LSECtin作为黑色素瘤免疫治疗的靶点的制作方法
LSECtin作为黑色素瘤免疫治疗的靶点的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及LSECtin作为黑色素瘤免疫治疗的祀点。
【背景技术】
[0002] 黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，恶性程度极高，占 皮肤肿瘤死亡病例的极大部分。多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜，也见于软脑膜和脉络膜。 其发病率随人种、地域，种族的不同而存有所差异，白种人的发病率远较黑种人高，居住在 澳大利亚昆±兰州的白种人其发病率高达17/10万，我国虽属黑色素瘤的低发区，但近年 来发病率却呈不断上升趋势。
[0003] 目前对于黑色素瘤的治疗手段主要包括；原发病灶的手术切除、放疗、化疗W及免 疫治疗。其中免疫治疗手段是近年来逐步发展起来的治疗黑色素瘤的有效手段。肿瘤免疫 学治疗的目的是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和 杀伤肿瘤细胞。肿瘤免疫学治疗的方法种类繁多，已与现代生物高科技技术结合，发展成为 继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式一肿瘤生物学治疗方法。肿瘤免疫治疗手 段也包括多种策略；（1)主动免疫；给机体输入具有抗原性的肿瘤疫苗，刺激机体产生特异 性抗肿瘤免疫，W达到治疗肿瘤、预防肿瘤转移和复发的目的；（2)免疫导向疗法；将具有 细胞毒作用的杀伤因子与单克隆抗体偶联制成"生物导弹"，并利用单抗能特异性结合肿瘤 抗原的特性使杀伤因子"导向"集中到肿瘤病灶，杀伤肿瘤细胞；（3)肿瘤过继免疫疗法；将 自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肤等激 活剂进行诱导、激活和扩增，然后转输给肿瘤患者，提高患者抗肿瘤免疫力，W达到治疗和 预防复发的目的；（4)细胞因子疗法：该疗法是近期随着高纯化或重组细胞因子的生产得 W实现。细胞因子疗法的原理是某些细胞因子注射体内后可调节、增强一种或多种免疫细 胞的功能，发挥更强的抗肿瘤免疫功能。目前临床常用的细胞因子有IL-2、TNF-a、IFN-g及 CSF等；（5)肿瘤的基因疗法；其原理是克隆某些可用于肿瘤治疗的目的基因，将目的基因 在体外转染受体细胞，然后回输体内，或直接将目的基因体内注射，使目的基因在体内有效 表达，增强体内抗肿瘤作用或改善肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫力。
[0004] 近年来，肿瘤的主动免疫策略应用较为广泛，美国食品和药品监督管理局（抑A) 2011年批准了CTLA4的抗体（Ipilimumab)用于治疗黑色素瘤患者。CTLA4是T细胞表面 的具有抑制T细胞免疫反应功能的跨膜分子，针对该一祀点的单克隆抗体，能够激活病人 的抗肿瘤免疫反应，从而减缓黑色素瘤的疾病进程。因为CTLA4具有非常重要的生理功能， 导致该一药物在治疗过程中有比较大的毒副作用。
[0005]LSECtin化iverSinusoidalElndothelialCellslectin)是II型跨膜糖蛋白，位 于人类19pl3. 3,是C型凝集素家族的新成员。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供抑制LSECtin活性的物质的应用。
[0007] 本发明提供了抑制LSECtin活性的物质在制备具有如下（a)、（b)、（c)中的至少一 种功能的产品中的应用：
[0008]a)治疗肿瘤或者抑制肿瘤生长；
[0009]b)促进肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应；
[0010] C)促进肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y;
[0011] 所述LSECtin为如下（1)或（2);
[0012] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0013] (2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
[0014] 上述应用中，所述抑制LSECtin活性的物质为抗LSECtin抗体或小分子抑制剂。
[0015] 上述应用中，所述抗LSECtin抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；所述抗LSECtin抗 体具体为多克隆抗体，所述多克隆抗体具体为兔抗鼠LSECtin多克隆抗体。
[0016] 上述应用中，所述广品为药品；
[0017] 所述肿瘤为黑色素瘤。
[0018]LSECtin或其编码基因或含有LSECtin编码基因的重组载体在制备促进肿瘤生长 产品中的应用也是本发明保护的范围；
[0019]所述LSECtin为如下（1)或（2);
[0020] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0021] (2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
[0022] 上述应用中，所述LSECtin编码基因的核巧酸序列为序列表中的序列2。
[0023] 上述应用中，所述促进肿瘤生长通过如下1) -3)中至少一种实现：
[0024] 1)抑巧IJ肿瘤特异性T细胞的增殖；
[00巧]2)增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期；
[0026] 3)抑制肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y。
[0027] 上述应用中，所述增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期为使肿瘤特异性T细胞细胞 周期的G1期到S期的时间增长；
[0028] 所述使肿瘤特异性T细胞细胞周期的G1期到S期的时间增长体现在抑制CDK2、 CDK4和/或CDK6的表达和/或促进P21的表达。
[0029] 上述应用中，所述产品为药物；
[0030] 所述肿瘤为黑色素瘤。
[0031]LSECtin作为肿瘤免疫治疗的祀点也是本发明保护的范围；
[0032] 或LSECtin作为祀点在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用； 所述LSECtin的氨基酸序列为序列表中的序列1;
[0033] 上述应用中，所述肿瘤具体为黑色素瘤。
[0034] 本发明通过实验证明；（1)黑色素瘤病人的肿瘤组织表达LSECtin;(2)小鼠黑色 素瘤细胞系B16细胞表达LSECtin;(3)B16细胞表达的LSECtin促进小鼠黑色素瘤的生 长，该一功能依赖于T细胞的存在；（4)B16细胞表达的LSECtin抑制肿瘤特异性T细胞的 增殖和效应功能。因此，本发明证明抑制LSECtin的活性的物质可W用于制备预防和/或 治疗黑色素瘤的药品，而作为肿瘤免疫治疗的祀点；LSECtin在筛选、开发和/或设计预防 和/或治疗黑色素瘤产品。本发明具有较大的社会意义和经济价值。
【附图说明】
[00巧]图1为检测黑色素瘤病人肿瘤组织LSECtin的表达。
[0036] 图2为检测小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞LSECtin的表达。
[0037] 图3为判定B16-mock和B16-LSECtin稳定株体外生长结果图。
[0038] 图4为野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞之后的肿瘤生长情况。
[0039] 图5为野生型小鼠免疫B16细胞后注射anti-LSECtin之后的肿瘤生长情况。
[0040] 图6为抗体清除小鼠体内CD4+和CD8+T细胞的结果。
[00川图7为清除小鼠CD4+和CD8+T细胞之后，野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞之后的肿瘤生长情况。
[0042] 图8为LSECtin在体外抑制肿瘤特异性T细胞的增殖。
[0043] 图9为LSECtin在体外劫持肿瘤特异性T细胞的细胞周期。
[0044] 图10为LSECtin在体外抑制肿瘤特异性T细胞的效应功能。
[0045] 图11为LSECtin在体内抑巧IJ肿瘤特异性T细胞的效应功能。
[0046] 图12为LSECtin促进肿瘤特异性CD8+T细胞干扰素-Y的分泌情况。
【具体实施方式】
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049]C57化/6小鼠；体重20 + 2克，6-8周，购自华 阜康公司。黑色素瘤病人芯片购西 安艾丽娜生物科技有限公司，货号是Me481a。小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞；购自中国医 学科学院细胞资源中也。RNA提取试剂盒；购自QIAGEN公司，货号是74104。cDNA合成试 剂盒；购自化rmantas公司，货号是K1622。DNA聚合酶：购自天根生化科技（北京）有限 公司，货号是KT201。SYBRGreen酶；购自T0Y0B0公司，货号为QPK-201。细胞转染试剂： 购自Invitrogen公司，货号是11668019。稳定株筛选试剂G418;购自Merck公司，货号是 345810。兔抗鼠LSECtin多克隆抗体（鼠源的LSECtin蛋白（氨基酸序列为序列1)免疫兔得 到的兔抗鼠LSECtin多克隆抗体)。阳标记的鼠源CD3抗体、APC标记的鼠源CD4和CD8抗体 和阳标记的鼠源CD8抗体；购自eBioscience公司，货号分别为12-0031、17-0041、17-0081 和12-0081。CFSE;购自eBioscience公司，货号是65-0850。小鼠干扰素-y抗体；购自 eBioscience公司，货号是17-7311。小鼠干扰素-Y检测化ISA试剂盒：购自eBioscience 公司，货号是88-7314。小鼠干扰素-Y检测化ISP0T试剂盒：购自M油tech公司，货号为 3321-2AW-P1US。抗原特异性肤段TRP-2180-188;购自Anaspec公司，货号是61058。小鼠 CD3 抗体；购自抓Biosciences公司，货号是 555273。CDK2、CDK4、CDK6、P21 和P27 抗体购 自SantaCruz,货号分别是SC-163、SC-260、SC-177、SC-397 和SC-528。
[0050] 实施例1、LSECtin的发现
[0051] 一、检测黑色素瘤病人肿瘤组织LSECtin表达
[0052] 从西安艾丽娜生物科技有限公司购入小鼠黑色素瘤芯片，按照常规的免疫组化方 法，使用小鼠抗人LSECtin单克隆抗体对芯片进行染色。
[0053] 结果如图1所示，图1展示的是其中代表性的阳性结果之一 ；1代表黑色素瘤组织 的肥染色的结果，2代表使用对照抗体对黑色素瘤组织进行免疫组化染色的结果，3代表使 用鼠抗人LSECtin单克隆抗体对黑色素瘤组织进行免疫组化染色的结果；表明，使用免疫 组化的方法能够检测到病人黑色素瘤组织表达LSECtin,多例病人的组织样品中LSECtin 表达呈阳性的比例在50%。
[0054] 二、检测小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞LSECtin表达
[00巧]1、PCR反应扩增小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞中的LSECtin
[0056] 先获取B16细胞，按照RNA提取试剂盒的方法，提取其RNA;按照cDNA合成试剂盒 的方法合成cDNA;使用DNA聚合酶开展聚合链式反应（PCR)扩增LSECtin。
[0057]上游引物；atgaacactggtgaatac,下游引物；ttagtagcaactgctcctctt。
[005引 WcDNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增。
[0059]PCR产物电泳结果如图2所示，使用LSECtin的特异引物能够从小鼠黑色素瘤细胞 系B16细胞cDNA模板中扩增出88化PLSECtin的条带(经过测序，该PCR产物为LSECtin 的基因，其核巧酸序列为序列表中序列1，编码的蛋白LSECtin的氨基酸序列为序列表中的 序列2。），说明B16细胞表达LSECtin。1代表DNA分子量标记，2代表空白模板对照的扩增 结果，3代表B16细胞cDNA的扩增结果。
[0060] 实施例2、LSECtin作为黑色素瘤免疫治疗的祀点
[0061]一、B16-mock和B16-LSECtin稳定株的构建
[0062] 获取B16细胞，按照转染试剂的说明书，给B16细胞分别转染PIRES2-EGFP (Clontech，6029-1)和pIRES2-EGFP-mLSECtinfulllength(将LSECtin编码基因（序 列2)插入载体PIRES2-EGFP的化eI和BglII酶切位点得到的重组载体。）质粒。添加 800yg/mlG418筛选，流式细胞分选仪分选获取带有绿色英光的细胞，重复五轮，最终获得 B16-mock和B16-LSECtin稳定株细胞。
[0063] 使用实时定量PCR的方法确认LSECtin过表达的B16-LSECtin稳定株，使用 SYBRGreen酶开展实时定量PCR实验检测LSECtin的表达量。
[0064] 具体如下：分别提取B16-mock和B16-LSECtin细胞的RNA，按照cDNA合成试 剂盒的方法合成cDM;扩增引物序列为；上游ATGGTGCATCATTCCACAGCCCCGAGTG，下游为 TGATTGTCAGAGGCCTGAACGAGCAGG。GAPDH内参引物序列如下；上游TGAACGGGAAGCTCACTGG，下 游GAGCTTGACAAAGTTGTCATTGAG。WB16 细胞为对照。
[0065]结果如图 3 所示，B16-LSECtin细胞的LSECtin表达量为 2471.700 + 509. 851， B16-mock细胞LSECtin表达量为 1. 000 + 0. 086，B16-LSECtin细胞中LSECtin的表达远远 高于B16-mock细胞，说明B16-LSECtin细胞为过表达LSECtin的细胞。
[0066]B16细胞的LSECtin表达量与B16-mock细胞无显著差异。
[0067] 分别获取对数生长状态的B16-mock和B16-LSECtin细胞，使用六孔板培养，每个 孔初始细胞数为1*1〇5个，每种细胞重复铺3个孔，总共设置4个时间点。分别在第1、2、3 和4天收集上述细胞，使用BioRad细胞计数仪分别计数，绘制细胞生长曲线。
[006引结果如图4所示，B16-mock和B16-LSECtin稳定株在体外生长速度没有差异，表 明过表达LSECtin对细胞株生长无影响。
[0069] 二、小鼠黑色素瘤模型
[0070] 1、肿瘤细胞的准备
[0071] 保证B16细胞或者B16-LSECtin和B16-mock稳定株正处于对数生长期，密度最好 不超过50%。弃掉培养基，用3ml膜酶轻轻冲洗培养瓶，弃掉。再加入3ml膜酶，轻轻摇晃 培养瓶，使得细胞完全脱落，注意不要让细胞在膜酶里存在过长时间。加入3ml新鲜预冷的 DMEM培养基，用移液器混匀成单细胞息液。将细胞转移到50ml离也管中，再加入40ml预冷 的DMEM培养基，完全中和膜酶，4°C500g离也lOmin。弃掉上清，在预冷的皿SS中息浮细 胞，获得终浓度为l-5*l〇7ml。将细胞浓度调整到2*l〇Vml。
[007引 2、接种小鼠
[007引将小鼠麻醉，按小鼠体重注射70mg/kg的戊己比妥轴。小鼠昏迷之后，重息细胞， 装满1ml注射器。用70%酒精湿润腹部皮肤，适量剪去毛发，将细胞缓慢皮下注射进去，每 只小鼠lOOy1细胞（105个细胞)，注射完成之后，应该隆起的现象。
[0074]上述细胞分别为B16、B16-LSECtin和B16-mock。
[007引 H、过表达LSECtin在促进小鼠黑色素瘤的生长中的应用
[0076]经上述二小鼠接种了B16-LSECtin和B16-mock，得到WT+B16-LSECtin组小鼠、 WT+B16-mock组小鼠，在接种细胞后，第8天开始观察，之后隔天观察一次，使用游标卡尺分 别测量小鼠肿瘤的长径a和短径b，肿瘤体积计算公式为0. 5相b2。直到肿瘤体积大于2mm3 时，处死小鼠。
[0077] 结果如图5所示，
[007引在第8、10、12、14、16、18天，WT+B16-mock组小鼠的肿瘤体积分别为 25. 785 + 5. 148、42. 408 + 5. 718、226. 419 + 59. 687、355. 146 + 56. 607、455. 176 + 74. 325、 673. 596 + 72. 459 (单位为臟3);
[0079] 在第8 、10、12、14、16、18天，WT+B16-LSECtin组小鼠的肿瘤体积分别 为 41. 128 + 4. 071、111. 171 ± 17. 505、291. 042 + 53. 488、527. 990 + 128. 961、 757. 904+138. 026、1135. 632 + 182. 637 (单位为臟3).
[0080] 给小鼠接种B16-LSECtin细胞之后，小鼠黑色素瘤生长更加迅速，说明过表达 LSECtin能够促进小鼠黑色素瘤的生长。
[0081] 四、抗LSECtin抗体在减缓小鼠黑色素瘤的生长中的应用
[0082] 经上述二小鼠接种了B16,得到B16组小鼠，分为两部分，一部分在接种肿瘤细胞 之后的第3、6和9天，每只小鼠分别腹腔注射兔抗鼠LSECtin多克隆抗体，剂量是200yg 每只小鼠，得到WT+B16+anti-LSECtin小组；
[0083] 另一个部分在接种肿瘤细胞之后的第3、6和9天，每只小鼠分别腹腔注射兔IgG (取家兔血清，进行ProteinA/G纯化后得到兔IgG)作为对照，剂量是200yg每只小鼠，得 到WT+B16+R油bitIgG小组。
[0084] 注射后，第8天开始观察，之后隔天观察一次，使用游标卡尺分别测量小鼠肿瘤的 长径a和短径b，肿瘤体积计算公式为0. 5相b2。直到肿瘤体积大于2mm3时，处死小鼠。
[00财 结果如图6所示，在第16、18、20、22、24天，WT+B16+anti-LSECtin小组小鼠的 肿瘤体积分别为 14. 579 + 13. 479、54. 047 + 32. 422U14. 297 + 49. 195U35. 737 + 12. 303、 396. 208 + 37. 193 (单位为mm3);
[0086] 在第16、18、20、22、24天，WT+B16+R油bitIgG小组小鼠的肿瘤体积分 别为 52. 667 + 22. 302、215. 460 + 99. 032、452. 230 + 152. 84U944. 964 + 272. 526、 1781.949 + 489. 685 (单位为臟3);
[0087] 可W看出，注射兔抗鼠LSECtin多克隆抗体，可W有效减缓小鼠黑色素瘤的生长， 说明针对于LSECtin的抗体能够减缓小鼠黑色素瘤的生长。
[0088]LSECtin的抗体和LSECtin结合，从而使LSECtin无法与其它分子结合进行作用， 因此LSECtin的抗体抑制LSECtin活性。
[0089] 实施例3、LSECtin通过抑制抗肿瘤免疫反应促进黑色素瘤的生长
[0090] 一、使用抗体清除小鼠体内CD4+和CD8+T细胞
[00川 1、肿瘤细胞的准备
[0092] 保证B16细胞或者B16-LSECtin和B16-mock稳定株正处于对数生长期，密度最好 不超过50%。弃掉培养基，用3ml膜酶轻轻冲洗培养瓶，弃掉。再加入3ml膜酶，轻轻摇晃 培养瓶，使得细胞完全脱落，注意不要让细胞在膜酶里存在过长时间。加入3ml新鲜预冷的 DMEM培养基，用移液器混匀成单细胞息液。将细胞转移到50ml离也管中，再加入40ml预冷 的DMEM培养基，完全中和膜酶，4°C500g离也lOmin。弃掉上清，在预冷的皿SS中息浮细 胞，获得终浓度为l-5*l〇7ml。将细胞浓度调整到2*l〇Vml。
[0093] 2、小鼠腹腔注射anti-CD4和anti-CD8抗体
[0094] 选取适龄巧7BL/6小鼠，腹腔注射大鼠抗小鼠CD4抗体（aCD4,购自 eBioscience,货号为16-0041)和大鼠抗小鼠CD8抗体（aCD8,购自eBioscience,货号为 16-0081)，每只小鼠100yg，每隔4天，重复注射。W兔IgG为对照抗体。
[0095] 获取注射过大鼠抗小鼠CD4和CD8抗体的小鼠，常规方法分离其脾细胞，分别标记 PE标记的鼠源CD3抗体W及APC标记的鼠源CD4抗体或者APC标记的鼠源CD8抗体，流式 细胞仪检测相应细胞群的阳性比例。
[009引如图7所示，注射对照抗体的小鼠，其脾细胞中CD4+和CD8+T细胞的比例正常进 射清除抗体(大鼠抗小鼠CD4抗体和大鼠抗小鼠CD8抗体)的小鼠，其脾细胞中CD4+和CD8+T 细胞的比例几乎为零，说明清除抗体能够有效清除小鼠体内的CD4+和CD8+T细胞。
[0097] 二、LSECtin通过抑制肿瘤特异性T细胞的效应功能来促进小鼠黑色素瘤的生长
[009引1、肿瘤细胞的准备
[0099] 将B16-LSECtin和B16-mock按照上述培养，且使细胞浓度调整到2*l〇Vml。
[0100] 2、小鼠腹腔注射anti-CD4和anti-CD8抗体
[0101] 选取适龄巧7BL/6小鼠，腹腔注射大鼠抗小鼠CD4抗体和大鼠抗小鼠CD8抗体，每 只小鼠100yg，每隔4天，重复注射。
[0102] 3、接种小鼠
[010引将小鼠麻醉，按小鼠体重注射70mg/kg的戊己比妥轴。小鼠昏迷之后，重息细胞， 装满1ml注射器。用70%酒精湿润腹部皮肤，适量剪去毛发，将细胞缓慢皮下注射进去，每 只小鼠lOOy1细胞（105个细胞)，注射完成之后，应该隆起的现象。
[0104]得到IgG+B16-mock组小鼠、IgG+B16-LSECtin组小鼠、aCD4+B16-mock组小鼠、 aCD4+B16-LSECtin组小鼠、aCD8+B16-mock组小鼠、aCD8+B16-LSECtin组小鼠。
[0105] 4、小鼠肿瘤体积观察和测量
[0106] 接种细胞后，第8天开始观察上述四组小鼠，之后隔天观察一次，使用游标卡尺分 别测量小鼠肿瘤的长径a和短径b，肿瘤体积计算公式为0. 5相b2。直到肿瘤体积大于2mm3 时，处死小鼠。
[0107] 结果如图8所示，
[010引左图中：
[0109] IgG+B16-mock组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 19. 828 + 8. 896、62. 482 + 16. 904、93. 202 + 30. 304、246. 675 + 96. 615 (单位为臟3);
[0110] IgG+B16-LSECtin组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 47. 962 + 11. 153U10. 190 + 24. 057、238. 205 + 33. 88U670. 643 + 116. 672 (单位为臟3);
[01川a CD4+B16-mock组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 19. 128 + 12. 21U71.日48 + 29. 565U27. 500 + 52. 686、257. 496 + 125. 520 (单位为臟3);
[011引aCD4+B16-LSECtin组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 25. 960 + 9. 318、71. 167 + 23. 767U00. 414 + 22. 018U53. 537 + 38. 286 (单位为臟3);
[0113] 右图中：
[0114] IgG+B16-mock组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 19. 828 + 8. 896、62. 482 + 16. 904、93. 202 + 30. 304、246. 675 + 96. 615 (单位为臟3);
[01巧]IgG+B16-LSECtin组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 47. 962 + 11. 153U10. 190 + 24. 057、238. 205 + 33. 88U670. 643 + 116. 672 (单位为臟3);
[0116] a CD8+B16-mock组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 23. 979 + 12. 307、93. 804 + 20. 286、155. 263 + 40. 993、463 . 604+108. 768 (单位为臟3);
[0117]aCD8+B16-LSECtin组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 ：M. 688 + 11. 136U14. 315 + 23. 054U55. 235 + 31. 902、523. 215 + 99. 469 (单位为臟3)。
[011引清除小鼠体内CD4+ (左图)和CD8+ (右图)T细胞之后，肿瘤细胞表达的LSECtin并 不能如图5所示，能够促进小鼠黑色素瘤的生长，说明肿瘤细胞表达的LSECtin促进小鼠黑 色素瘤的生长，需要CD4+和CD8+T细胞的存在，该就提示很有可能肿瘤细胞表达的LSECtin 通过抑制肿瘤特异性T细胞的效应功能来促进小鼠黑色素瘤的生长。
[0119] 二、LSECtin在体外对肿瘤特异性T细胞增殖和效应功能的抑制
[0120] 1、肿瘤特异性T细胞的获取
[012。获取B16细胞，200Gy照射。C57化/6小鼠皮下注射照射过的B16细胞，每只小鼠 注射5*105个细胞。2周W后，取上述小鼠脾细胞，l0μg/ml TRP-2刺激4-6天。收集上述 细胞，即为肿瘤特异性T细胞，用于下一步实验。
[0122] 2、肿瘤细胞与肿瘤特异性T细胞共培养
[0123] 第一组；按照说明书所示方法，先给上述1制备的肿瘤特异性T细胞标记 1yMCFSE，然后与200Gy照射过的B16-mock和B16-LSECtin共培养，细胞比例为5:1，包被 1yg/mlCD3抗体，共培养3天，流式分析仪检测T细胞的增殖情况。
[0124] 第二组：获取肿瘤特异性T细胞之后，与200Gy照射过的B16-mock和B16-LSECtin 共培养，细胞比例为5:1，包被1yg/mlCD3抗体，共培养1天，流式分析仪分选出肿瘤特异 性T细胞，使用westernblotting检测CDK2、CDK4、CDK6、P21W及P27 的表达水平。
[0125] 第H组；肿瘤特异性T细胞与200Gy照射过的B16-mock和B16-LSECtin共培养， 细胞比例为5:1，包被1yg/mlCD3抗体，共培养2天，使用ELISA试剂盒检测上清中干扰 素-Y的分泌情况。
[0126] 3、结果及分析
[0127] 第一组实验的结果如图9所示，肿瘤特异性T细胞与B16-LSECtin细胞共培养 后，其增殖效果显著弱于其与B16-mock细胞共培养后的增殖效果，说明肿瘤细胞过表达的 LSECtin能够抑制肿瘤特异性T细胞的增殖能力。
[0128] 第二组实验的结果如图10所示，肿瘤特异性T细胞与B16-LSECtin细胞共培 养后，其促进细胞周期相关分子的表达水平，例如CDK2、CDK4和CDK6等显著低于其与 B16-mock细胞共培养后的效果，另一方面，其抑制细胞周期相关分子的表达水平，例如P21 等显著高于其与B16-mock细胞共培养后的效果，说明肿瘤细胞过表达的LSECtin能够增长 肿瘤特异性T细胞的细胞周期，使肿瘤特异性T细胞细胞周期的G1期到S期的时间增长；
[0129] 第H组实验的结果如图11所示，肿瘤特异性T细胞与B16-LSECtin细胞共培养 后，其效应细胞因子干扰素-Y的分泌水平（89. 629 + 4. 459pg/ml)显著低于其与B16-mock 细胞共培养后干扰素-Y的分泌（124. 772 + 2. 167pg/ml)，说明肿瘤细胞过表达的LSECtin 能够抑制肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y，从而抑制肿瘤特异性T细胞的效应能力。
[0130]H、LSECtin在体内对肿瘤特异性T细胞效应功能的抑制
[0131] 1、小鼠足底免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞
[0132] 获取适龄巧7BL/6小鼠，足底免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞，每只小鼠免疫 5*1〇5个细胞。
[0133] 2、干扰素-Y胞内染色分析肿瘤特异性CD8+T细胞的效应功能
[0134] 免疫2周后，分离其肿瘤引流淋己结细胞（TDLN)，按照干扰素-Y胞内染色的方法 分析肿瘤特异性CD8+T细胞干扰素-Y的分泌情况。
[0135] 3、结果及分析
[013引如图12所示，给小鼠免疫B16-LSECtin细胞之后，相较于免疫B16-mock细胞的 小鼠来说，其肿瘤引流淋己结细胞分泌干扰素-Y的能力明显下降，说明肿瘤细胞表达的 LSECtin在体内能够抑制肿瘤特异性T细胞的效应功能。
[0137] 总之，LSECtin可W抑制肿瘤特异性T细胞的增殖、增长肿瘤特异性T细胞的细胞 周期和/或抑制肿瘤特异性T细胞分泌干扰素-Y;
[0138] 因此可W认为，抑制LSECtin活性的物质可W促进肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应或 促进肿瘤特异性T细胞干扰素-Y的产生。
【主权项】
1. 抑制LSECtin活性的物质在制备具有如下（a)、（b)、（c)中的至少一种功能的产品 中的应用： a) 治疗肿瘤或者抑制肿瘤生长； b) 促进肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应； c) 促进肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y; 所述LSECtin为如下（1)或（2): (1) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (2) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述抑制LSECtin活性的物质为抗LSECtin抗体或小分子抑制剂。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗LSECtin抗体为单克隆抗体或多 克隆抗体；所述抗LSECtin抗体具体为多克隆抗体。4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药品； 所述肿瘤为黑色素瘤。 5. LSECtin或其编码基因或含有LSECtin编码基因的重组载体在制备促进肿瘤生长产 品中的应用； 所述LSECtin为如下（1)或（2): (1) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (2) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于： 所述LSECtin编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于： 所述促进肿瘤生长通过如下1) -3)中至少一种实现： 1) 抑制肿瘤特异性T细胞的增殖； 2) 增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期； 3) 抑制肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y。8. 根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于： 所述增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期为使肿瘤特异性T细胞细胞周期的Gl期到S期的时间增长。9. 根据权利要求5-8中任一所述的应用，其特征在于： 所述产品为药物； 所述肿瘤为黑色素瘤。 10. LSECtin作为肿瘤免疫治疗的靶点； 或LSECtin作为靶点在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用；所述LSECtin的氨基酸序列为序列表中的序列1 ; 所述肿瘤具体为黑色素瘤。
【专利摘要】本发明公开了LSECtin可能作为黑色素瘤免疫治疗的靶点。本发明提供了抑制LSECtin活性的物质在制备具有如下（a）、（b）、（c）中的至少一种功能的产品中的应用：a）治疗肿瘤或者减缓肿瘤生长；b）促进肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应；c）促进肿瘤特异性T细胞干扰素-γ的产生。本发明证明，抑制LSECtin的活性的物质可以用于制备预防和/或治疗黑色素瘤的药品，而作为肿瘤免疫治疗的靶点；LSECtin在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗黑色素瘤产品。本发明具有较大的社会意义和经济价值。
【IPC分类】A61K39/395, A61K48/00, A61P35/00, A61K39/00
【公开号】CN104906575
【申请号】CN201410089832
【发明人】唐丽, 贺福初, 徐锋, 刘静
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月12日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及LSECtin作为黑色素瘤免疫治疗的祀点。
【背景技术】
[0002] 黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，恶性程度极高，占 皮肤肿瘤死亡病例的极大部分。多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜，也见于软脑膜和脉络膜。 其发病率随人种、地域，种族的不同而存有所差异，白种人的发病率远较黑种人高，居住在 澳大利亚昆±兰州的白种人其发病率高达17/10万，我国虽属黑色素瘤的低发区，但近年 来发病率却呈不断上升趋势。
[0003] 目前对于黑色素瘤的治疗手段主要包括；原发病灶的手术切除、放疗、化疗W及免 疫治疗。其中免疫治疗手段是近年来逐步发展起来的治疗黑色素瘤的有效手段。肿瘤免疫 学治疗的目的是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和 杀伤肿瘤细胞。肿瘤免疫学治疗的方法种类繁多，已与现代生物高科技技术结合，发展成为 继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式一肿瘤生物学治疗方法。肿瘤免疫治疗手 段也包括多种策略；（1)主动免疫；给机体输入具有抗原性的肿瘤疫苗，刺激机体产生特异 性抗肿瘤免疫，W达到治疗肿瘤、预防肿瘤转移和复发的目的；（2)免疫导向疗法；将具有 细胞毒作用的杀伤因子与单克隆抗体偶联制成"生物导弹"，并利用单抗能特异性结合肿瘤 抗原的特性使杀伤因子"导向"集中到肿瘤病灶，杀伤肿瘤细胞；（3)肿瘤过继免疫疗法；将 自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肤等激 活剂进行诱导、激活和扩增，然后转输给肿瘤患者，提高患者抗肿瘤免疫力，W达到治疗和 预防复发的目的；（4)细胞因子疗法：该疗法是近期随着高纯化或重组细胞因子的生产得 W实现。细胞因子疗法的原理是某些细胞因子注射体内后可调节、增强一种或多种免疫细 胞的功能，发挥更强的抗肿瘤免疫功能。目前临床常用的细胞因子有IL-2、TNF-a、IFN-g及 CSF等；（5)肿瘤的基因疗法；其原理是克隆某些可用于肿瘤治疗的目的基因，将目的基因 在体外转染受体细胞，然后回输体内，或直接将目的基因体内注射，使目的基因在体内有效 表达，增强体内抗肿瘤作用或改善肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫力。
[0004] 近年来，肿瘤的主动免疫策略应用较为广泛，美国食品和药品监督管理局（抑A) 2011年批准了CTLA4的抗体（Ipilimumab)用于治疗黑色素瘤患者。CTLA4是T细胞表面 的具有抑制T细胞免疫反应功能的跨膜分子，针对该一祀点的单克隆抗体，能够激活病人 的抗肿瘤免疫反应，从而减缓黑色素瘤的疾病进程。因为CTLA4具有非常重要的生理功能， 导致该一药物在治疗过程中有比较大的毒副作用。
[0005]LSECtin化iverSinusoidalElndothelialCellslectin)是II型跨膜糖蛋白，位 于人类19pl3. 3,是C型凝集素家族的新成员。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供抑制LSECtin活性的物质的应用。
[0007] 本发明提供了抑制LSECtin活性的物质在制备具有如下（a)、（b)、（c)中的至少一 种功能的产品中的应用：
[0008]a)治疗肿瘤或者抑制肿瘤生长；
[0009]b)促进肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应；
[0010] C)促进肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y;
[0011] 所述LSECtin为如下（1)或（2);
[0012] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0013] (2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
[0014] 上述应用中，所述抑制LSECtin活性的物质为抗LSECtin抗体或小分子抑制剂。
[0015] 上述应用中，所述抗LSECtin抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；所述抗LSECtin抗 体具体为多克隆抗体，所述多克隆抗体具体为兔抗鼠LSECtin多克隆抗体。
[0016] 上述应用中，所述广品为药品；
[0017] 所述肿瘤为黑色素瘤。
[0018]LSECtin或其编码基因或含有LSECtin编码基因的重组载体在制备促进肿瘤生长 产品中的应用也是本发明保护的范围；
[0019]所述LSECtin为如下（1)或（2);
[0020] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0021] (2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
[0022] 上述应用中，所述LSECtin编码基因的核巧酸序列为序列表中的序列2。
[0023] 上述应用中，所述促进肿瘤生长通过如下1) -3)中至少一种实现：
[0024] 1)抑巧IJ肿瘤特异性T细胞的增殖；
[00巧]2)增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期；
[0026] 3)抑制肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y。
[0027] 上述应用中，所述增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期为使肿瘤特异性T细胞细胞 周期的G1期到S期的时间增长；
[0028] 所述使肿瘤特异性T细胞细胞周期的G1期到S期的时间增长体现在抑制CDK2、 CDK4和/或CDK6的表达和/或促进P21的表达。
[0029] 上述应用中，所述产品为药物；
[0030] 所述肿瘤为黑色素瘤。
[0031]LSECtin作为肿瘤免疫治疗的祀点也是本发明保护的范围；
[0032] 或LSECtin作为祀点在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用； 所述LSECtin的氨基酸序列为序列表中的序列1;
[0033] 上述应用中，所述肿瘤具体为黑色素瘤。
[0034] 本发明通过实验证明；（1)黑色素瘤病人的肿瘤组织表达LSECtin;(2)小鼠黑色 素瘤细胞系B16细胞表达LSECtin;(3)B16细胞表达的LSECtin促进小鼠黑色素瘤的生 长，该一功能依赖于T细胞的存在；（4)B16细胞表达的LSECtin抑制肿瘤特异性T细胞的 增殖和效应功能。因此，本发明证明抑制LSECtin的活性的物质可W用于制备预防和/或 治疗黑色素瘤的药品，而作为肿瘤免疫治疗的祀点；LSECtin在筛选、开发和/或设计预防 和/或治疗黑色素瘤产品。本发明具有较大的社会意义和经济价值。
【附图说明】
[00巧]图1为检测黑色素瘤病人肿瘤组织LSECtin的表达。
[0036] 图2为检测小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞LSECtin的表达。
[0037] 图3为判定B16-mock和B16-LSECtin稳定株体外生长结果图。
[0038] 图4为野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞之后的肿瘤生长情况。
[0039] 图5为野生型小鼠免疫B16细胞后注射anti-LSECtin之后的肿瘤生长情况。
[0040] 图6为抗体清除小鼠体内CD4+和CD8+T细胞的结果。
[00川图7为清除小鼠CD4+和CD8+T细胞之后，野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞之后的肿瘤生长情况。
[0042] 图8为LSECtin在体外抑制肿瘤特异性T细胞的增殖。
[0043] 图9为LSECtin在体外劫持肿瘤特异性T细胞的细胞周期。
[0044] 图10为LSECtin在体外抑制肿瘤特异性T细胞的效应功能。
[0045] 图11为LSECtin在体内抑巧IJ肿瘤特异性T细胞的效应功能。
[0046] 图12为LSECtin促进肿瘤特异性CD8+T细胞干扰素-Y的分泌情况。
【具体实施方式】
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049]C57化/6小鼠；体重20 + 2克，6-8周，购自华 阜康公司。黑色素瘤病人芯片购西 安艾丽娜生物科技有限公司，货号是Me481a。小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞；购自中国医 学科学院细胞资源中也。RNA提取试剂盒；购自QIAGEN公司，货号是74104。cDNA合成试 剂盒；购自化rmantas公司，货号是K1622。DNA聚合酶：购自天根生化科技（北京）有限 公司，货号是KT201。SYBRGreen酶；购自T0Y0B0公司，货号为QPK-201。细胞转染试剂： 购自Invitrogen公司，货号是11668019。稳定株筛选试剂G418;购自Merck公司，货号是 345810。兔抗鼠LSECtin多克隆抗体（鼠源的LSECtin蛋白（氨基酸序列为序列1)免疫兔得 到的兔抗鼠LSECtin多克隆抗体)。阳标记的鼠源CD3抗体、APC标记的鼠源CD4和CD8抗体 和阳标记的鼠源CD8抗体；购自eBioscience公司，货号分别为12-0031、17-0041、17-0081 和12-0081。CFSE;购自eBioscience公司，货号是65-0850。小鼠干扰素-y抗体；购自 eBioscience公司，货号是17-7311。小鼠干扰素-Y检测化ISA试剂盒：购自eBioscience 公司，货号是88-7314。小鼠干扰素-Y检测化ISP0T试剂盒：购自M油tech公司，货号为 3321-2AW-P1US。抗原特异性肤段TRP-2180-188;购自Anaspec公司，货号是61058。小鼠 CD3 抗体；购自抓Biosciences公司，货号是 555273。CDK2、CDK4、CDK6、P21 和P27 抗体购 自SantaCruz,货号分别是SC-163、SC-260、SC-177、SC-397 和SC-528。
[0050] 实施例1、LSECtin的发现
[0051] 一、检测黑色素瘤病人肿瘤组织LSECtin表达
[0052] 从西安艾丽娜生物科技有限公司购入小鼠黑色素瘤芯片，按照常规的免疫组化方 法，使用小鼠抗人LSECtin单克隆抗体对芯片进行染色。
[0053] 结果如图1所示，图1展示的是其中代表性的阳性结果之一 ；1代表黑色素瘤组织 的肥染色的结果，2代表使用对照抗体对黑色素瘤组织进行免疫组化染色的结果，3代表使 用鼠抗人LSECtin单克隆抗体对黑色素瘤组织进行免疫组化染色的结果；表明，使用免疫 组化的方法能够检测到病人黑色素瘤组织表达LSECtin,多例病人的组织样品中LSECtin 表达呈阳性的比例在50%。
[0054] 二、检测小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞LSECtin表达
[00巧]1、PCR反应扩增小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞中的LSECtin
[0056] 先获取B16细胞，按照RNA提取试剂盒的方法，提取其RNA;按照cDNA合成试剂盒 的方法合成cDNA;使用DNA聚合酶开展聚合链式反应（PCR)扩增LSECtin。
[0057]上游引物；atgaacactggtgaatac,下游引物；ttagtagcaactgctcctctt。
[005引 WcDNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增。
[0059]PCR产物电泳结果如图2所示，使用LSECtin的特异引物能够从小鼠黑色素瘤细胞 系B16细胞cDNA模板中扩增出88化PLSECtin的条带(经过测序，该PCR产物为LSECtin 的基因，其核巧酸序列为序列表中序列1，编码的蛋白LSECtin的氨基酸序列为序列表中的 序列2。），说明B16细胞表达LSECtin。1代表DNA分子量标记，2代表空白模板对照的扩增 结果，3代表B16细胞cDNA的扩增结果。
[0060] 实施例2、LSECtin作为黑色素瘤免疫治疗的祀点
[0061]一、B16-mock和B16-LSECtin稳定株的构建
[0062] 获取B16细胞，按照转染试剂的说明书，给B16细胞分别转染PIRES2-EGFP (Clontech，6029-1)和pIRES2-EGFP-mLSECtinfulllength(将LSECtin编码基因（序 列2)插入载体PIRES2-EGFP的化eI和BglII酶切位点得到的重组载体。）质粒。添加 800yg/mlG418筛选，流式细胞分选仪分选获取带有绿色英光的细胞，重复五轮，最终获得 B16-mock和B16-LSECtin稳定株细胞。
[0063] 使用实时定量PCR的方法确认LSECtin过表达的B16-LSECtin稳定株，使用 SYBRGreen酶开展实时定量PCR实验检测LSECtin的表达量。
[0064] 具体如下：分别提取B16-mock和B16-LSECtin细胞的RNA，按照cDNA合成试 剂盒的方法合成cDM;扩增引物序列为；上游ATGGTGCATCATTCCACAGCCCCGAGTG，下游为 TGATTGTCAGAGGCCTGAACGAGCAGG。GAPDH内参引物序列如下；上游TGAACGGGAAGCTCACTGG，下 游GAGCTTGACAAAGTTGTCATTGAG。WB16 细胞为对照。
[0065]结果如图 3 所示，B16-LSECtin细胞的LSECtin表达量为 2471.700 + 509. 851， B16-mock细胞LSECtin表达量为 1. 000 + 0. 086，B16-LSECtin细胞中LSECtin的表达远远 高于B16-mock细胞，说明B16-LSECtin细胞为过表达LSECtin的细胞。
[0066]B16细胞的LSECtin表达量与B16-mock细胞无显著差异。
[0067] 分别获取对数生长状态的B16-mock和B16-LSECtin细胞，使用六孔板培养，每个 孔初始细胞数为1*1〇5个，每种细胞重复铺3个孔，总共设置4个时间点。分别在第1、2、3 和4天收集上述细胞，使用BioRad细胞计数仪分别计数，绘制细胞生长曲线。
[006引结果如图4所示，B16-mock和B16-LSECtin稳定株在体外生长速度没有差异，表 明过表达LSECtin对细胞株生长无影响。
[0069] 二、小鼠黑色素瘤模型
[0070] 1、肿瘤细胞的准备
[0071] 保证B16细胞或者B16-LSECtin和B16-mock稳定株正处于对数生长期，密度最好 不超过50%。弃掉培养基，用3ml膜酶轻轻冲洗培养瓶，弃掉。再加入3ml膜酶，轻轻摇晃 培养瓶，使得细胞完全脱落，注意不要让细胞在膜酶里存在过长时间。加入3ml新鲜预冷的 DMEM培养基，用移液器混匀成单细胞息液。将细胞转移到50ml离也管中，再加入40ml预冷 的DMEM培养基，完全中和膜酶，4°C500g离也lOmin。弃掉上清，在预冷的皿SS中息浮细 胞，获得终浓度为l-5*l〇7ml。将细胞浓度调整到2*l〇Vml。
[007引 2、接种小鼠
[007引将小鼠麻醉，按小鼠体重注射70mg/kg的戊己比妥轴。小鼠昏迷之后，重息细胞， 装满1ml注射器。用70%酒精湿润腹部皮肤，适量剪去毛发，将细胞缓慢皮下注射进去，每 只小鼠lOOy1细胞（105个细胞)，注射完成之后，应该隆起的现象。
[0074]上述细胞分别为B16、B16-LSECtin和B16-mock。
[007引 H、过表达LSECtin在促进小鼠黑色素瘤的生长中的应用
[0076]经上述二小鼠接种了B16-LSECtin和B16-mock，得到WT+B16-LSECtin组小鼠、 WT+B16-mock组小鼠，在接种细胞后，第8天开始观察，之后隔天观察一次，使用游标卡尺分 别测量小鼠肿瘤的长径a和短径b，肿瘤体积计算公式为0. 5相b2。直到肿瘤体积大于2mm3 时，处死小鼠。
[0077] 结果如图5所示，
[007引在第8、10、12、14、16、18天，WT+B16-mock组小鼠的肿瘤体积分别为 25. 785 + 5. 148、42. 408 + 5. 718、226. 419 + 59. 687、355. 146 + 56. 607、455. 176 + 74. 325、 673. 596 + 72. 459 (单位为臟3);
[0079] 在第8 、10、12、14、16、18天，WT+B16-LSECtin组小鼠的肿瘤体积分别 为 41. 128 + 4. 071、111. 171 ± 17. 505、291. 042 + 53. 488、527. 990 + 128. 961、 757. 904+138. 026、1135. 632 + 182. 637 (单位为臟3).
[0080] 给小鼠接种B16-LSECtin细胞之后，小鼠黑色素瘤生长更加迅速，说明过表达 LSECtin能够促进小鼠黑色素瘤的生长。
[0081] 四、抗LSECtin抗体在减缓小鼠黑色素瘤的生长中的应用
[0082] 经上述二小鼠接种了B16,得到B16组小鼠，分为两部分，一部分在接种肿瘤细胞 之后的第3、6和9天，每只小鼠分别腹腔注射兔抗鼠LSECtin多克隆抗体，剂量是200yg 每只小鼠，得到WT+B16+anti-LSECtin小组；
[0083] 另一个部分在接种肿瘤细胞之后的第3、6和9天，每只小鼠分别腹腔注射兔IgG (取家兔血清，进行ProteinA/G纯化后得到兔IgG)作为对照，剂量是200yg每只小鼠，得 到WT+B16+R油bitIgG小组。
[0084] 注射后，第8天开始观察，之后隔天观察一次，使用游标卡尺分别测量小鼠肿瘤的 长径a和短径b，肿瘤体积计算公式为0. 5相b2。直到肿瘤体积大于2mm3时，处死小鼠。
[00财 结果如图6所示，在第16、18、20、22、24天，WT+B16+anti-LSECtin小组小鼠的 肿瘤体积分别为 14. 579 + 13. 479、54. 047 + 32. 422U14. 297 + 49. 195U35. 737 + 12. 303、 396. 208 + 37. 193 (单位为mm3);
[0086] 在第16、18、20、22、24天，WT+B16+R油bitIgG小组小鼠的肿瘤体积分 别为 52. 667 + 22. 302、215. 460 + 99. 032、452. 230 + 152. 84U944. 964 + 272. 526、 1781.949 + 489. 685 (单位为臟3);
[0087] 可W看出，注射兔抗鼠LSECtin多克隆抗体，可W有效减缓小鼠黑色素瘤的生长， 说明针对于LSECtin的抗体能够减缓小鼠黑色素瘤的生长。
[0088]LSECtin的抗体和LSECtin结合，从而使LSECtin无法与其它分子结合进行作用， 因此LSECtin的抗体抑制LSECtin活性。
[0089] 实施例3、LSECtin通过抑制抗肿瘤免疫反应促进黑色素瘤的生长
[0090] 一、使用抗体清除小鼠体内CD4+和CD8+T细胞
[00川 1、肿瘤细胞的准备
[0092] 保证B16细胞或者B16-LSECtin和B16-mock稳定株正处于对数生长期，密度最好 不超过50%。弃掉培养基，用3ml膜酶轻轻冲洗培养瓶，弃掉。再加入3ml膜酶，轻轻摇晃 培养瓶，使得细胞完全脱落，注意不要让细胞在膜酶里存在过长时间。加入3ml新鲜预冷的 DMEM培养基，用移液器混匀成单细胞息液。将细胞转移到50ml离也管中，再加入40ml预冷 的DMEM培养基，完全中和膜酶，4°C500g离也lOmin。弃掉上清，在预冷的皿SS中息浮细 胞，获得终浓度为l-5*l〇7ml。将细胞浓度调整到2*l〇Vml。
[0093] 2、小鼠腹腔注射anti-CD4和anti-CD8抗体
[0094] 选取适龄巧7BL/6小鼠，腹腔注射大鼠抗小鼠CD4抗体（aCD4,购自 eBioscience,货号为16-0041)和大鼠抗小鼠CD8抗体（aCD8,购自eBioscience,货号为 16-0081)，每只小鼠100yg，每隔4天，重复注射。W兔IgG为对照抗体。
[0095] 获取注射过大鼠抗小鼠CD4和CD8抗体的小鼠，常规方法分离其脾细胞，分别标记 PE标记的鼠源CD3抗体W及APC标记的鼠源CD4抗体或者APC标记的鼠源CD8抗体，流式 细胞仪检测相应细胞群的阳性比例。
[009引如图7所示，注射对照抗体的小鼠，其脾细胞中CD4+和CD8+T细胞的比例正常进 射清除抗体(大鼠抗小鼠CD4抗体和大鼠抗小鼠CD8抗体)的小鼠，其脾细胞中CD4+和CD8+T 细胞的比例几乎为零，说明清除抗体能够有效清除小鼠体内的CD4+和CD8+T细胞。
[0097] 二、LSECtin通过抑制肿瘤特异性T细胞的效应功能来促进小鼠黑色素瘤的生长
[009引1、肿瘤细胞的准备
[0099] 将B16-LSECtin和B16-mock按照上述培养，且使细胞浓度调整到2*l〇Vml。
[0100] 2、小鼠腹腔注射anti-CD4和anti-CD8抗体
[0101] 选取适龄巧7BL/6小鼠，腹腔注射大鼠抗小鼠CD4抗体和大鼠抗小鼠CD8抗体，每 只小鼠100yg，每隔4天，重复注射。
[0102] 3、接种小鼠
[010引将小鼠麻醉，按小鼠体重注射70mg/kg的戊己比妥轴。小鼠昏迷之后，重息细胞， 装满1ml注射器。用70%酒精湿润腹部皮肤，适量剪去毛发，将细胞缓慢皮下注射进去，每 只小鼠lOOy1细胞（105个细胞)，注射完成之后，应该隆起的现象。
[0104]得到IgG+B16-mock组小鼠、IgG+B16-LSECtin组小鼠、aCD4+B16-mock组小鼠、 aCD4+B16-LSECtin组小鼠、aCD8+B16-mock组小鼠、aCD8+B16-LSECtin组小鼠。
[0105] 4、小鼠肿瘤体积观察和测量
[0106] 接种细胞后，第8天开始观察上述四组小鼠，之后隔天观察一次，使用游标卡尺分 别测量小鼠肿瘤的长径a和短径b，肿瘤体积计算公式为0. 5相b2。直到肿瘤体积大于2mm3 时，处死小鼠。
[0107] 结果如图8所示，
[010引左图中：
[0109] IgG+B16-mock组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 19. 828 + 8. 896、62. 482 + 16. 904、93. 202 + 30. 304、246. 675 + 96. 615 (单位为臟3);
[0110] IgG+B16-LSECtin组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 47. 962 + 11. 153U10. 190 + 24. 057、238. 205 + 33. 88U670. 643 + 116. 672 (单位为臟3);
[01川a CD4+B16-mock组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 19. 128 + 12. 21U71.日48 + 29. 565U27. 500 + 52. 686、257. 496 + 125. 520 (单位为臟3);
[011引aCD4+B16-LSECtin组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 25. 960 + 9. 318、71. 167 + 23. 767U00. 414 + 22. 018U53. 537 + 38. 286 (单位为臟3);
[0113] 右图中：
[0114] IgG+B16-mock组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 19. 828 + 8. 896、62. 482 + 16. 904、93. 202 + 30. 304、246. 675 + 96. 615 (单位为臟3);
[01巧]IgG+B16-LSECtin组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 47. 962 + 11. 153U10. 190 + 24. 057、238. 205 + 33. 88U670. 643 + 116. 672 (单位为臟3);
[0116] a CD8+B16-mock组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 23. 979 + 12. 307、93. 804 + 20. 286、155. 263 + 40. 993、463 . 604+108. 768 (单位为臟3);
[0117]aCD8+B16-LSECtin组小鼠在接种细胞后第10、12、14、16天肿瘤体积分别为 ：M. 688 + 11. 136U14. 315 + 23. 054U55. 235 + 31. 902、523. 215 + 99. 469 (单位为臟3)。
[011引清除小鼠体内CD4+ (左图)和CD8+ (右图)T细胞之后，肿瘤细胞表达的LSECtin并 不能如图5所示，能够促进小鼠黑色素瘤的生长，说明肿瘤细胞表达的LSECtin促进小鼠黑 色素瘤的生长，需要CD4+和CD8+T细胞的存在，该就提示很有可能肿瘤细胞表达的LSECtin 通过抑制肿瘤特异性T细胞的效应功能来促进小鼠黑色素瘤的生长。
[0119] 二、LSECtin在体外对肿瘤特异性T细胞增殖和效应功能的抑制
[0120] 1、肿瘤特异性T细胞的获取
[012。获取B16细胞，200Gy照射。C57化/6小鼠皮下注射照射过的B16细胞，每只小鼠 注射5*105个细胞。2周W后，取上述小鼠脾细胞，l0μg/ml TRP-2刺激4-6天。收集上述 细胞，即为肿瘤特异性T细胞，用于下一步实验。
[0122] 2、肿瘤细胞与肿瘤特异性T细胞共培养
[0123] 第一组；按照说明书所示方法，先给上述1制备的肿瘤特异性T细胞标记 1yMCFSE，然后与200Gy照射过的B16-mock和B16-LSECtin共培养，细胞比例为5:1，包被 1yg/mlCD3抗体，共培养3天，流式分析仪检测T细胞的增殖情况。
[0124] 第二组：获取肿瘤特异性T细胞之后，与200Gy照射过的B16-mock和B16-LSECtin 共培养，细胞比例为5:1，包被1yg/mlCD3抗体，共培养1天，流式分析仪分选出肿瘤特异 性T细胞，使用westernblotting检测CDK2、CDK4、CDK6、P21W及P27 的表达水平。
[0125] 第H组；肿瘤特异性T细胞与200Gy照射过的B16-mock和B16-LSECtin共培养， 细胞比例为5:1，包被1yg/mlCD3抗体，共培养2天，使用ELISA试剂盒检测上清中干扰 素-Y的分泌情况。
[0126] 3、结果及分析
[0127] 第一组实验的结果如图9所示，肿瘤特异性T细胞与B16-LSECtin细胞共培养 后，其增殖效果显著弱于其与B16-mock细胞共培养后的增殖效果，说明肿瘤细胞过表达的 LSECtin能够抑制肿瘤特异性T细胞的增殖能力。
[0128] 第二组实验的结果如图10所示，肿瘤特异性T细胞与B16-LSECtin细胞共培 养后，其促进细胞周期相关分子的表达水平，例如CDK2、CDK4和CDK6等显著低于其与 B16-mock细胞共培养后的效果，另一方面，其抑制细胞周期相关分子的表达水平，例如P21 等显著高于其与B16-mock细胞共培养后的效果，说明肿瘤细胞过表达的LSECtin能够增长 肿瘤特异性T细胞的细胞周期，使肿瘤特异性T细胞细胞周期的G1期到S期的时间增长；
[0129] 第H组实验的结果如图11所示，肿瘤特异性T细胞与B16-LSECtin细胞共培养 后，其效应细胞因子干扰素-Y的分泌水平（89. 629 + 4. 459pg/ml)显著低于其与B16-mock 细胞共培养后干扰素-Y的分泌（124. 772 + 2. 167pg/ml)，说明肿瘤细胞过表达的LSECtin 能够抑制肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y，从而抑制肿瘤特异性T细胞的效应能力。
[0130]H、LSECtin在体内对肿瘤特异性T细胞效应功能的抑制
[0131] 1、小鼠足底免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞
[0132] 获取适龄巧7BL/6小鼠，足底免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞，每只小鼠免疫 5*1〇5个细胞。
[0133] 2、干扰素-Y胞内染色分析肿瘤特异性CD8+T细胞的效应功能
[0134] 免疫2周后，分离其肿瘤引流淋己结细胞（TDLN)，按照干扰素-Y胞内染色的方法 分析肿瘤特异性CD8+T细胞干扰素-Y的分泌情况。
[0135] 3、结果及分析
[013引如图12所示，给小鼠免疫B16-LSECtin细胞之后，相较于免疫B16-mock细胞的 小鼠来说，其肿瘤引流淋己结细胞分泌干扰素-Y的能力明显下降，说明肿瘤细胞表达的 LSECtin在体内能够抑制肿瘤特异性T细胞的效应功能。
[0137] 总之，LSECtin可W抑制肿瘤特异性T细胞的增殖、增长肿瘤特异性T细胞的细胞 周期和/或抑制肿瘤特异性T细胞分泌干扰素-Y;
[0138] 因此可W认为，抑制LSECtin活性的物质可W促进肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应或 促进肿瘤特异性T细胞干扰素-Y的产生。
【主权项】
1. 抑制LSECtin活性的物质在制备具有如下（a)、（b)、（c)中的至少一种功能的产品 中的应用： a) 治疗肿瘤或者抑制肿瘤生长； b) 促进肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应； c) 促进肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y; 所述LSECtin为如下（1)或（2): (1) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (2) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述抑制LSECtin活性的物质为抗LSECtin抗体或小分子抑制剂。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗LSECtin抗体为单克隆抗体或多 克隆抗体；所述抗LSECtin抗体具体为多克隆抗体。4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药品； 所述肿瘤为黑色素瘤。 5. LSECtin或其编码基因或含有LSECtin编码基因的重组载体在制备促进肿瘤生长产 品中的应用； 所述LSECtin为如下（1)或（2): (1) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (2) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于： 所述LSECtin编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于： 所述促进肿瘤生长通过如下1) -3)中至少一种实现： 1) 抑制肿瘤特异性T细胞的增殖； 2) 增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期； 3) 抑制肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y。8. 根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于： 所述增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期为使肿瘤特异性T细胞细胞周期的Gl期到S期的时间增长。9. 根据权利要求5-8中任一所述的应用，其特征在于： 所述产品为药物； 所述肿瘤为黑色素瘤。 10. LSECtin作为肿瘤免疫治疗的靶点； 或LSECtin作为靶点在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用；所述LSECtin的氨基酸序列为序列表中的序列1 ; 所述肿瘤具体为黑色素瘤。
【专利摘要】本发明公开了LSECtin可能作为黑色素瘤免疫治疗的靶点。本发明提供了抑制LSECtin活性的物质在制备具有如下（a）、（b）、（c）中的至少一种功能的产品中的应用：a）治疗肿瘤或者减缓肿瘤生长；b）促进肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应；c）促进肿瘤特异性T细胞干扰素-γ的产生。本发明证明，抑制LSECtin的活性的物质可以用于制备预防和/或治疗黑色素瘤的药品，而作为肿瘤免疫治疗的靶点；LSECtin在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗黑色素瘤产品。本发明具有较大的社会意义和经济价值。
【IPC分类】A61K39/395, A61K48/00, A61P35/00, A61K39/00
【公开号】CN104906575
【申请号】CN201410089832
【发明人】唐丽, 贺福初, 徐锋, 刘静
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月12日
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