质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用
质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及质子泵抑制剂的新用途，尤其涉及质子泵抑制剂在制备抗肝细胞癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞癌是常见的恶性肿瘤，居我国恶性肿瘤发生率的第四位。肝细胞癌恶性程度高，病情发展快，预后差，平均生存期6-8月，其死亡率占我国恶性肿瘤的第二位，仅次于肺癌。由于肝细胞癌对临床上使用的化疗药物均不敏感，目前临床上治疗肝细胞癌有效的方法仍然是外科手术治疗。但由于肝细胞癌病情发展快，大多数患者就诊时由于较差的肝功能情况、基础的肝脏疾病或远处转移的出现，已经不适宜进行外科手术治疗。即使少数能进行外科手术治疗的病人，手术后仍然具有较高的复发率。而且，目前对肝细胞癌手术后的复发仍无有效的治疗方法。近年来，随着肿瘤细胞分子生物学研究的进展，人们在研究针对肝细胞癌的分子靶向治疗。开发了以索拉非尼(Sorafenib)为代表的一系列以酪氨酸激酶受体为治疗靶点的药物。目前，索拉非尼(是血管内皮生长因子、血小板源生长因子、表皮生长因子和胰岛素生长因子等多种激酶的抑制剂)已经被美国FDA批准作为肝细胞癌的治疗。但广泛的临床试验研究发现，与安慰剂相比，索拉非尼延长病人的生存期仅仅3月。而且，索拉非尼价格昂贵。因此，对于具有可怕预后的肝细胞癌，寻找其有效的治疗药物仍然是迫切需要的。
[0003]研究表明肝细胞癌的发生是一个复杂的过程，累及了很多细胞分子信号的改变和基因的改变，很多因素共同作用最终导致了肝细胞癌的发生发展。不管恶性肿瘤是由什么原因引起以及它发生的机制如何，大量的证据表明肿瘤细胞的酸性微环境在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。肿瘤细胞通常生长于低氧微环境，而且具有高糖酵解活性，会导致产生大量酸性代谢产物。但研究表明肿瘤细胞是处于细胞外偏酸而细胞内偏碱的微环境。这就需要肿瘤细胞能及时的排除细胞内产生的酸到细胞外以维持有利于肿瘤细胞生长、侵袭、转移的细胞外酸性微环境。在肿瘤细胞有四种主要的细胞PH调节机制:钠氢交换体、碳酸氢盐转运剂、质子-乳酸根共输体和质子泵。而质子泵Vacuolar H+-ATPase (V-ATPase)被认为是在肿瘤细胞中重要的PH调节机制。
[0004]质子泵抑制剂能有效的抑制胃粘膜壁细胞的H+-K+-ATPase。第一个质子泵抑制剂奥美拉唑(Omeprazole)由瑞典阿斯利康公司开发在1988年首先应用于临床治疗消化性溃瘍，随后各国相继开发了兰索拉唑(Lansoprazole)、泮托拉唑(Pantoprazole)、雷贝拉唑(Rabeprazole)、埃索美拉唑(Esomeprazole)、艾普拉唑(Iaprazole)等。由于这类药物能抑制胃粘膜壁细胞的H+-K+-ATPase，从而有效的抑制胃酸分泌，目前临床上已经广泛用于胃酸相关性疾病(如消化性溃疡、胃食道反流病等)的治疗。我们的研究发现质子泵抑制剂除了抑制质子泵H+-K+-ATPase外，也能有效的抑制质子泵V-ATPase。
[0005]但迄今为止，未发现质子泵抑制剂在抗肝细胞癌药物中的应用。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用。
[0007]本发明提出质子泵抑制剂能有效的抑制肝细胞癌细胞的增殖和生长，促进肝细胞癌细胞的凋亡，可以用于制备治疗肝细胞癌的新的药物。
[0008]本发明是这样实现的:
1.本发明通过细胞实验的结果显示质子泵抑制剂泮托拉唑抑制了人肝细胞癌细胞的增殖和生长；
2.通过动物模型实验的结果显示质子泵抑制剂泮托拉唑抑制了人肝细胞肝癌细胞在肝脏内的生长，抑制了化学物质诱导的小鼠肝细胞癌的发生。
[0009]3.通过进一步的细胞实验的结果显示质子泵抑制剂泮托拉唑明显的诱导了人肝细胞癌细胞的凋亡。
[0010]因此，本发明提出了质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用的技术方案。
[0011]本发明的技术效果是:本发明发现质子泵抑制剂能有效地抑制肝细胞癌细胞的增殖和生长，抑制肝细胞癌的发生，诱导肝细胞癌细胞的凋亡。质子泵抑制剂是可以应用于制备能有效治疗肝细胞癌的药物，而质子泵抑制剂在制备抗肝细胞癌药物中的用途属于首次公开，而且其在对于抑制人肝细胞癌细胞的增殖和生长方面有意想不到的作用，因此具备了突出的实质性特点和显著的进步。
【附图说明】
[0012]图1展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对人肝细胞癌细胞H印G2、SMMC7721、Huh7、SK-HEP-1、PLC/PRF/5、MHCC-9H、MHHCC-97L 和 HCCLM3 细胞增殖的影响。
[0013]图2展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞克隆形成能力和生长曲线的影响。
[0014]图3展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对人的肝细胞癌细胞SMMC7721细胞在小鼠体内生长和对小鼠肝细胞癌发生的影响。
[0015]图4展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞SMMC7721和!fepG2凋亡的影响。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
[0017]实施例1:
本发明所涉及的质子泵抑制剂片剂的制备:
取质子泵抑制剂泮托拉唑或其它质子泵抑制剂400g，加入制备片剂的常规辅料(食用淀粉)100g，混匀，并用常规压片机制备成片剂1000片。
[0018]实施例2:
本发明所涉及的质子泵抑制剂胶囊剂的制备: 取质子泵抑制剂泮托拉唑或其它质子泵抑制剂400g，加入制备胶囊剂的常规辅料(食用淀粉)100g，混匀，并装胶囊制备成胶囊剂1000粒。
[0019]实施例3:本发明所涉及的质子泵抑制剂丸剂的制备:
取质子泵抑制剂泮托拉唑或其它质子泵抑制剂400g，加入制备丸剂的常规辅料(食用淀粉)100g，混匀，制备成丸剂1000丸。
[0020]实施例:4:
本发明所涉及的质子泵抑制剂注射液的制备:
取质子泵抑制剂泮托拉唑或其它质子泵抑制剂0.5g,加入2ml无菌的溶液制备成泮托拉唑或其它质子泵抑制剂注射液。
[0021]下面通过药效学实验来进一步说明质子泵抑制剂在抗肝细胞癌药物中的活性。
[0022]实验例1:质子泵抑制剂对人的肝细胞癌细胞增殖的影响:
我们选用了 8株人的肝细胞癌细胞株，分别在体外与不同剂量的质子泵抑制剂泮托拉唑(P)培养 24、48 和 72 小时，通过 MTT【(4，5-Dimethylthiazol_2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide, 3- (4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐】方法分析不同剂量的泮托拉唑在与这些细胞作用不同时间后对这些肝细胞癌细胞增殖的影响。MTT方法是一种常用检测细胞存活和增殖的方法，已广泛用于大规模 的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验等。结果显示泮托拉唑呈剂量和时间依懒性地抑制了人的肝细胞癌细胞的增殖(见图1)。
[0023]图1:展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对人肝细胞癌细胞H印G2、SMMC7721、Huh7、SK-HEP-1、PLC/PRF/5、MHCC-9H、MHHCC-97L 和 HCCLM3 细胞增殖的影响。泮托拉唑(P)呈剂量和时间依赖性地抑制了人肝细胞癌细胞的增殖。在每一系列中η = 8。
[0024]实验例2:质子泵抑制剂对人的肝细胞癌细胞的生长曲线和克隆形成能力的影响:
细胞生长曲线是判断细胞活力的重要指标。我们首先通过细胞计数方法研究了质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞SMMC7721和!fepG2的细胞生长曲线的影响。结果显示，随着泮托拉唑浓度的升高，肝细胞癌细胞SMMC7721和H印G2的生长速率明显下降。(见图2中A部分)。
[0025]肿瘤的生长、转移、复发均以克隆原细胞(干细胞)的增殖为基础。集落形成实验反映了单个克隆活细胞的增殖能力，是测定抗癌药活性最可靠的指标。我们进一步选用人的肝细胞癌细胞SMMC7721和H印G2通过平板克隆形成实验研究质子泵抑制剂对肝细胞癌细胞克隆形成能力的影响。在细胞与质子泵抑制剂泮托拉唑作用2周后，结果显示随着泮托拉唑浓度的升高，人肝细胞癌细胞SMMC7721和HepG2的集落形成能力逐渐下降。在泮托拉唑160 μ M组，在两个细胞株都完全没有集落形成(见图2中B部分)。提示质子泵抑制剂对人肝细胞肝细胞H印G2及SMMC-7721的克隆原细胞具有明显抑制作用。
[0026]图2: A部分:质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞H印G2 (Al)和SMMC7721(Α2)生长曲线的影响。泮托拉唑剂量依赖地抑制了 SMMC7721和!fepG2细胞的生长速率。在每一系列中，η = 6。与对照组相比，#Α0.05，#Κ0.01。B部分:泮托拉唑对肝细胞癌细胞H印G2 (BI)和SMMC7721 (Β2)克隆形成能力的影响。Top panel:细胞克隆形成能力的代表性的图。Bottom panel:各组之间克隆形成数量的比较。泮托拉唑剂量依赖地抑制了 SMMC7721和IfepG2细胞的克隆形成能力。在160μΜ组，SMMC7721和！fepG2细胞均没有克隆的形成。在每一系列中，η = 8。与对照组相比，*代0.05，#代0.01。
[0027]实验例3:质子泵抑制剂对肝细胞癌细胞体内生长和肝细胞癌发生的影响:
为了观察质子泵抑制剂对人的肝细胞癌细胞体内生长的影响。我们用裸鼠建立肝细胞癌的异体移植模型。将人的肝细胞癌细胞SMMC7721细胞接种于裸鼠背部的皮下。在移植后4天，当裸鼠移植部位的肿瘤形成后，将移植瘤已经形成的裸鼠随机分为对照组以及质子泵抑制剂泮托拉唑20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg组,每组系列10只裸鼠。将泮托拉唑按20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg或对照媒剂,小鼠腹腔内给予,每12小时一次。每3天观察一次，测量移植在裸鼠背部的肿瘤组织的大小，在给予泮托拉唑后30天处死小鼠。我们的结果显示质子泵抑制剂泮托拉唑呈剂量依赖地抑制了人的肝细胞癌细胞SMMC7721细胞在裸鼠体内的生长(见图3A)。
[0028]为了进一步研究质子泵抑制剂对肝细胞癌发生的影响，我们应用C57BL6小鼠，用二甲硝胺(diethylnitrosamine)和四氯化碳建立化学诱导的肝细胞肝癌动物模型,在建立模型后3月，将小鼠随机分为对照组以及质子泵抑制剂泮托拉唑20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg组,每组系列20只小鼠。将泮托拉唑按20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg或对照媒剂,小鼠腹腔内给予，每12小时一次，于给药后60天，处死小鼠，检查小鼠肝脏内肿瘤的发生情况。结果显示在对照组有16只小鼠的肝脏内发生了肿瘤，且瘤体较大，多发。而在泮托拉唑20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg组,分别只有8只、5只和5只小鼠发生了肿瘤,且瘤体较小(见图3中B部分)。
[0029]图3: A部分:质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞SMMC7721细胞在体内生长的影响。左侧:为各组的瘤体的图像。右侧:为各组肿瘤大小的比较。在每一系列中η =10。与对照组相比，**Κ0.01。泮托拉唑呈剂量依赖地抑制了人的肝细胞癌细胞SMMC7721在裸鼠体内的生长。B部分:质子泵抑制剂泮托拉唑对小鼠肝细胞癌发生的影响。左侧:为各组的肝细胞癌发生的代表性图像。右侧:为各组肝细胞癌发生率的比较。在每组中η=20，与对照组相比，林代0.01。
[0030]实验例4:质子泵抑制剂对肝细胞癌细胞凋亡的影响:
为了了解质子泵抑制剂对肝细胞癌细胞凋亡的影响，我们通过流式细胞仪检测技术和TUNEL染色技术研究了质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞SMMC7721和H印G2早期和晚期凋亡的影响。在SMMC7721和!fepG2细胞与泮托拉唑320 μ M作用24小时后用流式细胞仪检测细胞的早期凋亡。在SMMC7721和HepG2细胞与泮托拉唑320 μ M作用48小时后用TUNEL染色法检测细胞的晚期凋亡。结果显示泮托拉唑明显的诱导了 SMMC7721和H印62细胞的凋亡(见图4)。
[0031]图4:Α部分:流式细胞仪检测质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞IfepG2(Al)和SMMC7721 (A2)早期凋亡的影响。Top panel:对照组和泮托拉唑(P)组的代表性的流式细胞仪检测图。Bottom panel:对照组和泮托拉唑(P)组结果的比较。B部分:TUNEL染色法检测质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞H印G2 (BI)和SMMC7721 (B2)晚期凋亡的影响。Top panel:对照组和泮托拉唑(P)组TUNEL染色的代表性的图。Bottom panel:对照组和泮托拉唑(P)组结果的比较。在每一系列中n=8,与对照组相比，01。
[0032]这些结果表明质子泵抑制剂泮托拉唑能有效地抑制肝细胞癌细胞的增殖和生长，抑制肝细胞癌的发生，诱导肝细胞癌细胞的凋亡。质子泵抑制剂制备出能有效治疗肝细胞癌的药物是可行的。
【主权项】
1.质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用，本发明发现质子泵抑制剂能有效地抑制肝细胞癌细胞的增殖和生长，抑制肝细胞癌的发生，诱导肝细胞癌细胞的凋亡。质子泵抑制剂是可以应用于制备能有效治疗肝细胞癌的药物，而质子泵抑制剂在制备抗肝细胞癌药物中的用途属于首次公开，而且其在对于抑制人肝细胞癌细胞的增殖和生长方面有意想不到的作用。
【IPC分类】A61K45/00, A61K31/4439, A61P35/00
【公开号】CN104906578
【申请号】CN201510060273
【发明人】庹必光
【申请人】遵义医学院附属医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年2月5日
【技术领域】
[0001]本发明涉及质子泵抑制剂的新用途，尤其涉及质子泵抑制剂在制备抗肝细胞癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞癌是常见的恶性肿瘤，居我国恶性肿瘤发生率的第四位。肝细胞癌恶性程度高，病情发展快，预后差，平均生存期6-8月，其死亡率占我国恶性肿瘤的第二位，仅次于肺癌。由于肝细胞癌对临床上使用的化疗药物均不敏感，目前临床上治疗肝细胞癌有效的方法仍然是外科手术治疗。但由于肝细胞癌病情发展快，大多数患者就诊时由于较差的肝功能情况、基础的肝脏疾病或远处转移的出现，已经不适宜进行外科手术治疗。即使少数能进行外科手术治疗的病人，手术后仍然具有较高的复发率。而且，目前对肝细胞癌手术后的复发仍无有效的治疗方法。近年来，随着肿瘤细胞分子生物学研究的进展，人们在研究针对肝细胞癌的分子靶向治疗。开发了以索拉非尼(Sorafenib)为代表的一系列以酪氨酸激酶受体为治疗靶点的药物。目前，索拉非尼(是血管内皮生长因子、血小板源生长因子、表皮生长因子和胰岛素生长因子等多种激酶的抑制剂)已经被美国FDA批准作为肝细胞癌的治疗。但广泛的临床试验研究发现，与安慰剂相比，索拉非尼延长病人的生存期仅仅3月。而且，索拉非尼价格昂贵。因此，对于具有可怕预后的肝细胞癌，寻找其有效的治疗药物仍然是迫切需要的。
[0003]研究表明肝细胞癌的发生是一个复杂的过程，累及了很多细胞分子信号的改变和基因的改变，很多因素共同作用最终导致了肝细胞癌的发生发展。不管恶性肿瘤是由什么原因引起以及它发生的机制如何，大量的证据表明肿瘤细胞的酸性微环境在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。肿瘤细胞通常生长于低氧微环境，而且具有高糖酵解活性，会导致产生大量酸性代谢产物。但研究表明肿瘤细胞是处于细胞外偏酸而细胞内偏碱的微环境。这就需要肿瘤细胞能及时的排除细胞内产生的酸到细胞外以维持有利于肿瘤细胞生长、侵袭、转移的细胞外酸性微环境。在肿瘤细胞有四种主要的细胞PH调节机制:钠氢交换体、碳酸氢盐转运剂、质子-乳酸根共输体和质子泵。而质子泵Vacuolar H+-ATPase (V-ATPase)被认为是在肿瘤细胞中重要的PH调节机制。
[0004]质子泵抑制剂能有效的抑制胃粘膜壁细胞的H+-K+-ATPase。第一个质子泵抑制剂奥美拉唑(Omeprazole)由瑞典阿斯利康公司开发在1988年首先应用于临床治疗消化性溃瘍，随后各国相继开发了兰索拉唑(Lansoprazole)、泮托拉唑(Pantoprazole)、雷贝拉唑(Rabeprazole)、埃索美拉唑(Esomeprazole)、艾普拉唑(Iaprazole)等。由于这类药物能抑制胃粘膜壁细胞的H+-K+-ATPase，从而有效的抑制胃酸分泌，目前临床上已经广泛用于胃酸相关性疾病(如消化性溃疡、胃食道反流病等)的治疗。我们的研究发现质子泵抑制剂除了抑制质子泵H+-K+-ATPase外，也能有效的抑制质子泵V-ATPase。
[0005]但迄今为止，未发现质子泵抑制剂在抗肝细胞癌药物中的应用。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用。
[0007]本发明提出质子泵抑制剂能有效的抑制肝细胞癌细胞的增殖和生长，促进肝细胞癌细胞的凋亡，可以用于制备治疗肝细胞癌的新的药物。
[0008]本发明是这样实现的:
1.本发明通过细胞实验的结果显示质子泵抑制剂泮托拉唑抑制了人肝细胞癌细胞的增殖和生长；
2.通过动物模型实验的结果显示质子泵抑制剂泮托拉唑抑制了人肝细胞肝癌细胞在肝脏内的生长，抑制了化学物质诱导的小鼠肝细胞癌的发生。
[0009]3.通过进一步的细胞实验的结果显示质子泵抑制剂泮托拉唑明显的诱导了人肝细胞癌细胞的凋亡。
[0010]因此，本发明提出了质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用的技术方案。
[0011]本发明的技术效果是:本发明发现质子泵抑制剂能有效地抑制肝细胞癌细胞的增殖和生长，抑制肝细胞癌的发生，诱导肝细胞癌细胞的凋亡。质子泵抑制剂是可以应用于制备能有效治疗肝细胞癌的药物，而质子泵抑制剂在制备抗肝细胞癌药物中的用途属于首次公开，而且其在对于抑制人肝细胞癌细胞的增殖和生长方面有意想不到的作用，因此具备了突出的实质性特点和显著的进步。
【附图说明】
[0012]图1展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对人肝细胞癌细胞H印G2、SMMC7721、Huh7、SK-HEP-1、PLC/PRF/5、MHCC-9H、MHHCC-97L 和 HCCLM3 细胞增殖的影响。
[0013]图2展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞克隆形成能力和生长曲线的影响。
[0014]图3展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对人的肝细胞癌细胞SMMC7721细胞在小鼠体内生长和对小鼠肝细胞癌发生的影响。
[0015]图4展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞SMMC7721和!fepG2凋亡的影响。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
[0017]实施例1:
本发明所涉及的质子泵抑制剂片剂的制备:
取质子泵抑制剂泮托拉唑或其它质子泵抑制剂400g，加入制备片剂的常规辅料(食用淀粉)100g，混匀，并用常规压片机制备成片剂1000片。
[0018]实施例2:
本发明所涉及的质子泵抑制剂胶囊剂的制备: 取质子泵抑制剂泮托拉唑或其它质子泵抑制剂400g，加入制备胶囊剂的常规辅料(食用淀粉)100g，混匀，并装胶囊制备成胶囊剂1000粒。
[0019]实施例3:本发明所涉及的质子泵抑制剂丸剂的制备:
取质子泵抑制剂泮托拉唑或其它质子泵抑制剂400g，加入制备丸剂的常规辅料(食用淀粉)100g，混匀，制备成丸剂1000丸。
[0020]实施例:4:
本发明所涉及的质子泵抑制剂注射液的制备:
取质子泵抑制剂泮托拉唑或其它质子泵抑制剂0.5g,加入2ml无菌的溶液制备成泮托拉唑或其它质子泵抑制剂注射液。
[0021]下面通过药效学实验来进一步说明质子泵抑制剂在抗肝细胞癌药物中的活性。
[0022]实验例1:质子泵抑制剂对人的肝细胞癌细胞增殖的影响:
我们选用了 8株人的肝细胞癌细胞株，分别在体外与不同剂量的质子泵抑制剂泮托拉唑(P)培养 24、48 和 72 小时，通过 MTT【(4，5-Dimethylthiazol_2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide, 3- (4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐】方法分析不同剂量的泮托拉唑在与这些细胞作用不同时间后对这些肝细胞癌细胞增殖的影响。MTT方法是一种常用检测细胞存活和增殖的方法，已广泛用于大规模 的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验等。结果显示泮托拉唑呈剂量和时间依懒性地抑制了人的肝细胞癌细胞的增殖(见图1)。
[0023]图1:展示了质子泵抑制剂泮托拉唑对人肝细胞癌细胞H印G2、SMMC7721、Huh7、SK-HEP-1、PLC/PRF/5、MHCC-9H、MHHCC-97L 和 HCCLM3 细胞增殖的影响。泮托拉唑(P)呈剂量和时间依赖性地抑制了人肝细胞癌细胞的增殖。在每一系列中η = 8。
[0024]实验例2:质子泵抑制剂对人的肝细胞癌细胞的生长曲线和克隆形成能力的影响:
细胞生长曲线是判断细胞活力的重要指标。我们首先通过细胞计数方法研究了质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞SMMC7721和!fepG2的细胞生长曲线的影响。结果显示，随着泮托拉唑浓度的升高，肝细胞癌细胞SMMC7721和H印G2的生长速率明显下降。(见图2中A部分)。
[0025]肿瘤的生长、转移、复发均以克隆原细胞(干细胞)的增殖为基础。集落形成实验反映了单个克隆活细胞的增殖能力，是测定抗癌药活性最可靠的指标。我们进一步选用人的肝细胞癌细胞SMMC7721和H印G2通过平板克隆形成实验研究质子泵抑制剂对肝细胞癌细胞克隆形成能力的影响。在细胞与质子泵抑制剂泮托拉唑作用2周后，结果显示随着泮托拉唑浓度的升高，人肝细胞癌细胞SMMC7721和HepG2的集落形成能力逐渐下降。在泮托拉唑160 μ M组，在两个细胞株都完全没有集落形成(见图2中B部分)。提示质子泵抑制剂对人肝细胞肝细胞H印G2及SMMC-7721的克隆原细胞具有明显抑制作用。
[0026]图2: A部分:质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞H印G2 (Al)和SMMC7721(Α2)生长曲线的影响。泮托拉唑剂量依赖地抑制了 SMMC7721和!fepG2细胞的生长速率。在每一系列中，η = 6。与对照组相比，#Α0.05，#Κ0.01。B部分:泮托拉唑对肝细胞癌细胞H印G2 (BI)和SMMC7721 (Β2)克隆形成能力的影响。Top panel:细胞克隆形成能力的代表性的图。Bottom panel:各组之间克隆形成数量的比较。泮托拉唑剂量依赖地抑制了 SMMC7721和IfepG2细胞的克隆形成能力。在160μΜ组，SMMC7721和！fepG2细胞均没有克隆的形成。在每一系列中，η = 8。与对照组相比，*代0.05，#代0.01。
[0027]实验例3:质子泵抑制剂对肝细胞癌细胞体内生长和肝细胞癌发生的影响:
为了观察质子泵抑制剂对人的肝细胞癌细胞体内生长的影响。我们用裸鼠建立肝细胞癌的异体移植模型。将人的肝细胞癌细胞SMMC7721细胞接种于裸鼠背部的皮下。在移植后4天，当裸鼠移植部位的肿瘤形成后，将移植瘤已经形成的裸鼠随机分为对照组以及质子泵抑制剂泮托拉唑20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg组,每组系列10只裸鼠。将泮托拉唑按20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg或对照媒剂,小鼠腹腔内给予,每12小时一次。每3天观察一次，测量移植在裸鼠背部的肿瘤组织的大小，在给予泮托拉唑后30天处死小鼠。我们的结果显示质子泵抑制剂泮托拉唑呈剂量依赖地抑制了人的肝细胞癌细胞SMMC7721细胞在裸鼠体内的生长(见图3A)。
[0028]为了进一步研究质子泵抑制剂对肝细胞癌发生的影响，我们应用C57BL6小鼠，用二甲硝胺(diethylnitrosamine)和四氯化碳建立化学诱导的肝细胞肝癌动物模型,在建立模型后3月，将小鼠随机分为对照组以及质子泵抑制剂泮托拉唑20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg组,每组系列20只小鼠。将泮托拉唑按20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg或对照媒剂,小鼠腹腔内给予，每12小时一次，于给药后60天，处死小鼠，检查小鼠肝脏内肿瘤的发生情况。结果显示在对照组有16只小鼠的肝脏内发生了肿瘤，且瘤体较大，多发。而在泮托拉唑20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg组,分别只有8只、5只和5只小鼠发生了肿瘤,且瘤体较小(见图3中B部分)。
[0029]图3: A部分:质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞SMMC7721细胞在体内生长的影响。左侧:为各组的瘤体的图像。右侧:为各组肿瘤大小的比较。在每一系列中η =10。与对照组相比，**Κ0.01。泮托拉唑呈剂量依赖地抑制了人的肝细胞癌细胞SMMC7721在裸鼠体内的生长。B部分:质子泵抑制剂泮托拉唑对小鼠肝细胞癌发生的影响。左侧:为各组的肝细胞癌发生的代表性图像。右侧:为各组肝细胞癌发生率的比较。在每组中η=20，与对照组相比，林代0.01。
[0030]实验例4:质子泵抑制剂对肝细胞癌细胞凋亡的影响:
为了了解质子泵抑制剂对肝细胞癌细胞凋亡的影响，我们通过流式细胞仪检测技术和TUNEL染色技术研究了质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞SMMC7721和H印G2早期和晚期凋亡的影响。在SMMC7721和!fepG2细胞与泮托拉唑320 μ M作用24小时后用流式细胞仪检测细胞的早期凋亡。在SMMC7721和HepG2细胞与泮托拉唑320 μ M作用48小时后用TUNEL染色法检测细胞的晚期凋亡。结果显示泮托拉唑明显的诱导了 SMMC7721和H印62细胞的凋亡(见图4)。
[0031]图4:Α部分:流式细胞仪检测质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞IfepG2(Al)和SMMC7721 (A2)早期凋亡的影响。Top panel:对照组和泮托拉唑(P)组的代表性的流式细胞仪检测图。Bottom panel:对照组和泮托拉唑(P)组结果的比较。B部分:TUNEL染色法检测质子泵抑制剂泮托拉唑对肝细胞癌细胞H印G2 (BI)和SMMC7721 (B2)晚期凋亡的影响。Top panel:对照组和泮托拉唑(P)组TUNEL染色的代表性的图。Bottom panel:对照组和泮托拉唑(P)组结果的比较。在每一系列中n=8,与对照组相比，01。
[0032]这些结果表明质子泵抑制剂泮托拉唑能有效地抑制肝细胞癌细胞的增殖和生长，抑制肝细胞癌的发生，诱导肝细胞癌细胞的凋亡。质子泵抑制剂制备出能有效治疗肝细胞癌的药物是可行的。
【主权项】
1.质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了质子泵抑制剂在制备治疗肝细胞肝癌药物中的应用，本发明发现质子泵抑制剂能有效地抑制肝细胞癌细胞的增殖和生长，抑制肝细胞癌的发生，诱导肝细胞癌细胞的凋亡。质子泵抑制剂是可以应用于制备能有效治疗肝细胞癌的药物，而质子泵抑制剂在制备抗肝细胞癌药物中的用途属于首次公开，而且其在对于抑制人肝细胞癌细胞的增殖和生长方面有意想不到的作用。
【IPC分类】A61K45/00, A61K31/4439, A61P35/00
【公开号】CN104906578
【申请号】CN201510060273
【发明人】庹必光
【申请人】遵义医学院附属医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年2月5日
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