鸟类中增强的免疫应答的制作方法
鸟类中增强的免疫应答的制作方法
【专利说明】
[OOOU本申请是国际申请日为2010年5月7日、国际申请号为PCT/EP2010/002809、进入 国家阶段的申请号为201080021073. 9、发明名称为"鸟类中增强的免疫应答"的PCT申请 的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及一种鸟类中免疫活化的方法。具体来说，本发明包括用于引发呼吸性 和全身性，非特异性W及抗原特异性免疫应答的方法，其可用于抗传染病的动物免疫，接种 和治疗。
【背景技术】
[0003] 疫苗被用于预防传染病和治疗确定的疾病。感染性疾病由传染原（包括诸如病 毒，细菌，寄生虫，和其他真菌的实例）引起。已经为所有类型的物种（包括哺乳动物，鸟， 鱼和灵长类动物）开发了许多试剂和方法来预防和治疗传染性疾病。
[0004] 接种程序对于食品工业中使用的商业化养殖的动物是特别重要的。鸟类是许多感 染类型的主要目标。育种人员和商品化的鸡、火鸡W及其他家禽群体通常被接种W保护他 们抵抗病原体的环境暴露。对养禽业来说，经济上最重要的疾病之一是Marek'S病，其是鸡 中天然发生的淋己组织增生疾病。该疾病由高度传染性的瘤疹病毒引起，所述瘤疹病毒水 平传播，并导致养禽业的主要经济损失。Marek'S病的症状在感染鸟类的神经，生殖器官，内 脏，眼睛和皮肤中广泛存在，引起运动麻搏，器官功能减弱和慢性营养不良，最终导致死亡。
[0005] 解化的鸟类在出生后不久即暴露于致病微生物。尽管该些鸟类最初被来自母亲的 抗体针对病原体进行保护，但该种保护只是暂时的，鸟类自己未成熟的免疫系统必须开始 保护鸟类抵抗病原体。通常希望在幼维中预防感染，此时它们是最易感染的。还希望在年 纪较大的鸟类中预防感染，尤其是当鸟类被近距离圈养时，导致疾病的快速传播。
[0006] 在大部分商品家禽场中，在解化时肠胃外给予新解化的维鸡某些疫苗。因为暴露 于病原体经常发生在非常小的年纪，在将它们置于饲养室或解卵室之前经常需要对它们进 行接种。该类接种方案需要处理单只鸟类，设及意外自身注射的可能风险。此外，该些疫苗 并不总是有效的。在它们有机会发展出足够的保护性免疫前，年幼的维鸡可能在接种后很 快就暴露于疾病的毒性形式。
[0007] 在鸟类解化前，可W在鸡蛋中施用一些活的病毒疫苗。该种方法被称作"卵内接 种"。卵内接种的鸟类发展出针对祀疾病的抗性。但是，由于疫苗药剂的胚胎致病性，用于解 化鸟类的许多疫苗不能用于卵内接种。晚期胚胎对大部分被测疫苗病毒的感染高度敏感。 不是所有对新解化维鸡无致病性的疫苗病毒对于晚期胚胎也是安全的。例如，传染性支气 管炎病毒（IBV)和新城疫病毒（NDV)的疫苗株（通常用做新解化维鸡的新生疫苗），在卵内 接种后对于胚胎是致死性的。该些病毒已经被改造使得它们对于卵内使用来说是安全的。 病毒的改造减弱了引发的免疫应答，因此是在保护晚期胚胎方面效果降低的疫苗药剂。
【发明内容】
[0008] 由需要提供避免传染病和经济损失的保护的该类不同疫苗产生的接种程序是复 杂的。因此，需要一种引发非抗原特异性免疫应答的方法，所述免疫应答增强鸟类免受传染 病的保护，并且容易施用。此外，希望具有一种引发免疫应答的方法，所述免疫应答提供针 对不止一种传染原的保护功能。此外还需要一种引发免疫应答的方法，所述免疫应答具有 更长的持续时间或不需要疫苗的加强注射。本发明提供一种引发鸟类非抗原特异性免疫应 答的方法，其还降低群体的发病率，提供针对不止一种传染原的保护功能，W及提供比本领 域通常已知的其他产品更长时段的保护。
【附图说明】
[0009] 图1图示含胚鸡蛋的不同处理组之间的解化率。分析的研究组包括T1, 0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0010] 图2图示解化后每天每个鸡舍的平均日死亡率。图解化ey) ;T1，0微克免疫调节 剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3，1.0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5，0 微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0011] 图3图示基于含胚鸡蛋的初始数目，每个鸡舍任意特定研究日的鸟类存活比例。 图解；T1，0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠 杆菌攻击；T3，1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10. 0微克免疫调节剂/ 蛋和大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/ 蛋和未攻击。
[0012] 图4用图表示解化后鸟类的生存力。图解；T1，0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆 菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3，1.0微克免疫调节剂/蛋和 大肠杆菌攻击；T4，10.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂 /蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0013] 图5图示7天研究期间的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1，0微克 免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5，0 微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0014] 图6用图表示到研究第14天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1，0 微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0015] 图7用图描述到研究第21天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1，0 微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0016] 图8图示到研究第28天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1，0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5，0 微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0017] 图9用图描述到研究第35天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；Tl，0 微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0018] 图10用图表示到研究第45天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1， 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击； T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0019] 图11显示到研究第45天来自18天龄胚胎的每组的累计死亡率。图解；T1，0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3， 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻 击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0020] 图12显示从研究第0天到研究第45天解化后的每组的累计死亡率。图解；T1， 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击； T3，1.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌 攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0021] 图13显示从研究第0天到第7天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3，1. 0 微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击； T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0022] 图14显示从研究第0天到第14天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0023] 图15显示从研究第0天到第21天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0024] 图16显示从研究第0天到第28天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[00巧]图17显示从研究第0天到第35天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0026] 图18显示从研究第0天到第45天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0027] 图19用图描述含胚鸡蛋的每个研究组解出鸡的数目。被分析的研究组包括T1， 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1 . 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 1. 0微克免疫调节剂/蛋加1剂量的 Marek'S疫苗和大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免 疫调节剂/蛋和未攻击。
[002引图20图示研究第7天每组活鸡的数目。图解：T1，0微克免疫调节剂/蛋和大 肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3,1.0微克免疫调节剂/ 蛋和大肠杆菌攻击；T4,1.0微克免疫调节剂/蛋加1剂量的Marek' S疫苗和大肠杆菌攻 击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6,1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0029] 图21显示研究第7天每组活鸡和死鸡的比较。
[0030] 图22显示到研究第7天每个研究组的死亡百分比。图解：T1，0微克免疫调节 剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3,1.0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4,1.0微克免疫调节剂/蛋加1剂量的Marek' S疫苗和 大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6,1.0微克免疫调节剂/蛋和 未攻击。
[0031] 图23图示研究结束时（第7天）包括死胚，死鸡和活鸡（绿色）的每组的存活鸟 类的数目。图解；T1，0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/ 蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 1. 0微克免疫调节 剂/蛋加1剂量的Marek'S疫苗和大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击； 和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0032] 图24用图描述含胚鸡蛋的每个研究组解出鸡的百分比。被分析的研究组包括列 于表4的那些。
[0033] 图25显示解化后到研究第7天未用大肠杆菌攻击的研究组的死亡百分比。被分 析的研究组包括列于表4的那些。
[0034] 图26显示解化后到研究第7天用大肠杆菌攻击的研究组的死亡百分比。被分析 的研究组包括列于表4的那些。
[00巧]图27用图描述解化后到研究第7天每个研究组的死亡百分比。被分析的研究组 包括列于表4的那些。
[0036] 图28显示解化后到研究第7天每个研究组的存活百分比。被分析的研究组包括 列于表4的那些。
[0037] 图29显示研究第7天每个研究组的存活百分比。被分析的研究组包括列于表4 的那些。
[0038] 图30显示到研究第7天和第14天每个研究组的周死亡率。被分析的研究组包括 列于表4的那些的亚组。
[0039] 图31用图描述在研究第一周免疫调节剂对脾细胞中HVT的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[0040] 图32用图描述在研究第一周免疫调节剂对PMBC中HVT的MD疫苗复制的影响。被 分析的研究组包括列于表5的那些。
[00川图33用图描述在研究第一周免疫调节剂对脾细胞中SB-1的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[004引图34用图描述在研究第一周免疫调节剂对PMBC中SB-1的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[004引图35用图描述在研究第二周免疫调节剂对脾细胞中HVT的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[0044] 图36用图描述在研究第二周免疫调节剂对PMBC中HVT的MD疫苗复制的影响。被 分析的研究组包括列于表5的那些。
[004引图37用图描述在研究第二周免疫调节剂对脾细胞中SB-1的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[0046] 图38用图描述在研究第二周免疫调节剂对PMBC中SB-1的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[0047] 图39用图描述卵内接受免疫调节剂，抗ND接种和接受攻击的维鸡中气囊炎的降 低。被分析的研究组包括列于表7的那些。
[004引图40用图描述第26天表7所列研究组的ELISAs。
[0049] 图41用图描述表8所列研究组中维鸡的存活率。
[0050] 图42用图描述表8所列研究组中Marek' S病的发病率。
【具体实施方式】
[0051] 本发明引发鸟类成员免疫应答的方法包括给鸟类成员施用有效量的免疫调节剂 组合物W引发鸟类成员的免疫应答。所述免疫调节剂组合物包括脂质体递送载体和至少一 种核酸分子。具体来说，所述免疫调节剂引发非抗原特异性免疫应答，利用施用至少一种生 物制剂诸如疫苗将其进一步增强。
[0052] 所述方法为保护鸟类免受传染性疾病和治疗患有传染病的群体提供新的治疗策 略。此外，通过使用本发明的免疫调节剂组合物，当卵内施用免疫调节剂时不存解化率或在 解化后存活率的降低，当与疫苗共施用时也不存在解化率或存活率的降低。此外，在施用疫 苗前预施用免疫调节剂进一步增强非抗原特异性免疫应答。本发明的方法还允许之前只能 在解化后施用的疫苗安全用于卵内。此外，本发明的方法允许不止一种疫苗与免疫调节剂 组合物的组合。最后，当免疫调节剂与疫苗联用时，本发明的方法提供更长的抗疾病预防。 [00閲I.组合物 a.免疫调节剂 在本发明的一个实施方案中，免疫调节剂组合物包括脂质体递送载体和至少一种核酸 分子，如美国专利号6,693,086所述，其通过引用引入本文。
[0054] 合适的脂质体递送载体包括能够将核酸分子递送到被治疗的受试者组织的脂质 组合物。脂质体递送载体优选的能够在受试者中保持足够量时间的稳定W递送核酸分子和 /或生物制剂。在一个实施方案中，脂质体递送载体在受体受试者中稳定至少约30分钟。 在另一个实施方案中，脂质体递送载体在受体受试者中稳定至少约1小时。仍在另一实施 方案中，脂质体递送载体在受体受试者中稳定至少约24小时。
[00巧]本发明的脂质体递送载体包括脂质组合物，所述脂质组合物能够与细胞质膜融合W将核酸分子递送入细胞。在一个实施方案中，当递送本发明的核酸：脂质体复合物时，每 毫克（mg)总组织蛋白每微克（yg)递送的核酸表达至少约1皮克（pg)蛋白。在另一个实 施方案中，核酸：脂质体复合物的转染效率是每mg总组织蛋白每微克递送的核酸表达至 少约10pg蛋白；和仍在另一个实施方案中，每mg总组织蛋白每微克递送的核酸表达至少 约50pg蛋白。复合物的转染效率可W低至每mg总组织蛋白每微克递送的核酸表达1毫 微微克（fg)蛋白，上述量是更优选的。
[0056] 本发明优选的脂质体递送载体是直径约100到500纳米（nm)，在另一个实施方案 中，直径约150到450皿和仍在另一个实施方案中，直径约200到400皿。
[0057] 合适脂质体包括任何脂质体，诸如常用于，例如，本领域技术人员已知的基因 递送方法的那些脂质体。优选的脂质体递送载体包括多层囊泡（MLV)脂质和挤压的脂 质。用于制备MLV's的方法是本领域公知的。更优选的脂质体递送载体包括具有聚阳 离子脂质组成的脂质体（即，阳离子脂质体）和/或具有与聚己二醇缀合的胆固醇主链 的脂质体。示例性的阳离子脂质体组合物包括，但不限于N-[l-(2, 3-二油基氧基）丙 基]-N，N，N-S甲基氯化锭值0TMA)和胆固醇，N-[l-(2, 3-二油酷氧基）丙基]-N，N，N-S 甲基氯化锭值0TA巧和胆固醇，1-[2-(油酷氧基）己基]-2-油基-3-(2-哲己基）咪挫咐 鑛氯化物值0TIM)和胆固醇，二甲基双十八烷基漠化锭值DAB)和胆固醇，W及其组合。用 做递送载体的最优选脂质体组合物包括D0TIM和胆固醇。
[0058] 合适的核酸分子包括任何核酸序列诸如编码或非编码序列，W及DNA或RNA。编码 核酸序列编码蛋白或肤的至少一部分，而非编码序列不编码蛋白或肤的任何部分。根据本 发明，"非编码"核酸可W包括转录单位的调节区域，诸如启动子区域。术语"空载体"可W 与术语"非编码"互换使用，尤其是指不存在蛋白编码部分的核酸序列，诸如不含基因插入 物的质粒载体。由核酸分子编码的蛋白表达不是诱发非抗原特异性免疫应答所需要的；因 此所述核酸分子不是必须与转录调控序列可操作的连接。但是，通过在组合物中包括编码 免疫原和/或细胞因子的核酸序列值NA或RNA)可W获得进一步的优势（即抗原特异和增 强的免疫）。
[0059] 可W使用本领域标准的方法或美国专利号6, 693, 086(通过引用引入本文）描述 的方法实现脂质体与核酸分子的复合。添加到脂质体的核酸分子的合适浓度包括能够有效 将足够量的核酸分子递送入受试者的浓度，该样的话可W引发全身性的免疫应答。当核酸 分子编码免疫原或细胞因子时，添加到脂质体的核酸分子的合适浓度包括能够有效将足够 量的核酸分子递送入细胞的浓度，该样的话细胞可W产生足够的免疫原和/或细胞因子蛋 白W便按照需要的方式调节效应细胞免疫。在一个实施方案中，约0. 1微克到约10微克核 酸分子与约8nmol脂质体组合，在另一个实施方案中，约0. 5微克到约5微克核酸分子与 约8nmol脂质体组合，仍在另一个实施方案中，约1.0微克核酸分子与约8nmol脂质体组 合。在一个实施方案中，组合物中核酸与脂质的比值（微克核酸：nmol脂质）是按重量计 至少约1:1核酸：脂质（即，1微克核酸：1nmol脂质），和在另一个实施方案中，至少约 1:5,和仍在另一个实施方案中，至少约1:10,和在进一步的实施方案中，至少约1:20。此处 表述的比值基于组合物中阳离子脂质的量，而不是基于组合物中脂质的总量。在另一个实 施方案中，本发明组合物中核酸与脂质的比值是按重量计约1:1到约1:64核酸：脂质；和 在另一个实施方案中，按重量计约1:5到约1:50核酸：脂质；和在进一步的实施方案中， 按重量计约1:10到约1:40核酸：脂质；和仍在另一个实施方案中，按重量计约1:15到约 1:30核酸：脂质。核酸：脂质的另一比值是约1:8到1:16,其中约1:8到1:32是优选的。
[0060]b.生物制剂 在本发明的另一个实施方案中，免疫调节剂包括脂质体递送载体，核酸分子，和至少一 种生物制剂。
[0061] 合适的生物制剂是有效预防或治疗鸟类疾病的制剂。该类生物制剂包括免疫增强 蛋白，免疫原，疫苗或其任意组合。合适的免疫增强蛋白是已知增强免疫的那些蛋白。作为 非限制性的实例，细胞因子（包括蛋白家族）是已知增强免疫的蛋白家族。合适的免疫原 是引发体液和/或细胞免疫应答的蛋白，该样的话给受试者施用免疫原获得针对相同或类 似蛋白（在受试者的组织内遇到的）的免疫原特异性免疫应答。免疫原可W包括细菌、病 毒、寄生虫或真菌表达的致病性抗原。优选的抗原包括在受试者中造成传染病的抗原。根 据本发明，免疫原可W是天然存在或合成来源的蛋白的任意部分，其引发体液和/或细胞 免疫应答。因此，抗原或免疫原的大小可W是小至约5-12个氨基酸，大至全长蛋白，包括该 两者之间的大小。抗原可W是多聚体蛋白或融合蛋白。抗原可W是衍生自天然或重组细胞 的纯化的肤抗原。免疫增强蛋白和免疫原的核酸序列与转录调控序列可操作的连接，该样 的话免疫原在受试者组织中表达，从而在受试者中引发免疫原特异性免疫应答（除了非特 异性免疫应答之外）。
[0062] 在本发明的另一个实施方案中，生物制剂是疫苗。疫苗可W包括活的，传染性的 病毒疫苗或灭活的，失活的病毒疫苗。在一个实施方案中，一种或更多种疫苗，活的或灭 活的病毒疫苗，可W与本发明的免疫调节剂组合物联用。合适的疫苗包括本领域已知用 于鸟类的那些疫苗。示例性的疫苗，不受限制，包括本领域用于针对下列疾病进行保护的 那些疫苗；Marek'S病病毒（MDV)，新城疫病毒（NDV)，维鸡贫血病毒（CAV)，传染性囊病病 毒（I抓V)，传染性支气管炎病毒（IBV)，火鸡瘤疹病毒（HVT)，传染性喉气管炎病毒（ILTV)， 禽脑髓炎病毒（AEV)，禽痘病毒（FPV)，禽霍乱，禽流感病毒（AIV)，呼肠孤病毒，鸟类白血 性增生病毒（ALV)，网状内皮组织增殖病毒（REV)，鸟类腺病毒和出血性肠炎病毒（肥V)， 球虫目，和本领域已知的其他疾病。在另一个实例中，疫苗可W是美国专利号5, 427, 791， 6, 048, 535和6, 406, 702描述的疫苗。在一个示例性的实施方案中，用于Marek'S病的保护 的疫苗可W与本发明的免疫调节剂组合物联用。
[0063]II.方法 a.免疫刺激的方法 在本发明的一个实施方案中，通过给鸟类成员施用有效量的免疫调节剂组合物在鸟类 成员中引发免疫应答。有效量足W在鸟类成员中引发免疫应答。免疫调节剂包括脂质体递 送载体和核酸分子。
[0064] 在一个实施方案中，免疫调节剂的有效量是约0. 05微克到约10微克。在另一个 实施方案中，免疫调节剂的有效量是约0. 1微克到约5微克。
[0065] 在本发明的另一个实施方案中，通过施用有效量的免疫调节剂组合物（包括脂质 体递送载体，分离的核酸分子和生物制剂）在鸟类成员中引发免疫应答。预期生物制剂可 W与免疫调节剂共施用或与其独立地施用。单独施用可W在施用免疫调节剂之前或之后。 还预期免疫调节剂或生物制剂的不止一次施用可用于延长增强的免疫。此外，不止一种生 物制剂可W与免疫调节剂共施用，在免疫调节剂之前施用，或施用免疫调节剂之后施用，如 本文实施例所述。在一个实施方案中，免疫调节剂的有效量是约0. 05微克到约5微克的脂 质体递送载体和分离的核酸分子和约300到约30000TCIDg。病毒生物制剂。在另一个实施 方案中，免疫调节剂的有效量是约0. 1微克到约3微克的脂质体递送载体和分离的核酸分 子和约100到约1000EIDs。病毒生物制剂。
[006引b.疾病 本发明的方法在受试者中引发免疫应答，该样的话受试者被保护免于会引起免疫应答 的疾病。如本文使用的，短语"保护免受疾病"是指疾病症状减轻；疾病发生率的降低；和疾 病严重性的减轻。保护受试者可指给受试者施用时，本发明的治疗组合物预防疾病出现和/ 或治愈或减轻疾病症状、体征或病因的能力。因此，保护鸟类成员免受疾病包括预防疾病发 生(预防性治疗）和治疗患有疾病的鸟类成员（治疗性治疗)。具体来说，保护受试者免受疾 病通过W下方式实现；通过诱导有益或保护性的免疫应答在鸟类成员中引发免疫应答，在 一些情况下，其还可W另外遏制、减轻、抑制或阻断过度或有害的免疫应答。术语"疾病"是 指对鸟类成员正常健康状况的任意偏离，包括W下状态；当疾病症状存在时，W及偏离（例 如，感染，基因突变，遗传缺陷等）已经存在但症状还未显示的状况。
[0067] 本发明的方法可W用于预防疾病，刺激抗疾病的效应细胞免疫，清除疾病，减轻疾 病，和预防源于原发病发生的继发病。
[0068] 本发明的方法包括施用组合物W针对多种病原体的感染进行保护。施用的组合 物可W包括或可W不包括引发特异性应答的特异性抗原。预期本发明的方法将保护受体 受试者免受源于传染性微生物原的疾病，包括但不限于，病毒，细菌，真菌，和寄生虫。示例 性的病毒传染性疾病，不受限制，包括源于W下病毒感染的那些疾病；鸡传染性贫血病毒 (CIAV)，Marek'S疾病病毒（MDV)，鸡瘤疹病毒（HCV)，火鸡瘤疹病毒（HTV)，传染性囊病病 毒（I抓V)，新城疫病毒（NDV)，传染性支气管炎病毒（IBV)，传染性喉气管炎病毒（ILTV)，3 型副粘病毒，禽脑髓炎（AEV)，禽痘病毒（FPV)，禽霍乱，禽流感病毒（AIV)，呼肠孤病毒，禽 白血病病毒（ALV)，网状内皮组织增殖病毒（REV)，鸟类腺病毒，出血性肠炎病毒（肥V)，肺 炎病毒，错子痘病毒，其重组物，和本领域已知的其他病毒。示例性的细菌感染，不受限制， 包括源于W下细菌感染的那些；革兰氏阳性或阴性细菌和真菌诸如大肠杆菌，鸡败血支原 体（Mycoplasmagallisepticum)，火鸡支原体（Mycoplasmameleagridis)，滑液囊支原体 (Mycoplasmasynoviae)，博德特氏菌属炬ordetellaSp)，多杀己斯德氏菌（Pasteurella multocida)，产气英膜梭菌（Clostridiumperfringens)，肠梭菌（Clostridiumcolinum)， 空肠弯曲杆菌（Camp}dobacterje化ni)，沙口氏菌属S(almonellasp)，肠炎沙口氏 菌（Salmonellaenteritidis)，鸡白频沙 口氏菌（Salmonellapullorum)，鸡沙 口氏菌 (Salmonellagallinarum)，肉毒杆菌（Clostridiumbotulinum)，鸡嗜血杆菌化emophilus gallinarum)，红斑丹毒丝菌巧；rysipelot虹ixinsidiosa)，鸭疫里氏杆菌（riemerella anatipestifer) (RA)，和本领域已知的其他细菌。示例性的真菌或霉菌感染，不受限 审ij，包括源于W下感染的那些；烟曲霉（Aspergillusfumigates),黄曲霉（Aspergillus flavus)，白色念珠菌（Candidaa化icans)，和本领域已知的其他传染性真菌或霉菌。示 例性的疾病状况，不受限制，包括源于W下毒素的那些：来自革兰氏阳性或阴性细菌和真 菌的毒素诸如产气英膜梭菌（Clostridiumperhingesns)毒素，肉毒杆菌毒素，大肠杆菌 肠毒素，葡萄球菌属毒素，己斯德氏菌白细胞毒素，和镶刀菌霉菌毒素W及本领域已知的其 他毒素。示例性的寄生虫包括，但不限于，珠鸡艾美球虫巧imeriameleagridis)，球虫目 属koccidiasp)，鸡咖虫（Ascaridiagalli)，鸡异刺线虫化eterakisgallinae)，环首 毛细线虫（Capillariaannulata)，扭转毛细线虫（Capillariacontorta)，错毛细线虫 (Capillariaobsi即ata)，气管比翼线虫（Syngamustrachea),和本领域已知的其他寄生 虫。
[0069] C.受试者 本发明的方法可施用给鸟类的任意受试者或成员，无论是驯养的还是野生的。具体来 说，它可W施用给用于育种、产肉或产蛋的商业化饲养的那些受试者。合适的鸟类受试者， 不受限制，包括鸡，火鸡，鶴，鸭，野鸡，鹤觀错子，驼鸟，笼鸟，动物学采集的鸟类和鸟舍等 等。在一个实施方案中，鸟类成员选自鸡或火鸡。技术人员将理解本发明的方法将非常有 益于高密度解房饲养的鸟类，诸如肉仔鸡和蛋鸡，因为它们对传染原的环境暴露是特别脆 弱的。
[0070]d.施用 可W提供各种施用途径。挑选的具体方式当然取决于选定的具体生物制剂，受试者的 年龄和全身健康状况，待治疗的具体病症和治疗功效需要的剂量。本发明的方法可W采用 任何施用方式来实施，其产生有效水平的免疫应答并且不引起临床上无法接受的副作用。 所述组合物可W方便地存在于单位剂型中，并且可W采用本领域公知的任何方法制备。
[0071]可W在任何年龄进行鸟类的接种。通常，对18天龄胚胎（卵内）及W上进行活微 生物的接种，对3周龄及W上进行灭活微生物或其他类型疫苗的接种。对于卵内接种，可W 在胚胎发育的后1/4期间进行接种。疫苗可W通过W下方式施用；皮下，羽囊，通过喷雾，口 月良，眼内，气管内，鼻，卵内或通过本领域已知的其他方法。口服疫苗可W在饮用水中施用。 进一步的，预期本发明的方法可W基于常规接种方案来使用。在一个实施方案中，卵内施用 本发明的免疫调节剂组合物。在另一个实施方案中，在大肠杆菌攻击后施用作为喷雾的免 疫调节剂组合物。
[0072]其他递送系统可W包括定时释放，延迟释放或缓慢释放的递送系统。该类系统可W避免组合物的重复施用，从而增加便利性。许多类型的释放递送系统是已有的，并且为 本领域普通技术人员所知。它们包括基于多聚体的系统诸如聚（丙交醋-己交醋），共聚 草酸醋，聚己酸内醋，聚酷胺醋，聚正醋，聚哲基了酸，和聚酢。包含药物的上述多聚体的微 胶囊描述于，例如，美国专利号5, 075, 109。递送系统还包括非聚合物系统，它们是脂质包 括酱醇诸如胆固醇，胆固醇醋和脂肪酸或中性脂诸如单、双和=甘油醋；水凝胶释放系统； sylastic系统；基于肤的系统；蜡质涂层；使用常规结合剂和赋形剂的压制片剂；部分融 合的植入物；等等。具体实例包括，但不限于侵蚀系统，其中本发明的制剂包含在基质内形 式中，诸如描述于美国专利号4, 452, 775,4, 675, 189和5, 736, 152中的那些，和弥散系统， 其中活性成分W受控速率从多聚体渗透，诸如描述于美国专利号3, 854, 480, 5, 133, 974和 5, 407, 686。此外，可W使用基于累的硬件递送系统，其中一些适于移植。
[0073] 因为在不脱离本发明范围的情况下可W对上述组合物、产品和方法进行各种变 化，所W意图上述说明书W及下文实施例包含的所有内容均应被解释为说明性的，而不是 限制性的。
[0074] 定义 术语"有效量"是指必须或足W实现所需生物效应的量。例如，用于治疗或预防传染病 的免疫调节剂的有效量是当暴露于微生物时，该量是引起抗原特异性免疫应答的出现所必 需的，从而造成受试者内微生物量的降低和优选的消灭微生物。针对任何具体应用的有效 量可W变化，该取决于待治疗的疾病或病症、受试者的大小或疾病或病症的严重性该类因 素。本领域的普通技术人员无需过度实验，通过经验就可W确定免疫调节剂的有效量。
[00巧]术语"细胞因子"是指增强免疫的蛋白家族。细胞因子家族包括造血生长因子， 白介素，干扰素，免疫球蛋白超家族分子，肿瘤坏死因子家族分子和趋化因子（即调节细 胞尤其是吞瞻细胞的迁移和活化的蛋白）。示例性的细胞因子包括，但 不限于，白介素-2 (比-2)，白介素-12 (IL12),白介素-15 (比-15)，白介素-18 (比-18)，干扰素-曰 (IFN曰）干扰素-曰（IFN曰），和干扰素-曰（IFNa)。
[0076]术语"引发"可W与术语活化，刺激，产生或上调互换使用。
[0077]术语在受试者中"引发免疫应答"是指特异性控制或影响免疫应答的活性，可包括 活化免疫应答，上调免疫应答，增强免疫应答和/或改变免疫应答(诸如通过引发一种免疫 应答，其进而将受试者中占优势的免疫应答类型从有害或无效的类型转变为有益或保护性 的类型)。
[0078]术语"可操作的连结"是指采用W下方式将核酸分子连接到转录调控序列，该方式 使得当所述分子被转染（即，转化、转导或转染）入宿主细胞时能够表达。转录调控序列是 控制转录的起始、延伸和终止的序列。尤其重要的转录调控序列是控制转录起始的那些序 列，诸如启动子、增强子、操纵子和抑制序列。各种该类转录调控序列是本领域技术人员已 知的。优选的转录调控序列包括在鸟，鱼，哺乳动物，细菌，植物和昆虫细胞中起作用的那 些。尽管本发明可W使用任意转录调控序列，所述序列可W包括天然存在的转录调控序列， 其与编码免疫原或免疫刺激蛋白的序列天然结合。
[007引术语"核酸分子"和"核酸序列"可W互换使用，包括DNA，RNA，或DNA或RNA的衍 生物。术语还包括寡核巧酸和更大的序列，包括编码蛋白或其片段的核酸分子，W及包括调 节区、内含子或其他非编码DNA或RNA的核酸分子。通常，寡核巧酸具有长度为约1到约 500个核巧酸的核酸序列，和更常见的，长度为至少约5个核巧酸。核酸分子可W来源于任 意来源，包括哺乳动物，鱼，细菌，昆虫，病毒，植物，或合成来源。核酸分子可W通过本领域 通常已知的方法来产生，诸如重组DNA技术(例如，聚合酶链式反应（PCR)，扩增，克隆）或化 学合成。核酸分子包括天然核酸分子及其同系物，包括但不限于，天然等位基因变体和改造 的核酸分子，其中核巧酸已经采用如下方式被插入，缺失，取代或反向，所述方式使得该类 改造基本上不干扰核酸分子编码可用于本发明方法的免疫原或免疫刺激蛋白的能力。核酸 同系物可W利用本领域技术人员已知的大量方法来产生（参见，例如，Sambrooketal.， MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLabsPress,1989)， 其通过引用在此引入。筛选免疫原性（诸如病原体抗原免疫原性或细胞因子活性）的技术 是本领域技术人员已知的，包括各种体外和体内测定。 实施例
[0080] 下列实施例说明本发明的各种实施方案。
[0081] 实施例1.材料和方法。
[0082] 免疫调节剂 本研究使用的免疫调节剂是包括阳离子脂质和非编码DM的组合物。配制合成的免疫 调节剂脂质组分[1-[2-巧-狂)-十八締酷基氧基]]-2-[引狂)-十走締基]-3-[哲己基]咪 挫咐偷氯化物值OTIM)和合成的中性脂类胆固醇W产生直径为大约200皿的脂质体（参 见，美国专利6, 693, 086)。DNA组分是在大肠杆菌中产生的4292个碱基对的非编码DNA 质粒（pMB75. 6)，其是带负电荷的，与带正电荷（阳离子）的脂质体结合（参见，美国专利 6, 693, 086)。
[0083] 表1.给600个蛋/组施用的剂量的免疫调节剂稀释方案。
[0084] 研究动物 在18天解育期间对光检查商品化供应的鸡蛋（肉仔鸡）W确定活性。将健康的胚胎归 入研究中，丢弃不生育、死亡和不健康的胚胎。将维鸡放入常规加利福巧亚类型的侧面带窗 帘的鸡舍。在第0天每个鸡舍具有50只未鉴别鸟类。给维鸡饲喂符合MRC推荐的针对研 究动物的年龄和重量的口粮，并且维鸡通过连接到每个鸡舍供水的钟状饮水器可W随意获 得水。
[0085] 实验性感染和攻击 用生物攻击维鸡W确定免疫应答的功效。攻击或实验性感染，包括暴露于生物诸如大 肠杆菌巧.coli)的接种物。使用浓度为2. 63X105的生物，并通过将0. 15mL的接种物喷 到每个含胚卵（在解化盘中）上进行施用。
[0086] 实施例2.免疫调节剂的施用增加解化率。
[0087] 进行研究W确定如实施例1所述的免疫调节剂给18天龄的含胚鸡蛋施用（然后 暴露于大肠杆菌巧.coli))的效果。研究包括两组（表2)，一组用大肠杆菌攻击（T1-4)，另 一组不被攻击（T5和T6)。在大肠杆菌攻击组中，存在四个亚组，每个亚组施用不同剂量的 免疫调节剂，包括W下剂量：无订1)，0. 1微克订2)，1. 0微克订3)，和10. 0微克（T4)。 未攻击组包括两个亚组，其未施用免疫调节剂（T5)或施用1.0微克免疫调节剂订6)。
[008引表2.研究处理组。
[0089] 在研究第0天，对接受免疫调节剂的18天龄含胚蛋进行卵内注射。在第1天，对 攻击组（T1-T4)中19天龄含胚蛋每个喷雾0. 15血包含浓度为2. 63X105的大肠杆菌的 接种物。
[0090] 全部组的分析产生统计上显著的对含胚蛋解化率的处理效果。在两个未攻击对照 组之间不存在显著差异订5,0微克/kg，91 %对T6,1.0微克/kg，89 %)。此外，两个未处 理组（T1-攻击和T5-未攻击）之间的比较结果是，未攻击组中更多的含胚蛋解出（分别是 85 %对91 %)。因此，攻击模型被证实为评价解化率的有效模型。
[0091] 对于用免疫调节剂处理的那些组来说，T3 (1.0微克/kg-处理的蛋）组比未处理 /攻击的T1巧4. 5 %)或者T4 (10.0微克/kg-处理的蛋）（85 %)解化出更多的鸟类巧1.5 %)(图1)。在未处理/未攻击对照组（T5)和前述两个处理组订1，如上所述，和T4)之间显 示类似的差异。在任意剩余的两两（pair-wise)组比较中未显示其他重要的发现（图1)。
[0092] 在每个鸡舍，每组，每个研究天中鸟类死亡比例没有显著差异（图2)。任意特定研 究天的鸟类存活比例结果是处理和时间之间没有统计上显著的关联，但显示显著的处理效 果（图3)。当与组T1、T2和T4比较时，组T3、T5和T6的鸟类在任意天都具有显著更多的 鸟类。此外，T5鸟类还具有比T3显著活性更高的鸟类。评价解化后的鸟类生存力产生与 上述类似的重要发现（图4到图12)。
[0093] 在第7,14, 21或28天观察到的鸡舍重量不存在显著差异（图13到图16)。第35 天对总鸡舍重量的分析产生T5和T2组之间的显著差异（分别是平均87kgs对75kgs) (图17)。研究结束时（第45天），当与T1 (105kgs)比较时，组T5 (120kgs)和T6 (117 kgs)的鸡舍重量更大，当与T2 (106kgs)和T4 (105kgs)比较时，T5更大（图18)。
[0094] 总之，评价了当在商品化的肉仔鸡中卵内施用时（在大肠杆菌感染之前）免疫调 节剂的效果。对于用免疫调节剂处理的那些组，T3组巧2 %)比未处理/攻击的T1巧5 %) 或T4巧5 %)组解化出更多的鸟类。在未处理/未攻击对照组（T5)与相同处理组T1和T4 之间显示类似的差异。死亡率（图2到图12)和体重（图13到图18)不存在显著差异。在 本研究中，免疫调节剂有效增加商品化肉仔鸡蛋（解化前用大肠杆菌攻击）的解化率，特别 是1. 0微克的剂量显示免疫调节剂接受组中增强的免疫。
[0095] 实施例3.免疫调节剂的施用增加非抗原特异性免疫。
[0096] 进行研究W确定如实施例1所述的免疫调节剂在Marek'S病接种的鸡（暴露于大 肠杆菌）中的效果。研究包括两组，一组用大肠杆菌攻击（T1-T4)，另一组不被攻击（T5和 T6)。在大肠杆菌攻击组中，存在四个亚组，每个亚组施用不同剂量的免疫调节剂，包括W 下剂量：无（T1)，0. 1微克（T2)，1. 0微克（T3)，1. 0微克加1剂量的Marek'S疫苗（T4) (表3)。未攻击组包括两个亚组，其未施用免疫调节剂（T5)或施用1.0微克免疫调节剂 订6)。
[0097] 表3.研究处理组。
[0098] 将商品化肉仔鸡蛋解育18天，对光检查生存力，然后将接受免疫调节剂的18天龄 含胚蛋进行卵内注射。第二天，对攻击组中19天龄含胚蛋每个喷雾0.15mL包含浓度为 2. 8X107每毫升的大肠杆菌的接种物。蛋在研究第0天解出，所述研究延续45天。
[0099] 记录每组解出的含胚蛋数目（n=1000每组或解化盘）（图19)。在解出的维鸡中， 记录解出后第7天仍然存活的维鸡数目（图20)。还记录解出后第7天每组活鸡/死鸡的 数目（图21)。攻击组中死亡百分比随着免疫调节剂的增加而减少，Marek's疫苗与免疫调 节剂的共施用进一步降低死亡百分比（图22)。
[0100] 数据显示在免疫调节剂处理组和未处理组（未用大肠杆菌攻击）之间不存在解化 率的降低（图23)。在免疫调节剂处理组和未处理组（用大肠杆菌攻击）之间解化率显著 更高。接受免疫调节剂和一剂量的Marek'S疫苗的含胚蛋的解化率类似于未处理和未攻击 对照的解化率。总之，免疫调节剂增加攻击条件下的解化率，而Marek'S疫苗的共施用增强 免疫调节剂的保护性应答。结果表明，施用免疫调节剂或免疫调节剂和Marek'S疫苗引发 非抗原特异性免疫应答。
[0101] 实施例4.免疫调节剂的施用引发非抗原特异性免疫应答，其被生物制剂的额外 施用所增强。
[0102] 进行研究W确定免疫调节剂在Marek's病接种的鸡（暴露于大肠杆菌）中的效 果。该研究包括9个组，如表4所示进行不同处理。
[0103] 表4.研究组处理。
[0104] 将商品化肉仔鸡蛋解育18天，对光检查生存力，然后将接受免疫调节剂的18天龄 含胚蛋进行卵内注射。第二天，对攻击组中19天龄含胚蛋每个喷雾0.15mL包含浓度为 2. 63X105每毫升的大肠杆菌的接种物。蛋在研究第0天解出，所述研究延续45天。
[0105] 计算每组解出的含胚蛋百分比（图24)。在解出的维鸡中，在解化后第7天计算攻 击组（图26)和未攻击组（图25)的死亡百分比。攻击组比类似处理的未攻击组显示更高 的死亡百分比（图27)。计算从解出到第7天（图28)W及第3天（18天存活胚胎）到第 7天（图29，n=400)每组存活维鸡的百分比。与受到攻击的对照组巧2. 2 %，图28)相比， 对在攻击前用免疫调节剂处理的鸟类来说存在显著更高的存活率（>98. 2 %，图28)。与受 到攻击的对照组巧2. 2 %，图28)相比，对在攻击前后解化时用免疫调节剂处理的鸟类来说 在第7天存在显著更高的存活率巧5 %，图28)。该些结果是利用包含400个蛋每组的集合 概括得出的（图29 )。与对照组化7. 0 %，图29)相比，对攻击前接受处理的胚胎来说在第 7天存在更高的存活率（集合400) (>94. 3 %，图29)。类似的，在第14天与受到攻击的对 照组相比巧1.9 %，图30)，对于用免疫调节剂进行卵内处理的鸟类来说存在显著更高的存 活率巧7. 4 %，图30,没有第二次处理）。与对照组81. 9%相比（图30)，在攻击后1天龄 用免疫调节剂处理的组中在第14天存在显著更高的存活鸟类，93. 9 % (图30)，没有第一次 处理。与对照组81. 9%相比（图30)，在卵内用免疫调节剂处理并且随后在1天龄用免疫调 节剂处理的组中在第14天也存在显著更高的存活鸟类，95. 8 %(图30)。图30显示利用不 同处理的攻击组和未攻击组的周死亡率。
[0106] 数据显示在免疫调节剂处理组（处理一次或两次）和未处理组（未用大肠杆菌攻 击）之间不存在解化率的降低。在大肠杆菌攻击前用免疫调节剂处理的组中解化率更高。 当免疫调节剂与Marek'S疫苗共施用时，该功效被增强。此外，在未攻击组中，免疫调节剂 处理与死亡率降低相关。Marek'S疫苗的共施用W及施用免疫调节剂与Marek'S疫苗前用 免疫调节剂预处理将进一步降低死亡率。该些结果是从攻击组概括得出的。总之，免疫调节 剂增加攻击条件下的解化率，而Marek'S疫苗的共施用增强免疫调节剂的保护性应答。结 果表明，当免疫调节剂的施用伴随Marek'S疫苗时，由免疫调节剂施用引发的非抗原特异 性免疫应答被增强。免疫调节剂与Marek'S疫苗的共施用进一步增强非抗原特异性免疫应 答。
[0107] 实施例5.感染后施用免疫调节剂引发非抗原特异性免疫应答，其被生物制剂的 额外施用所增强。
[010引与受到攻击的对照组巧2. 2 %，图28)相比，对在攻击后用免疫调节剂处理的鸟类 来说存在显著更高的存活率巧5 %，图28)。该些结果是利用包含400个蛋每组的集合概括 得出的（图29)。
[0109] 结果表明，当免疫调节剂的施用伴随Marek'S疫苗时，由大肠杆菌攻击后施用免 疫调节剂引发的非抗原特异性免疫应答被增强。在Marek'S疫苗之后免疫调节剂的后施用 增强非抗原特异性免疫应答。
[0110] 实施例6.免疫调节剂与二价生物制剂的施用不抑制二价生物制剂的早期复制 进行研究W确定免疫调节剂是否将对Marek'S病二价疫苗的早期复制产生负面影响。 Marek'S病二价疫苗包括HVT(火鸡瘤疹病毒）和SB1 (鸡瘤疹病毒）。
[0111] 解育商品化肉仔鸡蛋18天，对光检查生存力。将蛋分成3组，A-C每组20个蛋。 按照表5所示接种每个蛋。
[0112] 表5:处理。
[0113] 为了评价免疫调节剂在体内对疫苗病毒复制的影响，在置于脾细胞（SPC)和外周 血单核细胞（PBMC)后第7和14天进行病毒再分离。
[0114] 因为已知MD疫苗病毒感染在病毒复制水平上对鸟到鸟有变异，利用鸡的S重集 合（每个集合2只鸡，每个取样点3个集合）进行再分离。
[0115] 尽管集合间存在变异，但在免疫调节剂存在条件下，HVT和SB-1的复制存在明确 的趋势。在第一周对于SB-1复制来说该数据最为显著，但在两个时间点（卵化后第7和 14天）的该两种组织中HVT和SB-1的总体趋势是类似的。所述数据概述于图31到图38。 图31显示第1周免疫调节剂对脾细胞中HVT的MD疫苗复制的影响。图32显示第1周免 疫调节剂对PBMC中HVT的MD疫苗复制的影响。图33显示第1周免疫调节剂对脾细胞中 SB-1的MD疫苗复制的影响。图34显示第1周免疫调节剂对PBMC中SB-1的MD疫苗复制 的影响。图35显示第2周免疫调节剂对脾细胞中HVT的MD疫苗复制的影响。图36显示 第2周免疫调节剂对PBMC中HVT的MD疫苗复制的影响。图37显示第2周免疫调节剂对 脾细胞中SB-1的MD疫苗复制的影响。图38显示第2周免疫调节剂对PBMC中SB-1的MD 疫苗复制的影响。
[0116] 免疫调节剂对MD疫苗复制不具有负面影响。免疫调节剂看起来具有佐剂功效，其 在感染后最初两周增加HVT和SB-1的复制。该些数据表明免疫调节剂对MD疫苗功效具有 正面影响。
[0117] 实施例7.免疫调节剂与修饰的活生物制剂的施用不干扰所述修饰的活生物制剂 进行研究W确定免疫调节剂与修饰的活的新城疫接种的鸡（暴露于新城疫）的效果。 该研究包括9个组，如表6所示进行不同处理。
[011引表6.研究组处理。
[0119] 解育商品化肉仔鸡蛋18天，对光检查生存力。将蛋分成9组，T1-T9每组60个 蛋。组T9在解化后第一晚遭受害虫攻击，在研究期间存在未知原因导致的一些死亡。在挑 选（culling)时，每组的鸟类数目列于表7。
[0120] 表7.每组的鸟类。
[0121] 组T4-T6的18天龄含胚蛋卵内注射免疫调节剂。组T1-T3和T7-T9注射盐水。在 第0天，组T1-T2中解化的蛋和维鸡用盐水喷雾，组T3-T6接受新城疫疫苗Newhatch-C2 (由 Intervet/Schering-Plou曲AnimalHealth制备），组T7-T9用免疫调节剂喷雾和接种。
[0122] 在解化后第7,14和21天获得血清用于测定抗NDV滴度。在第21天，用缓发型新 城疫病毒攻击维鸡组T2-T9。在第26天挑选维鸡，采血，检查气囊炎的宏观病理学，并进行 血清分析。
[0123] 数据显示在第7、14和21天的组之间不存在血清学的显著差异。但是，在第26天 (攻击后5天），卵内接受免疫调节剂的鸟类具有高于所有其他组（仅包括疫苗）的显著增 加的抗NDV滴度（图40)。
[0124] 气囊炎在T2-T5中显著降低，该些维鸡接受卵内调节剂（图39)。该结果表明免疫 调节剂的卵内施用不干扰NDV接种。
[0125] 实施例8.毒性攻击中施用免疫调节剂与生物制剂的功效 进行研究W鉴定18天龄含胚蛋中单剂量的免疫调节剂对常规Marek'S病接种的干扰。 该研究比较了Marek'S病接种抗毒性攻击的效果。
[0126] 将总共160个含胚蛋分成8组。在研究第0天，给解化刚脱壳的每只鸟接种 Marek's病病毒。解出的脱壳鸟类数目是160只中的148只（参见下面的表8,蛋/鸟类的 开始数目对括号中研究结束时的实际鸟类）。S周后，每只再添加80只鸟类，15只未接种 和未处理的鸟类（接触）和65只处理的鸟类（接种）（参见下面的表8,每组的处理）。
[0127] 表8:处理。
[0128] 在研究第42天，取出存活的脱壳鸟类并进行尸体剖检。在研究第63天（接触和 接种的第42天），取出存活的研究鸟类并进行尸体剖检。
[0129] 图41显示接种的脱壳鸟类，未接种的接触鸟类，只接种的鸟类，接种/免疫调节剂 鸟类的生存曲线。未接种的接触数据是8个鸡舍的均值，而每个接种组是每种4个鸡舍的 均值。可W观察到，只接种和接种/免疫调节剂鸟类的生存曲线的斜率存在相似性。
[0130]图42显示接种的脱壳鸟类，未接种的接触鸟类，只接种的鸟类，接种/免疫调节剂 鸟类中Marek'S病的平均发病率。脱壳和接触数据是8个鸡舍的均值，而每个接种组是每 种4个鸡舍的均值。可W观察到，只接种组和接种/免疫调节剂组具有低得多的Marek'S 病发病率。接种/免疫调节剂组具有比只接种组更低的Marek'S病发病率。
[0131] 从图41到图42可W看出，免疫调节剂对Marek'S病疫苗保护不具有损害作用。实 际上，它引发疫苗功效的增加。
【主权项】
1. 免疫调节剂组合物在制备用于通过向蛋卵内施用约0. 05至约10微克的有效量的所 述免疫调节剂组合物而降低从用大肠杆菌co7i)攻击的含胚鸡蛋孵化的鸡 中的死亡率的药物中的用途，其中所述免疫调节剂组合物包括： a. 阳离子脂质体递送载体；和 b. 核酸分子，所述核酸分子不编码免疫原。2. 权利要求1的用途，其中所述核酸分子是分离的细菌来源的核酸载体或其片段。3. 权利要求1或2的用途，其中所述核酸分子是DNA质粒。4. 权利要求1或2的用途，其中向蛋卵内施用约0. 1至约5微克的所述免疫调节剂组 合物。5. 权利要求1或2的用途，其中向蛋卵内施用约I. 0微克的所述免疫调节剂组合物。6. 权利要求1或2的用途，其中所述免疫调节剂组合物在孵育第18天施用于含胚鸡 蛋。7. 权利要求1或2的用途，其中所述脂质体递送载体包括选自多层囊泡脂质和挤压脂 质的脂质。8. 权利要求1或2的用途，其中所述阳离子脂质体递送载体包括选自DOTM和胆固醇； DOTAP和胆固醇；DOTM和胆固醇，以及DDAB和胆固醇的脂质对。9. 权利要求1或2的用途，其中所述阳离子脂质体递送载体包括DOTIM和胆固醇。10. 权利要求1或2的用途，其中施用是在攻击之前。11. 权利要求1或2的用途，其中施用是在攻击之后。12. 权利要求1或2的用途，其中所述免疫调节剂组合物还包括生物制剂，其中所述生 物制剂是用于针对选自下述的病毒或疾病进行保护的疫苗：Marek's病病毒（MDV)，新城疫 病毒（NDV)，雏鸡贫血病毒（CAV)，传染性囊病病毒（IBDV)，传染性支气管炎病毒（IBV)，火 鸡疱瘆病毒（HVT)，传染性喉气管炎病毒（ILTV)，禽脑髓炎病毒（AEV)，禽痘病毒（FPV)，禽 霍乱，禽流感病毒（AIV)，呼肠孤病毒，鸟类白血性增生病毒（ALV)，网状内皮组织增殖病毒 (REV)，鸟类腺病毒，出血性肠炎病毒（HEV)，及其组合。13. 免疫调节剂组合物在制备用于降低用大肠杆菌攻击的鸟类的至少一种成员中的死 亡率的药物中的用途，包括通过喷雾给所述鸟类成员施用有效量的免疫调节剂组合物，其 中所述免疫调节剂组合物包括： 阳离子脂质体递送载体；和 核酸分子，所述核酸分子不编码免疫原。
【专利摘要】本发明涉及一种免疫活化的方法，其在鸟类成员中有效引发非抗原特异性免疫应答。所述方法尤其可以有效的保护鸟类成员免受传染病和治疗患有传染病的动物。
【IPC分类】A61K9/127, A61P37/04, A61K48/00, A61K39/39, A61P31/04
【公开号】CN104906573
【申请号】CN201510317838
【发明人】A.阿伯拉罕
【申请人】拜耳知识产权有限责任公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2010年5月7日
【公告号】CA2761736A1, CN102427827A, CN102427827B, EP2429581A1, EP2429581B1, US20120064151, WO2010130374A1
【专利说明】
[OOOU本申请是国际申请日为2010年5月7日、国际申请号为PCT/EP2010/002809、进入 国家阶段的申请号为201080021073. 9、发明名称为"鸟类中增强的免疫应答"的PCT申请 的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及一种鸟类中免疫活化的方法。具体来说，本发明包括用于引发呼吸性 和全身性，非特异性W及抗原特异性免疫应答的方法，其可用于抗传染病的动物免疫，接种 和治疗。
【背景技术】
[0003] 疫苗被用于预防传染病和治疗确定的疾病。感染性疾病由传染原（包括诸如病 毒，细菌，寄生虫，和其他真菌的实例）引起。已经为所有类型的物种（包括哺乳动物，鸟， 鱼和灵长类动物）开发了许多试剂和方法来预防和治疗传染性疾病。
[0004] 接种程序对于食品工业中使用的商业化养殖的动物是特别重要的。鸟类是许多感 染类型的主要目标。育种人员和商品化的鸡、火鸡W及其他家禽群体通常被接种W保护他 们抵抗病原体的环境暴露。对养禽业来说，经济上最重要的疾病之一是Marek'S病，其是鸡 中天然发生的淋己组织增生疾病。该疾病由高度传染性的瘤疹病毒引起，所述瘤疹病毒水 平传播，并导致养禽业的主要经济损失。Marek'S病的症状在感染鸟类的神经，生殖器官，内 脏，眼睛和皮肤中广泛存在，引起运动麻搏，器官功能减弱和慢性营养不良，最终导致死亡。
[0005] 解化的鸟类在出生后不久即暴露于致病微生物。尽管该些鸟类最初被来自母亲的 抗体针对病原体进行保护，但该种保护只是暂时的，鸟类自己未成熟的免疫系统必须开始 保护鸟类抵抗病原体。通常希望在幼维中预防感染，此时它们是最易感染的。还希望在年 纪较大的鸟类中预防感染，尤其是当鸟类被近距离圈养时，导致疾病的快速传播。
[0006] 在大部分商品家禽场中，在解化时肠胃外给予新解化的维鸡某些疫苗。因为暴露 于病原体经常发生在非常小的年纪，在将它们置于饲养室或解卵室之前经常需要对它们进 行接种。该类接种方案需要处理单只鸟类，设及意外自身注射的可能风险。此外，该些疫苗 并不总是有效的。在它们有机会发展出足够的保护性免疫前，年幼的维鸡可能在接种后很 快就暴露于疾病的毒性形式。
[0007] 在鸟类解化前，可W在鸡蛋中施用一些活的病毒疫苗。该种方法被称作"卵内接 种"。卵内接种的鸟类发展出针对祀疾病的抗性。但是，由于疫苗药剂的胚胎致病性，用于解 化鸟类的许多疫苗不能用于卵内接种。晚期胚胎对大部分被测疫苗病毒的感染高度敏感。 不是所有对新解化维鸡无致病性的疫苗病毒对于晚期胚胎也是安全的。例如，传染性支气 管炎病毒（IBV)和新城疫病毒（NDV)的疫苗株（通常用做新解化维鸡的新生疫苗），在卵内 接种后对于胚胎是致死性的。该些病毒已经被改造使得它们对于卵内使用来说是安全的。 病毒的改造减弱了引发的免疫应答，因此是在保护晚期胚胎方面效果降低的疫苗药剂。
【发明内容】
[0008] 由需要提供避免传染病和经济损失的保护的该类不同疫苗产生的接种程序是复 杂的。因此，需要一种引发非抗原特异性免疫应答的方法，所述免疫应答增强鸟类免受传染 病的保护，并且容易施用。此外，希望具有一种引发免疫应答的方法，所述免疫应答提供针 对不止一种传染原的保护功能。此外还需要一种引发免疫应答的方法，所述免疫应答具有 更长的持续时间或不需要疫苗的加强注射。本发明提供一种引发鸟类非抗原特异性免疫应 答的方法，其还降低群体的发病率，提供针对不止一种传染原的保护功能，W及提供比本领 域通常已知的其他产品更长时段的保护。
【附图说明】
[0009] 图1图示含胚鸡蛋的不同处理组之间的解化率。分析的研究组包括T1, 0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0010] 图2图示解化后每天每个鸡舍的平均日死亡率。图解化ey) ;T1，0微克免疫调节 剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3，1.0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5，0 微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0011] 图3图示基于含胚鸡蛋的初始数目，每个鸡舍任意特定研究日的鸟类存活比例。 图解；T1，0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠 杆菌攻击；T3，1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10. 0微克免疫调节剂/ 蛋和大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/ 蛋和未攻击。
[0012] 图4用图表示解化后鸟类的生存力。图解；T1，0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆 菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3，1.0微克免疫调节剂/蛋和 大肠杆菌攻击；T4，10.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂 /蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0013] 图5图示7天研究期间的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1，0微克 免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5，0 微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0014] 图6用图表示到研究第14天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1，0 微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0015] 图7用图描述到研究第21天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1，0 微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0016] 图8图示到研究第28天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1，0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5，0 微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0017] 图9用图描述到研究第35天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；Tl，0 微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0018] 图10用图表示到研究第45天的存活率，解化死亡率和解化后死亡率。图解；T1， 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击； T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0019] 图11显示到研究第45天来自18天龄胚胎的每组的累计死亡率。图解；T1，0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3， 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻 击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0020] 图12显示从研究第0天到研究第45天解化后的每组的累计死亡率。图解；T1， 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击； T3，1.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10.0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌 攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0021] 图13显示从研究第0天到第7天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3，1. 0 微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4，10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击； T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0022] 图14显示从研究第0天到第14天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0023] 图15显示从研究第0天到第21天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0024] 图16显示从研究第0天到第28天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[00巧]图17显示从研究第0天到第35天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0026] 图18显示从研究第0天到第45天观察到的总平均体重增加。图解；T1，0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1.0微 克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 10. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T5， 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0027] 图19用图描述含胚鸡蛋的每个研究组解出鸡的数目。被分析的研究组包括T1， 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0. 1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1 . 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 1. 0微克免疫调节剂/蛋加1剂量的 Marek'S疫苗和大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6, 1. 0微克免 疫调节剂/蛋和未攻击。
[002引图20图示研究第7天每组活鸡的数目。图解：T1，0微克免疫调节剂/蛋和大 肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3,1.0微克免疫调节剂/ 蛋和大肠杆菌攻击；T4,1.0微克免疫调节剂/蛋加1剂量的Marek' S疫苗和大肠杆菌攻 击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6,1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0029] 图21显示研究第7天每组活鸡和死鸡的比较。
[0030] 图22显示到研究第7天每个研究组的死亡百分比。图解：T1，0微克免疫调节 剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T3,1.0微克免 疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4,1.0微克免疫调节剂/蛋加1剂量的Marek' S疫苗和 大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击；和T6,1.0微克免疫调节剂/蛋和 未攻击。
[0031] 图23图示研究结束时（第7天）包括死胚，死鸡和活鸡（绿色）的每组的存活鸟 类的数目。图解；T1，0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T2，0.1微克免疫调节剂/ 蛋和大肠杆菌攻击；T3, 1. 0微克免疫调节剂/蛋和大肠杆菌攻击；T4, 1. 0微克免疫调节 剂/蛋加1剂量的Marek'S疫苗和大肠杆菌攻击；T5，0微克免疫调节剂/蛋和未攻击； 和T6, 1.0微克免疫调节剂/蛋和未攻击。
[0032] 图24用图描述含胚鸡蛋的每个研究组解出鸡的百分比。被分析的研究组包括列 于表4的那些。
[0033] 图25显示解化后到研究第7天未用大肠杆菌攻击的研究组的死亡百分比。被分 析的研究组包括列于表4的那些。
[0034] 图26显示解化后到研究第7天用大肠杆菌攻击的研究组的死亡百分比。被分析 的研究组包括列于表4的那些。
[00巧]图27用图描述解化后到研究第7天每个研究组的死亡百分比。被分析的研究组 包括列于表4的那些。
[0036] 图28显示解化后到研究第7天每个研究组的存活百分比。被分析的研究组包括 列于表4的那些。
[0037] 图29显示研究第7天每个研究组的存活百分比。被分析的研究组包括列于表4 的那些。
[0038] 图30显示到研究第7天和第14天每个研究组的周死亡率。被分析的研究组包括 列于表4的那些的亚组。
[0039] 图31用图描述在研究第一周免疫调节剂对脾细胞中HVT的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[0040] 图32用图描述在研究第一周免疫调节剂对PMBC中HVT的MD疫苗复制的影响。被 分析的研究组包括列于表5的那些。
[00川图33用图描述在研究第一周免疫调节剂对脾细胞中SB-1的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[004引图34用图描述在研究第一周免疫调节剂对PMBC中SB-1的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[004引图35用图描述在研究第二周免疫调节剂对脾细胞中HVT的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[0044] 图36用图描述在研究第二周免疫调节剂对PMBC中HVT的MD疫苗复制的影响。被 分析的研究组包括列于表5的那些。
[004引图37用图描述在研究第二周免疫调节剂对脾细胞中SB-1的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[0046] 图38用图描述在研究第二周免疫调节剂对PMBC中SB-1的MD疫苗复制的影响。 被分析的研究组包括列于表5的那些。
[0047] 图39用图描述卵内接受免疫调节剂，抗ND接种和接受攻击的维鸡中气囊炎的降 低。被分析的研究组包括列于表7的那些。
[004引图40用图描述第26天表7所列研究组的ELISAs。
[0049] 图41用图描述表8所列研究组中维鸡的存活率。
[0050] 图42用图描述表8所列研究组中Marek' S病的发病率。
【具体实施方式】
[0051] 本发明引发鸟类成员免疫应答的方法包括给鸟类成员施用有效量的免疫调节剂 组合物W引发鸟类成员的免疫应答。所述免疫调节剂组合物包括脂质体递送载体和至少一 种核酸分子。具体来说，所述免疫调节剂引发非抗原特异性免疫应答，利用施用至少一种生 物制剂诸如疫苗将其进一步增强。
[0052] 所述方法为保护鸟类免受传染性疾病和治疗患有传染病的群体提供新的治疗策 略。此外，通过使用本发明的免疫调节剂组合物，当卵内施用免疫调节剂时不存解化率或在 解化后存活率的降低，当与疫苗共施用时也不存在解化率或存活率的降低。此外，在施用疫 苗前预施用免疫调节剂进一步增强非抗原特异性免疫应答。本发明的方法还允许之前只能 在解化后施用的疫苗安全用于卵内。此外，本发明的方法允许不止一种疫苗与免疫调节剂 组合物的组合。最后，当免疫调节剂与疫苗联用时，本发明的方法提供更长的抗疾病预防。 [00閲I.组合物 a.免疫调节剂 在本发明的一个实施方案中，免疫调节剂组合物包括脂质体递送载体和至少一种核酸 分子，如美国专利号6,693,086所述，其通过引用引入本文。
[0054] 合适的脂质体递送载体包括能够将核酸分子递送到被治疗的受试者组织的脂质 组合物。脂质体递送载体优选的能够在受试者中保持足够量时间的稳定W递送核酸分子和 /或生物制剂。在一个实施方案中，脂质体递送载体在受体受试者中稳定至少约30分钟。 在另一个实施方案中，脂质体递送载体在受体受试者中稳定至少约1小时。仍在另一实施 方案中，脂质体递送载体在受体受试者中稳定至少约24小时。
[00巧]本发明的脂质体递送载体包括脂质组合物，所述脂质组合物能够与细胞质膜融合W将核酸分子递送入细胞。在一个实施方案中，当递送本发明的核酸：脂质体复合物时，每 毫克（mg)总组织蛋白每微克（yg)递送的核酸表达至少约1皮克（pg)蛋白。在另一个实 施方案中，核酸：脂质体复合物的转染效率是每mg总组织蛋白每微克递送的核酸表达至 少约10pg蛋白；和仍在另一个实施方案中，每mg总组织蛋白每微克递送的核酸表达至少 约50pg蛋白。复合物的转染效率可W低至每mg总组织蛋白每微克递送的核酸表达1毫 微微克（fg)蛋白，上述量是更优选的。
[0056] 本发明优选的脂质体递送载体是直径约100到500纳米（nm)，在另一个实施方案 中，直径约150到450皿和仍在另一个实施方案中，直径约200到400皿。
[0057] 合适脂质体包括任何脂质体，诸如常用于，例如，本领域技术人员已知的基因 递送方法的那些脂质体。优选的脂质体递送载体包括多层囊泡（MLV)脂质和挤压的脂 质。用于制备MLV's的方法是本领域公知的。更优选的脂质体递送载体包括具有聚阳 离子脂质组成的脂质体（即，阳离子脂质体）和/或具有与聚己二醇缀合的胆固醇主链 的脂质体。示例性的阳离子脂质体组合物包括，但不限于N-[l-(2, 3-二油基氧基）丙 基]-N，N，N-S甲基氯化锭值0TMA)和胆固醇，N-[l-(2, 3-二油酷氧基）丙基]-N，N，N-S 甲基氯化锭值0TA巧和胆固醇，1-[2-(油酷氧基）己基]-2-油基-3-(2-哲己基）咪挫咐 鑛氯化物值0TIM)和胆固醇，二甲基双十八烷基漠化锭值DAB)和胆固醇，W及其组合。用 做递送载体的最优选脂质体组合物包括D0TIM和胆固醇。
[0058] 合适的核酸分子包括任何核酸序列诸如编码或非编码序列，W及DNA或RNA。编码 核酸序列编码蛋白或肤的至少一部分，而非编码序列不编码蛋白或肤的任何部分。根据本 发明，"非编码"核酸可W包括转录单位的调节区域，诸如启动子区域。术语"空载体"可W 与术语"非编码"互换使用，尤其是指不存在蛋白编码部分的核酸序列，诸如不含基因插入 物的质粒载体。由核酸分子编码的蛋白表达不是诱发非抗原特异性免疫应答所需要的；因 此所述核酸分子不是必须与转录调控序列可操作的连接。但是，通过在组合物中包括编码 免疫原和/或细胞因子的核酸序列值NA或RNA)可W获得进一步的优势（即抗原特异和增 强的免疫）。
[0059] 可W使用本领域标准的方法或美国专利号6, 693, 086(通过引用引入本文）描述 的方法实现脂质体与核酸分子的复合。添加到脂质体的核酸分子的合适浓度包括能够有效 将足够量的核酸分子递送入受试者的浓度，该样的话可W引发全身性的免疫应答。当核酸 分子编码免疫原或细胞因子时，添加到脂质体的核酸分子的合适浓度包括能够有效将足够 量的核酸分子递送入细胞的浓度，该样的话细胞可W产生足够的免疫原和/或细胞因子蛋 白W便按照需要的方式调节效应细胞免疫。在一个实施方案中，约0. 1微克到约10微克核 酸分子与约8nmol脂质体组合，在另一个实施方案中，约0. 5微克到约5微克核酸分子与 约8nmol脂质体组合，仍在另一个实施方案中，约1.0微克核酸分子与约8nmol脂质体组 合。在一个实施方案中，组合物中核酸与脂质的比值（微克核酸：nmol脂质）是按重量计 至少约1:1核酸：脂质（即，1微克核酸：1nmol脂质），和在另一个实施方案中，至少约 1:5,和仍在另一个实施方案中，至少约1:10,和在进一步的实施方案中，至少约1:20。此处 表述的比值基于组合物中阳离子脂质的量，而不是基于组合物中脂质的总量。在另一个实 施方案中，本发明组合物中核酸与脂质的比值是按重量计约1:1到约1:64核酸：脂质；和 在另一个实施方案中，按重量计约1:5到约1:50核酸：脂质；和在进一步的实施方案中， 按重量计约1:10到约1:40核酸：脂质；和仍在另一个实施方案中，按重量计约1:15到约 1:30核酸：脂质。核酸：脂质的另一比值是约1:8到1:16,其中约1:8到1:32是优选的。
[0060]b.生物制剂 在本发明的另一个实施方案中，免疫调节剂包括脂质体递送载体，核酸分子，和至少一 种生物制剂。
[0061] 合适的生物制剂是有效预防或治疗鸟类疾病的制剂。该类生物制剂包括免疫增强 蛋白，免疫原，疫苗或其任意组合。合适的免疫增强蛋白是已知增强免疫的那些蛋白。作为 非限制性的实例，细胞因子（包括蛋白家族）是已知增强免疫的蛋白家族。合适的免疫原 是引发体液和/或细胞免疫应答的蛋白，该样的话给受试者施用免疫原获得针对相同或类 似蛋白（在受试者的组织内遇到的）的免疫原特异性免疫应答。免疫原可W包括细菌、病 毒、寄生虫或真菌表达的致病性抗原。优选的抗原包括在受试者中造成传染病的抗原。根 据本发明，免疫原可W是天然存在或合成来源的蛋白的任意部分，其引发体液和/或细胞 免疫应答。因此，抗原或免疫原的大小可W是小至约5-12个氨基酸，大至全长蛋白，包括该 两者之间的大小。抗原可W是多聚体蛋白或融合蛋白。抗原可W是衍生自天然或重组细胞 的纯化的肤抗原。免疫增强蛋白和免疫原的核酸序列与转录调控序列可操作的连接，该样 的话免疫原在受试者组织中表达，从而在受试者中引发免疫原特异性免疫应答（除了非特 异性免疫应答之外）。
[0062] 在本发明的另一个实施方案中，生物制剂是疫苗。疫苗可W包括活的，传染性的 病毒疫苗或灭活的，失活的病毒疫苗。在一个实施方案中，一种或更多种疫苗，活的或灭 活的病毒疫苗，可W与本发明的免疫调节剂组合物联用。合适的疫苗包括本领域已知用 于鸟类的那些疫苗。示例性的疫苗，不受限制，包括本领域用于针对下列疾病进行保护的 那些疫苗；Marek'S病病毒（MDV)，新城疫病毒（NDV)，维鸡贫血病毒（CAV)，传染性囊病病 毒（I抓V)，传染性支气管炎病毒（IBV)，火鸡瘤疹病毒（HVT)，传染性喉气管炎病毒（ILTV)， 禽脑髓炎病毒（AEV)，禽痘病毒（FPV)，禽霍乱，禽流感病毒（AIV)，呼肠孤病毒，鸟类白血 性增生病毒（ALV)，网状内皮组织增殖病毒（REV)，鸟类腺病毒和出血性肠炎病毒（肥V)， 球虫目，和本领域已知的其他疾病。在另一个实例中，疫苗可W是美国专利号5, 427, 791， 6, 048, 535和6, 406, 702描述的疫苗。在一个示例性的实施方案中，用于Marek'S病的保护 的疫苗可W与本发明的免疫调节剂组合物联用。
[0063]II.方法 a.免疫刺激的方法 在本发明的一个实施方案中，通过给鸟类成员施用有效量的免疫调节剂组合物在鸟类 成员中引发免疫应答。有效量足W在鸟类成员中引发免疫应答。免疫调节剂包括脂质体递 送载体和核酸分子。
[0064] 在一个实施方案中，免疫调节剂的有效量是约0. 05微克到约10微克。在另一个 实施方案中，免疫调节剂的有效量是约0. 1微克到约5微克。
[0065] 在本发明的另一个实施方案中，通过施用有效量的免疫调节剂组合物（包括脂质 体递送载体，分离的核酸分子和生物制剂）在鸟类成员中引发免疫应答。预期生物制剂可 W与免疫调节剂共施用或与其独立地施用。单独施用可W在施用免疫调节剂之前或之后。 还预期免疫调节剂或生物制剂的不止一次施用可用于延长增强的免疫。此外，不止一种生 物制剂可W与免疫调节剂共施用，在免疫调节剂之前施用，或施用免疫调节剂之后施用，如 本文实施例所述。在一个实施方案中，免疫调节剂的有效量是约0. 05微克到约5微克的脂 质体递送载体和分离的核酸分子和约300到约30000TCIDg。病毒生物制剂。在另一个实施 方案中，免疫调节剂的有效量是约0. 1微克到约3微克的脂质体递送载体和分离的核酸分 子和约100到约1000EIDs。病毒生物制剂。
[006引b.疾病 本发明的方法在受试者中引发免疫应答，该样的话受试者被保护免于会引起免疫应答 的疾病。如本文使用的，短语"保护免受疾病"是指疾病症状减轻；疾病发生率的降低；和疾 病严重性的减轻。保护受试者可指给受试者施用时，本发明的治疗组合物预防疾病出现和/ 或治愈或减轻疾病症状、体征或病因的能力。因此，保护鸟类成员免受疾病包括预防疾病发 生(预防性治疗）和治疗患有疾病的鸟类成员（治疗性治疗)。具体来说，保护受试者免受疾 病通过W下方式实现；通过诱导有益或保护性的免疫应答在鸟类成员中引发免疫应答，在 一些情况下，其还可W另外遏制、减轻、抑制或阻断过度或有害的免疫应答。术语"疾病"是 指对鸟类成员正常健康状况的任意偏离，包括W下状态；当疾病症状存在时，W及偏离（例 如，感染，基因突变，遗传缺陷等）已经存在但症状还未显示的状况。
[0067] 本发明的方法可W用于预防疾病，刺激抗疾病的效应细胞免疫，清除疾病，减轻疾 病，和预防源于原发病发生的继发病。
[0068] 本发明的方法包括施用组合物W针对多种病原体的感染进行保护。施用的组合 物可W包括或可W不包括引发特异性应答的特异性抗原。预期本发明的方法将保护受体 受试者免受源于传染性微生物原的疾病，包括但不限于，病毒，细菌，真菌，和寄生虫。示例 性的病毒传染性疾病，不受限制，包括源于W下病毒感染的那些疾病；鸡传染性贫血病毒 (CIAV)，Marek'S疾病病毒（MDV)，鸡瘤疹病毒（HCV)，火鸡瘤疹病毒（HTV)，传染性囊病病 毒（I抓V)，新城疫病毒（NDV)，传染性支气管炎病毒（IBV)，传染性喉气管炎病毒（ILTV)，3 型副粘病毒，禽脑髓炎（AEV)，禽痘病毒（FPV)，禽霍乱，禽流感病毒（AIV)，呼肠孤病毒，禽 白血病病毒（ALV)，网状内皮组织增殖病毒（REV)，鸟类腺病毒，出血性肠炎病毒（肥V)，肺 炎病毒，错子痘病毒，其重组物，和本领域已知的其他病毒。示例性的细菌感染，不受限制， 包括源于W下细菌感染的那些；革兰氏阳性或阴性细菌和真菌诸如大肠杆菌，鸡败血支原 体（Mycoplasmagallisepticum)，火鸡支原体（Mycoplasmameleagridis)，滑液囊支原体 (Mycoplasmasynoviae)，博德特氏菌属炬ordetellaSp)，多杀己斯德氏菌（Pasteurella multocida)，产气英膜梭菌（Clostridiumperfringens)，肠梭菌（Clostridiumcolinum)， 空肠弯曲杆菌（Camp}dobacterje化ni)，沙口氏菌属S(almonellasp)，肠炎沙口氏 菌（Salmonellaenteritidis)，鸡白频沙 口氏菌（Salmonellapullorum)，鸡沙 口氏菌 (Salmonellagallinarum)，肉毒杆菌（Clostridiumbotulinum)，鸡嗜血杆菌化emophilus gallinarum)，红斑丹毒丝菌巧；rysipelot虹ixinsidiosa)，鸭疫里氏杆菌（riemerella anatipestifer) (RA)，和本领域已知的其他细菌。示例性的真菌或霉菌感染，不受限 审ij，包括源于W下感染的那些；烟曲霉（Aspergillusfumigates),黄曲霉（Aspergillus flavus)，白色念珠菌（Candidaa化icans)，和本领域已知的其他传染性真菌或霉菌。示 例性的疾病状况，不受限制，包括源于W下毒素的那些：来自革兰氏阳性或阴性细菌和真 菌的毒素诸如产气英膜梭菌（Clostridiumperhingesns)毒素，肉毒杆菌毒素，大肠杆菌 肠毒素，葡萄球菌属毒素，己斯德氏菌白细胞毒素，和镶刀菌霉菌毒素W及本领域已知的其 他毒素。示例性的寄生虫包括，但不限于，珠鸡艾美球虫巧imeriameleagridis)，球虫目 属koccidiasp)，鸡咖虫（Ascaridiagalli)，鸡异刺线虫化eterakisgallinae)，环首 毛细线虫（Capillariaannulata)，扭转毛细线虫（Capillariacontorta)，错毛细线虫 (Capillariaobsi即ata)，气管比翼线虫（Syngamustrachea),和本领域已知的其他寄生 虫。
[0069] C.受试者 本发明的方法可施用给鸟类的任意受试者或成员，无论是驯养的还是野生的。具体来 说，它可W施用给用于育种、产肉或产蛋的商业化饲养的那些受试者。合适的鸟类受试者， 不受限制，包括鸡，火鸡，鶴，鸭，野鸡，鹤觀错子，驼鸟，笼鸟，动物学采集的鸟类和鸟舍等 等。在一个实施方案中，鸟类成员选自鸡或火鸡。技术人员将理解本发明的方法将非常有 益于高密度解房饲养的鸟类，诸如肉仔鸡和蛋鸡，因为它们对传染原的环境暴露是特别脆 弱的。
[0070]d.施用 可W提供各种施用途径。挑选的具体方式当然取决于选定的具体生物制剂，受试者的 年龄和全身健康状况，待治疗的具体病症和治疗功效需要的剂量。本发明的方法可W采用 任何施用方式来实施，其产生有效水平的免疫应答并且不引起临床上无法接受的副作用。 所述组合物可W方便地存在于单位剂型中，并且可W采用本领域公知的任何方法制备。
[0071]可W在任何年龄进行鸟类的接种。通常，对18天龄胚胎（卵内）及W上进行活微 生物的接种，对3周龄及W上进行灭活微生物或其他类型疫苗的接种。对于卵内接种，可W 在胚胎发育的后1/4期间进行接种。疫苗可W通过W下方式施用；皮下，羽囊，通过喷雾，口 月良，眼内，气管内，鼻，卵内或通过本领域已知的其他方法。口服疫苗可W在饮用水中施用。 进一步的，预期本发明的方法可W基于常规接种方案来使用。在一个实施方案中，卵内施用 本发明的免疫调节剂组合物。在另一个实施方案中，在大肠杆菌攻击后施用作为喷雾的免 疫调节剂组合物。
[0072]其他递送系统可W包括定时释放，延迟释放或缓慢释放的递送系统。该类系统可W避免组合物的重复施用，从而增加便利性。许多类型的释放递送系统是已有的，并且为 本领域普通技术人员所知。它们包括基于多聚体的系统诸如聚（丙交醋-己交醋），共聚 草酸醋，聚己酸内醋，聚酷胺醋，聚正醋，聚哲基了酸，和聚酢。包含药物的上述多聚体的微 胶囊描述于，例如，美国专利号5, 075, 109。递送系统还包括非聚合物系统，它们是脂质包 括酱醇诸如胆固醇，胆固醇醋和脂肪酸或中性脂诸如单、双和=甘油醋；水凝胶释放系统； sylastic系统；基于肤的系统；蜡质涂层；使用常规结合剂和赋形剂的压制片剂；部分融 合的植入物；等等。具体实例包括，但不限于侵蚀系统，其中本发明的制剂包含在基质内形 式中，诸如描述于美国专利号4, 452, 775,4, 675, 189和5, 736, 152中的那些，和弥散系统， 其中活性成分W受控速率从多聚体渗透，诸如描述于美国专利号3, 854, 480, 5, 133, 974和 5, 407, 686。此外，可W使用基于累的硬件递送系统，其中一些适于移植。
[0073] 因为在不脱离本发明范围的情况下可W对上述组合物、产品和方法进行各种变 化，所W意图上述说明书W及下文实施例包含的所有内容均应被解释为说明性的，而不是 限制性的。
[0074] 定义 术语"有效量"是指必须或足W实现所需生物效应的量。例如，用于治疗或预防传染病 的免疫调节剂的有效量是当暴露于微生物时，该量是引起抗原特异性免疫应答的出现所必 需的，从而造成受试者内微生物量的降低和优选的消灭微生物。针对任何具体应用的有效 量可W变化，该取决于待治疗的疾病或病症、受试者的大小或疾病或病症的严重性该类因 素。本领域的普通技术人员无需过度实验，通过经验就可W确定免疫调节剂的有效量。
[00巧]术语"细胞因子"是指增强免疫的蛋白家族。细胞因子家族包括造血生长因子， 白介素，干扰素，免疫球蛋白超家族分子，肿瘤坏死因子家族分子和趋化因子（即调节细 胞尤其是吞瞻细胞的迁移和活化的蛋白）。示例性的细胞因子包括，但 不限于，白介素-2 (比-2)，白介素-12 (IL12),白介素-15 (比-15)，白介素-18 (比-18)，干扰素-曰 (IFN曰）干扰素-曰（IFN曰），和干扰素-曰（IFNa)。
[0076]术语"引发"可W与术语活化，刺激，产生或上调互换使用。
[0077]术语在受试者中"引发免疫应答"是指特异性控制或影响免疫应答的活性，可包括 活化免疫应答，上调免疫应答，增强免疫应答和/或改变免疫应答(诸如通过引发一种免疫 应答，其进而将受试者中占优势的免疫应答类型从有害或无效的类型转变为有益或保护性 的类型)。
[0078]术语"可操作的连结"是指采用W下方式将核酸分子连接到转录调控序列，该方式 使得当所述分子被转染（即，转化、转导或转染）入宿主细胞时能够表达。转录调控序列是 控制转录的起始、延伸和终止的序列。尤其重要的转录调控序列是控制转录起始的那些序 列，诸如启动子、增强子、操纵子和抑制序列。各种该类转录调控序列是本领域技术人员已 知的。优选的转录调控序列包括在鸟，鱼，哺乳动物，细菌，植物和昆虫细胞中起作用的那 些。尽管本发明可W使用任意转录调控序列，所述序列可W包括天然存在的转录调控序列， 其与编码免疫原或免疫刺激蛋白的序列天然结合。
[007引术语"核酸分子"和"核酸序列"可W互换使用，包括DNA，RNA，或DNA或RNA的衍 生物。术语还包括寡核巧酸和更大的序列，包括编码蛋白或其片段的核酸分子，W及包括调 节区、内含子或其他非编码DNA或RNA的核酸分子。通常，寡核巧酸具有长度为约1到约 500个核巧酸的核酸序列，和更常见的，长度为至少约5个核巧酸。核酸分子可W来源于任 意来源，包括哺乳动物，鱼，细菌，昆虫，病毒，植物，或合成来源。核酸分子可W通过本领域 通常已知的方法来产生，诸如重组DNA技术(例如，聚合酶链式反应（PCR)，扩增，克隆）或化 学合成。核酸分子包括天然核酸分子及其同系物，包括但不限于，天然等位基因变体和改造 的核酸分子，其中核巧酸已经采用如下方式被插入，缺失，取代或反向，所述方式使得该类 改造基本上不干扰核酸分子编码可用于本发明方法的免疫原或免疫刺激蛋白的能力。核酸 同系物可W利用本领域技术人员已知的大量方法来产生（参见，例如，Sambrooketal.， MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLabsPress,1989)， 其通过引用在此引入。筛选免疫原性（诸如病原体抗原免疫原性或细胞因子活性）的技术 是本领域技术人员已知的，包括各种体外和体内测定。 实施例
[0080] 下列实施例说明本发明的各种实施方案。
[0081] 实施例1.材料和方法。
[0082] 免疫调节剂 本研究使用的免疫调节剂是包括阳离子脂质和非编码DM的组合物。配制合成的免疫 调节剂脂质组分[1-[2-巧-狂)-十八締酷基氧基]]-2-[引狂)-十走締基]-3-[哲己基]咪 挫咐偷氯化物值OTIM)和合成的中性脂类胆固醇W产生直径为大约200皿的脂质体（参 见，美国专利6, 693, 086)。DNA组分是在大肠杆菌中产生的4292个碱基对的非编码DNA 质粒（pMB75. 6)，其是带负电荷的，与带正电荷（阳离子）的脂质体结合（参见，美国专利 6, 693, 086)。
[0083] 表1.给600个蛋/组施用的剂量的免疫调节剂稀释方案。
[0084] 研究动物 在18天解育期间对光检查商品化供应的鸡蛋（肉仔鸡）W确定活性。将健康的胚胎归 入研究中，丢弃不生育、死亡和不健康的胚胎。将维鸡放入常规加利福巧亚类型的侧面带窗 帘的鸡舍。在第0天每个鸡舍具有50只未鉴别鸟类。给维鸡饲喂符合MRC推荐的针对研 究动物的年龄和重量的口粮，并且维鸡通过连接到每个鸡舍供水的钟状饮水器可W随意获 得水。
[0085] 实验性感染和攻击 用生物攻击维鸡W确定免疫应答的功效。攻击或实验性感染，包括暴露于生物诸如大 肠杆菌巧.coli)的接种物。使用浓度为2. 63X105的生物，并通过将0. 15mL的接种物喷 到每个含胚卵（在解化盘中）上进行施用。
[0086] 实施例2.免疫调节剂的施用增加解化率。
[0087] 进行研究W确定如实施例1所述的免疫调节剂给18天龄的含胚鸡蛋施用（然后 暴露于大肠杆菌巧.coli))的效果。研究包括两组（表2)，一组用大肠杆菌攻击（T1-4)，另 一组不被攻击（T5和T6)。在大肠杆菌攻击组中，存在四个亚组，每个亚组施用不同剂量的 免疫调节剂，包括W下剂量：无订1)，0. 1微克订2)，1. 0微克订3)，和10. 0微克（T4)。 未攻击组包括两个亚组，其未施用免疫调节剂（T5)或施用1.0微克免疫调节剂订6)。
[008引表2.研究处理组。
[0089] 在研究第0天，对接受免疫调节剂的18天龄含胚蛋进行卵内注射。在第1天，对 攻击组（T1-T4)中19天龄含胚蛋每个喷雾0. 15血包含浓度为2. 63X105的大肠杆菌的 接种物。
[0090] 全部组的分析产生统计上显著的对含胚蛋解化率的处理效果。在两个未攻击对照 组之间不存在显著差异订5,0微克/kg，91 %对T6,1.0微克/kg，89 %)。此外，两个未处 理组（T1-攻击和T5-未攻击）之间的比较结果是，未攻击组中更多的含胚蛋解出（分别是 85 %对91 %)。因此，攻击模型被证实为评价解化率的有效模型。
[0091] 对于用免疫调节剂处理的那些组来说，T3 (1.0微克/kg-处理的蛋）组比未处理 /攻击的T1巧4. 5 %)或者T4 (10.0微克/kg-处理的蛋）（85 %)解化出更多的鸟类巧1.5 %)(图1)。在未处理/未攻击对照组（T5)和前述两个处理组订1，如上所述，和T4)之间显 示类似的差异。在任意剩余的两两（pair-wise)组比较中未显示其他重要的发现（图1)。
[0092] 在每个鸡舍，每组，每个研究天中鸟类死亡比例没有显著差异（图2)。任意特定研 究天的鸟类存活比例结果是处理和时间之间没有统计上显著的关联，但显示显著的处理效 果（图3)。当与组T1、T2和T4比较时，组T3、T5和T6的鸟类在任意天都具有显著更多的 鸟类。此外，T5鸟类还具有比T3显著活性更高的鸟类。评价解化后的鸟类生存力产生与 上述类似的重要发现（图4到图12)。
[0093] 在第7,14, 21或28天观察到的鸡舍重量不存在显著差异（图13到图16)。第35 天对总鸡舍重量的分析产生T5和T2组之间的显著差异（分别是平均87kgs对75kgs) (图17)。研究结束时（第45天），当与T1 (105kgs)比较时，组T5 (120kgs)和T6 (117 kgs)的鸡舍重量更大，当与T2 (106kgs)和T4 (105kgs)比较时，T5更大（图18)。
[0094] 总之，评价了当在商品化的肉仔鸡中卵内施用时（在大肠杆菌感染之前）免疫调 节剂的效果。对于用免疫调节剂处理的那些组，T3组巧2 %)比未处理/攻击的T1巧5 %) 或T4巧5 %)组解化出更多的鸟类。在未处理/未攻击对照组（T5)与相同处理组T1和T4 之间显示类似的差异。死亡率（图2到图12)和体重（图13到图18)不存在显著差异。在 本研究中，免疫调节剂有效增加商品化肉仔鸡蛋（解化前用大肠杆菌攻击）的解化率，特别 是1. 0微克的剂量显示免疫调节剂接受组中增强的免疫。
[0095] 实施例3.免疫调节剂的施用增加非抗原特异性免疫。
[0096] 进行研究W确定如实施例1所述的免疫调节剂在Marek'S病接种的鸡（暴露于大 肠杆菌）中的效果。研究包括两组，一组用大肠杆菌攻击（T1-T4)，另一组不被攻击（T5和 T6)。在大肠杆菌攻击组中，存在四个亚组，每个亚组施用不同剂量的免疫调节剂，包括W 下剂量：无（T1)，0. 1微克（T2)，1. 0微克（T3)，1. 0微克加1剂量的Marek'S疫苗（T4) (表3)。未攻击组包括两个亚组，其未施用免疫调节剂（T5)或施用1.0微克免疫调节剂 订6)。
[0097] 表3.研究处理组。
[0098] 将商品化肉仔鸡蛋解育18天，对光检查生存力，然后将接受免疫调节剂的18天龄 含胚蛋进行卵内注射。第二天，对攻击组中19天龄含胚蛋每个喷雾0.15mL包含浓度为 2. 8X107每毫升的大肠杆菌的接种物。蛋在研究第0天解出，所述研究延续45天。
[0099] 记录每组解出的含胚蛋数目（n=1000每组或解化盘）（图19)。在解出的维鸡中， 记录解出后第7天仍然存活的维鸡数目（图20)。还记录解出后第7天每组活鸡/死鸡的 数目（图21)。攻击组中死亡百分比随着免疫调节剂的增加而减少，Marek's疫苗与免疫调 节剂的共施用进一步降低死亡百分比（图22)。
[0100] 数据显示在免疫调节剂处理组和未处理组（未用大肠杆菌攻击）之间不存在解化 率的降低（图23)。在免疫调节剂处理组和未处理组（用大肠杆菌攻击）之间解化率显著 更高。接受免疫调节剂和一剂量的Marek'S疫苗的含胚蛋的解化率类似于未处理和未攻击 对照的解化率。总之，免疫调节剂增加攻击条件下的解化率，而Marek'S疫苗的共施用增强 免疫调节剂的保护性应答。结果表明，施用免疫调节剂或免疫调节剂和Marek'S疫苗引发 非抗原特异性免疫应答。
[0101] 实施例4.免疫调节剂的施用引发非抗原特异性免疫应答，其被生物制剂的额外 施用所增强。
[0102] 进行研究W确定免疫调节剂在Marek's病接种的鸡（暴露于大肠杆菌）中的效 果。该研究包括9个组，如表4所示进行不同处理。
[0103] 表4.研究组处理。
[0104] 将商品化肉仔鸡蛋解育18天，对光检查生存力，然后将接受免疫调节剂的18天龄 含胚蛋进行卵内注射。第二天，对攻击组中19天龄含胚蛋每个喷雾0.15mL包含浓度为 2. 63X105每毫升的大肠杆菌的接种物。蛋在研究第0天解出，所述研究延续45天。
[0105] 计算每组解出的含胚蛋百分比（图24)。在解出的维鸡中，在解化后第7天计算攻 击组（图26)和未攻击组（图25)的死亡百分比。攻击组比类似处理的未攻击组显示更高 的死亡百分比（图27)。计算从解出到第7天（图28)W及第3天（18天存活胚胎）到第 7天（图29，n=400)每组存活维鸡的百分比。与受到攻击的对照组巧2. 2 %，图28)相比， 对在攻击前用免疫调节剂处理的鸟类来说存在显著更高的存活率（>98. 2 %，图28)。与受 到攻击的对照组巧2. 2 %，图28)相比，对在攻击前后解化时用免疫调节剂处理的鸟类来说 在第7天存在显著更高的存活率巧5 %，图28)。该些结果是利用包含400个蛋每组的集合 概括得出的（图29 )。与对照组化7. 0 %，图29)相比，对攻击前接受处理的胚胎来说在第 7天存在更高的存活率（集合400) (>94. 3 %，图29)。类似的，在第14天与受到攻击的对 照组相比巧1.9 %，图30)，对于用免疫调节剂进行卵内处理的鸟类来说存在显著更高的存 活率巧7. 4 %，图30,没有第二次处理）。与对照组81. 9%相比（图30)，在攻击后1天龄 用免疫调节剂处理的组中在第14天存在显著更高的存活鸟类，93. 9 % (图30)，没有第一次 处理。与对照组81. 9%相比（图30)，在卵内用免疫调节剂处理并且随后在1天龄用免疫调 节剂处理的组中在第14天也存在显著更高的存活鸟类，95. 8 %(图30)。图30显示利用不 同处理的攻击组和未攻击组的周死亡率。
[0106] 数据显示在免疫调节剂处理组（处理一次或两次）和未处理组（未用大肠杆菌攻 击）之间不存在解化率的降低。在大肠杆菌攻击前用免疫调节剂处理的组中解化率更高。 当免疫调节剂与Marek'S疫苗共施用时，该功效被增强。此外，在未攻击组中，免疫调节剂 处理与死亡率降低相关。Marek'S疫苗的共施用W及施用免疫调节剂与Marek'S疫苗前用 免疫调节剂预处理将进一步降低死亡率。该些结果是从攻击组概括得出的。总之，免疫调节 剂增加攻击条件下的解化率，而Marek'S疫苗的共施用增强免疫调节剂的保护性应答。结 果表明，当免疫调节剂的施用伴随Marek'S疫苗时，由免疫调节剂施用引发的非抗原特异 性免疫应答被增强。免疫调节剂与Marek'S疫苗的共施用进一步增强非抗原特异性免疫应 答。
[0107] 实施例5.感染后施用免疫调节剂引发非抗原特异性免疫应答，其被生物制剂的 额外施用所增强。
[010引与受到攻击的对照组巧2. 2 %，图28)相比，对在攻击后用免疫调节剂处理的鸟类 来说存在显著更高的存活率巧5 %，图28)。该些结果是利用包含400个蛋每组的集合概括 得出的（图29)。
[0109] 结果表明，当免疫调节剂的施用伴随Marek'S疫苗时，由大肠杆菌攻击后施用免 疫调节剂引发的非抗原特异性免疫应答被增强。在Marek'S疫苗之后免疫调节剂的后施用 增强非抗原特异性免疫应答。
[0110] 实施例6.免疫调节剂与二价生物制剂的施用不抑制二价生物制剂的早期复制 进行研究W确定免疫调节剂是否将对Marek'S病二价疫苗的早期复制产生负面影响。 Marek'S病二价疫苗包括HVT(火鸡瘤疹病毒）和SB1 (鸡瘤疹病毒）。
[0111] 解育商品化肉仔鸡蛋18天，对光检查生存力。将蛋分成3组，A-C每组20个蛋。 按照表5所示接种每个蛋。
[0112] 表5:处理。
[0113] 为了评价免疫调节剂在体内对疫苗病毒复制的影响，在置于脾细胞（SPC)和外周 血单核细胞（PBMC)后第7和14天进行病毒再分离。
[0114] 因为已知MD疫苗病毒感染在病毒复制水平上对鸟到鸟有变异，利用鸡的S重集 合（每个集合2只鸡，每个取样点3个集合）进行再分离。
[0115] 尽管集合间存在变异，但在免疫调节剂存在条件下，HVT和SB-1的复制存在明确 的趋势。在第一周对于SB-1复制来说该数据最为显著，但在两个时间点（卵化后第7和 14天）的该两种组织中HVT和SB-1的总体趋势是类似的。所述数据概述于图31到图38。 图31显示第1周免疫调节剂对脾细胞中HVT的MD疫苗复制的影响。图32显示第1周免 疫调节剂对PBMC中HVT的MD疫苗复制的影响。图33显示第1周免疫调节剂对脾细胞中 SB-1的MD疫苗复制的影响。图34显示第1周免疫调节剂对PBMC中SB-1的MD疫苗复制 的影响。图35显示第2周免疫调节剂对脾细胞中HVT的MD疫苗复制的影响。图36显示 第2周免疫调节剂对PBMC中HVT的MD疫苗复制的影响。图37显示第2周免疫调节剂对 脾细胞中SB-1的MD疫苗复制的影响。图38显示第2周免疫调节剂对PBMC中SB-1的MD 疫苗复制的影响。
[0116] 免疫调节剂对MD疫苗复制不具有负面影响。免疫调节剂看起来具有佐剂功效，其 在感染后最初两周增加HVT和SB-1的复制。该些数据表明免疫调节剂对MD疫苗功效具有 正面影响。
[0117] 实施例7.免疫调节剂与修饰的活生物制剂的施用不干扰所述修饰的活生物制剂 进行研究W确定免疫调节剂与修饰的活的新城疫接种的鸡（暴露于新城疫）的效果。 该研究包括9个组，如表6所示进行不同处理。
[011引表6.研究组处理。
[0119] 解育商品化肉仔鸡蛋18天，对光检查生存力。将蛋分成9组，T1-T9每组60个 蛋。组T9在解化后第一晚遭受害虫攻击，在研究期间存在未知原因导致的一些死亡。在挑 选（culling)时，每组的鸟类数目列于表7。
[0120] 表7.每组的鸟类。
[0121] 组T4-T6的18天龄含胚蛋卵内注射免疫调节剂。组T1-T3和T7-T9注射盐水。在 第0天，组T1-T2中解化的蛋和维鸡用盐水喷雾，组T3-T6接受新城疫疫苗Newhatch-C2 (由 Intervet/Schering-Plou曲AnimalHealth制备），组T7-T9用免疫调节剂喷雾和接种。
[0122] 在解化后第7,14和21天获得血清用于测定抗NDV滴度。在第21天，用缓发型新 城疫病毒攻击维鸡组T2-T9。在第26天挑选维鸡，采血，检查气囊炎的宏观病理学，并进行 血清分析。
[0123] 数据显示在第7、14和21天的组之间不存在血清学的显著差异。但是，在第26天 (攻击后5天），卵内接受免疫调节剂的鸟类具有高于所有其他组（仅包括疫苗）的显著增 加的抗NDV滴度（图40)。
[0124] 气囊炎在T2-T5中显著降低，该些维鸡接受卵内调节剂（图39)。该结果表明免疫 调节剂的卵内施用不干扰NDV接种。
[0125] 实施例8.毒性攻击中施用免疫调节剂与生物制剂的功效 进行研究W鉴定18天龄含胚蛋中单剂量的免疫调节剂对常规Marek'S病接种的干扰。 该研究比较了Marek'S病接种抗毒性攻击的效果。
[0126] 将总共160个含胚蛋分成8组。在研究第0天，给解化刚脱壳的每只鸟接种 Marek's病病毒。解出的脱壳鸟类数目是160只中的148只（参见下面的表8,蛋/鸟类的 开始数目对括号中研究结束时的实际鸟类）。S周后，每只再添加80只鸟类，15只未接种 和未处理的鸟类（接触）和65只处理的鸟类（接种）（参见下面的表8,每组的处理）。
[0127] 表8:处理。
[0128] 在研究第42天，取出存活的脱壳鸟类并进行尸体剖检。在研究第63天（接触和 接种的第42天），取出存活的研究鸟类并进行尸体剖检。
[0129] 图41显示接种的脱壳鸟类，未接种的接触鸟类，只接种的鸟类，接种/免疫调节剂 鸟类的生存曲线。未接种的接触数据是8个鸡舍的均值，而每个接种组是每种4个鸡舍的 均值。可W观察到，只接种和接种/免疫调节剂鸟类的生存曲线的斜率存在相似性。
[0130]图42显示接种的脱壳鸟类，未接种的接触鸟类，只接种的鸟类，接种/免疫调节剂 鸟类中Marek'S病的平均发病率。脱壳和接触数据是8个鸡舍的均值，而每个接种组是每 种4个鸡舍的均值。可W观察到，只接种组和接种/免疫调节剂组具有低得多的Marek'S 病发病率。接种/免疫调节剂组具有比只接种组更低的Marek'S病发病率。
[0131] 从图41到图42可W看出，免疫调节剂对Marek'S病疫苗保护不具有损害作用。实 际上，它引发疫苗功效的增加。
【主权项】
1. 免疫调节剂组合物在制备用于通过向蛋卵内施用约0. 05至约10微克的有效量的所 述免疫调节剂组合物而降低从用大肠杆菌co7i)攻击的含胚鸡蛋孵化的鸡 中的死亡率的药物中的用途，其中所述免疫调节剂组合物包括： a. 阳离子脂质体递送载体；和 b. 核酸分子，所述核酸分子不编码免疫原。2. 权利要求1的用途，其中所述核酸分子是分离的细菌来源的核酸载体或其片段。3. 权利要求1或2的用途，其中所述核酸分子是DNA质粒。4. 权利要求1或2的用途，其中向蛋卵内施用约0. 1至约5微克的所述免疫调节剂组 合物。5. 权利要求1或2的用途，其中向蛋卵内施用约I. 0微克的所述免疫调节剂组合物。6. 权利要求1或2的用途，其中所述免疫调节剂组合物在孵育第18天施用于含胚鸡 蛋。7. 权利要求1或2的用途，其中所述脂质体递送载体包括选自多层囊泡脂质和挤压脂 质的脂质。8. 权利要求1或2的用途，其中所述阳离子脂质体递送载体包括选自DOTM和胆固醇； DOTAP和胆固醇；DOTM和胆固醇，以及DDAB和胆固醇的脂质对。9. 权利要求1或2的用途，其中所述阳离子脂质体递送载体包括DOTIM和胆固醇。10. 权利要求1或2的用途，其中施用是在攻击之前。11. 权利要求1或2的用途，其中施用是在攻击之后。12. 权利要求1或2的用途，其中所述免疫调节剂组合物还包括生物制剂，其中所述生 物制剂是用于针对选自下述的病毒或疾病进行保护的疫苗：Marek's病病毒（MDV)，新城疫 病毒（NDV)，雏鸡贫血病毒（CAV)，传染性囊病病毒（IBDV)，传染性支气管炎病毒（IBV)，火 鸡疱瘆病毒（HVT)，传染性喉气管炎病毒（ILTV)，禽脑髓炎病毒（AEV)，禽痘病毒（FPV)，禽 霍乱，禽流感病毒（AIV)，呼肠孤病毒，鸟类白血性增生病毒（ALV)，网状内皮组织增殖病毒 (REV)，鸟类腺病毒，出血性肠炎病毒（HEV)，及其组合。13. 免疫调节剂组合物在制备用于降低用大肠杆菌攻击的鸟类的至少一种成员中的死 亡率的药物中的用途，包括通过喷雾给所述鸟类成员施用有效量的免疫调节剂组合物，其 中所述免疫调节剂组合物包括： 阳离子脂质体递送载体；和 核酸分子，所述核酸分子不编码免疫原。
【专利摘要】本发明涉及一种免疫活化的方法，其在鸟类成员中有效引发非抗原特异性免疫应答。所述方法尤其可以有效的保护鸟类成员免受传染病和治疗患有传染病的动物。
【IPC分类】A61K9/127, A61P37/04, A61K48/00, A61K39/39, A61P31/04
【公开号】CN104906573
【申请号】CN201510317838
【发明人】A.阿伯拉罕
【申请人】拜耳知识产权有限责任公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2010年5月7日
【公告号】CA2761736A1, CN102427827A, CN102427827B, EP2429581A1, EP2429581B1, US20120064151, WO2010130374A1
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