫病，而且这种方式也存在的MHC(主要组织相容性复合物)限制性，使得此类树突状细胞肿瘤疫苗的应用受到严重限制。要使DC肿瘤疫苗真正成为临床上能广泛应用的肿瘤疫苗还面临着各种桃战，如制备的最优方法以及接种的最佳程序还不完全清楚，这都将影响DC肿瘤疫苗的临床应用。
[0004]利用树突状细胞来进行肿瘤治疗的制剂方法已有部分报道。曾有专利(CN1340361 A)公开了一种脂质体异体、自体肿瘤疫苗的制备方法。其主要方法是取人新鲜肿瘤组织处理成细胞混悬后，进行碎裂和灭活，经过提取和纯化过程，将特定部分的多肽、蛋白作为内容物包裹在脂质体内部进行给药，预激发DC细胞。但该方法不仅处理过程繁琐，承载内容物的脂质体进入体内后，如何靶向树突状细胞并未能解决；而且即使找到该脂质体后，DC细胞能否进行有效的免疫应答的问题也未能回答。
[0005]也有专利(CN 101690805 A)公开了一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺。其采用薄膜分散法来制备纳米脂质体，以从兔红细胞膜中提取的a l，3Gal糖脂修饰脂质体，靶向树突状细胞表面的Toll样受体。该专利糖脂提取工艺复杂，对制剂表面修饰的配体和树突状细胞表面受体具有很强的限制性，不具有广泛适用性。
【发明内容】
[0006]有效的肿瘤主动免疫治疗需要将目的抗原肽靶向输送到树突状细胞内，才能诱导强烈的免疫应答，这一过程必须借助载体的协助才能完成，因此，如何构建对DC具有高度靶向性的投放载体是对提高肿瘤抗原的传递效率，启动和维持配体介导的免疫应答具有十分重要的意义。将在DC表面高度受体表达的单克隆抗体连接到纳米制剂表面，能高效地将抗原加载到MHC分子上并提呈给T淋巴细胞，从而增加其对DC的靶向性，提高肿瘤疫苗的有效性。本发明针对上述现有技术中的不足，提供了一种广泛适用、制备简单、具有高效性、通用性和靶向性的树突状细胞肿瘤疫苗的构建方法。
[0007]为解决上述问题，本发明采用的技术方案是:
[0008]通过将肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽-热休克蛋白复合物包载于Texosomes仿生体内，提高了肿瘤抗原和免疫刺激因子水平，进而改善了免疫诱导能力；通过在仿生体制备中加入正电荷脂质，提高了与细胞膜表面荷负电的树突状细胞的结合能力，进而改善了摄取率；通过对仿生体表面进行配体的修饰，提高了与树突状细胞表面DEC205受体、甘露糖受体或热休克蛋白受体的靶向效率，进而达到了增强疫苗免疫原性、克服肿瘤免疫逃逸的目的。经树突状细胞对该载体进行摄取、加工和处理后，将抗原信息提呈到细胞表面，进而实现T细胞对肿瘤抗原信息的识别，激活分化为具有特异性杀伤肿瘤细胞功能的细胞毒性T淋巴细胞，从而使机体产生主动免疫，消灭肿瘤细胞，达到对肿瘤的治疗作用。
[0009]本发明还提供了一种配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗载体的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤:
[0010](I)Texosomes 仿生体的制备。
[0011]Texosomes仿生体采用微乳-胶束层层组装法制备。W/0型微乳以质量比小于1:1的聚氧乙稀蓖麻油和磷脂为混合乳化剂，溶于乙醚中作为油相，质量浓度为Img?5mg/ml。肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽与热休克蛋白复合物溶于PBS中作为水相，质量浓度为50 μ g?lmg/ml，4°C?25°C，在磁力搅拌下将水相逐滴加入油相中，形成微乳，其中，水相与油相体积比小于1:5，优选比例是1:8?1:25。胶束层以二油酰基磷脂酰乙醇胺，氨基甲酰基胆固醇盐酸盐和胆固醇单琥珀酸酯作为脂质材料，至圆底烧瓶中，加入乙醚使之溶解，20°C?40°C减压成膜后，加入蒸馏水和乙醇的混合溶剂，于30°C?60°C水浴中水化后，制得胶束相。其中，水和乙醇体积比为1:1?8:1，优选比例是2:1?5:1。以上所述微乳中磷脂和胶束中二油酰基磷脂酰乙醇胺的质量比小于1:1，优选1:3?4:5。将胶束相加入到微乳相中，涡旋混合5-10min后，30°C?60°C减压蒸发除去有机溶剂，冰浴下探头超声2_10min，制得Texosomes仿生体，并于4°C密封保存。其中，胶束相与微乳相的体积比是1:15?1:3，优选1:10?1:5。
[0012](2) Texosomes仿生体表面配体的修饰。
[0013]Texosomes仿生体表面配体修饰的方法为:按步骤(I)方法形成Texosomes仿生体后，按胆固醇单琥珀酸酯(CHS):N-羟基丁二酰亚胺(NHS):碳二亚胺盐酸盐(EDC)=1:1?3:1?3的摩尔比进行投料，0°C?4°C反应12?24h后，透析除去过量的反应物NHS和EDC。取相等体积的透析内液与浓度为100-1000 μ g/ml的DEC205单克隆抗体的PBS溶液，在温度为0°C?4°C，孵化2?12小时，得到DEC205单克隆抗体修饰的Texosomes仿生体。其中，胆固醇单琥珀酸酯和DEC205单克隆抗体的质量比为50:1?5:1，得到配体介导的革巴向树突状细胞的Texosomes仿生体。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点如下:
[0015](I)本发明以Texosomes仿 生体作为传递载体包裹某种肿瘤的特异性或相关性抗原肽、通用型肿瘤抗原肽或其与佐剂热休克蛋白的复合物，以增强肿瘤疫苗中抗原和免疫刺激因子的水平。与游离抗原相比，可以有效避免抗原的降解和失活，具有更强的免疫原性，同时这类已知抗原肽纯度高，具有较强的免疫效率，此外没有无关抗原的存在，而减少了针对自身组织的自身免疫反应。
[0016](2)本发明所述的Texosomes仿生体表面修饰的配体为能与树突状细胞表面受体特异性结合的，如:DEC205受体、甘露糖受体、热休克蛋白受体等，能极大的提高DC对抗原的提呈能力。
[0017](3)本发明所述的配体介导的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗的传递载体能特异性靶向树突状细胞表面的特定受体，高效递呈抗原，并提供抗原递呈分子及免疫共刺激分子，从而调动、激活和扩增具有特异性杀伤肿瘤细胞功能的细胞毒性T淋巴细胞，诱发机体针对肿瘤抗原的高效免疫反应，同时可以产生长效性的记忆细胞、以达到长期、持续的抗肿瘤作用、防止肿瘤的复发。
[0018]通过下列实例举例说明本发明的具体制备方法，但本发明的保护范围，不局限于此。
[0019]说明书附图
[0020]图1:DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体模式图。
[0021]图2:DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体电镜图。
[0022]图3:DC 对 NBD-Tex 及 NBD-DEC205_Tex 摄取能力的比较。
[0023]图 4:DC 对 NBD-Tex 及 NBD-DEC205_Tex 的内化实验。
[0024]图5:经各组肿瘤疫苗治疗后荷瘤小鼠的肿瘤体积变化图。
[0025]—、配体介导的革E向树突状细胞的Texosomes仿生体的制备
[0026]实施例1:采用逆向蒸发法制备DEC205单抗耦联的纳米脂质体
[0027]精密称取30.0mg磷脂、5.0mg氨基甲酰基胆固醇盐酸盐、5.0mg胆固醇单琥珀酸酯，加入1ml 二氯甲烷使之溶解，在室温条件下缓慢滴入100 μ g/ml肿瘤抗原肽MAGE-3溶液作为水相，磁力搅拌lOmin，形成乳状液，涡旋混合3min后，在60°C水浴中旋蒸除去有机溶剂，待完全转相成水性液体后停止减压蒸发，滴加外水相搅拌30min充分水合，冰浴下探头超声5min后，按胆固醇单琥珀酸酯:N-羟基丁二酰亚胺:碳二亚胺盐酸盐摩尔比1:1.5:1.5投料，反应12h，透析除去过量的反应物。取透析内液1ml，加入100 μ g/ml的DEC-205单克隆抗体溶液Iml于0°C孵化，制得DEC205单抗耦联的纳米脂质体。得到DEC205单抗耦联的纳米脂质体平均粒径是223.lnm，包封率为32.31%。
[0028]实施例2:采用层层组装法制备DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体
[0029](I) Texosomes仿生体的制备
[0030]精密称取15.0mg磷脂和5.0mg聚氧乙烯蓖麻油，加入乙醚1ml使之溶解，25°C下缓慢滴入浓度为100 μ g/ml的通用型肿瘤抗原与热休克蛋白70的复合物hTERT-HSP70溶液1ml，制备微乳相。精密称取20.0mg 二油酰基磷脂酰乙醇胺DOPE和5.0mg DC-Chol和5.0mg胆固醇单琥珀酸酯CHS，加入乙醚5ml使之溶解，30°C减压蒸发成膜后，加入蒸馏水
1.5ml和乙醇0.5ml，并于50°C下水化，制备胶束相。将两相涡旋混合5min，50°C旋蒸除去有机溶剂，冰浴下探头超声5min后，制得Texosomes仿生体。
[0031](2) Texosomes仿生体表面配体的修饰
[0032]按CHS:NHS:EDC摩尔比1:1.5:1.5投料，4°C反应12h，透析除去过量的NHS和EDC，取透析内液1ml，加入浓度为100 μ g/ml的DEC-205单克隆抗体溶液Iml于4°C孵化4h，制得DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体，附图1为其模式图。其平均粒径是93.4nm，包封率为92.3%。可见，与逆向蒸发法制备配体介导的纳米脂质体相比，层层组装法制备的DEC205单抗親联的Texosomes仿生体具有更小的粒径和更高的包封率。
[0033]实施例3:
[0034](I) Texosomes仿生体的制备
[0035]精密称取10.0mg磷脂和8.0mg聚氧乙烯蓖麻油，加入乙醚1ml使之溶解，10°C下缓慢滴入浓度为500 μ g/ml的通用型肿瘤抗原与热休克蛋白gp96的复合物hTERT_gp96溶液0.5ml，制备微乳相。精密称取20.0mg 二油酰基磷脂酰乙醇胺DOPE和5.0mg DC-Chol和
5.0mg胆固醇单琥珀酸酯CHS，加入乙醚1ml使之溶解，20°C减压蒸发成膜后，加入蒸馏水0.8ml和乙醇0.2ml，并于40°C下水化，制备胶束相。将两相涡旋混合8min，40°C旋蒸除去有机溶剂，冰浴下探头超声3min后，制得Texosomes仿生体。
[0036](2) Texosomes仿生体表面配体的修饰
[0037]按CHS:NHS:EDC摩尔比1: 2:2投料，O°C反应24h，透析除去过量的NHS和EDC，取透析内液1ml，加入浓度为500 μ g/ml的DEC-205单克隆抗体溶液Iml于0°C孵化12h，制得DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体，包封率为89.9%。
[0038]实施例4:
[0039](I) Texosomes仿生体的制备
[0040]精密称取30.0mg磷脂和5.0mg聚氧乙烯蓖麻油，加入乙醚1ml使之溶解，4°C下缓慢滴入浓度为1000 μ g/ml的通用型肿瘤抗原hTERT溶液0.6ml，制备微乳相。精密称取90.0mg 二油酰基磷脂酰乙醇胺DOPE和10.0mg DC-Chol和5.0mg胆固醇单琥珀酸酯CHS，加入乙醚20ml使之溶解，40°C减压蒸发成膜后，加入蒸馏水1.2ml和乙醇0.6ml，并于60°C下水化，制备胶束相。将两相涡旋混合10min，60°C旋蒸除去有机溶剂，冰浴下探头超声1min后，制得Texosomes仿生体。
[0041](2) Texosomes仿生体表面配体的修饰
[0042]按CHS: NHS: EDC摩尔比1:3:3投料，4°C反应18h，透析除去过量的NHS和EDC，取透析内液1ml，加入浓度为1000 μ g/ml的DEC-205单克隆抗体溶液Iml于4°C孵化8h，制得DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体，包封率为86.8%。
[0043]二、配体介导的革El向树突状细胞的Texosomes仿生体的鉴定
[0044](以实施例2中制备的配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体进行鉴定)
[0045]1、形态考察
[0046]取DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体适量，加水稀释后滴加在覆盖碳膜的铜网表面，以质量分数2.0%的磷钨酸负染，自然干燥后于透射电子显微镜下观察仿生体形态和大小，所得仿生体粒径为90nm左右，结果如附图2所示；
[0047]2、对树突状细胞的靶向性考察
[0048]在实施例2的制备中，加入2mg荧光染色脂质NBD-PE，分别制备NBD-PE标记的Texosomes仿生体NBD-Tex及NBD-PE标记的DEC205单抗親联Texosomes仿生体NBD-DEC205-Tex。取对数生长期的DC细胞，以每孔5X 15个细胞浓度接种于6孔板，将细胞置于37°C，5% 0)2的培养箱中培养24h待细胞贴壁后，加入NBD-Tex及NBD-DEC205-Tex，37 °C下培养0.5h，lh, 4h，采用流式细胞仪检测其 荧光强度，比较NBD-Tex和NBD-DEC205-Tex对树突状细胞的靶向性。结果表明树突状细胞对NBD-Tex及NBD-DEC205-Tex的摄取量随时间的延长而增加，0.5h树突状细胞对NBD-DEC205_Tex的摄取率是NBD-Tex的5.64倍，Ih树突状细胞对NBD_DEC205_Tex的摄取率是NBD-Tex的5.32倍，4h树突状细胞对NBD-DEC205-Tex的摄取率是NBD-Tex的3.69倍，经过t检验分析，P〈0.05，两者具有显著性差异，表明DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体对树突状细胞具有靶向性。
[0049]3、细胞摄取机制考察
[0050]将DC细胞以2.5X105cells/well接种于铺有载玻片的6孔板中，置于5% 0)2培养箱37°C培养24h后，分别加入NBD-Tex及NBD-DEC205_Tex，培养0.5h、lh、4h后，取出培养板用PBS清洗，置于摇床中避光振荡1min清洗3次，用500 μ I 4%的多聚甲醛固定细胞30min后，用PBS清洗。加入Hoechst 33258染料对细胞核染色，再用PBS清洗。取干净载玻片滴加50%甘油适量，用镊子夹住轻轻取出，保证有细胞面朝下缓慢放于载玻片上，封片后于激光共聚焦显微镜下拍照观察，比较NBD-Tex及NBD-DEC205-Tex在DC内的分布情况，以此推断摄取进入DC细胞的机理(DC细胞核染色后为蓝色荧光，NBD-PE为绿色荧光)。结果表明:0.5h、lh、4h时，NBD-Tex组只见蓝色荧光和微弱绿色荧光，而NBD_DEC205_Tex组随着时间延长，DC细胞核处绿色荧光显著增强，证明DEC205单抗耦联的Texosomes仿生体是以胞吞形式被DC摄取进入细胞核，且摄取量具有时间依懒性。结果如附图4所示；
[0051]4、肿瘤攻击实验
[0052]将H22肿瘤细胞悬液接种于雄性BALB/c鼠右腋皮下，建立H22实体瘤模型，7天后100%成瘤，可见并触及肿瘤。将荷瘤小鼠分4组，每组10只，分别给予生理盐水作为对照组、hTERT-HSP70复合物溶液、Texosomes仿生体及DEC205单抗親联的Texosomes仿生体为实验组，于7、14、21天皮下注射进行免疫。分别于7、11、14、18、21、25、28天用游标卡尺测量肿瘤的长径a和短径b，计算肿瘤体积V= l/2XaXb2，并绘制肿瘤生长曲线。由附图5可见，生理盐水组肿瘤生长迅速，hTERT-HSP70复合物溶液与Texosomes仿生体组均具有一定减慢肿瘤生长的作用，相对以上三组，DEC205单抗親联的Texosomes仿生体组能够明显抑制肿瘤的生长。证明本专利构建的配体介导的革G向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗载体具有明确的肿瘤治疗作用。
【主权项】
1.一种靶向树突状细胞的肿瘤疫苗，其特征在于，通过将肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽-热休克蛋白复合物包载于Texosomes仿生体内，提高了肿瘤抗原和免疫刺激因子水平，进而改善了免疫诱导能力；通过在仿生体制备中加入正电荷脂质，提高了与荷负电的树突状细胞的结合能力，进而提高了摄取率；通过对仿生体进行配体的修饰，提高了与树突状细胞表面DEC205受体、甘露糖受体或热休克蛋白受体的靶向效率，进而达到了增强疫苗免疫原性、克服肿瘤免疫逃逸的目的，经树突状细胞对该载体进行摄取、加工和处理后，将抗原信息提呈到细胞表面，进而实现T细胞对肿瘤抗原信息的识别，激活分化为具有特异性杀伤肿瘤细胞功能的细胞毒性T淋巴细胞，从而使机体产生主动免疫，消灭肿瘤细胞，达到对肿瘤的治疗作用。2.根据权利要求1所述的靶向树突状细胞的肿瘤疫苗，其特征在于，所述的肿瘤抗原是某种肿瘤的特异性或相关性抗原肽、或是通用型肿瘤抗原肽；所述的热休克蛋白具有分子伴侣活性，能够参与蛋白复合体组装、转运、抗原处理、蛋白定位等生物学过程，包括HSP110/grpl70、gp96/grp94、HSP90、HSP70/grp78、HSP65、HSP25/27 等，最佳为 HSP70。3.一种构建权利要求1或2所述的靶向树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (I)Texosomes仿生体的制备； (2)Texosomes仿生体表面配体的修饰。4.根据权利要求3所述的靶向树突状细胞肿瘤疫苗的构建方法，其特征在于， 步骤(I)中所述的Texosomes仿生体采用微乳-胶束层层组装法制备: 所述的微乳为W/0型微乳，并通过如下方法制备:以质量比小于1:1的聚氧乙烯蓖麻油和磷脂为混合乳化剂，溶于乙醚中作为油相，质量浓度为Img?5mg/ml ； 以肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽与热休克蛋白复合物，溶于PBS中作为水相，质量浓度为50μδ?lmg/ml，4°C?25°C，在磁力搅拌下将水相逐滴加入油相中，形成微乳，其中，水相与油相体积比小于1:5 ; 所述的胶束层通过如下方法制备:以二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，氨基甲酰基胆固醇盐酸盐(DC-Chol)和胆固醇单琥珀酸酯(CHS)作为脂质材料，至圆底烧瓶中，加入乙醚使之溶解，20°C?400C减压成膜后，加入蒸馏水和乙醇的混合溶剂，于30°C -60 V水浴中水化后，制得胶束相，其中，水和乙醇体积比为1:1?8:1 ; 将胶束相加入到微乳相中，涡旋混合5-10 min后，30°C _60°C减压蒸发除去有机溶剂，冰浴下探头超声2-10 min，制得Texosomes仿生体；微乳中PC和胶束中DOPE的质量比小于1: 1，优选1:3?4:5 ; 胶束相与微乳相的液体体积比是1:15?1: 3，优选1:10?1: 5。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，微乳中水相与油相体积比为1:8?1:25ο6.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，胶束中水和乙醇的体积比为2:1?5:1。7.根据权利要求4-6任何一项所述的靶向树突状细胞肿瘤疫苗的构建方法，其特征在于，Texosomes仿生体表面配体修饰的方法为:按步骤(I)方法形成Texosomes仿生体后，按胆固醇单琥珀酸酯(CHS): N-羟基丁二酰亚胺(NHS):碳二亚胺盐酸盐(EDC) =1:1?3:1?3的摩尔比进行投料，0°C?4°C反应4-24h后，透析除去过量的反应物NHS和EDC，取相等体积的透析内液与浓度为lOO-lOOOPg/ml的DEC205单克隆抗体溶液，在温度为0°C?4°C，孵化2?12小时，得到DEC205单克隆抗体修饰的Texosomes仿生体。8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，胆固醇单琥珀酸酯CHS和DEC205单克隆抗体的质量比为50:1?5:1。9.权利要求1或2所述的靶向树突状细胞的肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，是一种配体介导的靶向树突状细胞的纳米制剂作为肿瘤疫苗载体的构建方法。本发明是将肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽与热休克蛋白形成的复合物包载于配体修饰的纳米制剂中，该配体是能与树突状细胞表面受体特异性结合的抗体，从而特异性靶向树突状细胞，并通过树突状细胞对纳米制剂的摄取、加工和处理，将抗原信息提呈到细胞表面，进而实现特异性细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤抗原信息的识别，使机体产生主动免疫，消灭肿瘤细胞，达到对肿瘤的治疗作用。本发明提供的纳米制剂肿瘤疫苗的制备方法设计合理、制备简单，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61K39/00, A61K9/127, A61P35/00, A61K47/14, A61K39/39, A61K47/18, A61K47/24
【公开号】CN104906567
【申请号】CN201510305035
【发明人】李可欣, 常莎莎, 陈大为, 王中彦
【申请人】沈阳药科大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月4日
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