壳寡糖在制备疫苗佐剂及疫苗组合物中的用图
壳寡糖在制备疫苗佐剂及疫苗组合物中的用图
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，具体地，本发明涉及壳寡糖在制备疫苗佐剂及含该疫苗佐剂的疫苗组合物和疫苗制剂中的用途。
【背景技术】
[0002]佐剂是一类先于抗原或与抗原同时应用时能增强抗原免疫效应的物质，它的作用主要是增强机体免疫系统对抗原的特异性免疫应答反应。自200多年前英国医生Jenner接种牛痘预防天花并取得了人体试验成功，人类可以通过接种疫苗预防控制某些传染性疾病。1925年法国免疫学家兼兽医学家Gaston Ramon发现在白喉、破伤风疫苗中加入木薯淀粉、琼脂、化脓性细菌等某些与抗原无关的物质可以特异性地增强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗力。在此后的疫苗佐剂的研宄中发现许多物质均具有佐剂效应，如木薯粉、羊毛脂、丹宁酸等。近年来，随着人们对免疫佐剂研宄的不断深入，越来越多的物质被发现有免疫佐剂的功能，如铝盐佐剂、油乳佐剂、蜂胶佐剂、多糖佐剂、新型免疫佐剂等(B1molecular Engineering, 2001, 18(3):69-85.)。油乳佐剂主要有油包水乳剂的弗氏佐剂(FA)、水包油乳剂的MF-59等。新型免疫佐剂有脂质体、细胞因子佐剂等。至今被我国批准合法使用的人用疫苗佐剂是铝盐佐剂，它可以有效地诱导免疫反应，显著增强机体的体液免疫应答(Arch Virol，2008，153(5):831 一 837.)。然而，铝佐剂只能增强机体的体液免疫功能，对于如HIV等胞内病毒无法产生有效的细胞免疫促进作用。其次，铝佐剂主要以氢氧化铝和磷酸铝为代表，在注射部位产生红肿、结节等局部反应，铝盐还易在体内蓄积，特别是脑部，有可能导致脑病的发生。传统兽用疫苗中常用的佐剂有铝盐佐剂和油佐剂。油佐剂疫苗在抗体效价和免疫持久性方面都优于铝盐佐剂疫苗，但油佐剂不良反应严重，皮下注射会引起炎症、溃疡和肉芽肿；油类物质长期潴留于组织中不易代谢。
[0003]随着免疫学研宄的不断深入和基因工程技术的迅速发展，针对不同疾病已开展了各种新型基因工程疫苗的研制，新型技术疫苗如抗原表位疫苗、基因工程疫苗等抗原纯度越来越高，但这些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、难以诱导机体产生有效免疫应答等不足，从而需要免疫佐剂来协同这种作用，尤其是安全无毒、能够刺激较强细胞免疫应答的佐剂，以及适合粘膜疫苗、核酸疫苗和肿瘤疫苗的免疫佐剂。理想的疫苗佐剂应当具有以下特征:对于特定的人群或动物，要保证副作用最小；佐剂作用要持久稳定；生产成本要尽量低；增强细胞或体液免疫的强度要能达到保护要求；不同用药途径产生的毒副作用都应清楚研宄。
[0004]壳寡糖分子量小，水溶性良好，易被人体吸收，生物活性高，具有大分子糖所不具备的更独特的生理生化活性，同时具有纯天然、无辐射、无污染等特点，在保健品、营养剂、食品添加剂等食品工业方面，植物生长调节剂及饲料添加剂等农牧业方面，废水处理、纺织、化工、日用化学品、生物工程和医药等方面具有良好的应用价值，更为值得关注的是它能够有效激活机体细胞免疫和体液免疫，将其开发为疫苗佐剂具有良好的应用前景。
[0005]壳寡糖的制备主要有化学法、物理降解法、酶法、糖基转移法(中国生化药物杂志，1999，20 (2):99)。化学法一般用浓盐酸水解，但其产品多在四糖以下，而且化学反应条件十分苛刻，不易控制，后处理也繁琐。糖基转移法是利用低聚合度寡糖，在酶(主要是溶菌酶或几丁质酶)的参与后，延长糖链成为高聚合度的寡糖，此方法主要得到六糖和七糖。酶降解法所用的酶有壳聚糖酶、纤维素酶、糖苷酶和脂肪酶等，对其聚合度无法控制。而不同聚合度的壳寡糖对其佐剂活性有影响。目前所能制备得到的非常有限的寡糖价格昂贵，其在应用上受到很大的限制。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于，提供壳寡糖在制备疫苗佐剂及含该疫苗佐剂的疫苗组合物和疫苗制剂中的用途。
[0007]为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案:
[0008]本发明的第一方面涉及一种壳寡糖，所述壳寡糖由以下方法制备:
[0009]壳聚糖经生物酶法水解、化学法降解或物理方法(微波、射线照射)裂解生成聚合度为2-20的壳寡糖；
[0010]所述聚合度为2-20的壳寡糖脱乙酰度>90%，分子量范围为400?5000Da，其中聚合度为3-10的成分比例之和不低于20%?50%。
[0011]根据本发明任一项所述的壳寡糖，其具有图1或图2所示特征。
[0012]本发明的再一方面涉及一种疫苗佐剂，其包含上述的壳寡糖；具体地，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂。
[0013]本发明的再一方面涉及一种疫苗制剂或疫苗组合物，其包含本发明的壳寡糖组分。
[0014]根据本发明任一项所述的疫苗制剂或疫苗组合物，其为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗。
[0015]根据本发明任一项所述的疫苗制剂或疫苗组合物，其为乙肝亚单位疫苗。
[0016]本发明的再一方面涉及本发明任一项所述壳寡糖在制备疫苗佐剂中的用途；或者在制备疫苗组合物或疫苗制剂中的用途。
[0017]根据本发明任一项的用途，其中，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂；所述疫苗为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗。
[0018]本发明涉及的疫苗组合物，该疫苗组合物含疫苗抗原和壳寡糖佐剂；
[0019]本发明涉及的疫苗制剂，该疫苗制剂含疫苗抗原、壳寡糖佐剂和制剂所需的各种辅料；
[0020]本发明还涉及一种免疫方法或者接种方法，包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物或疫苗制剂的步骤。
[0021]术语“有效量”是指哺乳动物中实现免疫效果的疫苗制剂或疫苗组合物的剂量。
[0022]本发明的有益效果:
[0023]本发明的壳寡糖能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用作减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂。本发明中的壳寡糖已经可以大规模生产。本发明为壳寡糖佐剂作用机理的研宄奠定基础，为找到具有更好佐剂效果的寡糖提供了参考。
[0024]本发明通过生物酶法水解、化学法降解或物理方法裂解，并结合膜分离技术，制备聚合度为2-20的壳寡糖，可以高产率大规模地生产，并且质量可控，成本适宜，可以为制成体内环境下易溶、易吸收、使用方便的壳寡糖，应用于疫苗佐剂提供物质基础。
【附图说明】
[0025]图1为本发明壳寡糖的质谱检测图谱；
[0026]图2为本发明壳寡糖聚合度检测图谱；
[0027]图3为HlNl病毒抗原配伍壳寡糖第I次免疫小鼠血清抗体滴度；
[0028]图4为HlNl病毒抗原配伍壳寡糖第2次免疫小鼠血清抗体滴度；
[0029]图5为乙肝亚单位疫苗配伍壳寡糖第I次免疫小鼠血清抗体滴度；
[0030]图6为乙肝亚单位疫苗配伍壳寡糖第2次免疫小鼠血清抗体滴度；
[0031]图7为乙肝亚单位疫苗配伍壳寡糖第2次免疫小鼠血清抗体亚型及亚类。
【具体实施方式】
[0032]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0033]实施例1:壳寡糖的制备及理化性质
[0034]1、壳寡糖制备:
[0035]配料罐中加入去离子水，将壳聚糖溶解在I %的醋酸溶液中，搅拌升温至38±2.0°C。加入5% (对底物)的酶制剂，搅拌，38°C恒温，待酶解溶液粘度降至60%后，开始超滤(切割分子量在6000)。小于切割分子量的部分透过膜，大于切割分子量的部分返回反应釜继续降解。超滤透过液再通过纳米膜滤器(切割分子量300)，透过部分为水、醋酸和小分子糖(该透过部分可循环使用，用于配制壳聚糖溶液)，未透过部分被浓缩为壳寡糖溶液，喷雾干燥，制得壳寡糖粉末。
[0036]2、壳寡糖质谱检测:
[0037]仪器:BIFLEXIII型 MALD1-TOF 质谱仪 ?ruker 公司);
[0038]方法:壳寡糖样品配成10mg/mL的溶液，基质使用2，5_ 二羟基苯甲酸(DHB)，分别吸取IuL基质溶液和样品溶液，充分混匀，吸取0.5uL的混合液滴于干净的不锈钢样品板上，待溶剂自然挥发样品结晶后，进行质谱分析，结果如图1所示。由图可以看出:C0S聚合度为2-20。
[0039]3、壳寡糖聚合度检测:
[0040]样品处理方法:将聚合度为2-8的8% (W/V)壳寡糖溶于水，用氨水调节pH>12，过滤去沉淀，上清液进行分析。
[0041]检测条件:高效液相色谱-蒸发光散射检测器及Clici Mal色谱柱，线形梯度洗脱方式；柱温300C ;检测器气压23psi ;流速:lml/min。
[0042]流动相:A，甲酸胺溶液；B，乙腈。
[0043]洗脱程序:0-30分钟，70% B到50% B。
[0044]实验结果:采用面积归一化法计算得到不同聚合度壳寡糖单体在该样品中所占比例依次为 17.8%, 27.2%, 26.8%, 16.7%, 7.0%, 2.7%^P 1.9%，如图 2 所示。
[0045]实施例2:壳寡糖对流感疫苗的佐剂活性测定
[0046]将实施例1中的壳寡糖作为疫苗佐剂，以HlNl流感疫苗(H1N1流感病毒裂解液，30 μ g/ml)为抗原，二者联用肌肉注射免疫小鼠，测定抗体滴度。具体方法如下:
[0047]实验动物:BALb/c小鼠，6-8周龄，5只/组，雌性。
[0048]药物浓度:由上述实施例1中制备的壳寡糖(COS):4mg/ml和20mg/ml ；H1N1流感病毒裂解液:30 μ g/ml ;销佐剂(Al):4mg/ml。
[0049]对照溶剂:生理盐水(Saline)。
[0050]混合后药物浓度:壳寡糖:2mg/ml和10mg/ml ；H1N1流感病毒裂解液:15 μ g/ml ；销佐剂(Al):2mg/mlo
[0051]给药剂量:壳寡糖:200μ g/mouse (小鼠)和 lmg/mouse ；H1N1:1.5 μ g/mouse ;销佐剂(Al):200 μ g/mouse ο
[0052]分组:(I)空白对照组:Saline； (2)P 组:Saline+HlNl ； (3)铝佐剂组:A1+H1N1 ；
(4)COS 低剂量组:C0S (200 μ g/mouse) +HlNl ； (5) COS 高剂量组:C0S (lmg/mouse) +HlNl。
[0053]注射前等体积混合，100 μ I/鼠，右后肢肌肉注射。
[0054]免疫方案:动物按照免疫分组首次免疫注射后2周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度。首次免疫后第4周加强免疫，二次免疫后2周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度。视滴度情况，测定后2周进行第3次免疫。ELASI法测定血清中抗体滴度。
[0055]ELISA法所用试剂配制:
[0056]1.抗原包被液:50mmol/L碳酸盐缓冲液，ρΗ9.6。称取无水Na2C03 1.696g，NaHC032.856g，加水溶解到 100mL, PH 9.6。
[0057]2.洗涤液(10XPBST，PH 7.4):称取 NaCl 80g，KCl 2g，Na2HP04 29g，KH2P04 2g，Tween-20 1mL，加双蒸水至1000ml，调至PH 7.4，使用时稀释10倍即可。
[0058]3.封闭液:1% BSA，用 50mmol/L PBS PH 7.4 溶解。
[0059]4.底物液A(TMB-过氧化氢溶液):取3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)200mg，无水乙醇lOOmL，加双蒸水至1000mL。
[0060]5.底物液 B (0.lmol/L 柠檬酸-0.2mol/LNa2HP04 缓冲液):Na2HP04 24.8g，柠檬酸19.33g，加双蒸水至1000ML，调节pH至5.0?5.4。
[0061 ] 6.底物液:使用时将底物液A和底物液B按1:1，加入30 % H2O2至终浓度0.5%。
[0062]7.终止液:2N H2S04o
[0063]HlNl抗原用抗原包被液稀释至4 μ g/ml，加入96孔板(Costar)中，100 μ I/孔，4°C包被过夜。用PBST洗3次，1% BSA, 200 μ I/孔，37°C封闭lh。用PBST洗涤3次，小鼠抗血清从1:400开始，用PBST按等倍倍比稀释6个梯度，100 μ I/孔加入酶标板，37°C孵育Iho弃去血清样品，PBST洗涤3次，加入山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(PBST 1:1000倍稀释)，加入酶标板中，100 μ I/孔，37°C孵育lh。弃去二抗，PBST洗涤6次，加入新配置的新鲜TMB底物显色液，100 μ I/孔，室温避光显色15min。加入2N硫酸溶液终止显色，50 μ I/孔，并用酶标仪测定450nm吸光度(A450)。
[0064]实验结果:
[0065]以HlNl病毒裂解液为免疫抗原，壳寡糖作为佐剂初次免疫即可产生较高滴度的特异性抗体(图3)。经过第二次免疫，壳寡糖具有显著的免疫佐剂活性，能够促进抗体的产生(图4)。
[0066]实施例3:壳寡糖对乙肝疫苗的佐剂活性
[0067]将实施例1中的壳寡糖作为疫苗佐剂，以重组乙型肝炎亚单位疫苗(汉逊酵母表达HBsAg，大连汉信生物医药有限公司生产)为抗原，二者联用肌肉注射免疫小鼠，测定抗体滴度。具体实验同实施例2。
[0068]给药剂量:壳寡糖:200μ g/mouse (小鼠)和 50yg/mouse ；HBsAg:2 μ g/mouse ;销佐剂(Al):200 μ g/mouse ο
[0069]实验分组:⑴生理盐水组(Saline);⑵铝佐剂组(Al+HBsAg) ; (3)乙肝亚单位组(Saline+HBsAg) ； (4) COS 低剂量组:C0S (200 μ g/mouse) +HBsAg ； (5) COS 高剂量组:COS(lmg/mouse)+HBsAg0
[0070]注射前等体积混合，100 μ I/鼠，右后肢肌肉注射。
[0071]免疫方案:动物肌肉注射，初次免疫2周后ELASI方法测定小鼠血清抗体滴度，然后进行2次免疫。2次免疫2周后再次测定抗体滴度和亚型及亚类。
[0072]ELISA法检测血清特异性抗体亚型及亚类实验方法如下:
[0073]HBsAg抗原用抗原包被液稀释至4 μ g/ml，加入96孔板(Costar)中，100 μ I/孔，4°C包被过夜。用PBST洗3次，I % BSA, 200 μ I/孔，37°C封闭Ih0用PBST洗涤3次，小鼠抗血清用PBST进行1:400稀释后100 μ I/孔加入酶标板，37°C孵育lh。弃去血清样品，PBST洗涤3次，山羊抗小鼠亚类抗体用PBST1:1000倍稀释后，加入96孔酶标板中，100 μ I/孔，37°C孵育lh。PBST洗涤，洗涤3次，HRP标记的兔抗山羊IgG抗体用PBST 1:1000倍稀释，加入酶标板中，100 μ I/孔，37°C孵育Iho PBST洗涤5次，加入TMB显色底物，100 μ I/孔，室温避光显色15min。加入2N硫酸溶液终止显色，50 μ I/孔，并用酶标仪测定450nm吸光度(A450)?
[0074]实验结果:以重组乙型肝炎亚单位疫苗为免疫抗原，壳寡糖作为佐剂初次免疫即可产生较高乙肝疫苗的特异性抗体(图5)。经过第二次免疫，壳寡糖与同等剂量的铝佐剂具有相近的免疫佐剂活性，能够促进抗体的产生(图6)，对抗体IgG亚型以及IgA的产生均有促进作用，特别对IgGl、IgG2a、IgG2b亚类抗体的产生促进(图7)。
[0075]尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1.一种疫苗佐剂，其包含壳寡糖，所述壳寡糖由以下方法制备: 壳聚糖经生物酶法水解、化学法降解或物理方法裂解生成聚合度为2-20的壳寡糖；所述聚合度为2-20的壳寡糖脱乙酰度>90%，分子量范围为400?5000Da，其中聚合度为3-10的成分比例之和不低于50%。2.根据权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或蛋白质疫苗的佐剂。3.一种疫苗组合物，其包含权利要求1中所述的疫苗佐剂。4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为减毒疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或蛋白质疫苗。5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为乙肝亚单位疫苗。6.根据权利要求3-5中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为疫苗制剂。7.一种壳寡糖在制备疫苗佐剂中的用途；或者在制备疫苗组合物和疫苗制剂中的用途。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或蛋白质疫苗的佐剂。9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述疫苗组合物为疫苗制剂。10.根据权利要求7或9所述的用途，其特征在于，所述疫苗制剂为口服、静脉注射、动脉注射、粘膜给药、肌肉注射、皮下注射、器官注射或胸腹腔内注射的疫苗。
【专利摘要】本发明公开了壳寡糖在制备疫苗佐剂及含该疫苗佐剂的疫苗组合物和疫苗制剂中的用途，所述疫苗佐剂包含壳寡糖，所述壳寡糖由以下方法制备：壳聚糖经生物酶法水解、化学法降解或物理方法裂解生成聚合度为2-20的壳寡糖；所述聚合度为2-20的壳寡糖脱乙酰度>90％，分子量范围为400～5000Da，其中聚合度为3-10的成分比例之和不低于50％。本发明的含壳寡糖的疫苗佐剂可以用作减毒疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或蛋白质疫苗的佐剂。
【IPC分类】A61K9/00, A61K39/39, A61K39/00
【公开号】CN104906574
【申请号】CN201510358631
【发明人】杜昱光, 贾培媛, 单俊杰, 王玉霞, 许青松, 刘洪涛, 程功, 未金花
【申请人】中国科学院过程工程研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月25日
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，具体地，本发明涉及壳寡糖在制备疫苗佐剂及含该疫苗佐剂的疫苗组合物和疫苗制剂中的用途。
【背景技术】
[0002]佐剂是一类先于抗原或与抗原同时应用时能增强抗原免疫效应的物质，它的作用主要是增强机体免疫系统对抗原的特异性免疫应答反应。自200多年前英国医生Jenner接种牛痘预防天花并取得了人体试验成功，人类可以通过接种疫苗预防控制某些传染性疾病。1925年法国免疫学家兼兽医学家Gaston Ramon发现在白喉、破伤风疫苗中加入木薯淀粉、琼脂、化脓性细菌等某些与抗原无关的物质可以特异性地增强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗力。在此后的疫苗佐剂的研宄中发现许多物质均具有佐剂效应，如木薯粉、羊毛脂、丹宁酸等。近年来，随着人们对免疫佐剂研宄的不断深入，越来越多的物质被发现有免疫佐剂的功能，如铝盐佐剂、油乳佐剂、蜂胶佐剂、多糖佐剂、新型免疫佐剂等(B1molecular Engineering, 2001, 18(3):69-85.)。油乳佐剂主要有油包水乳剂的弗氏佐剂(FA)、水包油乳剂的MF-59等。新型免疫佐剂有脂质体、细胞因子佐剂等。至今被我国批准合法使用的人用疫苗佐剂是铝盐佐剂，它可以有效地诱导免疫反应，显著增强机体的体液免疫应答(Arch Virol，2008，153(5):831 一 837.)。然而，铝佐剂只能增强机体的体液免疫功能，对于如HIV等胞内病毒无法产生有效的细胞免疫促进作用。其次，铝佐剂主要以氢氧化铝和磷酸铝为代表，在注射部位产生红肿、结节等局部反应，铝盐还易在体内蓄积，特别是脑部，有可能导致脑病的发生。传统兽用疫苗中常用的佐剂有铝盐佐剂和油佐剂。油佐剂疫苗在抗体效价和免疫持久性方面都优于铝盐佐剂疫苗，但油佐剂不良反应严重，皮下注射会引起炎症、溃疡和肉芽肿；油类物质长期潴留于组织中不易代谢。
[0003]随着免疫学研宄的不断深入和基因工程技术的迅速发展，针对不同疾病已开展了各种新型基因工程疫苗的研制，新型技术疫苗如抗原表位疫苗、基因工程疫苗等抗原纯度越来越高，但这些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、难以诱导机体产生有效免疫应答等不足，从而需要免疫佐剂来协同这种作用，尤其是安全无毒、能够刺激较强细胞免疫应答的佐剂，以及适合粘膜疫苗、核酸疫苗和肿瘤疫苗的免疫佐剂。理想的疫苗佐剂应当具有以下特征:对于特定的人群或动物，要保证副作用最小；佐剂作用要持久稳定；生产成本要尽量低；增强细胞或体液免疫的强度要能达到保护要求；不同用药途径产生的毒副作用都应清楚研宄。
[0004]壳寡糖分子量小，水溶性良好，易被人体吸收，生物活性高，具有大分子糖所不具备的更独特的生理生化活性，同时具有纯天然、无辐射、无污染等特点，在保健品、营养剂、食品添加剂等食品工业方面，植物生长调节剂及饲料添加剂等农牧业方面，废水处理、纺织、化工、日用化学品、生物工程和医药等方面具有良好的应用价值，更为值得关注的是它能够有效激活机体细胞免疫和体液免疫，将其开发为疫苗佐剂具有良好的应用前景。
[0005]壳寡糖的制备主要有化学法、物理降解法、酶法、糖基转移法(中国生化药物杂志，1999，20 (2):99)。化学法一般用浓盐酸水解，但其产品多在四糖以下，而且化学反应条件十分苛刻，不易控制，后处理也繁琐。糖基转移法是利用低聚合度寡糖，在酶(主要是溶菌酶或几丁质酶)的参与后，延长糖链成为高聚合度的寡糖，此方法主要得到六糖和七糖。酶降解法所用的酶有壳聚糖酶、纤维素酶、糖苷酶和脂肪酶等，对其聚合度无法控制。而不同聚合度的壳寡糖对其佐剂活性有影响。目前所能制备得到的非常有限的寡糖价格昂贵，其在应用上受到很大的限制。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于，提供壳寡糖在制备疫苗佐剂及含该疫苗佐剂的疫苗组合物和疫苗制剂中的用途。
[0007]为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案:
[0008]本发明的第一方面涉及一种壳寡糖，所述壳寡糖由以下方法制备:
[0009]壳聚糖经生物酶法水解、化学法降解或物理方法(微波、射线照射)裂解生成聚合度为2-20的壳寡糖；
[0010]所述聚合度为2-20的壳寡糖脱乙酰度>90%，分子量范围为400?5000Da，其中聚合度为3-10的成分比例之和不低于20%?50%。
[0011]根据本发明任一项所述的壳寡糖，其具有图1或图2所示特征。
[0012]本发明的再一方面涉及一种疫苗佐剂，其包含上述的壳寡糖；具体地，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂。
[0013]本发明的再一方面涉及一种疫苗制剂或疫苗组合物，其包含本发明的壳寡糖组分。
[0014]根据本发明任一项所述的疫苗制剂或疫苗组合物，其为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗。
[0015]根据本发明任一项所述的疫苗制剂或疫苗组合物，其为乙肝亚单位疫苗。
[0016]本发明的再一方面涉及本发明任一项所述壳寡糖在制备疫苗佐剂中的用途；或者在制备疫苗组合物或疫苗制剂中的用途。
[0017]根据本发明任一项的用途，其中，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂；所述疫苗为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗。
[0018]本发明涉及的疫苗组合物，该疫苗组合物含疫苗抗原和壳寡糖佐剂；
[0019]本发明涉及的疫苗制剂，该疫苗制剂含疫苗抗原、壳寡糖佐剂和制剂所需的各种辅料；
[0020]本发明还涉及一种免疫方法或者接种方法，包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物或疫苗制剂的步骤。
[0021]术语“有效量”是指哺乳动物中实现免疫效果的疫苗制剂或疫苗组合物的剂量。
[0022]本发明的有益效果:
[0023]本发明的壳寡糖能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用作减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂。本发明中的壳寡糖已经可以大规模生产。本发明为壳寡糖佐剂作用机理的研宄奠定基础，为找到具有更好佐剂效果的寡糖提供了参考。
[0024]本发明通过生物酶法水解、化学法降解或物理方法裂解，并结合膜分离技术，制备聚合度为2-20的壳寡糖，可以高产率大规模地生产，并且质量可控，成本适宜，可以为制成体内环境下易溶、易吸收、使用方便的壳寡糖，应用于疫苗佐剂提供物质基础。
【附图说明】
[0025]图1为本发明壳寡糖的质谱检测图谱；
[0026]图2为本发明壳寡糖聚合度检测图谱；
[0027]图3为HlNl病毒抗原配伍壳寡糖第I次免疫小鼠血清抗体滴度；
[0028]图4为HlNl病毒抗原配伍壳寡糖第2次免疫小鼠血清抗体滴度；
[0029]图5为乙肝亚单位疫苗配伍壳寡糖第I次免疫小鼠血清抗体滴度；
[0030]图6为乙肝亚单位疫苗配伍壳寡糖第2次免疫小鼠血清抗体滴度；
[0031]图7为乙肝亚单位疫苗配伍壳寡糖第2次免疫小鼠血清抗体亚型及亚类。
【具体实施方式】
[0032]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0033]实施例1:壳寡糖的制备及理化性质
[0034]1、壳寡糖制备:
[0035]配料罐中加入去离子水，将壳聚糖溶解在I %的醋酸溶液中，搅拌升温至38±2.0°C。加入5% (对底物)的酶制剂，搅拌，38°C恒温，待酶解溶液粘度降至60%后，开始超滤(切割分子量在6000)。小于切割分子量的部分透过膜，大于切割分子量的部分返回反应釜继续降解。超滤透过液再通过纳米膜滤器(切割分子量300)，透过部分为水、醋酸和小分子糖(该透过部分可循环使用，用于配制壳聚糖溶液)，未透过部分被浓缩为壳寡糖溶液，喷雾干燥，制得壳寡糖粉末。
[0036]2、壳寡糖质谱检测:
[0037]仪器:BIFLEXIII型 MALD1-TOF 质谱仪 ?ruker 公司);
[0038]方法:壳寡糖样品配成10mg/mL的溶液，基质使用2，5_ 二羟基苯甲酸(DHB)，分别吸取IuL基质溶液和样品溶液，充分混匀，吸取0.5uL的混合液滴于干净的不锈钢样品板上，待溶剂自然挥发样品结晶后，进行质谱分析，结果如图1所示。由图可以看出:C0S聚合度为2-20。
[0039]3、壳寡糖聚合度检测:
[0040]样品处理方法:将聚合度为2-8的8% (W/V)壳寡糖溶于水，用氨水调节pH>12，过滤去沉淀，上清液进行分析。
[0041]检测条件:高效液相色谱-蒸发光散射检测器及Clici Mal色谱柱，线形梯度洗脱方式；柱温300C ;检测器气压23psi ;流速:lml/min。
[0042]流动相:A，甲酸胺溶液；B，乙腈。
[0043]洗脱程序:0-30分钟，70% B到50% B。
[0044]实验结果:采用面积归一化法计算得到不同聚合度壳寡糖单体在该样品中所占比例依次为 17.8%, 27.2%, 26.8%, 16.7%, 7.0%, 2.7%^P 1.9%，如图 2 所示。
[0045]实施例2:壳寡糖对流感疫苗的佐剂活性测定
[0046]将实施例1中的壳寡糖作为疫苗佐剂，以HlNl流感疫苗(H1N1流感病毒裂解液，30 μ g/ml)为抗原，二者联用肌肉注射免疫小鼠，测定抗体滴度。具体方法如下:
[0047]实验动物:BALb/c小鼠，6-8周龄，5只/组，雌性。
[0048]药物浓度:由上述实施例1中制备的壳寡糖(COS):4mg/ml和20mg/ml ；H1N1流感病毒裂解液:30 μ g/ml ;销佐剂(Al):4mg/ml。
[0049]对照溶剂:生理盐水(Saline)。
[0050]混合后药物浓度:壳寡糖:2mg/ml和10mg/ml ；H1N1流感病毒裂解液:15 μ g/ml ；销佐剂(Al):2mg/mlo
[0051]给药剂量:壳寡糖:200μ g/mouse (小鼠)和 lmg/mouse ；H1N1:1.5 μ g/mouse ;销佐剂(Al):200 μ g/mouse ο
[0052]分组:(I)空白对照组:Saline； (2)P 组:Saline+HlNl ； (3)铝佐剂组:A1+H1N1 ；
(4)COS 低剂量组:C0S (200 μ g/mouse) +HlNl ； (5) COS 高剂量组:C0S (lmg/mouse) +HlNl。
[0053]注射前等体积混合，100 μ I/鼠，右后肢肌肉注射。
[0054]免疫方案:动物按照免疫分组首次免疫注射后2周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度。首次免疫后第4周加强免疫，二次免疫后2周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度。视滴度情况，测定后2周进行第3次免疫。ELASI法测定血清中抗体滴度。
[0055]ELISA法所用试剂配制:
[0056]1.抗原包被液:50mmol/L碳酸盐缓冲液，ρΗ9.6。称取无水Na2C03 1.696g，NaHC032.856g，加水溶解到 100mL, PH 9.6。
[0057]2.洗涤液(10XPBST，PH 7.4):称取 NaCl 80g，KCl 2g，Na2HP04 29g，KH2P04 2g，Tween-20 1mL，加双蒸水至1000ml，调至PH 7.4，使用时稀释10倍即可。
[0058]3.封闭液:1% BSA，用 50mmol/L PBS PH 7.4 溶解。
[0059]4.底物液A(TMB-过氧化氢溶液):取3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)200mg，无水乙醇lOOmL，加双蒸水至1000mL。
[0060]5.底物液 B (0.lmol/L 柠檬酸-0.2mol/LNa2HP04 缓冲液):Na2HP04 24.8g，柠檬酸19.33g，加双蒸水至1000ML，调节pH至5.0?5.4。
[0061 ] 6.底物液:使用时将底物液A和底物液B按1:1，加入30 % H2O2至终浓度0.5%。
[0062]7.终止液:2N H2S04o
[0063]HlNl抗原用抗原包被液稀释至4 μ g/ml，加入96孔板(Costar)中，100 μ I/孔，4°C包被过夜。用PBST洗3次，1% BSA, 200 μ I/孔，37°C封闭lh。用PBST洗涤3次，小鼠抗血清从1:400开始，用PBST按等倍倍比稀释6个梯度，100 μ I/孔加入酶标板，37°C孵育Iho弃去血清样品，PBST洗涤3次，加入山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(PBST 1:1000倍稀释)，加入酶标板中，100 μ I/孔，37°C孵育lh。弃去二抗，PBST洗涤6次，加入新配置的新鲜TMB底物显色液，100 μ I/孔，室温避光显色15min。加入2N硫酸溶液终止显色，50 μ I/孔，并用酶标仪测定450nm吸光度(A450)。
[0064]实验结果:
[0065]以HlNl病毒裂解液为免疫抗原，壳寡糖作为佐剂初次免疫即可产生较高滴度的特异性抗体(图3)。经过第二次免疫，壳寡糖具有显著的免疫佐剂活性，能够促进抗体的产生(图4)。
[0066]实施例3:壳寡糖对乙肝疫苗的佐剂活性
[0067]将实施例1中的壳寡糖作为疫苗佐剂，以重组乙型肝炎亚单位疫苗(汉逊酵母表达HBsAg，大连汉信生物医药有限公司生产)为抗原，二者联用肌肉注射免疫小鼠，测定抗体滴度。具体实验同实施例2。
[0068]给药剂量:壳寡糖:200μ g/mouse (小鼠)和 50yg/mouse ；HBsAg:2 μ g/mouse ;销佐剂(Al):200 μ g/mouse ο
[0069]实验分组:⑴生理盐水组(Saline);⑵铝佐剂组(Al+HBsAg) ; (3)乙肝亚单位组(Saline+HBsAg) ； (4) COS 低剂量组:C0S (200 μ g/mouse) +HBsAg ； (5) COS 高剂量组:COS(lmg/mouse)+HBsAg0
[0070]注射前等体积混合，100 μ I/鼠，右后肢肌肉注射。
[0071]免疫方案:动物肌肉注射，初次免疫2周后ELASI方法测定小鼠血清抗体滴度，然后进行2次免疫。2次免疫2周后再次测定抗体滴度和亚型及亚类。
[0072]ELISA法检测血清特异性抗体亚型及亚类实验方法如下:
[0073]HBsAg抗原用抗原包被液稀释至4 μ g/ml，加入96孔板(Costar)中，100 μ I/孔，4°C包被过夜。用PBST洗3次，I % BSA, 200 μ I/孔，37°C封闭Ih0用PBST洗涤3次，小鼠抗血清用PBST进行1:400稀释后100 μ I/孔加入酶标板，37°C孵育lh。弃去血清样品，PBST洗涤3次，山羊抗小鼠亚类抗体用PBST1:1000倍稀释后，加入96孔酶标板中，100 μ I/孔，37°C孵育lh。PBST洗涤，洗涤3次，HRP标记的兔抗山羊IgG抗体用PBST 1:1000倍稀释，加入酶标板中，100 μ I/孔，37°C孵育Iho PBST洗涤5次，加入TMB显色底物，100 μ I/孔，室温避光显色15min。加入2N硫酸溶液终止显色，50 μ I/孔，并用酶标仪测定450nm吸光度(A450)?
[0074]实验结果:以重组乙型肝炎亚单位疫苗为免疫抗原，壳寡糖作为佐剂初次免疫即可产生较高乙肝疫苗的特异性抗体(图5)。经过第二次免疫，壳寡糖与同等剂量的铝佐剂具有相近的免疫佐剂活性，能够促进抗体的产生(图6)，对抗体IgG亚型以及IgA的产生均有促进作用，特别对IgGl、IgG2a、IgG2b亚类抗体的产生促进(图7)。
[0075]尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1.一种疫苗佐剂，其包含壳寡糖，所述壳寡糖由以下方法制备: 壳聚糖经生物酶法水解、化学法降解或物理方法裂解生成聚合度为2-20的壳寡糖；所述聚合度为2-20的壳寡糖脱乙酰度>90%，分子量范围为400?5000Da，其中聚合度为3-10的成分比例之和不低于50%。2.根据权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或蛋白质疫苗的佐剂。3.一种疫苗组合物，其包含权利要求1中所述的疫苗佐剂。4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为减毒疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或蛋白质疫苗。5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为乙肝亚单位疫苗。6.根据权利要求3-5中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为疫苗制剂。7.一种壳寡糖在制备疫苗佐剂中的用途；或者在制备疫苗组合物和疫苗制剂中的用途。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或蛋白质疫苗的佐剂。9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述疫苗组合物为疫苗制剂。10.根据权利要求7或9所述的用途，其特征在于，所述疫苗制剂为口服、静脉注射、动脉注射、粘膜给药、肌肉注射、皮下注射、器官注射或胸腹腔内注射的疫苗。
【专利摘要】本发明公开了壳寡糖在制备疫苗佐剂及含该疫苗佐剂的疫苗组合物和疫苗制剂中的用途，所述疫苗佐剂包含壳寡糖，所述壳寡糖由以下方法制备：壳聚糖经生物酶法水解、化学法降解或物理方法裂解生成聚合度为2-20的壳寡糖；所述聚合度为2-20的壳寡糖脱乙酰度>90％，分子量范围为400～5000Da，其中聚合度为3-10的成分比例之和不低于50％。本发明的含壳寡糖的疫苗佐剂可以用作减毒疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或蛋白质疫苗的佐剂。
【IPC分类】A61K9/00, A61K39/39, A61K39/00
【公开号】CN104906574
【申请号】CN201510358631
【发明人】杜昱光, 贾培媛, 单俊杰, 王玉霞, 许青松, 刘洪涛, 程功, 未金花
【申请人】中国科学院过程工程研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月25日
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