在胰岛移植中作为佐剂的cxcr1/2抑制剂的制作方法
在胰岛移植中作为佐剂的cxcr1/2抑制剂的制作方法
【专利说明】在肢岛移植中作为佐剂的CXCR1/2抑制剂
[0001]本申请是申请号为201080045208.5、发明名称为"在膜岛移植中作为佐剂的 CXCR1/2抑制剂"的申请的分案申请，该母案申请是2010年10月6日提交的PCT申请PCT/ EP2010/064921进入中国国家阶段的申请。
技术领域
[0002] 本发明设及可用于在1型糖尿病患者膜岛移植中作为佐剂的化合物。
【背景技术】
[0003] W整个膜腺或分离之膜岛形式进行的膜腺组织移植已经成为治疗1型膜岛素依 赖性糖尿病的临床选择。
[0004] 膜岛移植特别具有吸引力，该是因为与移植整个膜腺相比，膜岛移植具有更小的 创伤并且与较低的严重并发症的风险；但是，该种方法仍然受限于低效率。
[0005] 膜岛移植的早期策略基于已在实质器官移植中得到成功证明的方案（包括施用 免疫抑制剂（如硫挫嚷岭、环抱菌素和糖皮质激素）。结果证明该种策略在膜岛移植的具 体情形中不是有效的并且结果非常差，大多数的植入在移植起一年内都失败（Sulaiman和 化apiro，Di油etes，Obesity and Met油olism，8,2006，15-25)。
[0006] 近年来，引入了新的特异性免疫抑制方案和膜岛制备技术的埃德蒙顿方案 巧dmonton Protocol)的开发已显著地改善了膜岛移植的临床结果。
[0007] 根据埃德蒙顿方案，将膜岛从已故供者的膜腺中分离、纯化接着通过经上腹部 并进入肝口静脉放置的导管移植到受者中；当膜岛细胞输入肝脏后不久，该细胞开始释 放膜岛素。为了防止发生排斥，使用新的免疫抑制方案，该方案需要使用免疫抑制药物 (即西罗莫司（Sirolimus)和他克莫司（Tacrolimus))与CD25单克隆抗体达利珠单抗 值aclizum油）的组合（Saphiro等，N 化gl.JMed，2000，：M3(4) ;230-238)。
[000引遗憾的是，仍然有许多膜岛移植的缺陷没有解决，并且该些缺陷阻碍该方法成为 针对患有1型糖尿病患者的标准治疗方法。
[0009] 有关膜岛移植的第一个缺点是，即使埃德蒙顿方案显著地提高了成功率，由于一 系列复杂的现象（如血液介导的即刻炎症反应（IBMIR)、炎性细胞的动员和非特异性免 疫）所致，仍有高百分率的早期移植失败。事实上，在人体中肝内输入膜岛与血液介导的 即刻炎症反应、血栓W及伴随有血液肝酶升高的肝组织缺血有关炬arshes NR等，J Am Coll Surg，2005,200(3) ;353-361;Barshes NR等，J Leukoc Biol，2005,77(5) ;587-97; Be;rtuzzi等，J Clin Elndocrinol Met油，2004,89(11) ;5724-8;Miargava R等Di油etes， 2004,53(5)，；l3ll_7;Con1:reras等，2004,53(11) ;2894-14;Johansson等，Diabetes, 2005,54(6) ;1755-62)。在肝脏中植入过程中有多达50%至75%的膜岛损失（Contreras 等，同上），该被认为是造成为实现血糖量正常而需要巨大数目膜岛的主要原因炬arshes 等，同上）。
[0010] 另外，甚至当移植获得最初成功并且产生不依赖于受者的膜岛素时，该移植的膜 岛似乎也随时间失去其功能。该一事件限制了在移植患者中实现长期不依赖于膜岛素 的可能，从移植起两年后只有14%的患者表现出不依赖于膜岛素[MelocheRMWorldJ Gastroenterol2007; 13(47) ;6；M7-6355]。
[0011] 另一个缺点是埃德蒙顿方案需要使用免疫抑制药物组合；西罗莫司和他克莫司必 须终生服用或者只要移植的膜岛继续起作用就要服用。但是该些药物具有明显的副作用， 减少该些副作用是所期望的。来自免疫抑制治疗法的并发症是在该移植类型中报道的第二 常见的严重事件。
[0012] 因此，仍然有必要进一步的开发，W改善植入物的长期存活和功能，从而使对葡萄 糖随时间的控制并减少免疫抑制治疗。
[0013]CXCL8是一种由炎性介质诱导的趋化因子，其参与早期组织修复并且已被证实 通过诱导趋化、内皮细胞的存活和增殖来促进血管生成（Li等，JImmunol，2003，170 ; 3369-3376)，W及作为中性粒细胞引诱剂起作用。CXCL8通过与其同源的G蛋白偶联受体 CXCR1和CXCR2结合来发挥其作用。
[0014] 近来的文献假定CXCL8可W通过诱导植入组织的血管重建来促进植入（Mov址edi 等，Di油etes，2008,57 ;2128_36)。
[0015]EP1123276公开了N-(2-芳基-丙酷基）-横酷胺类及其可药用盐（其中包括 R(-)-2-[(4-异了基苯基）丙酷基]-甲横酷胺（I))，其作为CX化-8诱导的中性粒细胞趋 化和脱颗粒的抑制剂使用，特别是用于治疗诸如牛皮癖、类风湿性关节炎、溃瘍性结肠炎、 急性呼吸功能不全（ARD巧、先天性纤维化和肾小球肾炎等疾病。
[0016]EP1355641公开了R(-)-2-[(4-异了基苯基）丙酷基]-甲横酷胺及其可药用盐 (特别是其赖氨酸盐）在预防和治疗移植器官的缺血/再灌注损伤W及在实质器官（特别 是需要从供者取得并在移植前储存的肾）移植后由于排斥反应而导致的功能性损伤。所述 损伤被认为是造成植入物功能延迟的原因，该使得有必要在肾移植后进行透析。
[0017]EP1579859公开了N-(2-芳基-丙酷基）-横酷胺类（其中包括R(-)-2-[(4-异了 基苯基）丙酷基]-甲横酷胺及其赖氨酸盐）在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的用途。
【发明内容】
[001引本发明人出乎意料地发现，与从现有技术教导中所期望的相反，CXCR1和/或CXCR2的激动剂对膜岛移植后的膜岛存活是有害的。如在之后的实施例中将描述的，与野生 型小鼠相比，当将膜岛移植到CXCR2敲除的BALB/C小鼠中时，膜岛表现出增强的功能和存 活，并且与对照小鼠相比具有持续更好的葡萄糖耐量和更低的葡萄糖浓度。
[0019] 另外，本发明人实施的实验清楚地证明了抑制CXCR1和/或CXCR2信号转导的化 合物能够有效地改善膜岛移植后植入物的存活和功能。
[0020] 因此，本申请的第一个目的是CXCR1和/或CXCR2的抑制剂作为佐剂在1型糖尿 病患者膜岛移植中的用途。
[0021] 对于根据本发明的"CXCR1和/或CXCR2的抑制剂"而言，其意指能够阻遏CX化8 之源自CXCR1和/或CXCR2活化的生物学活性的化合物。该些化合物可W是所述受体的竞 争性括抗剂或变构抑制剂。
[0022] 本发明优选的化合物是式I化合物或其可药用盐：
[0023]
[0024] 其中，R选自直链或支链的4- (Ci-Ce)烷基、4-S氣甲横酷氧基或3-苯甲酯基，并 且Ri是直链或支链的（Ci-Ce)烷基。具体地，根据本发明优选的化合物是R(-)-2-[(4-异 了基苯基）丙酷基]-甲横酷胺（通常称为瑞帕他辛化epertaxin)或瑞帕利辛，在下文中 称为瑞帕利辛）和R(-)-2-[(4'-=氣甲横酷氧基）苯基]-丙酷基-甲横酷胺（通常并且 在下文中称为莫瑞辛（Meraxin))。
[0025] 本发明化合物的优选的盐是赖氨酸盐和钢盐。本发明化合物的特别优选的盐是瑞 帕利辛的赖氨酸盐和莫瑞辛的钢盐。
【附图说明】
[0026] 图1 ;图A表示在敲除小鼠（淡色线）和野生型小鼠（黑线）中从同系移植400膜 岛的-1天至移植后巧天测量的非禁食性血糖（单位为mg/dl)。图B表示口服葡萄糖耐 量试验（OGTT)的结果。在施用葡萄糖之前W及口服葡萄糖后10分钟、20分钟、30分钟、60 分钟和90分钟后立即测定血糖（单位为mg/dl)。示出每只动物的血液葡萄糖曲线。
[0027] 图2;图A表示移植后在瑞帕利辛巧巧arixin)处理的小鼠（实线）或对照小鼠 (虚线）中在不同时间时的血糖。图B表示Cox回归多变量分析。
[002引图3a和3b用散点示出在瑞帕利辛存在或不存在时移植有来自同一分离物之膜岛 的小鼠在口服葡萄糖耐量试验（0GTT)(图3a)和静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT)(图3b)中 获得的平均值。标记指明该分离物的数目。方形和圆形分别表示移植有250膜岛当量（1巧 或150膜岛当量的小鼠。上图和下图分别示出移植后1个月和3个月的数据。实线是鉴 别线；在鉴别线上方的圆形表示在瑞帕利辛组中比在载剂处理组（A+)中具有更高的观测 值。
[0029] 图4表示在移植有150膜岛当量（图A)或250膜岛当量（图B)的瑞帕利辛处理 的动物和载剂处理的动物移植后24小时和48小时时的丙氨酸氨基转移酶（ALT)的循环水 平。
[0030] 图5 ;图A表示在用瑞帕利辛、雷帕霉素、瑞帕利辛+雷帕霉素或载剂处理的小鼠 中移植后不同时间时的血糖。图B表示Cox多变量回归分析。
[0031] 图6 ;在用载剂（A)、瑞帕利辛炬)、雷帕霉素似或瑞帕利辛+雷帕霉素做处理 的小鼠中移植后24小时和48小时时的丙氨酸氨基转移酶（ALT)的循环水平。
[0032] 图7 ;图A表示在用瑞帕利辛、雷帕霉素、瑞帕利辛+雷帕霉素或载剂处理的小鼠 中移植后随时间的移植物存活百分率。图B表示Cox多变量回归分析。
[0033] 图8示出在对照小鼠（粗线）或瑞帕利辛处理的小鼠（淡色线）中膜岛移植后随 时间（天）从肝脏中提取的P^1N的数目（表示为每毫克肝组织的细胞）。
[0034] 图9示出在对照小鼠（粗线）或瑞帕利辛处理的小鼠（淡色线）中膜岛移植后随 时间（天）从肝脏中提取的NK的数目（表示为每毫克肝组织的细胞）。
[0035] 图10示出在同种异体膜岛移植后5天从肝脏中提取的不同白细胞亚群中CXCR2+ 细胞的百分数。在横坐标中，数字1至11代表如下含义：
[0036] 1;PMN(GrrCDl化+CD11C-)
[0037] 2 ;PMN(GrrCDl化+Ly6c-)
[003引 3;巨瞻细胞（CDUb+CDllc-GrO
[0039] 4;树突状细胞（CDllc+CDUb+GrO
[0040] 5;淋己细胞（CD3+CD4+)
[0041] 6 ;淋己细胞（CD3+CD8+)
[0042] 7;B淋己细胞（CD19+)
[0043] 8;NKT细胞（NK1. 1+CD3+)
[0044] 9 ;NKT细胞（NK1. 1+CD3-)
[0045] 10;淋己细胞（CD4+TC化+)
[0046] 11;淋己细胞（CD8+TC化+)
【具体实施方式】
[0047] 如下文将描述地，在动物模型中，所述式I化合物能有效地改善膜岛移植后植入 物的存活和功能。
[0048] 详细地，在膜岛移植的实验模型中得到的数据证明了上述化合物（W R(-)-2-[(4-异了基苯基）丙酷基]-甲横酷胺为代表）在保护所移植的0-细胞免于失去 活性和/或退化中的明显作用。
[0049] 根据本发明一个优选的实施方案，所述式I化合物是瑞帕利辛。根据另一个优选 的实施方案，所述式I化合物是莫瑞辛。
[0050] 本发明化合物有效地支持在1型糖尿病中植入移植的膜岛细胞。
[0化1] 事实上，从下述实验部分中将会更加清楚的是，与对照相比，在同基因或同种异体 膜岛移植的-1天到+6天在动物模型中静脉施用瑞帕利辛引起达到正常血糖水平（非禁食 血液葡萄糖水平低于250mg/ml)更高的概率和减少的时间中值。
[0化2] 因此，本发明的另一个目的是CXCR1和/或CXCR2抑制剂（优选式I化合物，更优 选瑞帕利辛或莫瑞辛）用于在1型糖尿病患者中膜岛移植后改善植入和早期植入物功能并 用于降低早期植入失败发生率的用途。
[0053] 所述移植优选在患者的肝脏中或骨髓中进行。
[0化4] 同种异体膜岛移植的实验证明了所述CXCR1/CXCR2抑制剂瑞帕利辛的施用显著 地降低了在移植后达到初始功能的小鼠中排斥反应的发生。
[0化5] 另外，所述结果证明，与对照相比，植入物的功能保持更长的时间，并伴随存活时 间中值的增加。
[0056] 在肝脏和骨髓中的所述膜岛移植均表明了瑞帕利辛在改善植入物的功能和存活 方面的功效。
[0化7] 因此，本发明的另一个目的是CXCRl和/或CXCR2抑制剂（优选式I化合物，更优 选瑞帕利辛）用于降低植入物的排斥反应W及改善植入物长期存活的用途。
[005引为此目的，本发明的所述化合物可W单独使用或者在与一种或更多种免疫抑制剂 进行组合治疗（优选选自西罗莫司（也称为雷帕霉素）和他克莫司）。
[0化9] 但是，在实验部分中报道的所获得的数据还表明本发明化合物单独使用即可足W 抑制植入物排斥。事实上，如在实验部分中所示地，瑞帕利辛对CXCR1/2受体的阻断显著延 长了小鼠在移植后达到原来功能的排斥时间，然而，该没有被雷帕霉素显著地改变。另外， 单独施用瑞帕利辛提供的结果与组合施用瑞帕利辛和雷帕霉素的结果是相当的。该些数据 强烈地表明，在不需要在毒性方面有明显优势的免疫抑制疗法的情况下或者所述需要降低 的情况下，单独施用瑞帕利辛即足W降低植入物排斥反应。
[0060] 本发明的所述化合物的合成可W根据本领域熟知的方法进行。例如，瑞帕利辛可 W如EP1123276的实施例1和EP1355641的实施例1中所公开的方法制备，而所述赖氨酸 盐则可W分别如前述专利的实施例7和实施例2中所公开的方法制备。例如，莫瑞辛可W 根据EP1776336的实施例1制备。
[0061] 根据本发明使用的化合物配制成适于口服施用的药物组合物（如片剂、胶囊、 糖浆剂，优选为控制释放制剂的形式），或者适于胃肠外施用的药物组合物（优选为适于 静脉内或肌内给药的无菌溶液的形式）。药物的形式可W根据常规的方法制备，例如在 Remington，"TheScienceandPracticeofPharmacy"，第 21 片反（LippincottWillians 和Wi化ins)中所公开的方法。优选地，在上述每一种施用形式中瑞帕利辛或其可药用盐的 量将例如提供每千克体重2mg至15mg的化合物或盐，而莫瑞辛或其可药用盐的量将例如提 供每千克体重lOmg至20mg的化合物或盐。在任何情况下，待施用药剂的方案和量将由医 师根据患者的需要确定。
[0062] 现将在下述实验部分中对本发明更多的细节做进一步的举例说明。
[006引实验部分
[0064] 1.在敲除小鼠中的同基因膜岛移植
[0065] 为了测试CX化8信号转导通路通过CXCR1和CXCR2的活化对膜岛存活的作用，在 Ba化/c CXCR2-/-小鼠和CXCR化/+小鼠中在同基因膜岛肝内移植后对膜岛功能进行了评 估。CXCR1在小鼠中不表达，因而CXCR2的敲除完全消除了由CX化8引起的信号转导。
[0066] 取移植后第一周非禁食血糖和移植后4周口服葡萄糖耐量作为功能性指标。如图 1所示的，如在整个评估阶段中循环葡萄糖浓度显著降低所证明地，经移植的CXCR2敲除小 鼠明显地表现出比对照野生型小鼠持续更好的葡萄糖耐受。
[0067] 如下面第2部分中所描述地进行了口服葡萄糖耐量试验。
[0068] 2.在小鼠中的同基因膜岛移植
[0069] 将取自12周龄C57小鼠的膜岛移植到糖尿病性C57小鼠（四氧喀晚诱导的糖尿 病，血糖高于450mg/dl)的肝脏中。使用两种不同的边际膜岛量模型（marginalisletmass model)，即150IE(膜岛当量）和250膜岛当量。瑞帕利辛从膜岛移植-1天开始到膜岛移 植后6天或13天W8mg/kg/小时的剂量通过皮下（S.C.)连续注入。对照动物接受连续的 皮下施用载剂。
[0070] 首先评估了两个连续的检测在膜岛移植后达到小于200mg/dl的非禁食血液葡萄 糖水平的能力。如图2所示，与用载剂处理的小鼠的35. 1%和50天相比，用瑞帕利辛处理 的小鼠达到正常血糖（611肖17〇3611113)(小于20〇1]1肖/(11)的概率和时间中值是；50%和7天 (时序检验（LogRank)，P< 0. 012)。
[0071] W瑞帕利辛处理、处理时间、移植膜岛的数目和受者移植前血糖作为协变量，多变 量Cox回归分析证实了瑞帕利辛显著地改善了结果（比数比（Oddsratio) ;2. 6 ;95%置信 区间（CI) ;1. 1-6. 1 ;p< 0.021)。正如预期的，250膜岛当量的移植引起了改善的植入（比 数比；1. 6 ;95%置信区间；0. 6-4. 3;p< 0. 28)，而移植前血糖对该结果有负面影响（比数 比；0. 6 ;95%置信区间；0. 3-1. 1;p= 0. 12)。
[007引在移植后1个月和3个月进行了静脉内葡萄糖耐量试验（IVGTT)和口服葡萄糖耐 量试验（0GTT)W评价植入膜岛的功能性。IVGTT在禁食16小时后开始；小鼠通过尾静脉 注射给予葡萄糖（0. 5g/kg)。在注射后0分钟、1分钟、5分钟、15分钟、20分钟、30分钟和 60分钟时获取血液样本并用于测定葡萄糖浓度。从IVGTT中，在各血浆葡萄糖值对数变换 后，通过静脉施用后循环葡萄糖在1分钟和15分钟之间的减少（KGi_i5)作为葡萄糖消除常 数（KG;表示为每分钟葡萄糖消除的百分数）来将葡萄糖耐量量化。对全部1分钟至60分 钟的葡萄糖消失速率（KGi_e。）进行类似的评估。该参数表示在整个试验中葡萄糖消失的速 率。0GTT在4小时禁食后开始；通过口腔管饲法给予小鼠葡萄糖（Ig/kg)。在施用葡萄糖 0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟后获取血液样本并用于测定 葡萄糖浓度。0GTT期间葡萄糖曲线下面积（AUC)用梯形法计算（基线=0分钟）。在图3 中示 意了在IVGTT和0GTT后膜岛移植对葡萄糖耐量的影响。数据表示为离散的点。每一 个点表示在瑞帕利辛存在或不存在时移植来自相同分离物之膜岛的小鼠中测量的参数的 平均值；标记表明该分离物的数目，而方形和圆形分别表示移植有250膜岛当量或150膜岛 当量的小鼠。上图和下图分别表示移植后1个月和3个月的数据。该实线为鉴别线；鉴别 线上方的圆形代表在瑞帕利辛处理组中比在载剂处理组（A+)中具有更高的观测值。移植 后1个月和3个月的0GTT表明，在用瑞帕利辛处理的小鼠中葡萄糖的AUC仍然低于对照小 鼠的AUC。与该些数据一致的是，与对照小鼠相比，在瑞帕利辛处理的小鼠中在1分钟至15 分钟做H5)和1分钟至60分钟做1_6。）的葡萄糖消除常数显著地增加了。
[0073] 通过移植后24小时和48小时时的丙氨酸氨基转移酶（ALT)的循环水平进行了对 急性肝损伤的量化。在移植有150膜岛当量或250膜岛当量的小鼠中瑞帕利辛的处理均没 有影响ALT水平（图4)。类似地，在白细胞、红细胞和血小板的循环水平上没有明显差别 (数据未给出）。
[0074] 3.在小鼠中的同种异体膜岛移植
[0075] 将来自12周龄Ba化/c小鼠的膜岛移植到糖尿病性巧7小鼠（四氧喀晚，血糖高 于450mg/dl)的肝脏中。在一些实验中，为了评价任何自身免疫反应的存在，将来自12周 龄巧7BL/6炬6)小鼠的膜岛移植到糖尿病雌性N0D/LtJ(N0D)小鼠的肝脏中。在至少S次 非禁食血液葡萄糖读数高于350mg/dl后，将NOD小鼠作为膜岛移植受者使用。在该两种情 形下均移植了 400膜岛当量。将该些动物单独用瑞帕利辛处理（从移植-1天开始至移植 后7天W5.28mg/kg/小时连续皮下注入）、单独用雷帕霉素（每日腹膜内（i.p.)注射，从 第0天的0. 3mg/kg的诱导剂量开始，之后维持0. 15mg/kg的剂量直到第14天）、用瑞帕利 辛+雷帕霉素或载剂处理。
[0076] 首先评价了达到初始功能的能力（定义为在膜岛移植后在2次连续测定中非禁食 血液葡萄糖水平低于250mg/dl)和排斥时间（定义为2次连续的非禁食血液葡萄糖读数高 于300mg/dl)。
[0077] 考虑到在同种免疫情况下所有移植的小鼠，达到初始功能（血糖低于250mg/dl) 的概率和时间中值是；对于单独用瑞帕利辛处理的小鼠为72%和1天，对于单独用雷帕霉 素处理的小鼠为73%和1天，对于用瑞帕利辛+雷帕霉素处理的小鼠为69%和1天，对于 用载剂处理的小鼠为44%和2天，（图5,时序检验p< 0.041)。W瑞帕利辛处理、雷帕霉 素处理W及受者移植前血糖作为协变量，多变量Cox回归分析证实瑞帕利辛处理改善了该 结果（比数比；2. 5 ;95%置信区间；0. 79至2. 99;p< 0. 202)。用雷帕霉素处理（比数比； 1. 1 ;95%置信区间；0. 62至2. 15 ;p<0. 62)与移植前血糖（比数比；1.03 ;95%置信区间； 0. 68至1. 59;p< 0. 88)相关性较低。
[007引移植后24小时和48小时测定的ALT循环水平在雷帕霉素存在或缺乏时都没有受 到瑞帕利辛的影响（图6)。
[0079] 此外，用瑞帕利辛处理显著地增加了小鼠在移植后实现初始功能的达排斥时间 (thetimetorejection))(图7)。在缺乏雷帕霉素时，对于用瑞帕利辛和载剂处理的小 鼠而言，存活时间中值分别为（12 + 0. 6)天（n= 13)和巧±0. 5)天（n= 7)。在雷帕霉素 存在时，对于瑞帕利辛小鼠和对照小鼠而言，存活时间中值分别为（12±。天（n= 11)和 巧±0. 6)天（n= 11)。W瑞帕利辛处理、雷帕霉素处理和受者移植前血糖作为协变量的多 变量Cox回归分析证实了该数据。对于植入物存活损失而言，证实了用瑞帕利辛处理是显 著独立的保护因素（比数比；〇. 252 ;95%置信区间；0. 099至0. 64;p= 0. 004)，而雷帕霉 素处理（比数比；1. 173 ;95%置信区间；0. 562至2. 45;p= 0. 67)和移植前血糖（比数比； 1. 002 ;95%置信区间；0. 604 至 1. 661;p= 0. 99)则不显著。
[0080] 4.同种异体膜岛移植后通过瑞帕利辛的CXCR1/2阻断调节肝脏炎症状况
[0081] 在小鼠中同种异体肝内膜岛移植后在瑞帕利辛处理存在或不存在的情况下分析 了肝内白细胞种群。在瑞帕利辛存在的情况下从移植-1天开始W8mg/小时/kg的剂量皮 下连续输注瑞帕利辛7天或者在载剂存在时，将来自12周龄的Balb/c小鼠的膜岛（400膜 岛当量）移植到糖尿病性C57小鼠（四氧喀晚诱导，> 450mg/dl)的肝脏中。小鼠在膜岛 移植后0天、+1天、+3天、巧天、巧天、+10天、+14天处死并且在解剖时将肝脏称重。从 已知重量的两个肝叶制备单细胞悬液并且通过流式细胞术进行肝内白细胞（ML)种群分 析。将该些细胞用异硫氯酸巧光素（FITC)、藻红蛋白（P巧或别藻红蛋白（APC)标记的抗 CD4、抗CD8、抗CD3、抗CD19、抗TCR、抗NK1. 1、抗CD11、抗Gr-1、抗CD1lb和抗CD1Ic特异 性抗体任harMingen，SanDiego，CA)进行表面染色，W检测Gr-r/CDUbVCDllc-细胞（多 为PMN)、CD47TCR+(多为T辅助细胞）、CD87TCR+细胞（多为细胞毒T淋己细胞）、NK1. 1 7 CD3-细胞（NK细胞）、NK1. 1 7CD3+细胞（NKT细胞）和Gr-1 7CDUb7CDllc-(多为巨瞻细 胞）、CD1157CDnb7CDllc-(多为单核细胞）、CDllc7CDUb7Grr(多为树突状细胞）、 CD19 (多为B淋己细胞）。样品利用FACSCalibur流式细胞仪获得，数据利用CE化如est软 件炬ectonDickinsonImmunocytometrySystems，SanJose，CA)分析。
[0082] 在实验的第二种情形下，在白细胞渗透达到最大渗透度时的时间点评估肝内白细 胞种群上CXCR2和CXCR1的表达。
[0083] 获得的结果证实了用瑞帕利辛处理降低了同种异体移植后白细胞在肝脏中的动 员和渗透。特别是表达CXCR2的白细胞亚群的中性粒细胞（图8)和自然杀伤T细胞（图 9)受到了明显的影响，也可W由图10中所示。
[0084] 5.通过瑞帕利辛的CXCR2/1阻断影响在骨髓中膜岛移植后同种异体膜岛移植的 结果
[0085] 在瑞帕利辛存在时从移植-1天开始W8mg/小、时/kg的剂量皮下连续注入瑞帕 利辛7天，将来自12周龄的Ba化/c小鼠的膜岛（400膜岛当量）移植到糖尿病性C57小 鼠（四氧喀晚诱导，> 450mg/dl)的骨髓中。对照组小鼠用载剂处理。该实验主要的终点 是达到初始功能的能力（定义为在膜岛移植后2次连续测定中非禁食血液葡萄糖水平低于 250mg/dl)和排斥时间（定义为2次连续的非禁食血液葡萄糖的读数高于350mg/dl)。
[0086] 获得的结果证实了通过用瑞帕利辛的处理改善了结果。
【主权项】
1. CXCR1和/或CXCR2的抑制剂在制备用于1型糖尿病患者中胰岛移植的佐剂药物中 的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂是式I化合物或其可药用盐：其中，R选自直链或支链的4-沁-(：6)烷基、4-三氟甲磺酰氧基和3-苯甲酰基，并且R1 是直链或支链的（Q-C；)烷基。3. 根据权利要求2所述的用途，其中所述可药用盐选自赖氨酸盐和钠盐。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述药物改善胰岛细胞植入和早期 植入物功能。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述药物减少移植胰岛失败的发生。6. 根据权利要求5所述的用途，其中所述药物减少胰岛细胞植入排斥的时间和发生。7. 根据权利要求6所述的用途，其中所述药物改善长期植入物存活。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中所述式I化合物选自 R(-)-N-2-[(4-异丁基苯基）丙酰基]-甲磺酰胺和R(-)-2-[(4' -三氟甲磺酰氧基）苯 基]丙酰基-甲磺酰胺。
【专利摘要】本发明涉及CXCR1和/或CXCR2抑制剂，其用于制备在1型糖尿病患者胰岛移植中作为佐剂使用的药物。具体地，可根据本发明使用的化合物具有下述式(I)，其中的R和R1如本说明书中所定义。
【IPC分类】A61P37/06, A61K39/39
【公开号】CN104906572
【申请号】CN201510089937
【发明人】洛伦佐·皮耶蒙蒂, 路易莎·达丰希奥, 马尔塞洛·阿莱格雷蒂
【申请人】多姆皮制药公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2010年10月6日
【公告号】CA2775902A1, CN102665703A, EP2308484A1, EP2485723A1, EP2485723B1, US20120202884, WO2011042466A1
【专利说明】在肢岛移植中作为佐剂的CXCR1/2抑制剂
[0001]本申请是申请号为201080045208.5、发明名称为"在膜岛移植中作为佐剂的 CXCR1/2抑制剂"的申请的分案申请，该母案申请是2010年10月6日提交的PCT申请PCT/ EP2010/064921进入中国国家阶段的申请。
技术领域
[0002] 本发明设及可用于在1型糖尿病患者膜岛移植中作为佐剂的化合物。
【背景技术】
[0003] W整个膜腺或分离之膜岛形式进行的膜腺组织移植已经成为治疗1型膜岛素依 赖性糖尿病的临床选择。
[0004] 膜岛移植特别具有吸引力，该是因为与移植整个膜腺相比，膜岛移植具有更小的 创伤并且与较低的严重并发症的风险；但是，该种方法仍然受限于低效率。
[0005] 膜岛移植的早期策略基于已在实质器官移植中得到成功证明的方案（包括施用 免疫抑制剂（如硫挫嚷岭、环抱菌素和糖皮质激素）。结果证明该种策略在膜岛移植的具 体情形中不是有效的并且结果非常差，大多数的植入在移植起一年内都失败（Sulaiman和 化apiro，Di油etes，Obesity and Met油olism，8,2006，15-25)。
[0006] 近年来，引入了新的特异性免疫抑制方案和膜岛制备技术的埃德蒙顿方案 巧dmonton Protocol)的开发已显著地改善了膜岛移植的临床结果。
[0007] 根据埃德蒙顿方案，将膜岛从已故供者的膜腺中分离、纯化接着通过经上腹部 并进入肝口静脉放置的导管移植到受者中；当膜岛细胞输入肝脏后不久，该细胞开始释 放膜岛素。为了防止发生排斥，使用新的免疫抑制方案，该方案需要使用免疫抑制药物 (即西罗莫司（Sirolimus)和他克莫司（Tacrolimus))与CD25单克隆抗体达利珠单抗 值aclizum油）的组合（Saphiro等，N 化gl.JMed，2000，：M3(4) ;230-238)。
[000引遗憾的是，仍然有许多膜岛移植的缺陷没有解决，并且该些缺陷阻碍该方法成为 针对患有1型糖尿病患者的标准治疗方法。
[0009] 有关膜岛移植的第一个缺点是，即使埃德蒙顿方案显著地提高了成功率，由于一 系列复杂的现象（如血液介导的即刻炎症反应（IBMIR)、炎性细胞的动员和非特异性免 疫）所致，仍有高百分率的早期移植失败。事实上，在人体中肝内输入膜岛与血液介导的 即刻炎症反应、血栓W及伴随有血液肝酶升高的肝组织缺血有关炬arshes NR等，J Am Coll Surg，2005,200(3) ;353-361;Barshes NR等，J Leukoc Biol，2005,77(5) ;587-97; Be;rtuzzi等，J Clin Elndocrinol Met油，2004,89(11) ;5724-8;Miargava R等Di油etes， 2004,53(5)，；l3ll_7;Con1:reras等，2004,53(11) ;2894-14;Johansson等，Diabetes, 2005,54(6) ;1755-62)。在肝脏中植入过程中有多达50%至75%的膜岛损失（Contreras 等，同上），该被认为是造成为实现血糖量正常而需要巨大数目膜岛的主要原因炬arshes 等，同上）。
[0010] 另外，甚至当移植获得最初成功并且产生不依赖于受者的膜岛素时，该移植的膜 岛似乎也随时间失去其功能。该一事件限制了在移植患者中实现长期不依赖于膜岛素 的可能，从移植起两年后只有14%的患者表现出不依赖于膜岛素[MelocheRMWorldJ Gastroenterol2007; 13(47) ;6；M7-6355]。
[0011] 另一个缺点是埃德蒙顿方案需要使用免疫抑制药物组合；西罗莫司和他克莫司必 须终生服用或者只要移植的膜岛继续起作用就要服用。但是该些药物具有明显的副作用， 减少该些副作用是所期望的。来自免疫抑制治疗法的并发症是在该移植类型中报道的第二 常见的严重事件。
[0012] 因此，仍然有必要进一步的开发，W改善植入物的长期存活和功能，从而使对葡萄 糖随时间的控制并减少免疫抑制治疗。
[0013]CXCL8是一种由炎性介质诱导的趋化因子，其参与早期组织修复并且已被证实 通过诱导趋化、内皮细胞的存活和增殖来促进血管生成（Li等，JImmunol，2003，170 ; 3369-3376)，W及作为中性粒细胞引诱剂起作用。CXCL8通过与其同源的G蛋白偶联受体 CXCR1和CXCR2结合来发挥其作用。
[0014] 近来的文献假定CXCL8可W通过诱导植入组织的血管重建来促进植入（Mov址edi 等，Di油etes，2008,57 ;2128_36)。
[0015]EP1123276公开了N-(2-芳基-丙酷基）-横酷胺类及其可药用盐（其中包括 R(-)-2-[(4-异了基苯基）丙酷基]-甲横酷胺（I))，其作为CX化-8诱导的中性粒细胞趋 化和脱颗粒的抑制剂使用，特别是用于治疗诸如牛皮癖、类风湿性关节炎、溃瘍性结肠炎、 急性呼吸功能不全（ARD巧、先天性纤维化和肾小球肾炎等疾病。
[0016]EP1355641公开了R(-)-2-[(4-异了基苯基）丙酷基]-甲横酷胺及其可药用盐 (特别是其赖氨酸盐）在预防和治疗移植器官的缺血/再灌注损伤W及在实质器官（特别 是需要从供者取得并在移植前储存的肾）移植后由于排斥反应而导致的功能性损伤。所述 损伤被认为是造成植入物功能延迟的原因，该使得有必要在肾移植后进行透析。
[0017]EP1579859公开了N-(2-芳基-丙酷基）-横酷胺类（其中包括R(-)-2-[(4-异了 基苯基）丙酷基]-甲横酷胺及其赖氨酸盐）在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的用途。
【发明内容】
[001引本发明人出乎意料地发现，与从现有技术教导中所期望的相反，CXCR1和/或CXCR2的激动剂对膜岛移植后的膜岛存活是有害的。如在之后的实施例中将描述的，与野生 型小鼠相比，当将膜岛移植到CXCR2敲除的BALB/C小鼠中时，膜岛表现出增强的功能和存 活，并且与对照小鼠相比具有持续更好的葡萄糖耐量和更低的葡萄糖浓度。
[0019] 另外，本发明人实施的实验清楚地证明了抑制CXCR1和/或CXCR2信号转导的化 合物能够有效地改善膜岛移植后植入物的存活和功能。
[0020] 因此，本申请的第一个目的是CXCR1和/或CXCR2的抑制剂作为佐剂在1型糖尿 病患者膜岛移植中的用途。
[0021] 对于根据本发明的"CXCR1和/或CXCR2的抑制剂"而言，其意指能够阻遏CX化8 之源自CXCR1和/或CXCR2活化的生物学活性的化合物。该些化合物可W是所述受体的竞 争性括抗剂或变构抑制剂。
[0022] 本发明优选的化合物是式I化合物或其可药用盐：
[0023]
[0024] 其中，R选自直链或支链的4- (Ci-Ce)烷基、4-S氣甲横酷氧基或3-苯甲酯基，并 且Ri是直链或支链的（Ci-Ce)烷基。具体地，根据本发明优选的化合物是R(-)-2-[(4-异 了基苯基）丙酷基]-甲横酷胺（通常称为瑞帕他辛化epertaxin)或瑞帕利辛，在下文中 称为瑞帕利辛）和R(-)-2-[(4'-=氣甲横酷氧基）苯基]-丙酷基-甲横酷胺（通常并且 在下文中称为莫瑞辛（Meraxin))。
[0025] 本发明化合物的优选的盐是赖氨酸盐和钢盐。本发明化合物的特别优选的盐是瑞 帕利辛的赖氨酸盐和莫瑞辛的钢盐。
【附图说明】
[0026] 图1 ;图A表示在敲除小鼠（淡色线）和野生型小鼠（黑线）中从同系移植400膜 岛的-1天至移植后巧天测量的非禁食性血糖（单位为mg/dl)。图B表示口服葡萄糖耐 量试验（OGTT)的结果。在施用葡萄糖之前W及口服葡萄糖后10分钟、20分钟、30分钟、60 分钟和90分钟后立即测定血糖（单位为mg/dl)。示出每只动物的血液葡萄糖曲线。
[0027] 图2;图A表示移植后在瑞帕利辛巧巧arixin)处理的小鼠（实线）或对照小鼠 (虚线）中在不同时间时的血糖。图B表示Cox回归多变量分析。
[002引图3a和3b用散点示出在瑞帕利辛存在或不存在时移植有来自同一分离物之膜岛 的小鼠在口服葡萄糖耐量试验（0GTT)(图3a)和静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT)(图3b)中 获得的平均值。标记指明该分离物的数目。方形和圆形分别表示移植有250膜岛当量（1巧 或150膜岛当量的小鼠。上图和下图分别示出移植后1个月和3个月的数据。实线是鉴 别线；在鉴别线上方的圆形表示在瑞帕利辛组中比在载剂处理组（A+)中具有更高的观测 值。
[0029] 图4表示在移植有150膜岛当量（图A)或250膜岛当量（图B)的瑞帕利辛处理 的动物和载剂处理的动物移植后24小时和48小时时的丙氨酸氨基转移酶（ALT)的循环水 平。
[0030] 图5 ;图A表示在用瑞帕利辛、雷帕霉素、瑞帕利辛+雷帕霉素或载剂处理的小鼠 中移植后不同时间时的血糖。图B表示Cox多变量回归分析。
[0031] 图6 ;在用载剂（A)、瑞帕利辛炬)、雷帕霉素似或瑞帕利辛+雷帕霉素做处理 的小鼠中移植后24小时和48小时时的丙氨酸氨基转移酶（ALT)的循环水平。
[0032] 图7 ;图A表示在用瑞帕利辛、雷帕霉素、瑞帕利辛+雷帕霉素或载剂处理的小鼠 中移植后随时间的移植物存活百分率。图B表示Cox多变量回归分析。
[0033] 图8示出在对照小鼠（粗线）或瑞帕利辛处理的小鼠（淡色线）中膜岛移植后随 时间（天）从肝脏中提取的P^1N的数目（表示为每毫克肝组织的细胞）。
[0034] 图9示出在对照小鼠（粗线）或瑞帕利辛处理的小鼠（淡色线）中膜岛移植后随 时间（天）从肝脏中提取的NK的数目（表示为每毫克肝组织的细胞）。
[0035] 图10示出在同种异体膜岛移植后5天从肝脏中提取的不同白细胞亚群中CXCR2+ 细胞的百分数。在横坐标中，数字1至11代表如下含义：
[0036] 1;PMN(GrrCDl化+CD11C-)
[0037] 2 ;PMN(GrrCDl化+Ly6c-)
[003引 3;巨瞻细胞（CDUb+CDllc-GrO
[0039] 4;树突状细胞（CDllc+CDUb+GrO
[0040] 5;淋己细胞（CD3+CD4+)
[0041] 6 ;淋己细胞（CD3+CD8+)
[0042] 7;B淋己细胞（CD19+)
[0043] 8;NKT细胞（NK1. 1+CD3+)
[0044] 9 ;NKT细胞（NK1. 1+CD3-)
[0045] 10;淋己细胞（CD4+TC化+)
[0046] 11;淋己细胞（CD8+TC化+)
【具体实施方式】
[0047] 如下文将描述地，在动物模型中，所述式I化合物能有效地改善膜岛移植后植入 物的存活和功能。
[0048] 详细地，在膜岛移植的实验模型中得到的数据证明了上述化合物（W R(-)-2-[(4-异了基苯基）丙酷基]-甲横酷胺为代表）在保护所移植的0-细胞免于失去 活性和/或退化中的明显作用。
[0049] 根据本发明一个优选的实施方案，所述式I化合物是瑞帕利辛。根据另一个优选 的实施方案，所述式I化合物是莫瑞辛。
[0050] 本发明化合物有效地支持在1型糖尿病中植入移植的膜岛细胞。
[0化1] 事实上，从下述实验部分中将会更加清楚的是，与对照相比，在同基因或同种异体 膜岛移植的-1天到+6天在动物模型中静脉施用瑞帕利辛引起达到正常血糖水平（非禁食 血液葡萄糖水平低于250mg/ml)更高的概率和减少的时间中值。
[0化2] 因此，本发明的另一个目的是CXCR1和/或CXCR2抑制剂（优选式I化合物，更优 选瑞帕利辛或莫瑞辛）用于在1型糖尿病患者中膜岛移植后改善植入和早期植入物功能并 用于降低早期植入失败发生率的用途。
[0053] 所述移植优选在患者的肝脏中或骨髓中进行。
[0化4] 同种异体膜岛移植的实验证明了所述CXCR1/CXCR2抑制剂瑞帕利辛的施用显著 地降低了在移植后达到初始功能的小鼠中排斥反应的发生。
[0化5] 另外，所述结果证明，与对照相比，植入物的功能保持更长的时间，并伴随存活时 间中值的增加。
[0056] 在肝脏和骨髓中的所述膜岛移植均表明了瑞帕利辛在改善植入物的功能和存活 方面的功效。
[0化7] 因此，本发明的另一个目的是CXCRl和/或CXCR2抑制剂（优选式I化合物，更优 选瑞帕利辛）用于降低植入物的排斥反应W及改善植入物长期存活的用途。
[005引为此目的，本发明的所述化合物可W单独使用或者在与一种或更多种免疫抑制剂 进行组合治疗（优选选自西罗莫司（也称为雷帕霉素）和他克莫司）。
[0化9] 但是，在实验部分中报道的所获得的数据还表明本发明化合物单独使用即可足W 抑制植入物排斥。事实上，如在实验部分中所示地，瑞帕利辛对CXCR1/2受体的阻断显著延 长了小鼠在移植后达到原来功能的排斥时间，然而，该没有被雷帕霉素显著地改变。另外， 单独施用瑞帕利辛提供的结果与组合施用瑞帕利辛和雷帕霉素的结果是相当的。该些数据 强烈地表明，在不需要在毒性方面有明显优势的免疫抑制疗法的情况下或者所述需要降低 的情况下，单独施用瑞帕利辛即足W降低植入物排斥反应。
[0060] 本发明的所述化合物的合成可W根据本领域熟知的方法进行。例如，瑞帕利辛可 W如EP1123276的实施例1和EP1355641的实施例1中所公开的方法制备，而所述赖氨酸 盐则可W分别如前述专利的实施例7和实施例2中所公开的方法制备。例如，莫瑞辛可W 根据EP1776336的实施例1制备。
[0061] 根据本发明使用的化合物配制成适于口服施用的药物组合物（如片剂、胶囊、 糖浆剂，优选为控制释放制剂的形式），或者适于胃肠外施用的药物组合物（优选为适于 静脉内或肌内给药的无菌溶液的形式）。药物的形式可W根据常规的方法制备，例如在 Remington，"TheScienceandPracticeofPharmacy"，第 21 片反（LippincottWillians 和Wi化ins)中所公开的方法。优选地，在上述每一种施用形式中瑞帕利辛或其可药用盐的 量将例如提供每千克体重2mg至15mg的化合物或盐，而莫瑞辛或其可药用盐的量将例如提 供每千克体重lOmg至20mg的化合物或盐。在任何情况下，待施用药剂的方案和量将由医 师根据患者的需要确定。
[0062] 现将在下述实验部分中对本发明更多的细节做进一步的举例说明。
[006引实验部分
[0064] 1.在敲除小鼠中的同基因膜岛移植
[0065] 为了测试CX化8信号转导通路通过CXCR1和CXCR2的活化对膜岛存活的作用，在 Ba化/c CXCR2-/-小鼠和CXCR化/+小鼠中在同基因膜岛肝内移植后对膜岛功能进行了评 估。CXCR1在小鼠中不表达，因而CXCR2的敲除完全消除了由CX化8引起的信号转导。
[0066] 取移植后第一周非禁食血糖和移植后4周口服葡萄糖耐量作为功能性指标。如图 1所示的，如在整个评估阶段中循环葡萄糖浓度显著降低所证明地，经移植的CXCR2敲除小 鼠明显地表现出比对照野生型小鼠持续更好的葡萄糖耐受。
[0067] 如下面第2部分中所描述地进行了口服葡萄糖耐量试验。
[0068] 2.在小鼠中的同基因膜岛移植
[0069] 将取自12周龄C57小鼠的膜岛移植到糖尿病性C57小鼠（四氧喀晚诱导的糖尿 病，血糖高于450mg/dl)的肝脏中。使用两种不同的边际膜岛量模型（marginalisletmass model)，即150IE(膜岛当量）和250膜岛当量。瑞帕利辛从膜岛移植-1天开始到膜岛移 植后6天或13天W8mg/kg/小时的剂量通过皮下（S.C.)连续注入。对照动物接受连续的 皮下施用载剂。
[0070] 首先评估了两个连续的检测在膜岛移植后达到小于200mg/dl的非禁食血液葡萄 糖水平的能力。如图2所示，与用载剂处理的小鼠的35. 1%和50天相比，用瑞帕利辛处理 的小鼠达到正常血糖（611肖17〇3611113)(小于20〇1]1肖/(11)的概率和时间中值是；50%和7天 (时序检验（LogRank)，P< 0. 012)。
[0071] W瑞帕利辛处理、处理时间、移植膜岛的数目和受者移植前血糖作为协变量，多变 量Cox回归分析证实了瑞帕利辛显著地改善了结果（比数比（Oddsratio) ;2. 6 ;95%置信 区间（CI) ;1. 1-6. 1 ;p< 0.021)。正如预期的，250膜岛当量的移植引起了改善的植入（比 数比；1. 6 ;95%置信区间；0. 6-4. 3;p< 0. 28)，而移植前血糖对该结果有负面影响（比数 比；0. 6 ;95%置信区间；0. 3-1. 1;p= 0. 12)。
[007引在移植后1个月和3个月进行了静脉内葡萄糖耐量试验（IVGTT)和口服葡萄糖耐 量试验（0GTT)W评价植入膜岛的功能性。IVGTT在禁食16小时后开始；小鼠通过尾静脉 注射给予葡萄糖（0. 5g/kg)。在注射后0分钟、1分钟、5分钟、15分钟、20分钟、30分钟和 60分钟时获取血液样本并用于测定葡萄糖浓度。从IVGTT中，在各血浆葡萄糖值对数变换 后，通过静脉施用后循环葡萄糖在1分钟和15分钟之间的减少（KGi_i5)作为葡萄糖消除常 数（KG;表示为每分钟葡萄糖消除的百分数）来将葡萄糖耐量量化。对全部1分钟至60分 钟的葡萄糖消失速率（KGi_e。）进行类似的评估。该参数表示在整个试验中葡萄糖消失的速 率。0GTT在4小时禁食后开始；通过口腔管饲法给予小鼠葡萄糖（Ig/kg)。在施用葡萄糖 0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟后获取血液样本并用于测定 葡萄糖浓度。0GTT期间葡萄糖曲线下面积（AUC)用梯形法计算（基线=0分钟）。在图3 中示 意了在IVGTT和0GTT后膜岛移植对葡萄糖耐量的影响。数据表示为离散的点。每一 个点表示在瑞帕利辛存在或不存在时移植来自相同分离物之膜岛的小鼠中测量的参数的 平均值；标记表明该分离物的数目，而方形和圆形分别表示移植有250膜岛当量或150膜岛 当量的小鼠。上图和下图分别表示移植后1个月和3个月的数据。该实线为鉴别线；鉴别 线上方的圆形代表在瑞帕利辛处理组中比在载剂处理组（A+)中具有更高的观测值。移植 后1个月和3个月的0GTT表明，在用瑞帕利辛处理的小鼠中葡萄糖的AUC仍然低于对照小 鼠的AUC。与该些数据一致的是，与对照小鼠相比，在瑞帕利辛处理的小鼠中在1分钟至15 分钟做H5)和1分钟至60分钟做1_6。）的葡萄糖消除常数显著地增加了。
[0073] 通过移植后24小时和48小时时的丙氨酸氨基转移酶（ALT)的循环水平进行了对 急性肝损伤的量化。在移植有150膜岛当量或250膜岛当量的小鼠中瑞帕利辛的处理均没 有影响ALT水平（图4)。类似地，在白细胞、红细胞和血小板的循环水平上没有明显差别 (数据未给出）。
[0074] 3.在小鼠中的同种异体膜岛移植
[0075] 将来自12周龄Ba化/c小鼠的膜岛移植到糖尿病性巧7小鼠（四氧喀晚，血糖高 于450mg/dl)的肝脏中。在一些实验中，为了评价任何自身免疫反应的存在，将来自12周 龄巧7BL/6炬6)小鼠的膜岛移植到糖尿病雌性N0D/LtJ(N0D)小鼠的肝脏中。在至少S次 非禁食血液葡萄糖读数高于350mg/dl后，将NOD小鼠作为膜岛移植受者使用。在该两种情 形下均移植了 400膜岛当量。将该些动物单独用瑞帕利辛处理（从移植-1天开始至移植 后7天W5.28mg/kg/小时连续皮下注入）、单独用雷帕霉素（每日腹膜内（i.p.)注射，从 第0天的0. 3mg/kg的诱导剂量开始，之后维持0. 15mg/kg的剂量直到第14天）、用瑞帕利 辛+雷帕霉素或载剂处理。
[0076] 首先评价了达到初始功能的能力（定义为在膜岛移植后在2次连续测定中非禁食 血液葡萄糖水平低于250mg/dl)和排斥时间（定义为2次连续的非禁食血液葡萄糖读数高 于300mg/dl)。
[0077] 考虑到在同种免疫情况下所有移植的小鼠，达到初始功能（血糖低于250mg/dl) 的概率和时间中值是；对于单独用瑞帕利辛处理的小鼠为72%和1天，对于单独用雷帕霉 素处理的小鼠为73%和1天，对于用瑞帕利辛+雷帕霉素处理的小鼠为69%和1天，对于 用载剂处理的小鼠为44%和2天，（图5,时序检验p< 0.041)。W瑞帕利辛处理、雷帕霉 素处理W及受者移植前血糖作为协变量，多变量Cox回归分析证实瑞帕利辛处理改善了该 结果（比数比；2. 5 ;95%置信区间；0. 79至2. 99;p< 0. 202)。用雷帕霉素处理（比数比； 1. 1 ;95%置信区间；0. 62至2. 15 ;p<0. 62)与移植前血糖（比数比；1.03 ;95%置信区间； 0. 68至1. 59;p< 0. 88)相关性较低。
[007引移植后24小时和48小时测定的ALT循环水平在雷帕霉素存在或缺乏时都没有受 到瑞帕利辛的影响（图6)。
[0079] 此外，用瑞帕利辛处理显著地增加了小鼠在移植后实现初始功能的达排斥时间 (thetimetorejection))(图7)。在缺乏雷帕霉素时，对于用瑞帕利辛和载剂处理的小 鼠而言，存活时间中值分别为（12 + 0. 6)天（n= 13)和巧±0. 5)天（n= 7)。在雷帕霉素 存在时，对于瑞帕利辛小鼠和对照小鼠而言，存活时间中值分别为（12±。天（n= 11)和 巧±0. 6)天（n= 11)。W瑞帕利辛处理、雷帕霉素处理和受者移植前血糖作为协变量的多 变量Cox回归分析证实了该数据。对于植入物存活损失而言，证实了用瑞帕利辛处理是显 著独立的保护因素（比数比；〇. 252 ;95%置信区间；0. 099至0. 64;p= 0. 004)，而雷帕霉 素处理（比数比；1. 173 ;95%置信区间；0. 562至2. 45;p= 0. 67)和移植前血糖（比数比； 1. 002 ;95%置信区间；0. 604 至 1. 661;p= 0. 99)则不显著。
[0080] 4.同种异体膜岛移植后通过瑞帕利辛的CXCR1/2阻断调节肝脏炎症状况
[0081] 在小鼠中同种异体肝内膜岛移植后在瑞帕利辛处理存在或不存在的情况下分析 了肝内白细胞种群。在瑞帕利辛存在的情况下从移植-1天开始W8mg/小时/kg的剂量皮 下连续输注瑞帕利辛7天或者在载剂存在时，将来自12周龄的Balb/c小鼠的膜岛（400膜 岛当量）移植到糖尿病性C57小鼠（四氧喀晚诱导，> 450mg/dl)的肝脏中。小鼠在膜岛 移植后0天、+1天、+3天、巧天、巧天、+10天、+14天处死并且在解剖时将肝脏称重。从 已知重量的两个肝叶制备单细胞悬液并且通过流式细胞术进行肝内白细胞（ML)种群分 析。将该些细胞用异硫氯酸巧光素（FITC)、藻红蛋白（P巧或别藻红蛋白（APC)标记的抗 CD4、抗CD8、抗CD3、抗CD19、抗TCR、抗NK1. 1、抗CD11、抗Gr-1、抗CD1lb和抗CD1Ic特异 性抗体任harMingen，SanDiego，CA)进行表面染色，W检测Gr-r/CDUbVCDllc-细胞（多 为PMN)、CD47TCR+(多为T辅助细胞）、CD87TCR+细胞（多为细胞毒T淋己细胞）、NK1. 1 7 CD3-细胞（NK细胞）、NK1. 1 7CD3+细胞（NKT细胞）和Gr-1 7CDUb7CDllc-(多为巨瞻细 胞）、CD1157CDnb7CDllc-(多为单核细胞）、CDllc7CDUb7Grr(多为树突状细胞）、 CD19 (多为B淋己细胞）。样品利用FACSCalibur流式细胞仪获得，数据利用CE化如est软 件炬ectonDickinsonImmunocytometrySystems，SanJose，CA)分析。
[0082] 在实验的第二种情形下，在白细胞渗透达到最大渗透度时的时间点评估肝内白细 胞种群上CXCR2和CXCR1的表达。
[0083] 获得的结果证实了用瑞帕利辛处理降低了同种异体移植后白细胞在肝脏中的动 员和渗透。特别是表达CXCR2的白细胞亚群的中性粒细胞（图8)和自然杀伤T细胞（图 9)受到了明显的影响，也可W由图10中所示。
[0084] 5.通过瑞帕利辛的CXCR2/1阻断影响在骨髓中膜岛移植后同种异体膜岛移植的 结果
[0085] 在瑞帕利辛存在时从移植-1天开始W8mg/小、时/kg的剂量皮下连续注入瑞帕 利辛7天，将来自12周龄的Ba化/c小鼠的膜岛（400膜岛当量）移植到糖尿病性C57小 鼠（四氧喀晚诱导，> 450mg/dl)的骨髓中。对照组小鼠用载剂处理。该实验主要的终点 是达到初始功能的能力（定义为在膜岛移植后2次连续测定中非禁食血液葡萄糖水平低于 250mg/dl)和排斥时间（定义为2次连续的非禁食血液葡萄糖的读数高于350mg/dl)。
[0086] 获得的结果证实了通过用瑞帕利辛的处理改善了结果。
【主权项】
1. CXCR1和/或CXCR2的抑制剂在制备用于1型糖尿病患者中胰岛移植的佐剂药物中 的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂是式I化合物或其可药用盐：其中，R选自直链或支链的4-沁-(：6)烷基、4-三氟甲磺酰氧基和3-苯甲酰基，并且R1 是直链或支链的（Q-C；)烷基。3. 根据权利要求2所述的用途，其中所述可药用盐选自赖氨酸盐和钠盐。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述药物改善胰岛细胞植入和早期 植入物功能。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述药物减少移植胰岛失败的发生。6. 根据权利要求5所述的用途，其中所述药物减少胰岛细胞植入排斥的时间和发生。7. 根据权利要求6所述的用途，其中所述药物改善长期植入物存活。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中所述式I化合物选自 R(-)-N-2-[(4-异丁基苯基）丙酰基]-甲磺酰胺和R(-)-2-[(4' -三氟甲磺酰氧基）苯 基]丙酰基-甲磺酰胺。
【专利摘要】本发明涉及CXCR1和/或CXCR2抑制剂，其用于制备在1型糖尿病患者胰岛移植中作为佐剂使用的药物。具体地，可根据本发明使用的化合物具有下述式(I)，其中的R和R1如本说明书中所定义。
【IPC分类】A61P37/06, A61K39/39
【公开号】CN104906572
【申请号】CN201510089937
【发明人】洛伦佐·皮耶蒙蒂, 路易莎·达丰希奥, 马尔塞洛·阿莱格雷蒂
【申请人】多姆皮制药公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2010年10月6日
【公告号】CA2775902A1, CN102665703A, EP2308484A1, EP2485723A1, EP2485723B1, US20120202884, WO2011042466A1
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