一种用于hiv-1b/c亚型的预防性重组vlp疫苗及制备方法
一种用于hiv-1 b/c亚型的预防性重组vlp疫苗及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物技术领域。具体的，本发明设及一种用于HIV-1B/C亚型的预 防性重组VLP疫苗及制备方法。
【背景技术】
[000引 艾滋病、又称获得性免疫缺陷综合征（Acquiredimmunedeficien巧syn化ome， AID巧是一种由HIV化umanimmunodeficiencyvirus)引起的全球性疾病，蔓延速度快，死 亡率高。自1981年首次发现艾滋病W来，HIV的感染在世界范围内迅速流行。至2002年 底世界上至少有193个国家和地区发现有HIV感染者死亡，且其仍W每天感染15000人的 速度快速扩展，其中95%W上的HIV感染者生活在发展中国家，已造成全球累计6000余万 人感染，2000余万人死于AIDS,艾滋病在非洲是首要死亡病因，而在全球范围内则是第四 大死亡病因。中国HIV感染人数现已超过100万，HIV/AIDS的流行对社会和经济产生了极 大的负面影响。目前没有针对HIV的特效治疗方法，虽然高效抗逆转录病毒的治疗方法已 经在减轻患者痛苦、延长患者寿命等方面取得了一定的效果，但用于治疗HIV感染的药物 只能控制病毒复制，不能彻底清除病毒，而且抗HIV药物价格昂贵，具有较严重的副作用， 药物使用不当，也会诱发耐药株的产生。因此，研制安全、有效的疫苗是控制HIV传播的重 要手段之一。
[0003] 自从20世纪80年代发现HIVW来，各国政府和企业投入了大量的资金开展了 一百多次的艾滋病疫苗临床试验研究，但绝大部分都没有显示出有效的保护效果。2009 年底，在泰国开展的一项基于重组金丝雀痘病毒疫苗（ALVAC，重组金丝雀痘病毒，带有 HIV-1B亚型丽毒株甜120、LAI毒株的甜41穿膜区，Gag和ProteaseW及部分Nef和 Pol区的CTL表位基因）初始免疫，VaxGengpl20蛋白疫苗（AIDSVA幻加强免疫的联合疫 苗RV144取得了 31. 2%的临床保护结果。该是人类首次获得具有一定保护效果的预防性艾 滋病疫苗，该一结果提示，W重组病毒疫苗初免，蛋白疫苗加强的联合免疫策略，可能是获 得保护性HIV-1疫苗的关键。
[0004] 重组病毒疫苗基于经过改造后降低毒力的各种病毒载体，携带外源基因并能包 装成成熟的病毒颗粒，从而介导外源基因的转移和表达。重组病毒能够W天然感染的方 式，在可接受安全性情况下具有可诱导广泛强烈和持久的免疫应答的作用。包括痘病毒 任oxviruses)、腺病毒（Adenovirus)、腺相关病毒（Adeno-associatedvirus)、瘤疹病毒 化erpesviruses)和麻疹病毒（Measlesvirus)等在内的多种病毒载体被开发用于各种病 毒疫苗的研制，进入临床效果和安全性评价。
[0005] 许多病毒的结构蛋白都具有自动组装成病毒样颗粒（Virus-1化eparticles， VLP)的能力，VLP是模拟自然界真实病毒的天然构象，但缺乏病毒基因组的多蛋白结构，因 而不具有感染性，作为免疫原使用具有安全性，是最有潜力的安全、有效的候选疫苗形式。 VLP与单个蛋白或多肤相比，其构象表位更接近于天然病毒，可明显增强抗体反应或免疫应 答；VLP不需要灭活，避免了因灭活而可能造成的表位改变；此外，由于VLP具有高度重复 的抗原表面，因此能够在无佐剂的情况下，通过与B细胞上的特异性受体有效交联来诱导 强的B细胞免疫应答。迄今为止，已研制出30余种人类及其他动物感染性病毒的VLP，少 量VLP疫苗已获准上市，如己型肝炎病毒化巧atitisBvirus,皿V)疫苗和人乳头瘤病毒 (Humanpapillomavirus,HPV)疫苗。与无包膜病毒不同，HIV-1作为有包膜病毒，其能够 诱发中和抗体的表面抗原为膜蛋白，各结构蛋白经剪切、包装成病毒样颗粒并出芽、分泌至 细胞外的过程特别复杂，因而体外表达获得具有包膜的VLP十分困难。已有报道，利用果蛹 S2细胞建立的稳定表达HIV-1BC亚型Gpl60、Rev和Gag的细胞系，可分泌出与天然病毒结 构接近的VLP结构。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗的制 备方法。
[000引本发明的技术方案概述如下：
[0009] 用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗的制备方法，包括如下步骤；用编码 HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白的重组MVA病毒感染原代鸡胚成纤维细胞，表达出Gag、 Pol和Env蛋白，包装并分泌出包含HIV-1B/C亚型Gag和Env蛋白的且与天然HIV-1病毒 结构类似的病毒样颗粒。
[0010] 所述Gag的氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示，所述化1的氨基酸序列是SEQID NO. 2所示，所述Env的氨基酸序列是SEQIDNO. 3所示。
[0011] 上述方法制备的用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗。
[001引本发明的优点：
[0013] 本发明的疫苗最大限度模拟HIV-1病毒抗原天然结构，有利于诱导保护性免疫反 应，且不含HIV基因，安全性有保障；利用重组MVA感染即可大量获得VLP，工艺简单；单一 组分疫苗用于HIV-1免疫不能诱导有效保护性免疫反应，RV144采用痘病毒初免，蛋白疫苗 加强的策略。本发明VLP为重组痘病毒MVA的副产物（收获细胞，裂解，制备MVA，收获培养 上清，纯化，收获VLP)，一个生产流程可同时生产两种疫苗。
【附图说明】
[0014] 图1为重组MVA感染BHK-21细胞滴定结果。
[0015] 图2为重组MVA感染原代CEF后外源蛋白表达水平比较。图中；M为protein marker;Lanel-3为不同M0I0%FBS培养4她；Lane4-6为不同M0I2%FBS培养4她；Lane 7-9 为不同M0I0%FBS培养 96h;Lanel〇-12 为不同M0I2%FBS培养 96h。
[0016] 图3为HIV-1B/C亚型VLP沉降区间的确定。
[0017] 图4庶糖超速离屯、纯化结果。图中；M为proteinmarker;Lane1为20%庶糖超 速离屯、后沉淀；Lane2为20-60%庶糖梯度超速离屯、后中间层；Lane3为20-60%庶糖梯 度超速离屯、后沉淀。
[0018] 图 5VLPP^Jative-Page及Western-blotting结果。图中；Lane1 为未处理；Lane 2为RIPAlysis处理；Lane3为SDS变性后对照
[0019] 图6小鼠免疫后血清化ISA检测结果。
【具体实施方式】
[0020] W下参照具体的实施例来说明本发明，其中未注明的具体实施条件的方法，通常 按照常规条件，或按照产商所建议的条件进行。
[0021] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0022] 实施例1 ;编码HIV-1B/C亚型Gag/化l、Env蛋白的重组MVA病毒工作种子库的建 立
[002引采用基因工程技术，将HIV-1B/C亚型GagM)l、Env基因分别融合在脑屯、肌炎病 毒巧nc巧halomyocarditisvirus,ECMV)内部核糖体进入位点序列（Internalribozyme 611付7 3116，11?6巧基因佑6油3证齡.；扣759789)的5'和3'端，构建^￥-18/(：亚型 Gag/Pol-IRES-Env的多顺反子基因表达元件，之后将该一元件插入修饰的安卡拉痘病 毒（ModifiedvacciniavirusAnkara,MVA)穿梭载体pSCll质粒（参考文献见下文） 中，经同源重组、瞻斑纯化后获得编码HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白的重组MVA病 毒（具体操作方法参考CarolineStaib,GerdSutter.Liveviralvectors:Vaccinia virus[M]In:VaccineProtocols, 2ndedition.EditedbyAndrewRobinson,Martin Cranage,MichaelJ.Hudson.HumanaPressInc. ;2003:51-68)。MVA在原代鸡胚成纤维细 胞（化ickenemtorofibroblasts,CE巧中扩增的速度最快，病毒的复制和包装均在细胞 内，当细胞完整时并不释放到胞外，因此常W反复冻融和超声的方法破碎细胞W释放病毒。 制备原代CEF巧~10日龄SPF级鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司），待细 胞生长至汇合度90 %W上后，取适量编码HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白的重组MVA病毒 毒种，经含 2%胎牛血清（Fetalcalfserum,FBS;购自Hyclone公司，化t.No. ;SV30087) 的MEM(Minimumessentialmedium,购自Gibco公司，Cat.No. ;C110955)完全培养基稀释 后，接种细胞，待细胞全部病变后（约48~7化），弃培养上清，刮取并收集细胞，低速离屯、 后W适量体积的lOmMTris(pH9. 0)重悬（lml/T175细胞培养瓶），反复冻融3次后，冰浴 超声（购自SonicsandMaterials公司，Model;VCX750)破碎细胞巧0ml离屯、管中，样品 体积不超过30ml，探头高度距离液面1/3高度，超声3s，间隔3s，超声总时间Imin)，重复3 次，进一步破坏细胞，300化pm离屯、5minW去除细胞残渣，收集上清；分之一原始体积 的lOmMTris-HCl(抑9.0)重悬沉淀，重复冻融和超声的步骤，将两次的病毒上清合并；将 病毒上清分装并保存于-80°C冰箱。
[0024] 实施例2 ;编码HIV-1B/C亚型Gag/化l、Env蛋白的 重组MVA病毒工作种子库的滴 定
[0025] 由于MVA为高度弱化的毒株，毒力有限，引起的致细胞病变效应（切topathic effect,CP巧较弱，通常结合免疫学方法进行病毒滴定。W96孔板为例，取出病毒毒种 后，进行10倍系列稀释于含2%FBS的MEM完全培养基中，感染已经培养2化，细胞汇合度 为 80-90%的BHK-21 细胞（购自Americantype州hurecollection,ATCC，ATCCNo.; (XL-IO)每孔100y1，设置复孔及阴性对照。感染4她后，弃培养上清，W丙酬与甲醇1:1混 合的固定液，室温固定细胞2min后，依次W1:1000稀释的痘苗病毒（Vacciniavirus，VV) 兔多抗（购自Bio-Rad公司，Cat.No. ;9503-2057)，1:1000稀释的HRP标记抗兔二抗（购 自Sigma公司，Cat.No.;A0545)，HRP底物（邻联茵香胺-四盐酸盐，H2化，购自北京索莱宝 科技有限公司）作用后，普通光学显微镜下，观察并计算显色的病毒斑数。按相关公式计算 病毒滴度，计算方式为感染单位（Infectiousunits,IU)，显色结果如图1所示。
[0026] 实施例3 ;HIV-1B/C亚型VLP的表达
[0027] 制备原代C邸细胞，待细胞生长至汇合度90%W上后，将编码HIV-1B/C亚型Gag/ Pol、Env蛋白的重组MVA病毒W不同的病毒感染复数（Multiplicityofinfection，MOI) 感染原代CEF细胞，比较不同MOI(1〇-2、1〇-3、1〇-4)和FBS浓度（0%、2% )条件下培养上清 中VLP表达量的差异。感染4她后，收集培养上清；更换新鲜培养基，继续培养4她，收集培 养上清；两次收集的上清分别低速离屯、去除细胞残渣；经SW28转子（购自Beckman公司， Model;0ptimaXE90)、20%庶糖垫层、28000巧111、41：超速离屯、化，弃上清，超速离屯、沉淀用 400y1PBS(抑7. 2)重悬；收集的产物经SDS-PAGE和Western-blotting,分别WGpl20 和 P24 抗体（购自Abeam公司，Cat.No.;油 106578,油63913)验证Gpl20 和Gagp55 的表达。 结果如图2所示，超速离屯、的结果表明，Env和Gag蛋白W非游离态的形式存在，M0I为1(T3 时，表达量略高。
[002引 实施例4 ;HIV-1B/C亚型VLP的纯化
[0029] W实施例3中筛选的表达条件（2%FBS、M0I为1〇-3)，大量制备原代C邸细胞进 行MVA感染和外源蛋白表达。两次收集的培养上清依次经3000巧m、20min，8000巧m、40min， 4°C离屯、，去除细胞碎片；高速离屯、后上清经0.45ym滤膜过滤，进一步去除细胞碎片；使用 300邸截留量孔径的超滤膜包（购自Millipore公司，Model;B300-C)对培养上清进行浓 缩，浓缩倍数为10~20倍之间；W5倍浓缩液体积的PBS(抑7. 2)进行连续流透析，去除培 养基中的血清等其他成分；HIV-1B/C亚型VLP沉降区间的确定；取部分浓缩、透析后上清， 经SW41转子、20-30-40-50-60%密度梯度庶糖垫层、28000巧m、4°C超速离屯、化，自上而下， 每1ml收集样品，经SDS-PAGE和Western-blotting验证（图3)，Env和Gag蛋白位于同一 组分中，超速离屯、后主要组分位于30%庶糖垫层，该与已报道的HIV-1病毒颗粒密度一致； 第一次超速离屯、；透析完成后经SW28转子、20%庶糖垫层、28000巧m、4°C超速离屯、化，弃上 清，离屯、沉淀用1/10超速离屯、前溶液体积的PBS(抑7. 2)重悬，此步骤可去除多数血清中杂 蛋白；第二次超速离屯、：第一次超速离屯、沉淀的重悬液经SW28转子、20%+60%庶糖垫层、 28000rpm、4°C超速离屯、化，W去除不可溶的杂质成分，可观察到在20%与50%庶糖垫层之 间有白色带层，收集此中间层；第=次超速离屯、：第二次超速离屯、收集的中间带层W2倍体 积的PBS(抑7. 2)稀释后，经SW28转子、28000巧m、4°C超速离屯、化，弃上清，此步骤可去除甘 油成分，离屯、沉淀用适量PBS(抑7. 2)重悬，为最终纯化产物。结果显示，经密度梯度超速离 屯、后可进一步去除杂蛋白，如图4所不。
[0030] 我们随后的数据显示，VLP在超速离屯、时Env/Gag位于同一组分，且主要组分位于 30%庶糖垫层，与HIV-1病毒颗粒密度一致，，表明两种病毒蛋白不是W游离态表达，而是 形成VLP(如果病毒蛋白W游离态形式存在，密度较小，不会在30 %庶糖垫层出现；Env和 Gag分子量大小不一，位于同一密度，表明形成复合物；复合物密度与HIV-1病毒颗粒密度 一致，表明表达的化v/Gag形成VLP)
[003U实施例5 ;HIV-1B/C亚型VLP结构的鉴定
[0032] 庶糖密度梯度超速离屯、结合SDS-PAGE和Western-blottingW确定HIV-IB/C亚 型VLP沉降系数区间的实验结果已经证实，该复合物具有类似病毒颗粒的结构，其中包含Gpl60剪切后的产物Gpl20,及未剪切的Gagp55。为了进一步证实该VLP中的Gpl20是否 与天然病毒中结构一样，形成TrimerS聚体结构，错定于包膜上，将纯化后的产物分别作 未处理、RIPA裂解处理后进行化tive-PAGE和Western-blotting,结果如图5所示，未处理 的样本由于包膜未被破坏，分子量过大，无法完成电泳分离；RIPA处理后，破坏包膜，释放 膜蛋白，与产物经SDS变性后的对照相比，分子量要更大，表明非Gpl20单体。
[003引实施例6 ;HIV-1B/C亚型VLP动物免疫及血清学检测
[0034] 6~8周龄雌性BALB/c小鼠（购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司），随机 分为3组，每组10只，分别为PBS组、DNA组和DNA+VLP组。DNA疫苗为编码HIV-1B/C亚型 Gag/Pol、Env蛋白的重组pVT118-Gag/Pol-Env质粒，其编码的氨基酸序列与编码HIV-1B/C 亚型Gag/化l、Env蛋白的重组MVA病毒中对应的序列一致，将Gag/化l、Env基因分别正向 插入真核表达载体VR1012(购自VicalInc.，SanDiego，CA)的甜aI/BamHI、BamHI位点之 间，将两个重组质粒pVR1012-Gag/Pol、pVR1012-Env分别经BamHI、BglII限制性内切酶消 化后，经T4DNA连接酶处理，两个重组质粒合并，称为pVT118-Gag/Pol-Env，转染真核细胞 后可同时表达HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白，pVT118-Gag/Pol-Env重组质粒免疫剂量 为DNAlOOyg/只；VLP疫苗为编码HIV-1B/C亚型Gag/化l、Env蛋白的重组MVA病毒感染 原代CEF表达的VLP纯化后产物，使用河北医科大学开发的HIV-1P24抗原检测试剂盒，W 63径蛋白定量，免疫剂量为2^肖/只；41(0巧3佐剂（购自化61'111〇公司，〔3*.齡.；77161)，免 疫剂量为50yg/只；免疫总体积为100y1/只，肌肉注射。免疫程序为：第0、14和28天进 行PBS和DNA免疫，第42和56天进行DNA和VLP免疫，每只小鼠均免疫5次，第70天处死 小鼠，收集血清。小鼠血清WPBS进行倍比稀释，PBS组血清从1:10开始稀释，其他免疫组 血清从1:100开始稀释，使用HIV-1BC亚型Gpl20ELISA试剂盒（购自ImmuneTechnology 公司，Cat.No. ;口-E3Ag-HIV甜120CN54-MAB)检测特异性IgG抗体水平。结果如图6所示， DNA免疫，VLP加强后，与单独免疫DNA相比，抗体水平明显得到提高。
[0035] 综上所述，利用编码HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白的重组MVA病毒感染原代 C邸细胞后，能表达相应外源蛋白Gag、Pol和化V，包装、形成并分泌HIV-1BC亚型Gag和 Env蛋白的且与天然HIV-1病毒结构类似的病毒样颗粒。为HIV-1蛋白疫苗提供一种新的 候选，同时，本发明亦建立了该VLP大量生产及纯化的方法，动物免疫实验表明，该蛋白能 够诱导有效的针对HIV-1的免疫应答，与其他类型疫苗联合使用，可获得更好的免疫效果。
【主权项】
1. 用于HIV-I B/C亚型的预防性重组VLP疫苗的制备方法，其特征是包括如下步骤：用 编码HIV-I B/C亚型Gag/Pol、Env蛋白的重组MVA病毒感染原代鸡胚成纤维细胞，表达出 Gag、Pol和Env蛋白，包装并分泌出包含HIV-I B/C亚型Gag和Env蛋白的且与天然HIV-I 病毒结构类似的病毒样颗粒。2. 权利要求1的方法制备的用于HIV-I B/C亚型的预防性重组VLP疫苗。
【专利摘要】本发明公开了一种用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗及制备方法，制备方法为：用编码HIV-1B/C亚型Gag/Pol、Env蛋白的重组MVA病毒感染原代鸡胚成纤维细胞，表达出Gag、Pol和Env蛋白，包装并分泌出包含HIV-1B/C亚型Gag和Env蛋白的且与天然HIV-1病毒结构类似的病毒样颗粒。本发明的疫苗最大限度模拟HIV-1病毒抗原天然结构，有利于诱导保护性免疫反应，且不含HIV基因，安全性有保障；利用重组MVA感染即可大量获得VLP，工艺简单；本发明可用于预防HIV-1B/C亚型感染引起的相关疾病。
【IPC分类】A61P31/18, A61K39/21
【公开号】CN104906571
【申请号】CN201510369612
【发明人】王涛, 于晓方, 庞正, 袁文肃, 武晓丽, 杨英
【申请人】天津大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月29日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物技术领域。具体的，本发明设及一种用于HIV-1B/C亚型的预 防性重组VLP疫苗及制备方法。
【背景技术】
[000引 艾滋病、又称获得性免疫缺陷综合征（Acquiredimmunedeficien巧syn化ome， AID巧是一种由HIV化umanimmunodeficiencyvirus)引起的全球性疾病，蔓延速度快，死 亡率高。自1981年首次发现艾滋病W来，HIV的感染在世界范围内迅速流行。至2002年 底世界上至少有193个国家和地区发现有HIV感染者死亡，且其仍W每天感染15000人的 速度快速扩展，其中95%W上的HIV感染者生活在发展中国家，已造成全球累计6000余万 人感染，2000余万人死于AIDS,艾滋病在非洲是首要死亡病因，而在全球范围内则是第四 大死亡病因。中国HIV感染人数现已超过100万，HIV/AIDS的流行对社会和经济产生了极 大的负面影响。目前没有针对HIV的特效治疗方法，虽然高效抗逆转录病毒的治疗方法已 经在减轻患者痛苦、延长患者寿命等方面取得了一定的效果，但用于治疗HIV感染的药物 只能控制病毒复制，不能彻底清除病毒，而且抗HIV药物价格昂贵，具有较严重的副作用， 药物使用不当，也会诱发耐药株的产生。因此，研制安全、有效的疫苗是控制HIV传播的重 要手段之一。
[0003] 自从20世纪80年代发现HIVW来，各国政府和企业投入了大量的资金开展了 一百多次的艾滋病疫苗临床试验研究，但绝大部分都没有显示出有效的保护效果。2009 年底，在泰国开展的一项基于重组金丝雀痘病毒疫苗（ALVAC，重组金丝雀痘病毒，带有 HIV-1B亚型丽毒株甜120、LAI毒株的甜41穿膜区，Gag和ProteaseW及部分Nef和 Pol区的CTL表位基因）初始免疫，VaxGengpl20蛋白疫苗（AIDSVA幻加强免疫的联合疫 苗RV144取得了 31. 2%的临床保护结果。该是人类首次获得具有一定保护效果的预防性艾 滋病疫苗，该一结果提示，W重组病毒疫苗初免，蛋白疫苗加强的联合免疫策略，可能是获 得保护性HIV-1疫苗的关键。
[0004] 重组病毒疫苗基于经过改造后降低毒力的各种病毒载体，携带外源基因并能包 装成成熟的病毒颗粒，从而介导外源基因的转移和表达。重组病毒能够W天然感染的方 式，在可接受安全性情况下具有可诱导广泛强烈和持久的免疫应答的作用。包括痘病毒 任oxviruses)、腺病毒（Adenovirus)、腺相关病毒（Adeno-associatedvirus)、瘤疹病毒 化erpesviruses)和麻疹病毒（Measlesvirus)等在内的多种病毒载体被开发用于各种病 毒疫苗的研制，进入临床效果和安全性评价。
[0005] 许多病毒的结构蛋白都具有自动组装成病毒样颗粒（Virus-1化eparticles， VLP)的能力，VLP是模拟自然界真实病毒的天然构象，但缺乏病毒基因组的多蛋白结构，因 而不具有感染性，作为免疫原使用具有安全性，是最有潜力的安全、有效的候选疫苗形式。 VLP与单个蛋白或多肤相比，其构象表位更接近于天然病毒，可明显增强抗体反应或免疫应 答；VLP不需要灭活，避免了因灭活而可能造成的表位改变；此外，由于VLP具有高度重复 的抗原表面，因此能够在无佐剂的情况下，通过与B细胞上的特异性受体有效交联来诱导 强的B细胞免疫应答。迄今为止，已研制出30余种人类及其他动物感染性病毒的VLP，少 量VLP疫苗已获准上市，如己型肝炎病毒化巧atitisBvirus,皿V)疫苗和人乳头瘤病毒 (Humanpapillomavirus,HPV)疫苗。与无包膜病毒不同，HIV-1作为有包膜病毒，其能够 诱发中和抗体的表面抗原为膜蛋白，各结构蛋白经剪切、包装成病毒样颗粒并出芽、分泌至 细胞外的过程特别复杂，因而体外表达获得具有包膜的VLP十分困难。已有报道，利用果蛹 S2细胞建立的稳定表达HIV-1BC亚型Gpl60、Rev和Gag的细胞系，可分泌出与天然病毒结 构接近的VLP结构。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗的制 备方法。
[000引本发明的技术方案概述如下：
[0009] 用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗的制备方法，包括如下步骤；用编码 HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白的重组MVA病毒感染原代鸡胚成纤维细胞，表达出Gag、 Pol和Env蛋白，包装并分泌出包含HIV-1B/C亚型Gag和Env蛋白的且与天然HIV-1病毒 结构类似的病毒样颗粒。
[0010] 所述Gag的氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示，所述化1的氨基酸序列是SEQID NO. 2所示，所述Env的氨基酸序列是SEQIDNO. 3所示。
[0011] 上述方法制备的用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗。
[001引本发明的优点：
[0013] 本发明的疫苗最大限度模拟HIV-1病毒抗原天然结构，有利于诱导保护性免疫反 应，且不含HIV基因，安全性有保障；利用重组MVA感染即可大量获得VLP，工艺简单；单一 组分疫苗用于HIV-1免疫不能诱导有效保护性免疫反应，RV144采用痘病毒初免，蛋白疫苗 加强的策略。本发明VLP为重组痘病毒MVA的副产物（收获细胞，裂解，制备MVA，收获培养 上清，纯化，收获VLP)，一个生产流程可同时生产两种疫苗。
【附图说明】
[0014] 图1为重组MVA感染BHK-21细胞滴定结果。
[0015] 图2为重组MVA感染原代CEF后外源蛋白表达水平比较。图中；M为protein marker;Lanel-3为不同M0I0%FBS培养4她；Lane4-6为不同M0I2%FBS培养4她；Lane 7-9 为不同M0I0%FBS培养 96h;Lanel〇-12 为不同M0I2%FBS培养 96h。
[0016] 图3为HIV-1B/C亚型VLP沉降区间的确定。
[0017] 图4庶糖超速离屯、纯化结果。图中；M为proteinmarker;Lane1为20%庶糖超 速离屯、后沉淀；Lane2为20-60%庶糖梯度超速离屯、后中间层；Lane3为20-60%庶糖梯 度超速离屯、后沉淀。
[0018] 图 5VLPP^Jative-Page及Western-blotting结果。图中；Lane1 为未处理；Lane 2为RIPAlysis处理；Lane3为SDS变性后对照
[0019] 图6小鼠免疫后血清化ISA检测结果。
【具体实施方式】
[0020] W下参照具体的实施例来说明本发明，其中未注明的具体实施条件的方法，通常 按照常规条件，或按照产商所建议的条件进行。
[0021] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0022] 实施例1 ;编码HIV-1B/C亚型Gag/化l、Env蛋白的重组MVA病毒工作种子库的建 立
[002引采用基因工程技术，将HIV-1B/C亚型GagM)l、Env基因分别融合在脑屯、肌炎病 毒巧nc巧halomyocarditisvirus,ECMV)内部核糖体进入位点序列（Internalribozyme 611付7 3116，11?6巧基因佑6油3证齡.；扣759789)的5'和3'端，构建^￥-18/(：亚型 Gag/Pol-IRES-Env的多顺反子基因表达元件，之后将该一元件插入修饰的安卡拉痘病 毒（ModifiedvacciniavirusAnkara,MVA)穿梭载体pSCll质粒（参考文献见下文） 中，经同源重组、瞻斑纯化后获得编码HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白的重组MVA病 毒（具体操作方法参考CarolineStaib,GerdSutter.Liveviralvectors:Vaccinia virus[M]In:VaccineProtocols, 2ndedition.EditedbyAndrewRobinson,Martin Cranage,MichaelJ.Hudson.HumanaPressInc. ;2003:51-68)。MVA在原代鸡胚成纤维细 胞（化ickenemtorofibroblasts,CE巧中扩增的速度最快，病毒的复制和包装均在细胞 内，当细胞完整时并不释放到胞外，因此常W反复冻融和超声的方法破碎细胞W释放病毒。 制备原代CEF巧~10日龄SPF级鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司），待细 胞生长至汇合度90 %W上后，取适量编码HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白的重组MVA病毒 毒种，经含 2%胎牛血清（Fetalcalfserum,FBS;购自Hyclone公司，化t.No. ;SV30087) 的MEM(Minimumessentialmedium,购自Gibco公司，Cat.No. ;C110955)完全培养基稀释 后，接种细胞，待细胞全部病变后（约48~7化），弃培养上清，刮取并收集细胞，低速离屯、 后W适量体积的lOmMTris(pH9. 0)重悬（lml/T175细胞培养瓶），反复冻融3次后，冰浴 超声（购自SonicsandMaterials公司，Model;VCX750)破碎细胞巧0ml离屯、管中，样品 体积不超过30ml，探头高度距离液面1/3高度，超声3s，间隔3s，超声总时间Imin)，重复3 次，进一步破坏细胞，300化pm离屯、5minW去除细胞残渣，收集上清；分之一原始体积 的lOmMTris-HCl(抑9.0)重悬沉淀，重复冻融和超声的步骤，将两次的病毒上清合并；将 病毒上清分装并保存于-80°C冰箱。
[0024] 实施例2 ;编码HIV-1B/C亚型Gag/化l、Env蛋白的 重组MVA病毒工作种子库的滴 定
[0025] 由于MVA为高度弱化的毒株，毒力有限，引起的致细胞病变效应（切topathic effect,CP巧较弱，通常结合免疫学方法进行病毒滴定。W96孔板为例，取出病毒毒种 后，进行10倍系列稀释于含2%FBS的MEM完全培养基中，感染已经培养2化，细胞汇合度 为 80-90%的BHK-21 细胞（购自Americantype州hurecollection,ATCC，ATCCNo.; (XL-IO)每孔100y1，设置复孔及阴性对照。感染4她后，弃培养上清，W丙酬与甲醇1:1混 合的固定液，室温固定细胞2min后，依次W1:1000稀释的痘苗病毒（Vacciniavirus，VV) 兔多抗（购自Bio-Rad公司，Cat.No. ;9503-2057)，1:1000稀释的HRP标记抗兔二抗（购 自Sigma公司，Cat.No.;A0545)，HRP底物（邻联茵香胺-四盐酸盐，H2化，购自北京索莱宝 科技有限公司）作用后，普通光学显微镜下，观察并计算显色的病毒斑数。按相关公式计算 病毒滴度，计算方式为感染单位（Infectiousunits,IU)，显色结果如图1所示。
[0026] 实施例3 ;HIV-1B/C亚型VLP的表达
[0027] 制备原代C邸细胞，待细胞生长至汇合度90%W上后，将编码HIV-1B/C亚型Gag/ Pol、Env蛋白的重组MVA病毒W不同的病毒感染复数（Multiplicityofinfection，MOI) 感染原代CEF细胞，比较不同MOI(1〇-2、1〇-3、1〇-4)和FBS浓度（0%、2% )条件下培养上清 中VLP表达量的差异。感染4她后，收集培养上清；更换新鲜培养基，继续培养4她，收集培 养上清；两次收集的上清分别低速离屯、去除细胞残渣；经SW28转子（购自Beckman公司， Model;0ptimaXE90)、20%庶糖垫层、28000巧111、41：超速离屯、化，弃上清，超速离屯、沉淀用 400y1PBS(抑7. 2)重悬；收集的产物经SDS-PAGE和Western-blotting,分别WGpl20 和 P24 抗体（购自Abeam公司，Cat.No.;油 106578,油63913)验证Gpl20 和Gagp55 的表达。 结果如图2所示，超速离屯、的结果表明，Env和Gag蛋白W非游离态的形式存在，M0I为1(T3 时，表达量略高。
[002引 实施例4 ;HIV-1B/C亚型VLP的纯化
[0029] W实施例3中筛选的表达条件（2%FBS、M0I为1〇-3)，大量制备原代C邸细胞进 行MVA感染和外源蛋白表达。两次收集的培养上清依次经3000巧m、20min，8000巧m、40min， 4°C离屯、，去除细胞碎片；高速离屯、后上清经0.45ym滤膜过滤，进一步去除细胞碎片；使用 300邸截留量孔径的超滤膜包（购自Millipore公司，Model;B300-C)对培养上清进行浓 缩，浓缩倍数为10~20倍之间；W5倍浓缩液体积的PBS(抑7. 2)进行连续流透析，去除培 养基中的血清等其他成分；HIV-1B/C亚型VLP沉降区间的确定；取部分浓缩、透析后上清， 经SW41转子、20-30-40-50-60%密度梯度庶糖垫层、28000巧m、4°C超速离屯、化，自上而下， 每1ml收集样品，经SDS-PAGE和Western-blotting验证（图3)，Env和Gag蛋白位于同一 组分中，超速离屯、后主要组分位于30%庶糖垫层，该与已报道的HIV-1病毒颗粒密度一致； 第一次超速离屯、；透析完成后经SW28转子、20%庶糖垫层、28000巧m、4°C超速离屯、化，弃上 清，离屯、沉淀用1/10超速离屯、前溶液体积的PBS(抑7. 2)重悬，此步骤可去除多数血清中杂 蛋白；第二次超速离屯、：第一次超速离屯、沉淀的重悬液经SW28转子、20%+60%庶糖垫层、 28000rpm、4°C超速离屯、化，W去除不可溶的杂质成分，可观察到在20%与50%庶糖垫层之 间有白色带层，收集此中间层；第=次超速离屯、：第二次超速离屯、收集的中间带层W2倍体 积的PBS(抑7. 2)稀释后，经SW28转子、28000巧m、4°C超速离屯、化，弃上清，此步骤可去除甘 油成分，离屯、沉淀用适量PBS(抑7. 2)重悬，为最终纯化产物。结果显示，经密度梯度超速离 屯、后可进一步去除杂蛋白，如图4所不。
[0030] 我们随后的数据显示，VLP在超速离屯、时Env/Gag位于同一组分，且主要组分位于 30%庶糖垫层，与HIV-1病毒颗粒密度一致，，表明两种病毒蛋白不是W游离态表达，而是 形成VLP(如果病毒蛋白W游离态形式存在，密度较小，不会在30 %庶糖垫层出现；Env和 Gag分子量大小不一，位于同一密度，表明形成复合物；复合物密度与HIV-1病毒颗粒密度 一致，表明表达的化v/Gag形成VLP)
[003U实施例5 ;HIV-1B/C亚型VLP结构的鉴定
[0032] 庶糖密度梯度超速离屯、结合SDS-PAGE和Western-blottingW确定HIV-IB/C亚 型VLP沉降系数区间的实验结果已经证实，该复合物具有类似病毒颗粒的结构，其中包含Gpl60剪切后的产物Gpl20,及未剪切的Gagp55。为了进一步证实该VLP中的Gpl20是否 与天然病毒中结构一样，形成TrimerS聚体结构，错定于包膜上，将纯化后的产物分别作 未处理、RIPA裂解处理后进行化tive-PAGE和Western-blotting,结果如图5所示，未处理 的样本由于包膜未被破坏，分子量过大，无法完成电泳分离；RIPA处理后，破坏包膜，释放 膜蛋白，与产物经SDS变性后的对照相比，分子量要更大，表明非Gpl20单体。
[003引实施例6 ;HIV-1B/C亚型VLP动物免疫及血清学检测
[0034] 6~8周龄雌性BALB/c小鼠（购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司），随机 分为3组，每组10只，分别为PBS组、DNA组和DNA+VLP组。DNA疫苗为编码HIV-1B/C亚型 Gag/Pol、Env蛋白的重组pVT118-Gag/Pol-Env质粒，其编码的氨基酸序列与编码HIV-1B/C 亚型Gag/化l、Env蛋白的重组MVA病毒中对应的序列一致，将Gag/化l、Env基因分别正向 插入真核表达载体VR1012(购自VicalInc.，SanDiego，CA)的甜aI/BamHI、BamHI位点之 间，将两个重组质粒pVR1012-Gag/Pol、pVR1012-Env分别经BamHI、BglII限制性内切酶消 化后，经T4DNA连接酶处理，两个重组质粒合并，称为pVT118-Gag/Pol-Env，转染真核细胞 后可同时表达HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白，pVT118-Gag/Pol-Env重组质粒免疫剂量 为DNAlOOyg/只；VLP疫苗为编码HIV-1B/C亚型Gag/化l、Env蛋白的重组MVA病毒感染 原代CEF表达的VLP纯化后产物，使用河北医科大学开发的HIV-1P24抗原检测试剂盒，W 63径蛋白定量，免疫剂量为2^肖/只；41(0巧3佐剂（购自化61'111〇公司，〔3*.齡.；77161)，免 疫剂量为50yg/只；免疫总体积为100y1/只，肌肉注射。免疫程序为：第0、14和28天进 行PBS和DNA免疫，第42和56天进行DNA和VLP免疫，每只小鼠均免疫5次，第70天处死 小鼠，收集血清。小鼠血清WPBS进行倍比稀释，PBS组血清从1:10开始稀释，其他免疫组 血清从1:100开始稀释，使用HIV-1BC亚型Gpl20ELISA试剂盒（购自ImmuneTechnology 公司，Cat.No. ;口-E3Ag-HIV甜120CN54-MAB)检测特异性IgG抗体水平。结果如图6所示， DNA免疫，VLP加强后，与单独免疫DNA相比，抗体水平明显得到提高。
[0035] 综上所述，利用编码HIV-1B/C亚型Gag/化1、Env蛋白的重组MVA病毒感染原代 C邸细胞后，能表达相应外源蛋白Gag、Pol和化V，包装、形成并分泌HIV-1BC亚型Gag和 Env蛋白的且与天然HIV-1病毒结构类似的病毒样颗粒。为HIV-1蛋白疫苗提供一种新的 候选，同时，本发明亦建立了该VLP大量生产及纯化的方法，动物免疫实验表明，该蛋白能 够诱导有效的针对HIV-1的免疫应答，与其他类型疫苗联合使用，可获得更好的免疫效果。
【主权项】
1. 用于HIV-I B/C亚型的预防性重组VLP疫苗的制备方法，其特征是包括如下步骤：用 编码HIV-I B/C亚型Gag/Pol、Env蛋白的重组MVA病毒感染原代鸡胚成纤维细胞，表达出 Gag、Pol和Env蛋白，包装并分泌出包含HIV-I B/C亚型Gag和Env蛋白的且与天然HIV-I 病毒结构类似的病毒样颗粒。2. 权利要求1的方法制备的用于HIV-I B/C亚型的预防性重组VLP疫苗。
【专利摘要】本发明公开了一种用于HIV-1B/C亚型的预防性重组VLP疫苗及制备方法，制备方法为：用编码HIV-1B/C亚型Gag/Pol、Env蛋白的重组MVA病毒感染原代鸡胚成纤维细胞，表达出Gag、Pol和Env蛋白，包装并分泌出包含HIV-1B/C亚型Gag和Env蛋白的且与天然HIV-1病毒结构类似的病毒样颗粒。本发明的疫苗最大限度模拟HIV-1病毒抗原天然结构，有利于诱导保护性免疫反应，且不含HIV基因，安全性有保障；利用重组MVA感染即可大量获得VLP，工艺简单；本发明可用于预防HIV-1B/C亚型感染引起的相关疾病。
【IPC分类】A61P31/18, A61K39/21
【公开号】CN104906571
【申请号】CN201510369612
【发明人】王涛, 于晓方, 庞正, 袁文肃, 武晓丽, 杨英
【申请人】天津大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月29日
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