一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗的制作方法
一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种罗非鱼无乳链球菌病的预防用疫苗，具体设及该疫苗所用菌株， 疫苗的制备，免疫剂量，免疫程序和免疫方法。
【背景技术】
[0002] 无乳链球菌是水产养殖中常见的一种病原菌，可危害不同品种的鱼类，如罗非 鱼、妒鱼、錯鱼、觸、石斑鱼等，其中W罗非鱼无乳链球菌病最为严重值uremdezetal， 2004Jafaretal，2008;Amaletal，2012)。该病造成极高死亡率，每年给水产业造 成巨额经济损失（Wangetal，2014)。中国是世界罗非鱼第一大国，产量约占世界总产 量的45 %。2009-2014连续6年，链球菌病在中国罗非鱼养殖大面积暴发流行，发病区 域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增，易感罗非鱼规格范围逐年扩大，累计死亡率高达 30%-90%，同时研究发现90%W上临床菌株为无乳链球菌（化enetal，2012)。
[0003] 目前该病的控制主要依靠抗生素等化学药物，但该方法有诸多负面作用，大量抗 生素的使用及其在鱼体内的积累，可对环境、潜在的食品安全危害和人类公众健康均有危 害（Baqueroetal，2008;Sunetal，2014)。同时调查研究显示，随着抗药和耐药性的产 生，近3年中国罗非鱼养殖很难找到可W控制无乳链球菌病的有效药物。而免疫接种是用 于控制无乳链球菌病最理想的方法之一（Darwishetal，2007)。目前，无乳链球菌较成 功疫苗有两类：第一类是利用无乳链球菌菌体和胞外产物制备的灭活疫苗，该疫苗已被证 实效果很好（Evansetal，2004;Pasniketal，2005);另一类是亚单位疫苗，也有效好的 免疫保护力（化日叫日131，2010;伽1-化21;1!'址日131，2014)。然而，该两类疫苗均是通过 注射方法进行免疫，注射操作劳力强度大，成本高，对鱼应激也大，不利于在养殖中大面积 推广应用。高效口服疫苗由于可将疫苗拌于饲料中投喂免疫，非常适合鱼类（Johnsonet al，1983)。其中口服弱毒疫苗比口服灭活疫苗免疫效果更好，主要是口服弱毒疫苗W活细 菌作为抗原，能最大程度避免肠道酶的降解，并且能到达脾、肾等免疫器官，产生持续性免 疫反应（化enetal，2015);另外，有研究显示口服弱毒疫苗可同时刺激机体产生局部粘 膜免疫反应和机体系统性免疫反应（Makeshetal，2015)。目前已报道两种方法制备无乳 链球菌弱毒疫苗；1)Pridgeon通过不断提高sparfloxain浓度筛选出无乳链球菌弱毒菌 株，该种方法获得弱毒菌株本身对罗非鱼还存在一定的毒力，在无抗生素胁迫下毒力更易 返强，并且采用注射进行免疫（Pridgeonetal，2013); 2)HuangW减毒沙口氏菌（live attenuatedSalmonellatyphimurium)为载体表达无乳链球菌表面抗原（Sip)的DM弱 毒疫苗，该方法制备的弱毒株稳定性差，免疫反应强度不高，免疫保护期才7天（化anget al，2014)。体外连续传代是经典的细菌毒力致弱方法，获得的弱毒菌株稳定性和免疫原性 均显著好于通过基因敲除或抗生素胁迫筛选获得的弱毒菌株，其缺点是因为传代次数往往 很大，所W费时费力。1978年通过该方法获得的猪链球菌弱毒菌株ST171目前还在中国广 泛应用，其稳定性、安全性和免疫效力均很好(缪家荣等，1983)。目前还未见鱼类或其它宿 主无乳链球菌自然传代弱毒株疫苗相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明针对当前我国罗非鱼无乳链球菌病预防难问题，将前期获得的无乳链球菌 自然传代弱毒株开发成口服型弱毒疫苗，为该病提供一种高效、安全、使用方便和成本低廉 的预防用疫苗。
[000引本发明技术方案： 该疫苗发明主要包括；（1)所用菌株；（2)疫苗的制备；（3)疫苗的免疫剂量；（4)疫苗 的免疫程序；（5)疫苗的免疫方法。
[0006](一）本发明疫苗所用弱毒株为罗非鱼源无乳链球菌弱毒菌株YM001，保存于中国 典型培养物保藏中屯、CCTCC，保藏编号为；CCTCCM2014045。本申请人已于2014年3月11 日将该菌株申请国家发明专利，申请号为201410087045. 7。
[0007](二）疫苗的制备： 将-8(TC保存的弱毒菌株YM001生产种子接种于绵羊血平板进行复苏，接种于优化的 改良马了培养基进行扩大培养，通过离屯、收集菌体，PBS调整细菌浓度后分装于10ml西林 瓶，加入筛选获得的冻干保护剂，按优化的冻干曲线对其冻干，封瓶后于-20°C保存。
[0008] 培养基配方（1000ml);改良马了培养基干粉28.5g，葡萄糖2g，新生牛血清20 ml,加立蒸水1000ml; 冻干保护剂配方（100ml);庶糖40g，脱脂奶粉12g，PVP0.8g，加S蒸水至100ml; 疫苗冻干曲线；4°C进箱，全速制冷到-40°C(1.5小时)维持约2. 5h，-5°C恒温32h， 60min到 0°C，0°C恒温 1h，60min到 10 °C，10°C恒温 1h，lh到 25 °C，25°C恒温 5h， 全程约36h。
[000引巨）疫苗的免疫剂量： 用PBS对冻干的疫苗进行10倍连续稀释，按1.0 X 105，1.0 X 106，1.0 X 107，1.0 X108和1.0 Xi09cfu/尾5个免疫剂量分别口服免疫罗非鱼(单次免疫)，分别于 免疫后第15天和第30天通过腹腔注射感染无乳链球菌强毒株KS029(保存于中国典型培 养物保藏中屯、CCTCC，保藏编号为；CCTCC M 209278)测定各剂量免疫组的相对免疫保护率， 进而确定疫苗免疫剂量。
[0010] (四）疫苗的免疫程序： 疫苗分别于第1天和第7天分别免疫2次，或分别于第1天、第4天和第7天免疫3次。
[0011] (五）疫苗的免疫方法： 冻干疫苗中加入PBS进行细菌复苏，再将复苏的弱毒疫苗倒入1/7V体积饮用水进行 稀释和混匀；根据免疫罗非鱼总体重3. 0%称量浮水性饲料并测量其体积为V，按饲料重量 0. 2%加入水产用粘合剂并与饲料充分混匀，将稀释好的疫苗喷洒到饲料表明，室温放置15 分钟后投喂免疫罗非鱼。
[001引（六）免疫试验： 2014年7月-11月，在广西南宁市分别选择了两个罗非鱼养殖场进行了田间免疫试验， 养殖模式分别是池塘和网箱养殖，分别于免疫后30天、60天、90天计算疫苗相对免疫保护 率，检验疫苗的生产应用效果。
[0013]本发明所具有的优点： 1、本发明的无乳链球菌疫苗是通过口服免疫罗非鱼，相对已报道的注射型疫苗，使用 非常方便，对鱼体应激非常小，非常适合水中生活鱼类的群体规模免疫。
[0014] 2、由于疫苗是通过口服免疫，适合的养殖方式、免疫鱼规格和养殖期相对已报道 的注射更适合生产实际需求，特别适合我国现在大量存在的池塘和水库罗非鱼养殖，由于 节省了注射人工成本，该疫苗的免疫成本显著降低。
[0015] 3、疫苗实验室30天免疫试验保护率达77. 61%，远高于已报道的最好结果63. 1% (Shoemakeretal，2006)，该结果是免疫后第23天的保护率；田间池塘和网箱免疫试验第 60天保护率分别达86. 09%和78. 74%，第90天免疫保护率分别达84. 71 %和72. 06%。同 时，该疫苗所用弱毒菌株YM001在毒力上安全稳定。相对已报道的该病其它弱毒或口服疫 苗(见【背景技术】)，本发明的疫苗更高效、更安全、使用更方便、成本低廉，具有很高的商业价 值。
【附图说明】
[0016] 图1;免疫剂量筛选试验结果； 图2;免疫程序筛选试验结果； 图3 ;外周血抗体水平检测结果； 图4 ;网箱养殖田间试验结果； 图5;池塘养殖田间试验结果。
【具体实施方式】
[0017](一）疫苗的制备： 将-80°C保存的弱毒菌株YM001生产种子接种于5%绵羊血琼脂平板，28°C培养36h， 挑单个菌落接种于100ml优化的改良马了培养基，28°C，150rpm培养24h;将培养获得的 100菌液全部接种于5000ml优化的改良马了培养基，28°C，150rpm培养12h;培养的菌液 9000g离屯、5min，加入350ml磯酸缓冲盐溶液（PBS)和50ml冻干保护剂，充分混匀；分装 于100个10ml西林瓶，4ml/瓶。另外，利用分光光度计和平板计数对培养的菌液进行计 数，通过菌液调整使每瓶细菌量为5.0X1(TWU。接着将分装好的西林瓶放于冻干机按 优化的冻干曲线进行冻干，真空封瓶后于-20°C保存。
[0018] 1、改良马了培养基配方（1000ml); 改良马了培养基干粉28.5g，葡萄糖2g，新生牛血清20ml,加S蒸水1000ml。
[0019] 2、冻干保护剂配方（100ml); 庶糖40g，脱脂奶粉12g，PVP0.8g，加S蒸水至100ml。
[0020] 3、冻干曲线； 4°C进箱，全速制冷到-40°C(1.5小时)维持约2. 5h，-5°C恒温32h，60min到0°C， 0°C恒温 1h，60min到 10 °C，10°C恒温 1h，lh到 25 °C ，25°C恒温 5h，全程约 44. 5h。
[0021] (二）疫苗的免疫剂量： 每瓶冻干疫苗加入4mlPBS，静止作用lOmin，用PBS调整疫苗浓度，分别按1.0X1〇5，1.0X1〇6，1.0X1〇7，1.0X10嘴 1.0Xi〇9cfu/尾 5 组免疫剂量单次口服 免疫罗非鱼，100尾/组，试验鱼体重平均为50g。分别于免疫后第15天和30天取50尾， 通过腹腔注射感染无乳链球菌强毒株KS029测定各剂量免疫组疫苗相对免疫保护率，感染 剂量为1.0X106CFU/尾（100XLDw)，感染后观察15天，计算各剂量免疫组免疫保护率。 试验结果见图 1，1. 0X1〇5、1. 0X1〇6、1. 0X1〇7、1. 0X1〇8、1. 0X1〇9cFU/ 尾 5 个剂量组第 15 天相对免疫保护率分别为6. 45% ,32. 26% ,48. 39% ,62. 90%和66. 13%，第30天相对免疫 保护率分别为 1. 47%,11. 76%,32. 35%,52. 94%和 55. 88%。1.OXl〇8和 1. 0X109cFU/尾 两组剂量在15天和30的保护率差异不大（A0. 05);1. 0X106和1. 0X10 7CFU/尾剂量组免 疫保护率相对1. 0X108和1. 0X10 9CFU/尾剂量组显著下降（K0. 01) ;1. 0X105CFU/尾剂 量组的保护率极低，第30天几乎没免疫保护作用。综合疫苗用量和保护率两个指标确定疫 苗最佳免疫剂量为1.0Xi〇8cfu/尾。
[0022] 巨）疫苗的免疫程序； 根据罗非鱼口服灌胃弱毒菌株YM001后体内示踪结果(表1)，共设计了 3种免疫程序， 即免疫程序I、II和III。3种免疫程序均是在1周内完成，免疫程序I为免疫1次，免疫程序 II为免疫2次，免疫程序III为免疫3次。为筛选到更好的免疫程序和免疫剂量，每个免疫程 序设计了 3个免疫剂量，50尾/组，试验鱼体重平均为50g，具体试验设计见表2。免疫后第 30天通过腹腔注射感染无乳链球菌强毒株KS029测定各剂量免疫组疫苗相对免疫保护率， 感染剂量为1.0X106CFU/尾（100XLDw)，感染后观察15天，计算各剂量免疫组免疫保 护率。试验结果见图2,1. 0X107CFU/尾剂量组免疫程序I、II和III保护率分别为25. 37%， 53. 73%和58. 21% ; 1.0X108CFU/尾剂量组免疫程序I、II和III保护率分别为46. 27%， 71. 64%和77. 61% ; 1.0X1〇9cFU/尾剂量组免疫程序I、II和III保护率分别为50. 75%， 68. 66%和73. 13%。3个剂量试验组均显示免疫程序II和III保护率均显著高于免疫程序I (K0. 01)，但免疫程序II和III之间保护率差异不显著（A0. 05)。结合疫苗用量和保护率两 个指标确定疫苗免疫程序为免疫程序II。另外，可根据生产实际需求进行加强免疫，加强免 疫程序与基础免疫程序一样，为免疫程序II。另外，ELISA方法检测试验鱼外周血抗体水平， 1. 0X107CFU/尾、1. 0X108CFU/尾和1. 0X109CFU/尾3个剂量口服免疫组抗体水平显著高 于对照组(於〇. 01 )，免疫后14-21天抗体水平最高，28天显著下降（图3)。
[0023] 表1罗非鱼口服灌胃弱毒菌株YM001后体内示踪
口服灌胃剂量为l.〇Xl〇8CFU/尾；"++++"表示细菌密集生长，较难区分单菌落，"+++" 表示细菌较密集生长，可区分单菌落，"++"表示细菌菌落较少，50个菌落W内；"+ "表示细 菌菌落很少，10个菌落W内，"一"表示无细菌生长。
[0024] 表2免疫程序筛选试验设计
(四）疫苗的免疫方法： 结合免疫剂量筛选试验结果和生产实际情况，每瓶疫苗含菌量为5.0Xl〇i°CFU，可 免疫500尾罗非鱼。免疫时，1瓶疫苗加入PBS4ml静止作用10min,再将复苏的弱毒疫 苗倒入1/7V体积的饮用水进行稀释和混匀，根据免疫罗非鱼总体重3. 0%称量浮水性饲料 并测量其体积为V，按饲料重量0. 2%加入水产用粘合剂并与饲料充分混匀，将稀释好的疫 苗喷洒到饲料表面，室温放置15min后投喂免疫罗非鱼。
[00幼（五）免疫试验： 1、网箱养殖田间试验 2014年7月12日，随机选择广西横县南乡镇合浦力富水产养殖有限公司网箱养殖罗非 鱼10箱，进行疫苗田间试验，试验鱼平均大小60g，1500尾/箱，其中5箱进行口服免疫， 免疫剂量为IX108CFU/尾，分别于第1和第7天进行两次口服免疫，另设5箱为对照组。 小试期间，10箱试验鱼(免疫组和对照组）的生产管理与其它网箱相同，但未投喂抗生素等 药物。从7月12日开始，由指定专口人员进行试验鱼死亡情况记录，试验结束对数据进行 统计，计算免疫保护率。结果见图3,免疫后第30天、60天、90天和107天疫苗免疫保护率 分别为83. 21 %、78. 74%、72. 06%和71. 34%。另外，免疫罗非鱼未出现致死、致残和致崎 等现现象，其生长速度与对照组罗非鱼未见有显著差异（A0. 05)。
[0026] 2、池塘养殖田间试验 2014年7月19日，随机选择广西南宁=塘镇廖兴能池塘养殖场进行疫苗田间试验，分 别设免疫组和对照组。免疫组池塘面积为4. 5亩，平均水深为1.8m，养殖罗非鱼5000尾， 平均大小为150g;对照组池塘面积为10亩，平均水深为2. 0m，养殖罗非鱼10000尾，平均 大小为150g。免疫组分别于第1和第7天进行两次口服免疫，免疫剂量为IX108C即/尾。 小试期间，免疫组未投喂抗生素等药物，对照组在发病高峰期8月20日~9月20日期间进 行了抗生素的投喂，但未产生效果。免疫组的其它生产管理与对照组相同。从7月19日开 始，由养殖场负责人廖兴能进行试验鱼死亡情况记录，试验结束对数据进行统计，计算免疫 保护率。结果见图4,免疫后第30天、60天、90天和107天疫苗免疫保护率分别为75. 30%、 86. 9 %和84. 71 %。另外，免疫罗非鱼未出现致死、致残和致崎等现象，其生长速度与对照组 罗非鱼未见有差异。
【主权项】
1. 一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于： 疫苗所用弱毒菌株为罗非鱼源无乳链球菌弱毒菌株YMOOl;疫苗制备方法包括疫苗 制备步骤、培养基配方、冻干保护剂配方和冻干曲线；疫苗口服免疫剂量范围为I.OXIO6 ~1.OXIO9CFU/尾；疫苗免疫程序及疫苗使用方法。2. 根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于疫苗的 制备方法包括以下步骤： (1) 疫苗制备：将_80°C保存的弱毒菌株YM001生产种子接种于绵羊血平板进行复苏， 接种于优化的改良马丁培养基进行扩大培养，通过离心收集菌体，磷酸缓冲盐溶液调整细 菌浓度后分装于10ml西林瓶，加入筛选获得的冻干保护剂，按优化的冻干曲线对其冻干， 封瓶后于_20°C保存； (2) 培养基配方（1000ml):改良马丁培养基干粉28.5g，葡萄糖2g，新生牛血清20ml， 加三蒸水1000ml; (3) 冻干保护剂配方（100ml):蔗糖40g，脱脂奶粉12g，PVP0.8g，加三蒸水至100 ml； (4) 疫苗冻干曲线：4°C进箱，全速制冷到_40°C(1. 5小时）维持约2. 5h，-5°C恒温 32h，60min到 0°C，0°C恒温Ih，60min到 10 °C，10°C恒温Ih，lh到 25 °C，25°C恒温 5h，全程约44. 5h。3. 根据权利要求I所述的罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于所述的 疫苗免疫程序为：疫苗分别于第1天和第7天分别免疫2次，或分别于第1天、第4天和第 7天免疫3次。4. 根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于所述的 疫苗免疫方法为：冻干疫苗中加入PBS进行细菌复苏，再将复苏的弱毒疫苗倒入1/7V体积 饮用水进行稀释和混匀；根据免疫罗非鱼总体重3. 0%称量浮水性饲料并测量其体积为V， 按饲料重量〇. 2%加入水产用粘合剂并与饲料充分混匀，将稀释好的疫苗喷洒到饲料表明， 室温放置15分钟后投喂免疫罗非鱼。
【专利摘要】本发明公开了一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗及其制备方法，将罗非鱼源无乳链球菌弱毒菌株YM001通过扩大培养、菌体收集和冻干制备成口服弱毒疫苗。通过试验确定了疫苗的免疫剂量、免疫程序和疫苗的使用方法。田间试验检测和确认了疫苗在生产上的免疫效力、安全性和可操作性，结果表明研发的疫苗具有保护效力高、安全性好，使用方便，成本低廉等优点，可用于养殖中罗非鱼无乳链球菌病预防，具有很高的商业价值。
【IPC分类】A23K1/18, A61P31/04, A23K1/16, A61K9/19, A61K39/09
【公开号】CN104906568
【申请号】CN201510163751
【发明人】陈明, 李莉萍, 王瑞, 甘西, 梁万文, 唐佳有, 黄婷, 雷爱莹, 罗永巨, 李健, 陈福艳
【申请人】广西壮族自治区水产科学研究院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月9日
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种罗非鱼无乳链球菌病的预防用疫苗，具体设及该疫苗所用菌株， 疫苗的制备，免疫剂量，免疫程序和免疫方法。
【背景技术】
[0002] 无乳链球菌是水产养殖中常见的一种病原菌，可危害不同品种的鱼类，如罗非 鱼、妒鱼、錯鱼、觸、石斑鱼等，其中W罗非鱼无乳链球菌病最为严重值uremdezetal， 2004Jafaretal，2008;Amaletal，2012)。该病造成极高死亡率，每年给水产业造 成巨额经济损失（Wangetal，2014)。中国是世界罗非鱼第一大国，产量约占世界总产 量的45 %。2009-2014连续6年，链球菌病在中国罗非鱼养殖大面积暴发流行，发病区 域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增，易感罗非鱼规格范围逐年扩大，累计死亡率高达 30%-90%，同时研究发现90%W上临床菌株为无乳链球菌（化enetal，2012)。
[0003] 目前该病的控制主要依靠抗生素等化学药物，但该方法有诸多负面作用，大量抗 生素的使用及其在鱼体内的积累，可对环境、潜在的食品安全危害和人类公众健康均有危 害（Baqueroetal，2008;Sunetal，2014)。同时调查研究显示，随着抗药和耐药性的产 生，近3年中国罗非鱼养殖很难找到可W控制无乳链球菌病的有效药物。而免疫接种是用 于控制无乳链球菌病最理想的方法之一（Darwishetal，2007)。目前，无乳链球菌较成 功疫苗有两类：第一类是利用无乳链球菌菌体和胞外产物制备的灭活疫苗，该疫苗已被证 实效果很好（Evansetal，2004;Pasniketal，2005);另一类是亚单位疫苗，也有效好的 免疫保护力（化日叫日131，2010;伽1-化21;1!'址日131，2014)。然而，该两类疫苗均是通过 注射方法进行免疫，注射操作劳力强度大，成本高，对鱼应激也大，不利于在养殖中大面积 推广应用。高效口服疫苗由于可将疫苗拌于饲料中投喂免疫，非常适合鱼类（Johnsonet al，1983)。其中口服弱毒疫苗比口服灭活疫苗免疫效果更好，主要是口服弱毒疫苗W活细 菌作为抗原，能最大程度避免肠道酶的降解，并且能到达脾、肾等免疫器官，产生持续性免 疫反应（化enetal，2015);另外，有研究显示口服弱毒疫苗可同时刺激机体产生局部粘 膜免疫反应和机体系统性免疫反应（Makeshetal，2015)。目前已报道两种方法制备无乳 链球菌弱毒疫苗；1)Pridgeon通过不断提高sparfloxain浓度筛选出无乳链球菌弱毒菌 株，该种方法获得弱毒菌株本身对罗非鱼还存在一定的毒力，在无抗生素胁迫下毒力更易 返强，并且采用注射进行免疫（Pridgeonetal，2013); 2)HuangW减毒沙口氏菌（live attenuatedSalmonellatyphimurium)为载体表达无乳链球菌表面抗原（Sip)的DM弱 毒疫苗，该方法制备的弱毒株稳定性差，免疫反应强度不高，免疫保护期才7天（化anget al，2014)。体外连续传代是经典的细菌毒力致弱方法，获得的弱毒菌株稳定性和免疫原性 均显著好于通过基因敲除或抗生素胁迫筛选获得的弱毒菌株，其缺点是因为传代次数往往 很大，所W费时费力。1978年通过该方法获得的猪链球菌弱毒菌株ST171目前还在中国广 泛应用，其稳定性、安全性和免疫效力均很好(缪家荣等，1983)。目前还未见鱼类或其它宿 主无乳链球菌自然传代弱毒株疫苗相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明针对当前我国罗非鱼无乳链球菌病预防难问题，将前期获得的无乳链球菌 自然传代弱毒株开发成口服型弱毒疫苗，为该病提供一种高效、安全、使用方便和成本低廉 的预防用疫苗。
[000引本发明技术方案： 该疫苗发明主要包括；（1)所用菌株；（2)疫苗的制备；（3)疫苗的免疫剂量；（4)疫苗 的免疫程序；（5)疫苗的免疫方法。
[0006](一）本发明疫苗所用弱毒株为罗非鱼源无乳链球菌弱毒菌株YM001，保存于中国 典型培养物保藏中屯、CCTCC，保藏编号为；CCTCCM2014045。本申请人已于2014年3月11 日将该菌株申请国家发明专利，申请号为201410087045. 7。
[0007](二）疫苗的制备： 将-8(TC保存的弱毒菌株YM001生产种子接种于绵羊血平板进行复苏，接种于优化的 改良马了培养基进行扩大培养，通过离屯、收集菌体，PBS调整细菌浓度后分装于10ml西林 瓶，加入筛选获得的冻干保护剂，按优化的冻干曲线对其冻干，封瓶后于-20°C保存。
[0008] 培养基配方（1000ml);改良马了培养基干粉28.5g，葡萄糖2g，新生牛血清20 ml,加立蒸水1000ml; 冻干保护剂配方（100ml);庶糖40g，脱脂奶粉12g，PVP0.8g，加S蒸水至100ml; 疫苗冻干曲线；4°C进箱，全速制冷到-40°C(1.5小时)维持约2. 5h，-5°C恒温32h， 60min到 0°C，0°C恒温 1h，60min到 10 °C，10°C恒温 1h，lh到 25 °C，25°C恒温 5h， 全程约36h。
[000引巨）疫苗的免疫剂量： 用PBS对冻干的疫苗进行10倍连续稀释，按1.0 X 105，1.0 X 106，1.0 X 107，1.0 X108和1.0 Xi09cfu/尾5个免疫剂量分别口服免疫罗非鱼(单次免疫)，分别于 免疫后第15天和第30天通过腹腔注射感染无乳链球菌强毒株KS029(保存于中国典型培 养物保藏中屯、CCTCC，保藏编号为；CCTCC M 209278)测定各剂量免疫组的相对免疫保护率， 进而确定疫苗免疫剂量。
[0010] (四）疫苗的免疫程序： 疫苗分别于第1天和第7天分别免疫2次，或分别于第1天、第4天和第7天免疫3次。
[0011] (五）疫苗的免疫方法： 冻干疫苗中加入PBS进行细菌复苏，再将复苏的弱毒疫苗倒入1/7V体积饮用水进行 稀释和混匀；根据免疫罗非鱼总体重3. 0%称量浮水性饲料并测量其体积为V，按饲料重量 0. 2%加入水产用粘合剂并与饲料充分混匀，将稀释好的疫苗喷洒到饲料表明，室温放置15 分钟后投喂免疫罗非鱼。
[001引（六）免疫试验： 2014年7月-11月，在广西南宁市分别选择了两个罗非鱼养殖场进行了田间免疫试验， 养殖模式分别是池塘和网箱养殖，分别于免疫后30天、60天、90天计算疫苗相对免疫保护 率，检验疫苗的生产应用效果。
[0013]本发明所具有的优点： 1、本发明的无乳链球菌疫苗是通过口服免疫罗非鱼，相对已报道的注射型疫苗，使用 非常方便，对鱼体应激非常小，非常适合水中生活鱼类的群体规模免疫。
[0014] 2、由于疫苗是通过口服免疫，适合的养殖方式、免疫鱼规格和养殖期相对已报道 的注射更适合生产实际需求，特别适合我国现在大量存在的池塘和水库罗非鱼养殖，由于 节省了注射人工成本，该疫苗的免疫成本显著降低。
[0015] 3、疫苗实验室30天免疫试验保护率达77. 61%，远高于已报道的最好结果63. 1% (Shoemakeretal，2006)，该结果是免疫后第23天的保护率；田间池塘和网箱免疫试验第 60天保护率分别达86. 09%和78. 74%，第90天免疫保护率分别达84. 71 %和72. 06%。同 时，该疫苗所用弱毒菌株YM001在毒力上安全稳定。相对已报道的该病其它弱毒或口服疫 苗(见【背景技术】)，本发明的疫苗更高效、更安全、使用更方便、成本低廉，具有很高的商业价 值。
【附图说明】
[0016] 图1;免疫剂量筛选试验结果； 图2;免疫程序筛选试验结果； 图3 ;外周血抗体水平检测结果； 图4 ;网箱养殖田间试验结果； 图5;池塘养殖田间试验结果。
【具体实施方式】
[0017](一）疫苗的制备： 将-80°C保存的弱毒菌株YM001生产种子接种于5%绵羊血琼脂平板，28°C培养36h， 挑单个菌落接种于100ml优化的改良马了培养基，28°C，150rpm培养24h;将培养获得的 100菌液全部接种于5000ml优化的改良马了培养基，28°C，150rpm培养12h;培养的菌液 9000g离屯、5min，加入350ml磯酸缓冲盐溶液（PBS)和50ml冻干保护剂，充分混匀；分装 于100个10ml西林瓶，4ml/瓶。另外，利用分光光度计和平板计数对培养的菌液进行计 数，通过菌液调整使每瓶细菌量为5.0X1(TWU。接着将分装好的西林瓶放于冻干机按 优化的冻干曲线进行冻干，真空封瓶后于-20°C保存。
[0018] 1、改良马了培养基配方（1000ml); 改良马了培养基干粉28.5g，葡萄糖2g，新生牛血清20ml,加S蒸水1000ml。
[0019] 2、冻干保护剂配方（100ml); 庶糖40g，脱脂奶粉12g，PVP0.8g，加S蒸水至100ml。
[0020] 3、冻干曲线； 4°C进箱，全速制冷到-40°C(1.5小时)维持约2. 5h，-5°C恒温32h，60min到0°C， 0°C恒温 1h，60min到 10 °C，10°C恒温 1h，lh到 25 °C ，25°C恒温 5h，全程约 44. 5h。
[0021] (二）疫苗的免疫剂量： 每瓶冻干疫苗加入4mlPBS，静止作用lOmin，用PBS调整疫苗浓度，分别按1.0X1〇5，1.0X1〇6，1.0X1〇7，1.0X10嘴 1.0Xi〇9cfu/尾 5 组免疫剂量单次口服 免疫罗非鱼，100尾/组，试验鱼体重平均为50g。分别于免疫后第15天和30天取50尾， 通过腹腔注射感染无乳链球菌强毒株KS029测定各剂量免疫组疫苗相对免疫保护率，感染 剂量为1.0X106CFU/尾（100XLDw)，感染后观察15天，计算各剂量免疫组免疫保护率。 试验结果见图 1，1. 0X1〇5、1. 0X1〇6、1. 0X1〇7、1. 0X1〇8、1. 0X1〇9cFU/ 尾 5 个剂量组第 15 天相对免疫保护率分别为6. 45% ,32. 26% ,48. 39% ,62. 90%和66. 13%，第30天相对免疫 保护率分别为 1. 47%,11. 76%,32. 35%,52. 94%和 55. 88%。1.OXl〇8和 1. 0X109cFU/尾 两组剂量在15天和30的保护率差异不大（A0. 05);1. 0X106和1. 0X10 7CFU/尾剂量组免 疫保护率相对1. 0X108和1. 0X10 9CFU/尾剂量组显著下降（K0. 01) ;1. 0X105CFU/尾剂 量组的保护率极低，第30天几乎没免疫保护作用。综合疫苗用量和保护率两个指标确定疫 苗最佳免疫剂量为1.0Xi〇8cfu/尾。
[0022] 巨）疫苗的免疫程序； 根据罗非鱼口服灌胃弱毒菌株YM001后体内示踪结果(表1)，共设计了 3种免疫程序， 即免疫程序I、II和III。3种免疫程序均是在1周内完成，免疫程序I为免疫1次，免疫程序 II为免疫2次，免疫程序III为免疫3次。为筛选到更好的免疫程序和免疫剂量，每个免疫程 序设计了 3个免疫剂量，50尾/组，试验鱼体重平均为50g，具体试验设计见表2。免疫后第 30天通过腹腔注射感染无乳链球菌强毒株KS029测定各剂量免疫组疫苗相对免疫保护率， 感染剂量为1.0X106CFU/尾（100XLDw)，感染后观察15天，计算各剂量免疫组免疫保 护率。试验结果见图2,1. 0X107CFU/尾剂量组免疫程序I、II和III保护率分别为25. 37%， 53. 73%和58. 21% ; 1.0X108CFU/尾剂量组免疫程序I、II和III保护率分别为46. 27%， 71. 64%和77. 61% ; 1.0X1〇9cFU/尾剂量组免疫程序I、II和III保护率分别为50. 75%， 68. 66%和73. 13%。3个剂量试验组均显示免疫程序II和III保护率均显著高于免疫程序I (K0. 01)，但免疫程序II和III之间保护率差异不显著（A0. 05)。结合疫苗用量和保护率两 个指标确定疫苗免疫程序为免疫程序II。另外，可根据生产实际需求进行加强免疫，加强免 疫程序与基础免疫程序一样，为免疫程序II。另外，ELISA方法检测试验鱼外周血抗体水平， 1. 0X107CFU/尾、1. 0X108CFU/尾和1. 0X109CFU/尾3个剂量口服免疫组抗体水平显著高 于对照组(於〇. 01 )，免疫后14-21天抗体水平最高，28天显著下降（图3)。
[0023] 表1罗非鱼口服灌胃弱毒菌株YM001后体内示踪
口服灌胃剂量为l.〇Xl〇8CFU/尾；"++++"表示细菌密集生长，较难区分单菌落，"+++" 表示细菌较密集生长，可区分单菌落，"++"表示细菌菌落较少，50个菌落W内；"+ "表示细 菌菌落很少，10个菌落W内，"一"表示无细菌生长。
[0024] 表2免疫程序筛选试验设计
(四）疫苗的免疫方法： 结合免疫剂量筛选试验结果和生产实际情况，每瓶疫苗含菌量为5.0Xl〇i°CFU，可 免疫500尾罗非鱼。免疫时，1瓶疫苗加入PBS4ml静止作用10min,再将复苏的弱毒疫 苗倒入1/7V体积的饮用水进行稀释和混匀，根据免疫罗非鱼总体重3. 0%称量浮水性饲料 并测量其体积为V，按饲料重量0. 2%加入水产用粘合剂并与饲料充分混匀，将稀释好的疫 苗喷洒到饲料表面，室温放置15min后投喂免疫罗非鱼。
[00幼（五）免疫试验： 1、网箱养殖田间试验 2014年7月12日，随机选择广西横县南乡镇合浦力富水产养殖有限公司网箱养殖罗非 鱼10箱，进行疫苗田间试验，试验鱼平均大小60g，1500尾/箱，其中5箱进行口服免疫， 免疫剂量为IX108CFU/尾，分别于第1和第7天进行两次口服免疫，另设5箱为对照组。 小试期间，10箱试验鱼(免疫组和对照组）的生产管理与其它网箱相同，但未投喂抗生素等 药物。从7月12日开始，由指定专口人员进行试验鱼死亡情况记录，试验结束对数据进行 统计，计算免疫保护率。结果见图3,免疫后第30天、60天、90天和107天疫苗免疫保护率 分别为83. 21 %、78. 74%、72. 06%和71. 34%。另外，免疫罗非鱼未出现致死、致残和致崎 等现现象，其生长速度与对照组罗非鱼未见有显著差异（A0. 05)。
[0026] 2、池塘养殖田间试验 2014年7月19日，随机选择广西南宁=塘镇廖兴能池塘养殖场进行疫苗田间试验，分 别设免疫组和对照组。免疫组池塘面积为4. 5亩，平均水深为1.8m，养殖罗非鱼5000尾， 平均大小为150g;对照组池塘面积为10亩，平均水深为2. 0m，养殖罗非鱼10000尾，平均 大小为150g。免疫组分别于第1和第7天进行两次口服免疫，免疫剂量为IX108C即/尾。 小试期间，免疫组未投喂抗生素等药物，对照组在发病高峰期8月20日~9月20日期间进 行了抗生素的投喂，但未产生效果。免疫组的其它生产管理与对照组相同。从7月19日开 始，由养殖场负责人廖兴能进行试验鱼死亡情况记录，试验结束对数据进行统计，计算免疫 保护率。结果见图4,免疫后第30天、60天、90天和107天疫苗免疫保护率分别为75. 30%、 86. 9 %和84. 71 %。另外，免疫罗非鱼未出现致死、致残和致崎等现象，其生长速度与对照组 罗非鱼未见有差异。
【主权项】
1. 一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于： 疫苗所用弱毒菌株为罗非鱼源无乳链球菌弱毒菌株YMOOl;疫苗制备方法包括疫苗 制备步骤、培养基配方、冻干保护剂配方和冻干曲线；疫苗口服免疫剂量范围为I.OXIO6 ~1.OXIO9CFU/尾；疫苗免疫程序及疫苗使用方法。2. 根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于疫苗的 制备方法包括以下步骤： (1) 疫苗制备：将_80°C保存的弱毒菌株YM001生产种子接种于绵羊血平板进行复苏， 接种于优化的改良马丁培养基进行扩大培养，通过离心收集菌体，磷酸缓冲盐溶液调整细 菌浓度后分装于10ml西林瓶，加入筛选获得的冻干保护剂，按优化的冻干曲线对其冻干， 封瓶后于_20°C保存； (2) 培养基配方（1000ml):改良马丁培养基干粉28.5g，葡萄糖2g，新生牛血清20ml， 加三蒸水1000ml; (3) 冻干保护剂配方（100ml):蔗糖40g，脱脂奶粉12g，PVP0.8g，加三蒸水至100 ml； (4) 疫苗冻干曲线：4°C进箱，全速制冷到_40°C(1. 5小时）维持约2. 5h，-5°C恒温 32h，60min到 0°C，0°C恒温Ih，60min到 10 °C，10°C恒温Ih，lh到 25 °C，25°C恒温 5h，全程约44. 5h。3. 根据权利要求I所述的罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于所述的 疫苗免疫程序为：疫苗分别于第1天和第7天分别免疫2次，或分别于第1天、第4天和第 7天免疫3次。4. 根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于所述的 疫苗免疫方法为：冻干疫苗中加入PBS进行细菌复苏，再将复苏的弱毒疫苗倒入1/7V体积 饮用水进行稀释和混匀；根据免疫罗非鱼总体重3. 0%称量浮水性饲料并测量其体积为V， 按饲料重量〇. 2%加入水产用粘合剂并与饲料充分混匀，将稀释好的疫苗喷洒到饲料表明， 室温放置15分钟后投喂免疫罗非鱼。
【专利摘要】本发明公开了一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗及其制备方法，将罗非鱼源无乳链球菌弱毒菌株YM001通过扩大培养、菌体收集和冻干制备成口服弱毒疫苗。通过试验确定了疫苗的免疫剂量、免疫程序和疫苗的使用方法。田间试验检测和确认了疫苗在生产上的免疫效力、安全性和可操作性，结果表明研发的疫苗具有保护效力高、安全性好，使用方便，成本低廉等优点，可用于养殖中罗非鱼无乳链球菌病预防，具有很高的商业价值。
【IPC分类】A23K1/18, A61P31/04, A23K1/16, A61K9/19, A61K39/09
【公开号】CN104906568
【申请号】CN201510163751
【发明人】陈明, 李莉萍, 王瑞, 甘西, 梁万文, 唐佳有, 黄婷, 雷爱莹, 罗永巨, 李健, 陈福艳
【申请人】广西壮族自治区水产科学研究院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月9日
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