神经浸润抑制剂的制作方法
神经浸润抑制剂的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为200980131148. 6、申请日为2009年6月5日、发明名称为"神 经浸润抑制剂"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及神经浸润抑制剂。更详细而言，本发明设及W白介素6(比-6)抑制剂 作为有效成分的神经浸润抑制剂。
【背景技术】
[0003] 白介素6 (比-6)是一种也称作B细胞刺激因子2炬SF2)或干扰素0 2的细胞因子。 IL-6是作为参与B淋己细胞类细胞的活化的分化因子被发现的（非专利文献1)，之后明确 了其是影响各种细胞的功能的多功能细胞因子（非专利文献2)。有报道称；IL-6诱导T淋 己细胞类细胞的成熟（非专利文献3)。
[0004]IL-6在细胞上经由两种蛋白来传递其生物学活性。一种蛋白是IL-6所结合的分 子量约80kD的配体结合性蛋白的IL-6受体（非专利文献4、5)。IL-6受体除了W跨膜而 在细胞膜上表达的膜结合型受体的形式存在W外，还主要W由其胞外区构成的可溶性IL-6 受体的形式存在。
[0005] 另一种蛋白是参与非配体结合性的信号传递的分子量约130kD的膜蛋白甜130。 IL-6和IL-6受体形成IL-6^L-6受体复合体，然后与甜130结合，从而向细胞内传递IL-6 的生物学活性（非专利文献6)。
[0006] 目前，大多数膜腺癌病例仍W不能切除的进展状态被诊断，而在唯一可W期待治 愈的切除病例中，大多数病例往往在术后早期又复发。此外，不能切除、且体力状态（P巧或 主要脏器功能良好的病例将采用化学疗法，但即使是目前的标准治疗，其疗效也不充分。例 如，即使是位于首选药位置的盐酸吉西他滨，其症状缓和效果的有效率为23. 8%，存活期间 中位数为5. 7个月，1年存活率为18% (海外3期临床试验结果）。在日本，每年有20000 人被诊断为膜腺癌，死亡人数达22, 260人（2004年厚生劳动省的人口动态调查），在癌症死 因中位于第5位。
[0007] 迄今为止，本发明人等明确了W下事实：神经浸润是膜腺癌的特征性浸润方式之 一，在膜腺癌中几乎100%确认到神经浸润；神经浸润是重要的预后因子；神经浸润导致肝 细胞功能异常，与贫血、体力状态（P巧下降或营养不良等恶病质症状有关等。另外，神经浸 润被认为是癌症性疼痛等的原因，有些报道称通过对神经浸润好发部位进行放射线照射或 切除位于其上位的神经可W使症状得到一定程度的控制。但神经浸润的机理W及由神经浸 润引起的症状所表现的机理尚不明确，因此，现实状况是：在神经浸润的控制W及神经浸润 所引起的症状的控制方面还缺乏经验。另一方面，不论癌症种类如何，普遍确认到神经浸 润，在前列腺癌、胃癌、头颈部癌中，神经浸润作为预后因子被报道。
[0008] 与本申请的发明相关的先行技术文献信息如下所示。
[0009] 先行技术文献
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献 1 ;Hirano,T.等人，化Uire(1986)324,73-76
[0012] 非专利文献 2 ;Akira，S.等人，Adv.inImmunology(1993) 54,1-78
[0013] 非专利文献 3 ;Lotz，M.等人，J.Exp.Med. (1988) 167,1253-1258
[0014] 非专利文献 4 ;Taga，T.等人，J.Exp.Med. (1987) 166,967-981
[0015]非专利文献 5;Yamasaki，K.等人，Science(1988) 241，825-828
[0016] 非专利文献 6 ;Taga，T.等人，Cell(1989) 58, 573-581
【发明内容】
[0017] 发明所要解决的课题
[001引因此，本发明提供新的神经浸润抑制剂。本发明还提供新的膜腺癌治疗药。
[0019] 解决课题的方法
[0020] 本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现；在膜腺癌的神经浸润 模型中，通过抑制比-6,神经浸润得到抑制，从而完成了本发明。并进一步明确了；IL-6受 体在人膜腺癌细胞株中表达、W及IL-6使膜腺癌细胞的趋化能力、迁移能力和细胞内信号 亢进，发现通过抑制IL-6可W治疗膜腺癌。进一步发现：通过对小鼠神经浸润模型给予 IL-6抑制剂，可W抑制人膜腺癌神经浸润。
[0021] 即，更具体而言，本发明提供W下山~巧2]。
[0022] [1]膜腺癌治疗药，其W白介素6(比-6)抑制剂作为有效成分。
[0023] [2]细胞的神经浸润抑制剂，其WIL-6抑制剂作为有效成分。
[0024] [3]凹所述的抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[002引[句閒所述的抑制剂，其特征在于：抑制膜腺癌细胞的神经浸润。
[002引 [5]凹~W中任一项所述的抑制剂，其特征在于；抑制向中枢侧进行的神经浸 润。
[0027] [6]山~[5]中任一项所述的治疗药或抑制剂，其特征在于；比-6抑制剂是与 IL-6受体结合的物质。
[002引 [7] [6]所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：比-6抑制剂为抗比-6受体抗体。
[0029] 巧][7]所述的治疗药或抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体 或人抗体。
[0030] [9]膜腺癌的治疗方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
[003。 [10]细胞的神经浸润抑制方法，该方法包括：将比-6抑制剂给予对象的步骤。
[003引[山[10]所述的方法，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[003引[切[山所述的方法，其特征在于：抑制膜腺癌细胞的神经浸润。
[0034][切[10]~[切中任一项所述的方法，其特征在于；抑制向中枢侧进行的神经浸 润。
[003引 [M] [9]~山]中任一项所述的方法，其特征在于：比-6抑制剂是与比-6受体结 合的物质。
[003引 [1引[M]所述的方法，其特征在于：比-6抑制剂为抗比-6受体抗体。
[0037] [16] [1引所述的方法，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[003引 [17]IL-6抑制剂在制备膜腺癌治疗药中的应用。
[0039] [1引IL-6抑制剂在制备细胞的神经浸润抑制剂中的应用。
[0040] [19] [18]所述的应用，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[0041] 巧0] [19]所述的应用，其特征在于：抑制膜腺癌细胞的神经浸润。
[004引 巧^ [18]~巧0]中任一项所述的应用，其特征在于；抑制向中枢侧进行的神经浸 润。
[004引 巧引[17]~巧U中任一项所述的应用，其特征在于：比-6抑制剂是与比-6受体 结合的物质。
[0044] 巧3]巧2]所述的应用，其特征在于JL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
[0045] 巧4]巧3]所述的应用，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[0046] 巧5]比-6抑制剂，该比-6抑制剂在治疗膜腺癌的方法中使用。
[0047] 巧6]比-6抑制剂，该比-6抑制剂在用于抑制细胞的神经浸润的方法中使用。
[0048] 巧7]巧6]所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[0049] 巧引巧7]所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制膜腺癌细胞的神经浸润。
[0050] 巧9]巧6]~巧8]中任一项所述的比-6抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行 的神经浸润。
[0051] 巧0]巧引~巧9]中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于JL-6抑制剂是与 IL-6受体结合的物质。
[0052] 巧1]巧0]所述的IL-6抑制剂，其特征在于JL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
[005引 巧引巧^所述的比-6抑制剂，其中，抗比-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或 人抗体。
【附图说明】
[0054] 图1是显示人膜腺癌细胞株中IL-6a受体（IL6R)的mRNA表达量（A)和IL-6 0 受体（甜130)的mRNA表达量做的图。
[00巧]图2是显示使用人重组IL-6,测定IL-6对人膜腺癌细胞株的增殖能力、趋化能力、 迁移能力的影响的结果的图。A和B;显示通过经时性计测细胞数来测定细胞增殖能力的结 果；C;显示通过趋化性分析来测定趋化能力的结果；D;显示通过伤口愈合分析来测定迁移 能力的结果。
[0056] 图3是显示使用人重组IL-6(rhIL6)，利用蛋白质印迹法评价IL-6对人膜腺癌细 胞株Capan-1的细胞内信号的影响的结果的图。A;显示细胞内磯酸化STAT3蛋白表达、B; 显示细胞内磯酸化化kl/2蛋白表达、C;显示细胞内磯酸化Akt蛋白表达。
[0057] 图4是显示使用人膜腺癌细胞株的、小鼠神经浸润模型的照片和图。A;显示4周 后的神经浸润肉眼图像，B;显示经时性浸润距离的图，C;显示4周后的神经浸润组织图像。
[0058] 图5是显示在神经浸润模型和各种神经损伤模型中小鼠IL-6表达分布的照片和 图。A;显示神经浸润模型图像，B和C;显示通过RT-PCR做或巧光免疫染色似测定的、 神经浸润模型及其他神经损伤模型中的小鼠IL-6表达量。
[0059] 图6是显示在神经浸润部分膜腺癌细胞的磯酸化STAT3蛋白表达的结果的图。
[0060] 图7是显示由甜130击倒（knockdown)产生的神经浸润距离抑制效果的图。
[0061] 图8是显示由IL-6R击倒产生的神经浸润距离抑制效果的图。
[0062] 图9是显示对小鼠神经浸润模型给予JAK抑制剂AG490或抗IL-6受体抗体对神 经浸润的影响的图。A;显示给予JAK抑制剂AG490时的经时性浸润距离的图。DMS0 ;显示 对照组、AG490 ;显示AG490给药组。B;显示给予抗IL-6受体抗体时的经时性浸润距离的 图。hIgG;显示对照组、MRA;显示抗IL-6受体抗体给药组。
【具体实施方式】
[0063] 在本发明中，"IL-6抑制剂"是指阻断IL-6的信号传递、抑制IL-6的生物学活性的 物质。IL-6抑制剂的具体例子有：与IL-6结合的物质、与IL-6受体结合的物质、与gpl30 结合的物质等。作为IL-6抑制剂，可W列举；抑制作为IL-6的细胞内信号重要的STAT3磯 酸化的物质、例如AG490等。对IL-6抑制剂没有特别限定，包括抗IL-6抗体、抗IL-6受体 抗体、抗gpl30抗体、IL-6修饰体、可溶性IL-6受体修饰体、IL-6部分肤、IL-6受体部分 肤、与上述物质显示出同样的活性的低分子化合物等。
[0064] 作为比-6抑制剂的优选方案，可W列举；比-6受体抑制剂、特别是抗比-6受体抗 体。
[0065] 对本发明中使用的抗体的来源没有特别限定，但优选来自哺乳动物，更优选来源 于人的抗体。
[0066] 本发明中使用的抗体，可W利用公知的方法W多克隆或单克隆抗体的形式得到。 作为本发明中使用的抗体，特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单 克隆抗体有；由杂交瘤产生的单克隆抗体；W及利用基因工程学方法，通过携带抗体基因 的表达载体转化宿主，在所得宿主中产生的单克隆抗体。通常，该抗体通过与IL-6JL-6受 体、gpl30等结合，阻断向细胞内传递IL-6的生物学活性。
[0067] 产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可W利用公知技术，如下操作来制作。目P，使 用 IL-6受体、比-6、甜130等作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫，再按照通常 的细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，利用通常的筛选方法筛选产生单 克隆抗体的细胞，从而可W制作杂交瘤。
[006引具体而言，制作单克隆抗体时可W如下进行。例如，制作抗IL-6受体抗体时，被用 作用于取得抗体的致敏抗原的人IL-6受体使用欧州专利申请公开号EP325474中公开的 IL-6受体基因/氨基酸序列、而小鼠IL-6受体使用日本专利申请公开号特开平3-155795 中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列，从而得到抗IL-6受体抗体。
[0069]IL-6受体蛋白有W下两种：在细胞膜上表达的IL-6受体蛋白和从细胞膜上脱 离的比-6受体蛋白（可溶性比-6受体）（Yas址awa，K.等人，J.Biochem. (1990) 108， 673-676)。可溶性IL-6受体实质上由与细胞膜结合的IL-6受体的胞外区构成，跨膜区或 跨膜区和胞内区缺失，该一点不同于膜结合型IL-6受体。只要IL-6受体蛋白能够用作制 作本发明中使用的抗IL-6受体抗体的致敏抗原，可W使用任一种IL-6受体。
[0070] 将IL-6受体的基因序列插入到公知的表达载体系统中，使适当的宿主细胞转化， 之后按照公知方法从其宿主细胞中或培养上清中纯化目标IL-6受体蛋白，可W使用该纯 化IL-6受体蛋白作为致敏抗原。此外，可W使用表达IL-6受体的细胞或IL-6受体蛋白与 其他蛋白的融合蛋白作为致敏抗原。
[OCm]同样，使用比-6作为用于取得抗体的致敏抗原时，通过使用化r. J.Biochem(1987) 168,543-550、J.Immunol. (1988) 140,15:34-1541 或Agr.Biol.Chem. (1990)54,2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列，从而得到人IL-6。作为取得抗 甜130抗体的致敏抗原，可W使用欧州专利申请公开号EP411946中公开的甜130基因/氨 基酸序列。
[0072] 对用致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定，但优选考虑其与用于细胞融合的亲 本细胞的适应性后再进行选择，通常使用晒齿类动物、例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
[0073] 用致敏抗原对动物进行免疫按照公知方法进行。例如，作为一般的方法，通过向哺 乳动物的腹腔内或皮下注射致敏抗原来进行。具体而言，用PBS(磯酸缓冲盐）或生理盐水 等稀释致敏抗原至适当量并使之悬浮，根据需要，向所得悬浮物中适量混合通常的佐剂、例 如弗氏完全佐剂，乳化后，优选每4~21天对哺乳动物给药数次。进行致敏抗原免疫时，可 W使用适当的载体。
[0074] 如此地对哺乳动物进行免疫，确认血清中所需抗体水平升高后，从哺乳动物中采 集免疫细胞用于细胞融合。作为用于细胞融合的优选的免疫细胞，特别优选使用脾细胞。
[0075] 作为与上述免疫细胞融合的另一方的亲本细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞，优选使 用已公知的各种细胞株、例如P3X63Ag8. 653 (Kearney,J.F.等人.J.Immunol. (1979) 123， 1548-1550)、P3X63Ag8U.l(Qi;rrentTopicsinMicrobiologyandImmunology(1978)81， 1-7)、NS-UKohler.G.和Mi1stein,C.Eur.J.Immunol. (1976) 6,511-519)、 MPC-ll(Margulies.D.H.等人，Cell(1976)8,405-415)、SP2/0(auilman，M.等人， 化1:山"6 (1978) 276, 269-270)、F0(deSt.Groth，S.F.等人，J.Immunol.Methods(1980) 35， 1-21)、S194 (Trowbridge,I.S.J.Exp.Med. (1978) 148, 313-323)、R210 (Galfre，G.等人， 化Uire(1979) 277,131-133)等。
[0076] 上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可W按照公知的方法、例如 Milstein等人的方法化ohler.G.和Milstein，C.，MethodsEnzymol. (1981)73,3-46)等 来进行。
[0077] 更具体而言，例如在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施上述 细胞融合。作为融合促进剂，例如使用聚己二醇（PEG)、仙台病毒（HVJ)等，为了进一步提高 融合效率，根据需要，还可W添加使用二甲基亚讽等辅助剂。
[0078] 关于免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例，例如优选使免疫细胞为骨髓瘤细胞的 1~10倍。用于上述细胞融合的培养液例如可W使用；适合上述骨髓瘤细胞株增殖的 RPMI1640培养液、MEM培养液、W及用于该种细胞培养的常规培养液。还可W结合使用胎牛 血清（FC巧等血清补充液。
[0079] 细胞融合可如下进行：将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充 分混合，通常再W30~60% (w/v)的浓度添加预先加热至37°C左右的PEG溶液、例如平均 分子量为1000~6000左右的PEG溶液，混合，从而形成目标融合细胞（杂交瘤）。接着，依 次添加适当的培养液，离屯、W除去上清，重复进行该操作，从而可W除去不利于杂交瘤生长 的细胞融合剂等。
[0080] 该杂交瘤通过在常规选择培养液、例如HAT培养液（含有次黄嚷岭、氨基蝶岭和胸 腺喀晚核巧的培养液）中培养而进行选择。为了使目标杂交瘤W外的细胞（非融合细胞） 死亡，使用该HAT培养液继续培养足够的时间、通常为数天~数周。接着，实施常规的极限 稀释法，可W进行产生目标抗体的杂交瘤的筛选和克隆。
[0081] 除了用抗原对人W外的动物进行免疫W得到上述杂交瘤W外，在体外用所需的抗 原蛋白或表达抗原的细胞致敏人淋己细胞，使致敏B淋己细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融 合，也可W得到与所需的抗原或表达抗原的细胞具有结合活性的所需人抗体（参照日本特 公平1-59878)。而且，对具有完全人抗体基因的所有组成成分（r巧ertoire)的转基因动物 给予抗原或表达抗原的细胞，按照上述方法可W获得所需的人抗体（参照国际专利申请公 开号W0 93/12227、W0 92/03918、W0 94/02602、W0 94/25585、W0 96/：M096、W0 96/33735)。
[0082] 如此制作的产生单克隆抗体的杂交瘤，可W在常规培养液中进行传代培养，还可 W在液氮中长期保存。
[0083] 为了由该杂交瘤获得单克隆抗体，可W采用W下方法：按照常规方法培养该杂交 瘤，W其培养上清的形式得到单克隆抗体的方法；或者，将杂交瘤给予与其具有适合性的哺 乳动物W使其增殖，W其腹水的形式得到单克隆抗体的方法等。前一种方法适合得到高纯 度的抗体，而后一种方法适于大量生产抗体。
[0084] 例如，产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制作可W通过日本特开平3-139293中公 开的方法来进行。可W按照下述方法进行；将产生PM-1抗体的杂交瘤注入BALB/c小鼠的 腹腔内得到腹水，从该腹水中纯化PM-1抗体的方法；或者，在适当的培养基、例如含有10% 胎牛血清、5%BM-CondimedH1 炬〇6虹ingerMannheim制）的RPMI1640 培养基、杂交瘤SFM 培养基佑IBC0-B化制）、PFHM-II培养基佑IBC0-B化制）等中培养本杂交瘤，从其培养上 清中纯化PM-1抗体的方法。
[0085] 在本发明中，作为单克隆抗体，可W使用下述抗体：由杂交瘤克隆抗体基因，之 后将其插入适当的载体中，再将其导入宿主中，利用基因重组技术产生的重组型抗体（例 如参照BorrebaeckC.A.K.和LarrickJ.W.T肥RAP抓TICMONO化0NALANTIB孤IES， Publishedinthe化itedKingdombyMACMILLANPUBLIS肥RSLTD,1990)。
[0086] 具体而言，从产生目标抗体的细胞、例如杂交瘤中分离编码抗体可变（V)区 的mRNA。分离mRNA时，利用公知的方法、例如脈超离屯、法（Chirgwin，J.M.等人， Biochemist;ry(1979) 18,5294-5299)、AGPC法（Qiomczynski'P.等人，Anal.Biochem. (1987) 162,156-159)等制备总RNA，再使用mRNA纯化试剂盒（Pharmacia制）等制备mRNA。 另外，通过使用如ickPrepmRNA纯化试剂盒（Pharmacia制），可W直接制备mRNA。
[0087] 使用逆转录酶由所得的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可W使用AMV 逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒（AMVReverseTranscriptaseFirst-strandcDNA SynthesisKit)等来进行。进行cDNA的合成和增幅时，可W采用使用5'-AmpliFIND邸 RACE试剂盒（Clontech制）和PCR的 5'-RACE法（化ohman，M.A.等人，Proc.化tl. Acad.Sci.USA(1988) 85,8998-9002 ;Belyavsky，A.等人，NucleicAcidsRes. (1989) 17， 2919-2932)。从所得的PCR产物中纯化目标DM片段，将其与载体DM连接。再由此制作 重组载体并导入大肠杆菌等中，选择菌落，制备所需的重组载体。利用公知的方法、例如脱 氧法来确认目标DNA的核巧酸序列。
[008引得到编码目标抗体V区的DNA时，将其与编码所需抗体恒定区（C区）的DNA连接， 再将其插入表达载体中。或者，可W将编码抗体V区的DNA插入含有抗体C区的DNA的表 达载体中。
[0089] 制备本发明中使用的抗体时，按照后述的方式将抗体基因插入表达载体中，使之 在表达调节区、例如增强子、启动子的调节下表达。接下来，利用该表达载体转化宿主细胞， 可W使抗体表达。
[0090] 在本发明中，可W使用进行人为修饰W降低对人的异种抗原性等的基因重组型抗 体、例如嵌合烟limeric)抗体、人源化（Humanized)抗体等。该些修饰抗体可W利用已知 的方法进行制备。
[0091] 关于嵌合抗体，通过连接如上操作得到的编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区 的DNA，将其插入表达载体中，再导入宿主中，使产生抗体，从而得到嵌合抗体（参照欧州专 利申请公开号EP125023、国际专利申请公开号W0 92-19759)。可W利用该已知方法得到 对本发明有用的嵌合抗体。
[0092] 人源化抗体也称作重构（reshaped)人抗体或人型化抗体，是将人W外的哺乳动 物、例如小鼠抗体的互补性决定区（CDR)移植到人抗体的互补性决定区中而得到的抗体， 其常规基因重组方法也是已知的（参照欧州专利申请公开号EP125023、国际专利申请公 开号W0 92-19759)。
[0093] 具体而言，利用PCR法由多个制作成在末端部具有重叠部分的寡核巧酸合成设计 成连接小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区（FR;化ameworkregion)的DNA序列。连接所 得的DNA和编码人抗体C区的DNA，接着插入到表达载体中，再将其导入宿主中，使之产生 抗体，从而得到人源化抗体（参照欧州专利申请公开号EP239400、国际专利申请公开号W0 92-19759)〇
[0094] 经由CDR连接的人抗体的FR选择互补性决定区形成良好的抗原结合位点的构架 区。根据需要，可W取代抗体可变区中的构架区的氨基酸，使重构人抗体的互补性决定区形 成适当的抗原结合位点（Sato,K.等人，CancerRes. (1993)53,851-856)。
[0095] 嵌合抗体、人源化抗体中 通常使用人抗体C区。人抗体重链C区的例子有；C丫等， 例如可W使用C丫 1、C丫 2、C丫 3或C丫 4。人抗体轻链C区的例子有；例如K或A。另外， 为了改善抗体或其产生的稳定性，可W对人抗体C区进行修饰。
[0096] 嵌合抗体由来自人W外的哺乳动物的抗体的可变区和来自人抗体的C区构成，而 人源化抗体由来自人W外的哺乳动物的抗体的互补性决定区和来自人抗体的构架区和C 区构成，由于该些抗体在人体内的抗原性降低，所W作为用作药品的抗体是有效的。
[0097] 本发明所使用的人源化抗体的优选的具体例子有；人源化PM-1抗体（参照国际专 利申请公开号W0 92-19759)。
[0098] 作为获得人抗体的方法，除之前阐述的方法外，还已知使用人抗体文库，通过淘 选获得人抗体的技术。例如，还可W利用瞻菌体展示法使人抗体的可变区作为单链抗体 (scFv)在瞻菌体表面表达，然后可W选择与抗原结合的瞻菌体。分析所选择的瞻菌体的基 因时，可W确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。明确了与抗原结合的scFv 的DM序列后，制作包含该序列的适当的表达载体，可W获得人抗体。该些方法已经众所 周知，可W参考W0 92/01047、W092/2079UW0 93/06213、W0 93/11236、W0 93/19172、W0 95/01438、W0 95/15388。
[0099] 按照上述方式构建的抗体基因，可W利用公知的方法使之表达。使用哺乳类细胞 时，可W利用使常用的有用启动子、所要表达的抗体基因及其3'侧下游的polyA信号功 能性结合的DM或含有该DM的载体使之表达。例如，作为启动子/增强子，可W列举；人 巨细胞病毒前期启动子 / 增强子化umancytomegalovirusimmediateearlypromoter/ enhancer)〇
[0100] 除此之外，作为本发明中使用的、可用于抗体表达的启动子/增强子，可W使用 逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子或人延伸因子 1a(肥F1a)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。
[0101] 例如，当使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等人的方法（Mulligan， R.C.等人，化化re(1979)277，108-114)可W容易地实施；而当使用肥Fla启动子/增 强子时，按照Mizushima等人的方法（Mizushima，S.和 ^gata，S.NucleicAcidsRes. (1990) 18,5322)可W容易地实施。
[0102] 使用原核细胞作为宿主时，有使用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞，已知有大 肠杆菌化coli)、枯草杆菌。
[0103] 当为大肠杆菌时，可W使常用的有用启动子、用于抗体分泌的信号序列、所要表 达的抗体基因功能性结合而使之表达。例如，启动子的例子有；lacZ启动子、araB启动 子。使用lacZ启动子时，可W按照Ward等人的方法（Ward,E.S.等人，化Uire(1989) 341， 544-546 ;Ward，E.S.等人.FASEBJ. (1992)6,2422-2427)进行；使用araB启动子时，可W 按照Better等人的方法炬etter，M.等人.Science(1988) 240,1041-1043)进行。
[0104] 作为用于抗体分泌的信号序列，当其在大肠杆菌的周质中产生时，可W使用pelB 信号序列（Lei，S.P.等人J.Bacteriol. (1987) 169,4379-4383)。分离周质中产生的抗体 后，适当地重折叠（refold)抗体的构造后使用（例如参照W0 96/30394)。
[0105] 作为复制起点，可W使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒炬PV)等的 复制起点。并且，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，表达载体中可W包含氨基糖巧磯 酸转移酶（APH)基因、胸腺喀晚核巧激酶（TK)基因、大肠杆菌黄嚷岭-鸟嚷岭磯酸核糖转 移酶巧CO甜t)基因、二氨叶酸还原酶（化化）基因等作为选择标志物。
[0106] 可W使用任意的产生系统W制备本发明中使用的抗体。用于制备抗体的产生系统 有体外（invitro)和体内（invivo)产生系统。体外产生系统的例子有；使用真核细胞的 产生系统和使用原核细胞的产生系统。
[0107]使用真核细胞作为宿主时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的产生系统。作 为动物细胞，已知有；（1)哺乳类细胞、例如CH0、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾）、化La、Vero等；（2)两栖类细胞、例如非洲爪赡卵母细胞狂enopusoocytes);或（3)昆虫细胞、例如 sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知有来源于烟草（Nicotianat油acum)的细胞，可W对 其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有；酵母，例如酵母菌（Saccharomyces)属（例 如啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae)) 及丝状菌，例如曲霉属（Aspergillus)(例 如黑曲霉（Aspergillusniger)等）。
[0108] 通过转化将目标抗体基因导入该些细胞中，之后在体外培养所转化的细胞，从而 得到抗体。可W按照公知方法进行培养。例如，可W使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作为 培养液，还可W结合使用胎牛血清（FC巧等血清补充液。此外，通过将导入有抗体基因的细 胞移入动物的腹腔等中，可W在体内产生抗体。
[0109] 另一方面，作为体内的产生系统，可W列举；使用动物的产生系统或使用植物的产 生系统。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的产生系统等。
[0110] 作为哺乳类动物，可W使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等（VickiGlaser,S阳CTRUM BiotechnologyApplications, 1993)。作为昆虫，可W使用蚕。使用植物时，例如可W使用 烟草。
[0111] 向该些动物或植物中导入抗体基因，使在动物或植物的体内产生抗体并回收。例 如，将抗体基因插入编码山羊0-酪素该样的乳汁中固有产生的蛋白的基因的中途，W 融合基因的形式进行制备。再将携带插入有抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山 羊胚胎（embryo)中，将该胚胎导入雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从 该转基因山羊或其后代产生的乳汁中可W得到所需抗体。为了使转基因山羊产生的含 有所需抗体的乳汁量增加，可W对转基因山羊使用适当的激素巧bert，K.M.等人，Bio/ Technology(1994) 12,699-702)。
[0112] 使用蚕时，使蚕感染插入有目标抗体基因的杆状病毒，从该蚕的体液中得到所需 抗体（Maeda，S.等人，化化re(1985) 315, 592-594)。并且，使用烟草时，将目标抗体基因插 入到植物表达用载体例如PM0N530中，再将该载体导入到根瘤±壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)该样的细菌中。用该细菌感染烟草例如烟草（Nicotianat油acum)，从该烟 草的叶中得到所需抗体（Julian,K. -C.Ma等人，Eur.J.Immunol. (1994) 24,131-138)。
[0113] 按照上述方式利用体外或体内的产生系统产生抗体时，可W将编码抗体重链化 链）或轻链（L链）的DNA分别插入表达载体中，同时转化宿主；或者，可W将编码H链和L 链的DNA插入单一的表达载体中，用于转化宿主（参照国际专利申请公开号W0 94-11523)。
[0114] 本发明中使用的抗体，只要能够适用于本发明，可W是抗体的片段或其修饰物。例 如，作为抗体片段，可W列举；F油、F(油'）2、Fv或用适当的接头连接H链和L链的Fv而形 成的单链Fv(scFv)。
[0115] 具体而言，用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体而生成抗体片段，或者，构 建编码该些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表 达（例如参照Co,M.S.等人，J.Immunol. (1994) 152,2968-2976 ;Better，M. &Horwitz， A.比MethodsinEnzymology(1989) 178,476-496 ;Plueckthun，A. &Skerra，A.Methods inEnzymology(1989) 178,497-515 ;Lamoyi，E.，MethodsinEnzymology(1989) 121， 652-663 ;Rousseaux，J.等人，MethodsinEnzymology(1989) 121,663-66 ;Bird，R.E.等 人，TIBTECHQ991)9,132-137)。
[0116]scFv可W通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。在该scFv中，H链V 区和L链V区经由接头、优选肤接头来连接化uston，J.S.等人、Proc.化tl.Acad.Sci. U.S.A. (1988)85,5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可W来自作为上述抗体而记 载的任一种抗体。作为连接V区的肤接头，例如使用包含12-19个氨基酸残基的任意的单 链肤。
[0117]W编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、W及编码L链或L链V区的DNA为模 板，使用引物对通过PCR法扩增编码该些序列中的所需氨基酸序列的DNA部分，所述引物对 规定该DNA部分的两端，然后，将编码肤接头部分的DNA和规定其两端与各H链、L链连接 的引物对组合起来，进一步进行扩增，从而得到编码scFv的DNA。
[0118] 一旦制作了编码scFv的DM,就可W按照常规方法得到含有该些DM的表达载体 和通过该表达载体转化的宿主，还可W使用该宿主，按照常规方法得到scFv。
[0119] 关于该些抗体的片段，可W进行与上述相同的操作，获得其基因并使之表达，利用 宿主产生该些抗体的片段。本发明中所说的"抗体"还包含该些抗体的片段。
[0120] 作为抗体的修饰物，还可W使用与聚己二醇（PEG)等各种分子结合的抗体。本发 明中所说的"抗体"还包含该些抗体修饰物。为了得到该样的抗体修饰物，可W通过对所得 抗体施行化学修饰而得到。该些方法在该领域已经确立。
[0121] 按照上述方式产生、表达的抗体可W从细胞内外、宿主中分离出来，并纯化至均 匀。本发明中使用的抗体的分离、纯化可W通过亲和层析来进行。作为亲和层析中使用 的柱，例如有蛋白A柱、蛋白G柱。作为蛋白A柱中使用的载体，例如有HyperD、P0R0S、 Se地aroseF.F.等。此外，可W使用普通蛋白中使用的分离、纯化方法，对其没有任何限定。
[0122] 例如，可W适当选择、组合上述亲和层析W外的层析、滤器、超滤、盐析、透析等来 分离、纯化本发明中使用的抗体。作为层析，例如有离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。 该些层析可适用于HPLC(高效液相色谱法）。此外，可W使用反相HPLCCreverse地ase HPLC)〇
[0123] 上述所得抗体的浓度测定可W通过吸光度的测定或化ISA等来进行。目P，通过测 定吸光度来测定抗体浓度时，用PBS(-)进行适当稀释后，测定280nm的吸光度，WImg/ml 作为1.350D，算出抗体浓度。通过化ISA来测定抗体浓度时，可如下测定。目P，向96孔板 (Nunc制）中加入100y1用0. 1M的碳酸氨盐缓冲液（pH9. 6)稀释至1yg/ml的山羊抗人 IgGCTAG制），在4°C下培养一夜，将抗体固化。封闭后，添加lOOiU已适当稀释的本发明中 使用的抗体或含有抗体的样品、或作为标准品的人IgG(CAPP化制），在室温下培养1小时。
[0124]清洗后，加入100y1经5000倍稀释的碱性磯酸酶标记抗人 IgG炬10SOURCE制）， 在室温下培养1小时。清洗后，加入底物溶液进行培养，之后使用MICR0PLATEREA呢RModel 3550炬io-Rad制）测定405皿的吸光度，算出目标抗体的浓度。
[012引对抗比-6抗体的具体例子没有特别限定，可W列举；MH166(Matsuda，T.等人，Eur.J.Immunol. (1998) 18,951-956)或SK2抗体（SatoK等人，第21回日本免疫学会絶会 (第21次日本免疫学会总会）、学术记录（1991)21,166)等。
[012引对抗比-6受体抗体的具体例子没有特别限定，可W列举；MR16-1抗体（Tamura，T.等人.Proc.化tl.Acad.Sci.USA(1993) 90,11924-11928)、PM-1 抗体化irata，Y.等人， J.Immunol. (1989) 143, 2900-2906)、AUK12-20 抗体、AUK64-7 抗体或AUK146-15 抗体（国 际专利申请公开号WO92-19759)等。其中，作为对抗人IL-6受体的优选的单克隆抗体， 可W例示PM-1抗体，而作为对抗小鼠IL-6受体的优选的单克隆抗体，可W列举MR16-1抗 体，但并不限于此。作为人源化抗IL-6受体抗体的优选的例子，可W列举人源化PM-1抗体 (Tocilizumab、MRA)。人源化抗IL-6受体抗体的其他优选的例子有；W0 2009/041621中 记载的抗体。并且，作为抗IL-6受体抗体的其他优选方案，可W列举；与人源化PM-1抗体 (Tocilizumab、MRA)所识别的表位识别相同表位的抗IL-6受体抗体。
[0127] 对于抗gpl30抗体的具体例子没有特别限定，可W列举：AM64抗体（日本公开公 报日本特开平3-219894)、4B11抗体、2H4抗体（美国专利公报US5571513)、B-P8抗体（日 本公开公报日本特开平8-291199)等。
[012引本发明中使用的IL-6修饰体是与IL-6受体具有结合活性、且不传递IL-6的生物 学活性的物质。目P，虽然IL-6修饰体和IL-6竞争与IL-6受体结合，但由于IL-6修饰体不 传递IL-6的生物学活性，所W其阻断由IL-6介导的信号传递。
[0129] 通过取代IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基来导入突变，制作IL-6修饰体。用作 IL-6修饰体的基础的IL-6,虽然对其来源没有限定，但考虑到抗原性等，优选为人IL-6。 具体而言，使用公知的分子模型程序、例如WHATIF(化iend等人，J.Mol.Graphics(1990)8， 52-56)预测IL-6的氨基酸序列的二级结构，再评价被取代的氨基酸残基对整体的影响，由 此进行氨基酸取代。确定了适当的取代氨基酸残基后，W包含编码人IL-6基因的核巧酸序 列的载体为模板，利用通常进行的PCR法导入突变，使氨基酸被取代，从而得到编码IL-6修 饰体的基因。根据需要，将该基因插入适当的表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、产 生及纯化方法，可W得到IL-6修饰体。
[0130]比-6 修饰体的具体例子有：化akenhoff等人，J.Biol.Chem. (1994)269,86-93 和 Savino等人，EMB0J. (1994) 13,1357-1367、W096-18648、W0 96-17869 中公开的IL-6 修饰 体。
[0131]IL-6受体部分肤是包含在IL-6受体的氨基酸序列中与IL-6和IL-6受体的结合 相关的区的一部分或全部的氨基酸序列的肤。该样的肤通常包含10~80个、优选20~50 个、更优选20~40个氨基酸残基。
[0132] 在IL-6受体的氨基酸序列中，特定与IL-6和IL-6受体的结合相关的区，根据该 特定的区的一部分或全部的氨基酸序列，利用通常已知的方法、例如基因工程学方法或肤 合成法，可W制作IL-6受体部分肤。
[0133] 利用基因工程学方法制作IL-6受体部分肤时，将编码所期望的肤的DNA序列插入 表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、产生及纯化方法可W得到IL-6受体部分肤。
[0134] 利用肤合成法制作IL-6受体部分肤时，可W采用肤合成中通常使用的方法、例如 固相合成法或液相合成法。
[0135] 具体而言，可W按照"続医薬品①開発第14卷乂文子F合成（续医药品的开发第 14卷肤合成）"监修矢岛治明广川书店1991年中记载的方法来进行。作为固相合成法，采用 W下方法；例如使欲合成的肤的C末端所对应的氨基酸与不溶于有机溶剂的支撑体结合， 交替重复进行使a-氨基和侧链官能团用适当的保护基保护起来的氨基酸按照C末端一N 末端方向依次缩合每1个氨基酸的反应、W及使树脂上结合的氨基酸或肤的a-氨基的该 保护基脱离的反应，从而使肤链伸长。根据所用保护基的种类，固相肤合成法大致分为Boc 法和Fmoc法。
[0136] 如此操作合成目标肤后，进行脱保护反应和从支撑体上切断肤链的反应。在肤链 的切断反应中，采用Boc法时，可W使用氣化氨或S氣甲横酸；采用Fmoc法时，通常可W使 用TFA。在Boc法中，例如在氣化氨中、在茵香離存在下处理上述保护肤树脂。然后，进行保 护基的脱离和从支撑体上切断肤链，回收肤。将其冷冻干燥，从而得到粗肤。而在Fmoc法 中，例如可W在TFA中、按照与上述相同的操作进行脱保护反应和从支撑体上切断肤链的 反应。
[0137] 通过将得到的粗肤应用于HPLC，可W分离、纯化。洗脱时，可W使用蛋白纯化中通 常使用的水-己膳系溶剂，在最佳条件下进行洗脱。分离收集得到的色谱图的峰所对应的 组分，将其冷冻干燥。对如此纯化的肤组分通过利用光谱分析进行的分子量解析、氨基酸组 成分析或氨基酸序列解析等进行鉴定。
[013引本发明的IL-6抑制剂可用于神经浸润的抑制。在本发明中，"神经浸润"是指癌 细胞及其他细胞侵入神经组织中生长的方式，有时还伴有组织破坏（破坏性生长）等。本 发明中，作为优选的神经浸润，可W列举；癌细胞的神经浸润。抑制癌细胞的浸润时，对作为 对象的癌症种类没有特别限定，可W是膜腺癌、胃癌、前列腺癌、头颈部癌、乳癌、肺癌、大肠 癌、卵巢癌等任何癌症种类，但优选抑制膜腺癌细胞的浸润。神经浸润的抑制可W是抑制向 末梢侧进行的神经浸润，也可W是抑制向中枢侧进行的神经浸润，但由于膜腺癌细胞存在 对中枢侧进行神经浸润的趋势，所W优选抑制向中枢侧进行的神经浸润（例如，从神经损 伤部位向中枢侧进行的神经浸润）。
[0139] 本发明中，"神经浸润的抑制"是指抑制神经浸润的发生、降低神经浸润的发生率、 缩短神经浸润距离、延缓神经浸润速度等。
[0140] 通过利用本发明的比-6抑制剂抑制神经浸润，可此治疗、抑制神经浸润所伴随的 各种症状（例如癌症性疼痛等疼痛、贫血、体力状态（P巧下降、营养不良等）。因此，本发明 还包括含有IL-6抑制剂的神经浸润所伴随的各种症状的治疗药、抑制剂。
[0141] 本发明的膜腺癌治疗药可W在膜腺癌的治疗和/或预防中使用。
[0142] 本发明中，"膜腺癌治疗"是指抑制膜腺癌的发生、降低膜腺癌的发生率、抑制膜腺 癌细胞的增殖、缩小膜腺癌组织、改善膜腺癌的症状、抑制膜腺癌的转移等。
[0143] 本发明中使用的IL-6抑制剂的效果例如可信号传递抑制活性为指标进行评 价，但并不限于此。IL-6抑制剂的信号传递抑制活性可W利用通常使用的方法进行评价。 具体而言，培养IL-6依赖性人骨髓瘤株（S6B45，KPMM2)、人LennertT淋己瘤细胞株KT3或 比-6依赖性细胞M册0.BSF2,向其中添加比-6,同时共存比-6抑制剂，由此可W测定比-6 依赖性细胞的巧-胸腺喀晚核巧摄入。另外，培养作为IL-6受体表达细胞的U266,并添加 issi标记IL-6,同时加入IL-6抑制剂，由此测定与IL-6受体表达细胞结合的1251标记IL-6。 在上述测定系统中，除存在IL-6抑制剂的组W外，还设置不含IL-6抑制剂的阴性对照组， 比较两者所得的结果，可W评价IL-6抑制剂的IL-6抑制活性。
[0144] 本发明的治疗药或抑制剂的给药对象为哺乳动物。哺乳动物优选为人。
[0145] 本发明的治疗药或抑制剂可药品形式进行给药，可W通过口服或胃肠外进行 全身或局部给药。例如，可W选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、 栓剂、灌肠剂、口服性肠溶剂等，根据患者的年龄、症状来选择适当的给药方法。有效给药 量可W在每次、每1kg体重0.Olmg~lOOmg的范围内选择。或者，可W选择每名患者1~ lOOOmg、优选5~50mg的给药量。关于优选的给药量、给药方法，例如当为抗比-6受体抗 体时，血中存在的游离抗体的程度的量为有效给药量，具体例子有下述方法：每1kg体重、1 个月（4周）给予0. 5mg~40mg、优选Img~20mg，分1次~数次、例如按照2次/周、1次 /周、1次/2周、1次/4周等给药时间表，通过点滴等静脉内注射、皮下注射等方法进行给药 等。还可W边观察患者的状态和血液检查值的动向，边由2次/周或1次/周延长给药间 隔至1次/2周、1次/3周、1次/4周等，W调整给药时间表。
[0146] 在本发明的治疗药或抑制剂中，可W添加保存剂或稳定剂等制剂上可接受的载 体。制剂上可接受的载体是指可W与上述药物一同给药的材料。作为制剂上可接受的材 料，可w列举；例如灭菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、馨合 剂巧DTA等）、粘合剂等。
[0147]本发明中，作为表面活性剂，可W列举非离子表面活性剂，典型例子有：例如脱水 山梨糖醇单辛酸醋、脱水山梨糖醇单月桂酸醋、脱水山梨糖醇单栋桐酸醋等脱水山梨糖醇 脂肪酸醋；单辛酸甘油醋、单肉豆違酸甘油醋、单硬脂酸甘油醋等脂肪酸甘油醋；单硬脂酸 十聚甘油醋、二硬脂酸十聚甘油醋、单亚油酸十聚甘油醋等脂肪酸聚甘油醋；聚氧己締脱水 山梨糖醇单月桂酸醋、聚氧己締脱水山梨糖醇单油酸醋、聚氧己締脱水山梨糖醇单硬脂酸 醋、聚氧己締脱水山梨糖醇单栋桐酸醋、聚氧己締脱水山梨糖醇=油酸醋、聚氧己締脱水山 梨糖醇=硬脂酸醋等聚氧己締脱水山梨糖醇脂肪酸醋；聚氧己締山梨糖醇四硬脂酸醋、聚 氧己締山梨糖醇四油酸醋等聚氧己締山梨糖醇脂肪酸醋；聚氧己締甘油单硬脂酸醋等聚氧 己締甘油脂肪酸醋；聚己二醇二硬脂酸醋等聚己二醇脂肪酸醋；聚氧己締月桂離等聚氧己 締烷基離；聚氧己締聚氧丙締二醇、聚氧己締聚氧丙締丙離、聚氧己締聚氧丙締嫁蜡離等聚 氧己締聚氧丙締烷基離；聚氧己締壬基苯基離等聚氧己締烷基苯基離；聚氧己締藍麻油、 聚氧己締硬化藍麻油（聚氧己締氨化藍麻油）等聚氧己締硬化藍麻油；聚氧己締山梨糖醇 蜂蜡等聚氧己締蜂蜡衍生物；聚氧己締羊毛脂等聚氧己締羊毛脂衍生物；聚氧己締硬脂酸 酷胺等聚氧己締脂肪酸酷胺等具有HLB6~18的非离子表面活性剂等。
[014引作为表面活性剂，还可W列举阴离子表面活性剂，典型例子有：例如十六烷基硫酸 钢、十二烷基硫酸钢、油締基硫酸钢等具有碳原子数为10~18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧 己締十二烷基硫酸钢等氧化己締的平均加成摩尔数为2~4、烷基的碳原子数为10~18的 聚氧己締烷基離硫酸盐；月桂基横基班巧酸醋钢等烷基的碳原子数为8~18的烷基横基班 巧酸醋盐；天然类的表面活性剂、例如卵磯脂、甘油磯脂；神经銷磯脂等銷磯脂；碳原子数 为12~18的脂肪酸的庶糖脂肪酸醋等。
[0149] 在本发明的药物中，可W组合添加1种或2种W上的上述表面活性剂。本发明的 制剂中使用的优选的表面活性剂为聚山梨醋任〇173〇&3*6)20、40、60或80等聚氧己締脱 水山梨糖醇脂肪酸醋，特别优选聚山梨醋20和80。此外，还优选泊洛沙姆（poloxamer) (PluronicF-68(注册商标）等）所代表的聚氧己締聚氧丙締二醇。
[0150] 表面活性剂的添加 量根据所用表面活性剂的种类而不同，当为聚山梨醋20或聚 山梨醋80时，其添加量通常为0. 001~lOOmg/mU优选为0. 003~50mg/mU进一步优选为 0.005 ~2mg/mL。
[0151] 在本发明中，作为缓冲剂，可W列举；磯酸、构檢酸缓冲液、己酸、苹果酸、酒石酸、 班巧酸、乳酸、磯酸钟、葡萄糖酸、癸酸、脱氧胆酸、水杨酸、=己醇胺、富马酸等、其他有机酸 等、或碳酸缓冲液、Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、咪挫缓冲液等。
[0152] 通过将本发明的药物溶解于溶液制剂领域中公知的水性缓冲液中，可W制备溶液 制剂。缓冲液的浓度通常为1~500mM，优选为5~lOOmM，进一步优选为10~20mM。
[0153] 本发明的药物可W含有其他低分子量的多肤、血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等 蛋白、氨基酸、多糖和单糖等糖类或碳水化合物、糖醇。
[0154]在本发明中，作为氨基酸，可W列举；碱性氨基酸、例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟 氨酸等、或该些氨基酸的无机盐（优选盐酸盐、磯酸盐的形式、即磯酸氨基酸）。使用游离氨 基酸时，优选的抑值通过添加适当的生理上可接受的缓冲物质、例如无机酸、特别是盐酸、 磯酸、硫酸、己酸、甲酸或它们的盐来调节。此时，使用磯酸盐可w得到特别稳定的冷冻干燥 物，因此特别有利。制备物中实质上不含有机酸、例如苹果酸、酒石酸、构檢酸、班巧酸、富马 酸等时或不存在对应的阴离子（苹果酸离子、酒石酸离子、构檢酸离子、班巧酸离子、富马 酸离子等）时，特别有利。优选的氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。并且，还可W 使用酸性氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸、及其盐的形式（优选钢盐）；或中性氨基酸、例如 异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、鄉氨酸、甲硫氨酸、半脱氨酸或丙氨酸；或芳族 氨基酸、例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、或衍生物的N-己酷色氨酸。
[0155] 本发明中，作为多糖和单糖等糖类或碳水化合物，可W列举；例如葡聚糖、葡萄糖、 果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、庶糖、海藻糖、蜜=糖等。
[0156] 本发明中，作为糖醇，可W列举；例如甘露醇、山梨醇、肌醇等。
[0157] 将本发明的药物制成注射用水溶液时，可W将其与例如生理盐水、含葡萄糖或其 他辅助药（例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钢）的等渗溶液混合。该水溶液还 可W与适当的助溶剂（例如醇（己醇等）、多元醇（丙二醇、PEG等）、非离子性表面活性剂 (聚山梨醋80、肥0-50)等）结合使用。
[0158]根据需要，可W进一步含有稀释剂、助溶剂、FiH调节剂、缓解剂（soothingagent)、 含硫还原剂、抗氧剂等。
[0159] 本发明中，作为含硫还原剂，可W列举；例如N-己酷半脱氨酸、N-己酷高半脱氨 酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代己醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、琉基己酸及其盐、硫代硫酸钢、 谷脱甘肤、W及碳原子数为1~7的硫代链烧酸等具有琉基的含硫还原剂等。
[0160] 本发明中，作为抗氧剂，可W列举；例如异抗坏血酸、二了基哲基甲苯、了基哲基茵 香離、a-生育酪、醋酸生育酪抗坏血酸及其盐、k抗坏血酸栋桐酸醋、k抗坏血酸硬脂 酸醋、亚硫酸氨钢、亚硫酸钢、没食子酸S戊醋、没食子酸丙醋或己二胺四己酸二钢巧DTA)、 焦磯酸钢、偏磯酸钢等馨合剂。
[0161] 根据需要，还可W将药物封入微囊（哲甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙締酸甲 醋]等的微囊）中，或者制成胶体药物传递系统（脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒 和纳米囊等）（参照"Remington's化armaceuticalScience16thedition",OsloEd.， 1980等）。并且，将药物制成缓释制剂的方法也是公知的，可应用于本发明（Langer等人， J.Biomed.Mater.Res. 1981,15 ; 167-277 ;Langer，Chem.Tech. 1982,12 ;98-105 ;美国专利 第3, 773, 919号；欧州专利申请公开巧巧第58, 481号；Sidman等人，Biopolymers1983， 22 ;547-556;EP第 133, 988 号）。
[0162] 所使用的制剂上可接受的载体，根据剂型从上述载体中适当或组合选择，但并不 限于该些。
[0163] 本发明设及在对象中抑制神经浸润的方法，该方法包括：对发生神经浸润的对象 或有可能发病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
[0164] 本发明还设及在对象中治疗和/或预防膜腺癌的方法，该方法包括：对患有膜腺 癌的对象或有可能患病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
[0165] 本发明中，"对象"是指给予本发明的治疗药或抑制剂的生物体、该生物体体内的 一部分。对生物体没有特别限定，包括动物（例如人、家畜动物种类、野生动物）。
[0166] 对"生物体体内的一部分"没有特别限定，可W优选列举；疾病部位等。
[0167] 本发明中，"给药"包括口服给药或胃肠外给药。作为口服给药，可W列举；W口服 审IJ剂的形式进行的给药；作为口服制剂，可W选择颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂 或悬浮剂等剂型。
[016引作为胃肠外给药，可W列举；W注射剂的形式进行的给药，注射剂的例子有；皮下 注射剂、肌肉注射剂或腹腔内注射剂等。通过利用基因疗法将应该给予的含有寡核巧酸的 基因导入生物体内，可W实现本发明的方法的效果。还可W将本发明的药物对欲实施处置 的部位进行局部给药。例如，还可W通过手术中的局部注入、插管的使用、或本发明的编码 肤的DNA祀向基因传递进行给药。
[0169] 实践本发明的方法时，可W将本发明的药物与至少一种其他药物（例如其他神经 浸润抑制剂或其他膜腺癌治疗药）一起作为药学组合物的一部分进行给药。在一个方案 中，本发明的药物和其他药物实质上可W同时给药。
[0170] 需要说明的是，本说明书中引用的所有先行技术文献均作为参照而纳入本说明书 中。
[0171] 实施例
[0172] 利用实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于此。本领域技术人员可W 进行各种变更、修饰，该些变更、修饰也包含在本发明中。
[0173] <材料和方法〉
[0174] (细胞）
[01巧]从AmericanTypeQiltureCollection(ATCC)购入人膜腺癌细胞株Capan-1、BxPC-3,按照ATCC推荐的操作指南，使用可W维持37度、5%C〇2的条件的恒温槽进行培养 和传代。
[0176](细胞数计测）
[0177] 从培养皿中采集细胞，使用台盼藍和血细胞计测盘计测活细胞。（趋化性分析） [017引将底面带有8ym的孔的细胞培养小室炬DFalcon)插入24个孔中，W细胞培养小 室作为上室，W孔作为下室。向下室中注入600y1用非血清培养液和人重组IL-6化rIL6) (R&Dsystems)制备的0、l、10、100ng/ml的虹IL6溶媒，向上室中注入100yl2Xl0e个/ ml的细胞悬浮液。培养24小时后，计测通过孔的细胞数。各组测定12次，再除WhrIL6为 Ong/ml时通过孔的平均细胞数，记录所得的数值，作为校正值。
[0179](伤口愈合分析）
[0180] 向24个孔中分别注入1ml3X105个/ml的细胞悬浮液，培养24小时。换成非血 清培养基，再培养24小时，之后用玻璃椿踏掉孔的中央部分，制作带状的无细胞区，计测其 宽度，交换培养基，使虹IL6溶媒达到0、1、10、lOOng/ml。培养24小时后，测定无细胞区的 宽度变化。各组测定12次，再除WhrIL6为化g/ml时的平均变化长度，记录所得的数值， 作为校正值。
[0181](抗体）
[0182]蛋白质印迹法中使用的一次抗体为：抗磯酸化STAT3抗体（Santa化UZ)、抗 STAT3 抗体（SantaCruz)、抗磯酸化化kl/2 抗体（CellSi即aling)、抗化kl/2 抗体（Cell Si即aling)、抗磯酸化Akt抗体（CellSi即aling)、抗Akt抗体（CellSi即aling)、抗Actin 抗体（Santa化uz)。巧光免疫染色中使用的一次抗体为：抗SlOO抗体值AKO)、抗小鼠IL-6 抗体（Santa化uz)，核染色使用DRAQ5(AXX0RA)。免疫染色中使用抗磯酸化STAT3抗体(SantaCruz)。
[0183](蛋白质印迹法）
[0184]使用裂解缓冲液（20mMH巧es-NaOHpH7. 0、0. 5%NP-40、15%甘油、300mM化C1、 ImM邸TA、10mMNaF)制作细胞溶解液。使用BCA蛋白测定试剂盒（PIERCE)测定蛋白浓 度后，使含有20mg蛋白的细胞溶解液在7. 5%或12%的丙締酷胺凝胶中进行电泳，之后转 移到聚偏二氣己締薄膜（Millipore)上。向薄膜上添加抗体，使用增强型化学发光试剂 (EnhancedChemiluminescenceReagent)(AmershamBiosciences)将蛋白表达图像化。
[0185](磯酸化STAT3免疫染色及其评价方法）
[0186] 使用微波在lOmM的构檢酸缓冲液中进行95°C、10分钟的加热处理W激活抗原，显 色时使用DAB。作为检体，使用从经过4周的26只小鼠神经浸润模型中采集的26根坐骨神 经。W神经浸润部的中枢侧顶端和末梢侧顶端作为目标区，使用40倍的物镜计测每个视野 的癌细胞数和磯酸化STAT3阳性癌细胞数，通过下式算出标记指数；（磯酸化STAT3阳性癌 细胞数）/(癌细胞数）。
[0187](神经浸润模型）
[018引所用小鼠为6周龄、雄性重度免疫功能不全小鼠（SCID小鼠）。按50mg/kg向小鼠 腹腔内给予己比妥，进行麻醉，露出左坐骨神经，使用微量注射器和30G针向坐骨神经内直 接注入2. 5y11. 0X104个/y1的癌细胞悬浮液。采集在评价时期注入了癌细胞的坐骨神 经，制作组织标本时，在4%低聚甲醒中、于4°C下静置一昼夜，W固定坐骨神经。将已固定 的上述坐骨神经切成3ym的厚度，进行苏木素-伊红染色或免疫染色，W测定神经浸润距 离。测定神经浸润距离时，使用沿神经长轴方向薄切的切片和物镜测微计啓），计测全 肿瘤范围的长轴。提取组织中的mRNA时，使用立即用Multi-Beads化ocker(安井器械） 破碎所采集的组织而得到的检体。
[0189](RNA提取和实时RT-PCR)
[0190]使用TRIzol(LifeTechnologies)，从自培养皿中采集的细胞团块（cell pellet)或破碎的组织断片中采集总RNA。使用ExScriptRT试剂试剂盒（Takara-bio) 和"TakaraPCRThermal切clerDice(Takara-bio)，按照"Takara-bio社推荐的操作指 南，由IXl〇3ng的总RNA合成cDNA。使用Smart切clerIISystem(Ce地eid)、SYBR RT-PCR试剂盒（Takara-bio)进行实时RT-PCR。引物使用分别特异性扩增人比-6a受 体（IL6R)、人比-6 0受体（甜130)、人GAPDH、小鼠比-6、小鼠EGF、小鼠GAPDH的cDNA 的引物。引物序列如下。人IL6R;正向tgagctcagatatcgggctgaac(SEQIDN0;1)、反向 cgtcgtggatgacacagtgatg(SEQIDNO；2)；人gpl30 ；正向gaagcaagtgggatcacctatgaa(SEQ IDN0;3)、反向ctgtagccttgagtatgggatgga(SEQIDN0;4);人GAPDH;正 向gcaccgtcaaggctgagaac(SEQIDNO；5)、 反向atggtgg tgaagacgccagt(SEQ IDN0;6);小鼠比-6;正向ccacttcacaagtcggaggctta(SEQIDN0;7)、反向 gcaagtgcatcatcgttgttcatac(SEQIDNO；8);小鼠EGF;正向catcatggtggtggctgtctg(SEQ IDN0;9)、反向cacttccgcttggctcatca(SEQIDN0;10);小鼠GAPDH;正向 aaatggtgaaggtcggtgtg(SEQIDN0;11)、反向tgaaggggtcgttgatgg(SEQIDN0;12)。利用 Takara-bio社推荐的方法进行定量。
[0191](mRNA击倒）
[019引 在mRNA表达的击倒中，使用Ambion社制作的siRNA。所用siRNA为人IL6RsiRNA、 人甜 130siRNA、NegatiVeControl#lsiRNA。在 3. 5cm的培养皿中播撒 2X105个癌细胞， 培养48小时后，加入20yM的siRNA和8y1Dharma阳CT转染试剂4Oharmacon)。24小 时后采集细胞，将其用于mRNA表达分析或神经浸润模型。
[0193](统计分析）
[0194] 分析软件使用STATVIEW5. 0。平均值之差的检验使用student-t双侧检验。图中 的误差椿按照显示标准偏差的方式制作。
[0195][实施例1]
[0196] 利用实时RT-PCR研究人膜腺癌细胞株中的IL-6a受体（IL6R)和IL-6 0受 体（甜130)的细胞内mRNA表达。在人膜腺癌细胞株中，确认到IL6RmRNA(图1A)和 甜130mRNA(图1B)的明确表达。
[0197][实施例2]
[0198]使用人重组IL-6,通过细胞数的经时性计测（图2A和B)、趋化性分析（图2C)、伤 口愈合分析（图2D)研究IL-6对人膜腺癌细胞株的增殖能力、趋化能力、迁移能力的影响。 明确了JL-6虽然对膜腺癌细胞株的细胞增殖没有影响，但使趋化能力和迁移能力亢进。
[0199][实施例3]
[0200]使用人重组比-6 (rhIL6)，对于磯酸化STAT3 (PSTAT3)(图3A)、磯酸化 化kl/2(p化kl/2)(图3B)、磯酸化Akt(pAkt)(图3C)，利用蛋白质印迹法评价比-6对人膜 腺癌细胞株Capan-1的细胞内信号的影响。在添加rhIL615分钟后，确认到细胞内的磯酸 化STAT3蛋白表达明显亢进，而在添加rhIL6 1小时后，确认到磯酸化化kl/2蛋白表达明 显亢进。没有确认到对磯酸化Akt表达的影响。
[0201] [实施例句
[0202] 膜腺癌的重要浸润方式为神经浸润距离。制作可W重现神经浸润、并且可W计测 神经浸润距离的小鼠神经浸润模型，该在研究控制膜腺癌的重要的肿瘤浸润方式的治疗方 法上至关重要。通过向免疫功能不全小鼠的坐骨神经内直接注入人膜腺癌细胞株Capan-1， 制作神经浸润模型。肉眼可见神经浸润部的表面不平整、且明显大于正常神经（图4A)。1 周后，组织学的神经浸润距离明显长于注入时Capan-1神经内扩散距离，该距离随时间而 增大（图4B)。另外，神经浸润从注入部向中枢侧进展（图4C)，该与人膜腺癌神经浸润是 相同的特征。
[020引[实施例引
[0204] 据报道，人膜腺癌神经浸润损伤肿瘤周围的神经组织。已经明确；神经损伤使 IL-6表达在损伤部位的末梢侧的神经组织中亢进。为了研究神经浸润引起的神经组织的IL-6表达动态，使用神经浸润模型，通过实时RT-PCR法分别评价在神经浸润中枢侧和末梢 侧的神经组织内（图地）表达的小鼠IL-6(mIL6)mRNA。虽然mIL6在神经浸润中枢侧高度 表达，但在其他神经损伤模型中没有确认到该趋势（图5B)。通过巧光免疫染色确认mIL6 蛋白表达时，与作为Schwann细胞的标志物的S100阳性细胞区一致，确认到IL6阳性颗粒 (图5C)。明确了；在神经浸润模型中，mIL6分泌细胞之一是Schwann细胞。虽然EGF是在 神经损伤中高度表达的分子，但小鼠EGF(mEGF)mRNA表达动态不同于mIL6,没有确认到其 在中枢侧高度表达的趋势。该结果暗示；IL-6与神经浸润部位的肿瘤-神经相互作用密切 相关。
[020引[实施例6]
[0206] 利用免疫染色研究IL-6的重要的细胞内信号即磯酸化STAT3(pSTAT3)蛋白在膜 腺癌细胞内表达时，磯酸化STAT3表达在神经浸润中枢方向亢进（图6)。该结果是；与在 神经浸润中枢侧的神经组织中IL-6表达的亢进分布一致。
[0207][实施例7]
[0208] 在比-6的细胞内信号中，必需有甜130的介在。使用用siRNA击倒了膜腺癌细胞 的gpl30mRNA表达的膜腺癌细胞株制作神经浸润模型时，神经浸润距离得到抑制（图7)。 该结果表明：由甜130介导的信号对于神经浸润是重要的，所述甜130包含来自IL-6的 甜 130。
[020引[实施例8]
[0210] 在IL-6的细胞内信号中，必需有IL-6受体（IL6R)的介在。使用用siRNA击倒了 膜腺癌细胞的IL6RmRNA表达的膜腺癌细胞株制作神经浸润模型时，神经浸润距离得到抑 制（图8)。该结果表明：由IL-6介导的信号对于神经浸润是重要的。
[0211] [实施例9]
[0212] 接下来，对小鼠神经浸润模型给予JAK抑制剂或抗IL-6受体抗体，确认该些抑制 剂对神经浸润的影响。
[0213](对小鼠神经浸润模型给予JAK抑制剂的实验）
[0214] 将抑制STAT3磯酸化的JAK抑制剂AG490 (CALBI0CHEM)溶于DMS0中，之后用生理 盐水进行稀释，制备1 %DMS0的AG490液。从制作神经浸润模型2天后起，向小鼠腹腔内 连日给予0. 5mgAG490,从制作模型起2周后采集注入有癌细胞的坐骨神经，测定神经浸润 距离。对照组则按照同样的方法给予1%DMS0液。AG490组和DMS0组中所用小鼠数均为 7只。
[0215](对小鼠神经浸润模型给予抗IL-6受体抗体的实验）
[0216] 将抑制人IL-6受体的抗IL-6受体抗体（中外制药、tocilizumab)溶于生理盐水 中，从制作模型1周后起，按5yg/g、每周2次对小鼠神经浸润模型给予抗IL-6抗体抑制抗 体。从制作模型起3周后采集注入有癌细胞的坐骨神经，测定神经浸润距离。对照组则按 照同样的方法W5yg/g给予溶解在生理盐水中的人IgG(Sigma)。抗IL-6受体抗体组中所 用小鼠数为6只，对照组中所用小鼠数为4只。
[0217](统计分析）
[021引分析软件使用STATVIEW5. 0。平均值之差的检验使用student-t双侧检验。图中 的误差椿按照显示标准偏差的方式制作。
[0219] 从注入癌细胞2天后起连续12天腹腔内给予对于IL-6的细胞内信号重要的 STAT3磯酸化的JAKQanusKinase)抑制剂AG490时，明确了神经浸润得到抑制（图9A)。 该结果表明；IL-6下游的细胞内信号即JAK-STAT对神经浸润是重要的。
[0220] 另外，为了发挥人IL-6的抑制作用，从注入癌细胞1周后起每周2次、连续2周给 予抗人IL-6受体抗体时，明确了神经浸润得到抑制（图9B)。由该结果认为：人膜腺癌神 经浸润被抗人IL-6受体抗体抑制。
[0221] 产业实用性
[0222] 本发明显示；通过给予抗IL-6受体抗体，在膜腺癌中可W抑制神经浸润。进一步 显示；通过给予抗IL-6受体抗体，可W治疗膜腺癌。
【主权项】
1. 胰腺癌治疗药，其以白介素6抑制剂、即IL-6抑制剂作为有效成分。2. 细胞的神经浸润抑制剂，其以IL-6抑制剂作为有效成分。3. 权利要求2所述的抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。4. 权利要求3所述的抑制剂，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。5. 权利要求2~4中任一项所述的抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸 润。6. 权利要求1~5中任一项所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是与 IL-6受体结合的物质。7. 权利要求6所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。8. 权利要求7所述的治疗药或抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体 或人抗体。9. 胰腺癌的治疗方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。10. 细胞的神经浸润抑制方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。11. 权利要求10所述的方法，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。12. 权利要求11所述的方法，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。13. 权利要求10~12中任一项所述的方法，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸 润。14. 权利要求9~13中任一项所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结 合的物质。15. 权利要求14所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。16. 权利要求15所述的方法，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗 体。 17. IL-6抑制剂在制备胰腺癌治疗药中的应用。 18. IL-6抑制剂在制备细胞的神经浸润抑制剂中的应用。19. 权利要求18所述的应用，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。20. 权利要求19所述的应用，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。21. 权利要求18~20中任一项所述的应用，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸 润。22. 权利要求17~21中任一项所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体 结合的物质。23. 权利要求22所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。24. 权利要求23所述的应用，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗 体。 25. IL-6抑制剂，该IL-6抑制剂在治疗胰腺癌的方法中使用。 26. IL-6抑制剂，该IL-6抑制剂在用于抑制细胞的神经浸润的方法中使用。27. 权利要求26所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。28. 权利要求27所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。29. 权利要求26~28中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行 的神经浸润。30. 权利要求25~29中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是与 IL-6受体结合的物质。31. 权利要求30所述的IL-6抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。32. 权利要求31所述的IL-6抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体 或人抗体。
【专利摘要】本发明人等发现：在胰腺癌的神经浸润模型中，通过抑制IL-6，神经浸润得到抑制，从而完成了本发明。进一步明确了：IL-6受体在人胰腺癌细胞株中表达、以及IL-6使胰腺癌细胞的趋化能力、迁移能力和细胞内信号亢进，发现通过抑制IL-6可以治疗胰腺癌。进一步发现：通过对小鼠神经浸润模型给予IL-6抑制剂，可以抑制人胰腺癌神经浸润。
【IPC分类】A61K45/06, A61K39/395, A61P35/00
【公开号】CN104906581
【申请号】CN201510206764
【发明人】光永修一, 落合淳志
【申请人】国立研究开发法人国立癌症研究中心, 中外制药株式会社
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2009年6月5日
【公告号】CA2728243A1, CN102256623A, EP2305306A1, EP2305306A4, US20110150869, WO2009148148A1
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为200980131148. 6、申请日为2009年6月5日、发明名称为"神 经浸润抑制剂"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及神经浸润抑制剂。更详细而言，本发明设及W白介素6(比-6)抑制剂 作为有效成分的神经浸润抑制剂。
【背景技术】
[0003] 白介素6 (比-6)是一种也称作B细胞刺激因子2炬SF2)或干扰素0 2的细胞因子。 IL-6是作为参与B淋己细胞类细胞的活化的分化因子被发现的（非专利文献1)，之后明确 了其是影响各种细胞的功能的多功能细胞因子（非专利文献2)。有报道称；IL-6诱导T淋 己细胞类细胞的成熟（非专利文献3)。
[0004]IL-6在细胞上经由两种蛋白来传递其生物学活性。一种蛋白是IL-6所结合的分 子量约80kD的配体结合性蛋白的IL-6受体（非专利文献4、5)。IL-6受体除了W跨膜而 在细胞膜上表达的膜结合型受体的形式存在W外，还主要W由其胞外区构成的可溶性IL-6 受体的形式存在。
[0005] 另一种蛋白是参与非配体结合性的信号传递的分子量约130kD的膜蛋白甜130。 IL-6和IL-6受体形成IL-6^L-6受体复合体，然后与甜130结合，从而向细胞内传递IL-6 的生物学活性（非专利文献6)。
[0006] 目前，大多数膜腺癌病例仍W不能切除的进展状态被诊断，而在唯一可W期待治 愈的切除病例中，大多数病例往往在术后早期又复发。此外，不能切除、且体力状态（P巧或 主要脏器功能良好的病例将采用化学疗法，但即使是目前的标准治疗，其疗效也不充分。例 如，即使是位于首选药位置的盐酸吉西他滨，其症状缓和效果的有效率为23. 8%，存活期间 中位数为5. 7个月，1年存活率为18% (海外3期临床试验结果）。在日本，每年有20000 人被诊断为膜腺癌，死亡人数达22, 260人（2004年厚生劳动省的人口动态调查），在癌症死 因中位于第5位。
[0007] 迄今为止，本发明人等明确了W下事实：神经浸润是膜腺癌的特征性浸润方式之 一，在膜腺癌中几乎100%确认到神经浸润；神经浸润是重要的预后因子；神经浸润导致肝 细胞功能异常，与贫血、体力状态（P巧下降或营养不良等恶病质症状有关等。另外，神经浸 润被认为是癌症性疼痛等的原因，有些报道称通过对神经浸润好发部位进行放射线照射或 切除位于其上位的神经可W使症状得到一定程度的控制。但神经浸润的机理W及由神经浸 润引起的症状所表现的机理尚不明确，因此，现实状况是：在神经浸润的控制W及神经浸润 所引起的症状的控制方面还缺乏经验。另一方面，不论癌症种类如何，普遍确认到神经浸 润，在前列腺癌、胃癌、头颈部癌中，神经浸润作为预后因子被报道。
[0008] 与本申请的发明相关的先行技术文献信息如下所示。
[0009] 先行技术文献
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献 1 ;Hirano,T.等人，化Uire(1986)324,73-76
[0012] 非专利文献 2 ;Akira，S.等人，Adv.inImmunology(1993) 54,1-78
[0013] 非专利文献 3 ;Lotz，M.等人，J.Exp.Med. (1988) 167,1253-1258
[0014] 非专利文献 4 ;Taga，T.等人，J.Exp.Med. (1987) 166,967-981
[0015]非专利文献 5;Yamasaki，K.等人，Science(1988) 241，825-828
[0016] 非专利文献 6 ;Taga，T.等人，Cell(1989) 58, 573-581
【发明内容】
[0017] 发明所要解决的课题
[001引因此，本发明提供新的神经浸润抑制剂。本发明还提供新的膜腺癌治疗药。
[0019] 解决课题的方法
[0020] 本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现；在膜腺癌的神经浸润 模型中，通过抑制比-6,神经浸润得到抑制，从而完成了本发明。并进一步明确了；IL-6受 体在人膜腺癌细胞株中表达、W及IL-6使膜腺癌细胞的趋化能力、迁移能力和细胞内信号 亢进，发现通过抑制IL-6可W治疗膜腺癌。进一步发现：通过对小鼠神经浸润模型给予 IL-6抑制剂，可W抑制人膜腺癌神经浸润。
[0021] 即，更具体而言，本发明提供W下山~巧2]。
[0022] [1]膜腺癌治疗药，其W白介素6(比-6)抑制剂作为有效成分。
[0023] [2]细胞的神经浸润抑制剂，其WIL-6抑制剂作为有效成分。
[0024] [3]凹所述的抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[002引[句閒所述的抑制剂，其特征在于：抑制膜腺癌细胞的神经浸润。
[002引 [5]凹~W中任一项所述的抑制剂，其特征在于；抑制向中枢侧进行的神经浸 润。
[0027] [6]山~[5]中任一项所述的治疗药或抑制剂，其特征在于；比-6抑制剂是与 IL-6受体结合的物质。
[002引 [7] [6]所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：比-6抑制剂为抗比-6受体抗体。
[0029] 巧][7]所述的治疗药或抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体 或人抗体。
[0030] [9]膜腺癌的治疗方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
[003。 [10]细胞的神经浸润抑制方法，该方法包括：将比-6抑制剂给予对象的步骤。
[003引[山[10]所述的方法，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[003引[切[山所述的方法，其特征在于：抑制膜腺癌细胞的神经浸润。
[0034][切[10]~[切中任一项所述的方法，其特征在于；抑制向中枢侧进行的神经浸 润。
[003引 [M] [9]~山]中任一项所述的方法，其特征在于：比-6抑制剂是与比-6受体结 合的物质。
[003引 [1引[M]所述的方法，其特征在于：比-6抑制剂为抗比-6受体抗体。
[0037] [16] [1引所述的方法，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[003引 [17]IL-6抑制剂在制备膜腺癌治疗药中的应用。
[0039] [1引IL-6抑制剂在制备细胞的神经浸润抑制剂中的应用。
[0040] [19] [18]所述的应用，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[0041] 巧0] [19]所述的应用，其特征在于：抑制膜腺癌细胞的神经浸润。
[004引 巧^ [18]~巧0]中任一项所述的应用，其特征在于；抑制向中枢侧进行的神经浸 润。
[004引 巧引[17]~巧U中任一项所述的应用，其特征在于：比-6抑制剂是与比-6受体 结合的物质。
[0044] 巧3]巧2]所述的应用，其特征在于JL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
[0045] 巧4]巧3]所述的应用，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[0046] 巧5]比-6抑制剂，该比-6抑制剂在治疗膜腺癌的方法中使用。
[0047] 巧6]比-6抑制剂，该比-6抑制剂在用于抑制细胞的神经浸润的方法中使用。
[0048] 巧7]巧6]所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。
[0049] 巧引巧7]所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制膜腺癌细胞的神经浸润。
[0050] 巧9]巧6]~巧8]中任一项所述的比-6抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行 的神经浸润。
[0051] 巧0]巧引~巧9]中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于JL-6抑制剂是与 IL-6受体结合的物质。
[0052] 巧1]巧0]所述的IL-6抑制剂，其特征在于JL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。
[005引 巧引巧^所述的比-6抑制剂，其中，抗比-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或 人抗体。
【附图说明】
[0054] 图1是显示人膜腺癌细胞株中IL-6a受体（IL6R)的mRNA表达量（A)和IL-6 0 受体（甜130)的mRNA表达量做的图。
[00巧]图2是显示使用人重组IL-6,测定IL-6对人膜腺癌细胞株的增殖能力、趋化能力、 迁移能力的影响的结果的图。A和B;显示通过经时性计测细胞数来测定细胞增殖能力的结 果；C;显示通过趋化性分析来测定趋化能力的结果；D;显示通过伤口愈合分析来测定迁移 能力的结果。
[0056] 图3是显示使用人重组IL-6(rhIL6)，利用蛋白质印迹法评价IL-6对人膜腺癌细 胞株Capan-1的细胞内信号的影响的结果的图。A;显示细胞内磯酸化STAT3蛋白表达、B; 显示细胞内磯酸化化kl/2蛋白表达、C;显示细胞内磯酸化Akt蛋白表达。
[0057] 图4是显示使用人膜腺癌细胞株的、小鼠神经浸润模型的照片和图。A;显示4周 后的神经浸润肉眼图像，B;显示经时性浸润距离的图，C;显示4周后的神经浸润组织图像。
[0058] 图5是显示在神经浸润模型和各种神经损伤模型中小鼠IL-6表达分布的照片和 图。A;显示神经浸润模型图像，B和C;显示通过RT-PCR做或巧光免疫染色似测定的、 神经浸润模型及其他神经损伤模型中的小鼠IL-6表达量。
[0059] 图6是显示在神经浸润部分膜腺癌细胞的磯酸化STAT3蛋白表达的结果的图。
[0060] 图7是显示由甜130击倒（knockdown)产生的神经浸润距离抑制效果的图。
[0061] 图8是显示由IL-6R击倒产生的神经浸润距离抑制效果的图。
[0062] 图9是显示对小鼠神经浸润模型给予JAK抑制剂AG490或抗IL-6受体抗体对神 经浸润的影响的图。A;显示给予JAK抑制剂AG490时的经时性浸润距离的图。DMS0 ;显示 对照组、AG490 ;显示AG490给药组。B;显示给予抗IL-6受体抗体时的经时性浸润距离的 图。hIgG;显示对照组、MRA;显示抗IL-6受体抗体给药组。
【具体实施方式】
[0063] 在本发明中，"IL-6抑制剂"是指阻断IL-6的信号传递、抑制IL-6的生物学活性的 物质。IL-6抑制剂的具体例子有：与IL-6结合的物质、与IL-6受体结合的物质、与gpl30 结合的物质等。作为IL-6抑制剂，可W列举；抑制作为IL-6的细胞内信号重要的STAT3磯 酸化的物质、例如AG490等。对IL-6抑制剂没有特别限定，包括抗IL-6抗体、抗IL-6受体 抗体、抗gpl30抗体、IL-6修饰体、可溶性IL-6受体修饰体、IL-6部分肤、IL-6受体部分 肤、与上述物质显示出同样的活性的低分子化合物等。
[0064] 作为比-6抑制剂的优选方案，可W列举；比-6受体抑制剂、特别是抗比-6受体抗 体。
[0065] 对本发明中使用的抗体的来源没有特别限定，但优选来自哺乳动物，更优选来源 于人的抗体。
[0066] 本发明中使用的抗体，可W利用公知的方法W多克隆或单克隆抗体的形式得到。 作为本发明中使用的抗体，特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单 克隆抗体有；由杂交瘤产生的单克隆抗体；W及利用基因工程学方法，通过携带抗体基因 的表达载体转化宿主，在所得宿主中产生的单克隆抗体。通常，该抗体通过与IL-6JL-6受 体、gpl30等结合，阻断向细胞内传递IL-6的生物学活性。
[0067] 产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可W利用公知技术，如下操作来制作。目P，使 用 IL-6受体、比-6、甜130等作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫，再按照通常 的细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，利用通常的筛选方法筛选产生单 克隆抗体的细胞，从而可W制作杂交瘤。
[006引具体而言，制作单克隆抗体时可W如下进行。例如，制作抗IL-6受体抗体时，被用 作用于取得抗体的致敏抗原的人IL-6受体使用欧州专利申请公开号EP325474中公开的 IL-6受体基因/氨基酸序列、而小鼠IL-6受体使用日本专利申请公开号特开平3-155795 中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列，从而得到抗IL-6受体抗体。
[0069]IL-6受体蛋白有W下两种：在细胞膜上表达的IL-6受体蛋白和从细胞膜上脱 离的比-6受体蛋白（可溶性比-6受体）（Yas址awa，K.等人，J.Biochem. (1990) 108， 673-676)。可溶性IL-6受体实质上由与细胞膜结合的IL-6受体的胞外区构成，跨膜区或 跨膜区和胞内区缺失，该一点不同于膜结合型IL-6受体。只要IL-6受体蛋白能够用作制 作本发明中使用的抗IL-6受体抗体的致敏抗原，可W使用任一种IL-6受体。
[0070] 将IL-6受体的基因序列插入到公知的表达载体系统中，使适当的宿主细胞转化， 之后按照公知方法从其宿主细胞中或培养上清中纯化目标IL-6受体蛋白，可W使用该纯 化IL-6受体蛋白作为致敏抗原。此外，可W使用表达IL-6受体的细胞或IL-6受体蛋白与 其他蛋白的融合蛋白作为致敏抗原。
[OCm]同样，使用比-6作为用于取得抗体的致敏抗原时，通过使用化r. J.Biochem(1987) 168,543-550、J.Immunol. (1988) 140,15:34-1541 或Agr.Biol.Chem. (1990)54,2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列，从而得到人IL-6。作为取得抗 甜130抗体的致敏抗原，可W使用欧州专利申请公开号EP411946中公开的甜130基因/氨 基酸序列。
[0072] 对用致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定，但优选考虑其与用于细胞融合的亲 本细胞的适应性后再进行选择，通常使用晒齿类动物、例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
[0073] 用致敏抗原对动物进行免疫按照公知方法进行。例如，作为一般的方法，通过向哺 乳动物的腹腔内或皮下注射致敏抗原来进行。具体而言，用PBS(磯酸缓冲盐）或生理盐水 等稀释致敏抗原至适当量并使之悬浮，根据需要，向所得悬浮物中适量混合通常的佐剂、例 如弗氏完全佐剂，乳化后，优选每4~21天对哺乳动物给药数次。进行致敏抗原免疫时，可 W使用适当的载体。
[0074] 如此地对哺乳动物进行免疫，确认血清中所需抗体水平升高后，从哺乳动物中采 集免疫细胞用于细胞融合。作为用于细胞融合的优选的免疫细胞，特别优选使用脾细胞。
[0075] 作为与上述免疫细胞融合的另一方的亲本细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞，优选使 用已公知的各种细胞株、例如P3X63Ag8. 653 (Kearney,J.F.等人.J.Immunol. (1979) 123， 1548-1550)、P3X63Ag8U.l(Qi;rrentTopicsinMicrobiologyandImmunology(1978)81， 1-7)、NS-UKohler.G.和Mi1stein,C.Eur.J.Immunol. (1976) 6,511-519)、 MPC-ll(Margulies.D.H.等人，Cell(1976)8,405-415)、SP2/0(auilman，M.等人， 化1:山"6 (1978) 276, 269-270)、F0(deSt.Groth，S.F.等人，J.Immunol.Methods(1980) 35， 1-21)、S194 (Trowbridge,I.S.J.Exp.Med. (1978) 148, 313-323)、R210 (Galfre，G.等人， 化Uire(1979) 277,131-133)等。
[0076] 上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可W按照公知的方法、例如 Milstein等人的方法化ohler.G.和Milstein，C.，MethodsEnzymol. (1981)73,3-46)等 来进行。
[0077] 更具体而言，例如在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施上述 细胞融合。作为融合促进剂，例如使用聚己二醇（PEG)、仙台病毒（HVJ)等，为了进一步提高 融合效率，根据需要，还可W添加使用二甲基亚讽等辅助剂。
[0078] 关于免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例，例如优选使免疫细胞为骨髓瘤细胞的 1~10倍。用于上述细胞融合的培养液例如可W使用；适合上述骨髓瘤细胞株增殖的 RPMI1640培养液、MEM培养液、W及用于该种细胞培养的常规培养液。还可W结合使用胎牛 血清（FC巧等血清补充液。
[0079] 细胞融合可如下进行：将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充 分混合，通常再W30~60% (w/v)的浓度添加预先加热至37°C左右的PEG溶液、例如平均 分子量为1000~6000左右的PEG溶液，混合，从而形成目标融合细胞（杂交瘤）。接着，依 次添加适当的培养液，离屯、W除去上清，重复进行该操作，从而可W除去不利于杂交瘤生长 的细胞融合剂等。
[0080] 该杂交瘤通过在常规选择培养液、例如HAT培养液（含有次黄嚷岭、氨基蝶岭和胸 腺喀晚核巧的培养液）中培养而进行选择。为了使目标杂交瘤W外的细胞（非融合细胞） 死亡，使用该HAT培养液继续培养足够的时间、通常为数天~数周。接着，实施常规的极限 稀释法，可W进行产生目标抗体的杂交瘤的筛选和克隆。
[0081] 除了用抗原对人W外的动物进行免疫W得到上述杂交瘤W外，在体外用所需的抗 原蛋白或表达抗原的细胞致敏人淋己细胞，使致敏B淋己细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融 合，也可W得到与所需的抗原或表达抗原的细胞具有结合活性的所需人抗体（参照日本特 公平1-59878)。而且，对具有完全人抗体基因的所有组成成分（r巧ertoire)的转基因动物 给予抗原或表达抗原的细胞，按照上述方法可W获得所需的人抗体（参照国际专利申请公 开号W0 93/12227、W0 92/03918、W0 94/02602、W0 94/25585、W0 96/：M096、W0 96/33735)。
[0082] 如此制作的产生单克隆抗体的杂交瘤，可W在常规培养液中进行传代培养，还可 W在液氮中长期保存。
[0083] 为了由该杂交瘤获得单克隆抗体，可W采用W下方法：按照常规方法培养该杂交 瘤，W其培养上清的形式得到单克隆抗体的方法；或者，将杂交瘤给予与其具有适合性的哺 乳动物W使其增殖，W其腹水的形式得到单克隆抗体的方法等。前一种方法适合得到高纯 度的抗体，而后一种方法适于大量生产抗体。
[0084] 例如，产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制作可W通过日本特开平3-139293中公 开的方法来进行。可W按照下述方法进行；将产生PM-1抗体的杂交瘤注入BALB/c小鼠的 腹腔内得到腹水，从该腹水中纯化PM-1抗体的方法；或者，在适当的培养基、例如含有10% 胎牛血清、5%BM-CondimedH1 炬〇6虹ingerMannheim制）的RPMI1640 培养基、杂交瘤SFM 培养基佑IBC0-B化制）、PFHM-II培养基佑IBC0-B化制）等中培养本杂交瘤，从其培养上 清中纯化PM-1抗体的方法。
[0085] 在本发明中，作为单克隆抗体，可W使用下述抗体：由杂交瘤克隆抗体基因，之 后将其插入适当的载体中，再将其导入宿主中，利用基因重组技术产生的重组型抗体（例 如参照BorrebaeckC.A.K.和LarrickJ.W.T肥RAP抓TICMONO化0NALANTIB孤IES， Publishedinthe化itedKingdombyMACMILLANPUBLIS肥RSLTD,1990)。
[0086] 具体而言，从产生目标抗体的细胞、例如杂交瘤中分离编码抗体可变（V)区 的mRNA。分离mRNA时，利用公知的方法、例如脈超离屯、法（Chirgwin，J.M.等人， Biochemist;ry(1979) 18,5294-5299)、AGPC法（Qiomczynski'P.等人，Anal.Biochem. (1987) 162,156-159)等制备总RNA，再使用mRNA纯化试剂盒（Pharmacia制）等制备mRNA。 另外，通过使用如ickPrepmRNA纯化试剂盒（Pharmacia制），可W直接制备mRNA。
[0087] 使用逆转录酶由所得的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可W使用AMV 逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒（AMVReverseTranscriptaseFirst-strandcDNA SynthesisKit)等来进行。进行cDNA的合成和增幅时，可W采用使用5'-AmpliFIND邸 RACE试剂盒（Clontech制）和PCR的 5'-RACE法（化ohman，M.A.等人，Proc.化tl. Acad.Sci.USA(1988) 85,8998-9002 ;Belyavsky，A.等人，NucleicAcidsRes. (1989) 17， 2919-2932)。从所得的PCR产物中纯化目标DM片段，将其与载体DM连接。再由此制作 重组载体并导入大肠杆菌等中，选择菌落，制备所需的重组载体。利用公知的方法、例如脱 氧法来确认目标DNA的核巧酸序列。
[008引得到编码目标抗体V区的DNA时，将其与编码所需抗体恒定区（C区）的DNA连接， 再将其插入表达载体中。或者，可W将编码抗体V区的DNA插入含有抗体C区的DNA的表 达载体中。
[0089] 制备本发明中使用的抗体时，按照后述的方式将抗体基因插入表达载体中，使之 在表达调节区、例如增强子、启动子的调节下表达。接下来，利用该表达载体转化宿主细胞， 可W使抗体表达。
[0090] 在本发明中，可W使用进行人为修饰W降低对人的异种抗原性等的基因重组型抗 体、例如嵌合烟limeric)抗体、人源化（Humanized)抗体等。该些修饰抗体可W利用已知 的方法进行制备。
[0091] 关于嵌合抗体，通过连接如上操作得到的编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区 的DNA，将其插入表达载体中，再导入宿主中，使产生抗体，从而得到嵌合抗体（参照欧州专 利申请公开号EP125023、国际专利申请公开号W0 92-19759)。可W利用该已知方法得到 对本发明有用的嵌合抗体。
[0092] 人源化抗体也称作重构（reshaped)人抗体或人型化抗体，是将人W外的哺乳动 物、例如小鼠抗体的互补性决定区（CDR)移植到人抗体的互补性决定区中而得到的抗体， 其常规基因重组方法也是已知的（参照欧州专利申请公开号EP125023、国际专利申请公 开号W0 92-19759)。
[0093] 具体而言，利用PCR法由多个制作成在末端部具有重叠部分的寡核巧酸合成设计 成连接小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区（FR;化ameworkregion)的DNA序列。连接所 得的DNA和编码人抗体C区的DNA，接着插入到表达载体中，再将其导入宿主中，使之产生 抗体，从而得到人源化抗体（参照欧州专利申请公开号EP239400、国际专利申请公开号W0 92-19759)〇
[0094] 经由CDR连接的人抗体的FR选择互补性决定区形成良好的抗原结合位点的构架 区。根据需要，可W取代抗体可变区中的构架区的氨基酸，使重构人抗体的互补性决定区形 成适当的抗原结合位点（Sato,K.等人，CancerRes. (1993)53,851-856)。
[0095] 嵌合抗体、人源化抗体中 通常使用人抗体C区。人抗体重链C区的例子有；C丫等， 例如可W使用C丫 1、C丫 2、C丫 3或C丫 4。人抗体轻链C区的例子有；例如K或A。另外， 为了改善抗体或其产生的稳定性，可W对人抗体C区进行修饰。
[0096] 嵌合抗体由来自人W外的哺乳动物的抗体的可变区和来自人抗体的C区构成，而 人源化抗体由来自人W外的哺乳动物的抗体的互补性决定区和来自人抗体的构架区和C 区构成，由于该些抗体在人体内的抗原性降低，所W作为用作药品的抗体是有效的。
[0097] 本发明所使用的人源化抗体的优选的具体例子有；人源化PM-1抗体（参照国际专 利申请公开号W0 92-19759)。
[0098] 作为获得人抗体的方法，除之前阐述的方法外，还已知使用人抗体文库，通过淘 选获得人抗体的技术。例如，还可W利用瞻菌体展示法使人抗体的可变区作为单链抗体 (scFv)在瞻菌体表面表达，然后可W选择与抗原结合的瞻菌体。分析所选择的瞻菌体的基 因时，可W确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。明确了与抗原结合的scFv 的DM序列后，制作包含该序列的适当的表达载体，可W获得人抗体。该些方法已经众所 周知，可W参考W0 92/01047、W092/2079UW0 93/06213、W0 93/11236、W0 93/19172、W0 95/01438、W0 95/15388。
[0099] 按照上述方式构建的抗体基因，可W利用公知的方法使之表达。使用哺乳类细胞 时，可W利用使常用的有用启动子、所要表达的抗体基因及其3'侧下游的polyA信号功 能性结合的DM或含有该DM的载体使之表达。例如，作为启动子/增强子，可W列举；人 巨细胞病毒前期启动子 / 增强子化umancytomegalovirusimmediateearlypromoter/ enhancer)〇
[0100] 除此之外，作为本发明中使用的、可用于抗体表达的启动子/增强子，可W使用 逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子或人延伸因子 1a(肥F1a)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。
[0101] 例如，当使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等人的方法（Mulligan， R.C.等人，化化re(1979)277，108-114)可W容易地实施；而当使用肥Fla启动子/增 强子时，按照Mizushima等人的方法（Mizushima，S.和 ^gata，S.NucleicAcidsRes. (1990) 18,5322)可W容易地实施。
[0102] 使用原核细胞作为宿主时，有使用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞，已知有大 肠杆菌化coli)、枯草杆菌。
[0103] 当为大肠杆菌时，可W使常用的有用启动子、用于抗体分泌的信号序列、所要表 达的抗体基因功能性结合而使之表达。例如，启动子的例子有；lacZ启动子、araB启动 子。使用lacZ启动子时，可W按照Ward等人的方法（Ward,E.S.等人，化Uire(1989) 341， 544-546 ;Ward，E.S.等人.FASEBJ. (1992)6,2422-2427)进行；使用araB启动子时，可W 按照Better等人的方法炬etter，M.等人.Science(1988) 240,1041-1043)进行。
[0104] 作为用于抗体分泌的信号序列，当其在大肠杆菌的周质中产生时，可W使用pelB 信号序列（Lei，S.P.等人J.Bacteriol. (1987) 169,4379-4383)。分离周质中产生的抗体 后，适当地重折叠（refold)抗体的构造后使用（例如参照W0 96/30394)。
[0105] 作为复制起点，可W使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒炬PV)等的 复制起点。并且，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，表达载体中可W包含氨基糖巧磯 酸转移酶（APH)基因、胸腺喀晚核巧激酶（TK)基因、大肠杆菌黄嚷岭-鸟嚷岭磯酸核糖转 移酶巧CO甜t)基因、二氨叶酸还原酶（化化）基因等作为选择标志物。
[0106] 可W使用任意的产生系统W制备本发明中使用的抗体。用于制备抗体的产生系统 有体外（invitro)和体内（invivo)产生系统。体外产生系统的例子有；使用真核细胞的 产生系统和使用原核细胞的产生系统。
[0107]使用真核细胞作为宿主时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的产生系统。作 为动物细胞，已知有；（1)哺乳类细胞、例如CH0、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾）、化La、Vero等；（2)两栖类细胞、例如非洲爪赡卵母细胞狂enopusoocytes);或（3)昆虫细胞、例如 sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知有来源于烟草（Nicotianat油acum)的细胞，可W对 其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有；酵母，例如酵母菌（Saccharomyces)属（例 如啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae)) 及丝状菌，例如曲霉属（Aspergillus)(例 如黑曲霉（Aspergillusniger)等）。
[0108] 通过转化将目标抗体基因导入该些细胞中，之后在体外培养所转化的细胞，从而 得到抗体。可W按照公知方法进行培养。例如，可W使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作为 培养液，还可W结合使用胎牛血清（FC巧等血清补充液。此外，通过将导入有抗体基因的细 胞移入动物的腹腔等中，可W在体内产生抗体。
[0109] 另一方面，作为体内的产生系统，可W列举；使用动物的产生系统或使用植物的产 生系统。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的产生系统等。
[0110] 作为哺乳类动物，可W使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等（VickiGlaser,S阳CTRUM BiotechnologyApplications, 1993)。作为昆虫，可W使用蚕。使用植物时，例如可W使用 烟草。
[0111] 向该些动物或植物中导入抗体基因，使在动物或植物的体内产生抗体并回收。例 如，将抗体基因插入编码山羊0-酪素该样的乳汁中固有产生的蛋白的基因的中途，W 融合基因的形式进行制备。再将携带插入有抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山 羊胚胎（embryo)中，将该胚胎导入雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从 该转基因山羊或其后代产生的乳汁中可W得到所需抗体。为了使转基因山羊产生的含 有所需抗体的乳汁量增加，可W对转基因山羊使用适当的激素巧bert，K.M.等人，Bio/ Technology(1994) 12,699-702)。
[0112] 使用蚕时，使蚕感染插入有目标抗体基因的杆状病毒，从该蚕的体液中得到所需 抗体（Maeda，S.等人，化化re(1985) 315, 592-594)。并且，使用烟草时，将目标抗体基因插 入到植物表达用载体例如PM0N530中，再将该载体导入到根瘤±壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)该样的细菌中。用该细菌感染烟草例如烟草（Nicotianat油acum)，从该烟 草的叶中得到所需抗体（Julian,K. -C.Ma等人，Eur.J.Immunol. (1994) 24,131-138)。
[0113] 按照上述方式利用体外或体内的产生系统产生抗体时，可W将编码抗体重链化 链）或轻链（L链）的DNA分别插入表达载体中，同时转化宿主；或者，可W将编码H链和L 链的DNA插入单一的表达载体中，用于转化宿主（参照国际专利申请公开号W0 94-11523)。
[0114] 本发明中使用的抗体，只要能够适用于本发明，可W是抗体的片段或其修饰物。例 如，作为抗体片段，可W列举；F油、F(油'）2、Fv或用适当的接头连接H链和L链的Fv而形 成的单链Fv(scFv)。
[0115] 具体而言，用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体而生成抗体片段，或者，构 建编码该些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表 达（例如参照Co,M.S.等人，J.Immunol. (1994) 152,2968-2976 ;Better，M. &Horwitz， A.比MethodsinEnzymology(1989) 178,476-496 ;Plueckthun，A. &Skerra，A.Methods inEnzymology(1989) 178,497-515 ;Lamoyi，E.，MethodsinEnzymology(1989) 121， 652-663 ;Rousseaux，J.等人，MethodsinEnzymology(1989) 121,663-66 ;Bird，R.E.等 人，TIBTECHQ991)9,132-137)。
[0116]scFv可W通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。在该scFv中，H链V 区和L链V区经由接头、优选肤接头来连接化uston，J.S.等人、Proc.化tl.Acad.Sci. U.S.A. (1988)85,5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可W来自作为上述抗体而记 载的任一种抗体。作为连接V区的肤接头，例如使用包含12-19个氨基酸残基的任意的单 链肤。
[0117]W编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、W及编码L链或L链V区的DNA为模 板，使用引物对通过PCR法扩增编码该些序列中的所需氨基酸序列的DNA部分，所述引物对 规定该DNA部分的两端，然后，将编码肤接头部分的DNA和规定其两端与各H链、L链连接 的引物对组合起来，进一步进行扩增，从而得到编码scFv的DNA。
[0118] 一旦制作了编码scFv的DM,就可W按照常规方法得到含有该些DM的表达载体 和通过该表达载体转化的宿主，还可W使用该宿主，按照常规方法得到scFv。
[0119] 关于该些抗体的片段，可W进行与上述相同的操作，获得其基因并使之表达，利用 宿主产生该些抗体的片段。本发明中所说的"抗体"还包含该些抗体的片段。
[0120] 作为抗体的修饰物，还可W使用与聚己二醇（PEG)等各种分子结合的抗体。本发 明中所说的"抗体"还包含该些抗体修饰物。为了得到该样的抗体修饰物，可W通过对所得 抗体施行化学修饰而得到。该些方法在该领域已经确立。
[0121] 按照上述方式产生、表达的抗体可W从细胞内外、宿主中分离出来，并纯化至均 匀。本发明中使用的抗体的分离、纯化可W通过亲和层析来进行。作为亲和层析中使用 的柱，例如有蛋白A柱、蛋白G柱。作为蛋白A柱中使用的载体，例如有HyperD、P0R0S、 Se地aroseF.F.等。此外，可W使用普通蛋白中使用的分离、纯化方法，对其没有任何限定。
[0122] 例如，可W适当选择、组合上述亲和层析W外的层析、滤器、超滤、盐析、透析等来 分离、纯化本发明中使用的抗体。作为层析，例如有离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。 该些层析可适用于HPLC(高效液相色谱法）。此外，可W使用反相HPLCCreverse地ase HPLC)〇
[0123] 上述所得抗体的浓度测定可W通过吸光度的测定或化ISA等来进行。目P，通过测 定吸光度来测定抗体浓度时，用PBS(-)进行适当稀释后，测定280nm的吸光度，WImg/ml 作为1.350D，算出抗体浓度。通过化ISA来测定抗体浓度时，可如下测定。目P，向96孔板 (Nunc制）中加入100y1用0. 1M的碳酸氨盐缓冲液（pH9. 6)稀释至1yg/ml的山羊抗人 IgGCTAG制），在4°C下培养一夜，将抗体固化。封闭后，添加lOOiU已适当稀释的本发明中 使用的抗体或含有抗体的样品、或作为标准品的人IgG(CAPP化制），在室温下培养1小时。
[0124]清洗后，加入100y1经5000倍稀释的碱性磯酸酶标记抗人 IgG炬10SOURCE制）， 在室温下培养1小时。清洗后，加入底物溶液进行培养，之后使用MICR0PLATEREA呢RModel 3550炬io-Rad制）测定405皿的吸光度，算出目标抗体的浓度。
[012引对抗比-6抗体的具体例子没有特别限定，可W列举；MH166(Matsuda，T.等人，Eur.J.Immunol. (1998) 18,951-956)或SK2抗体（SatoK等人，第21回日本免疫学会絶会 (第21次日本免疫学会总会）、学术记录（1991)21,166)等。
[012引对抗比-6受体抗体的具体例子没有特别限定，可W列举；MR16-1抗体（Tamura，T.等人.Proc.化tl.Acad.Sci.USA(1993) 90,11924-11928)、PM-1 抗体化irata，Y.等人， J.Immunol. (1989) 143, 2900-2906)、AUK12-20 抗体、AUK64-7 抗体或AUK146-15 抗体（国 际专利申请公开号WO92-19759)等。其中，作为对抗人IL-6受体的优选的单克隆抗体， 可W例示PM-1抗体，而作为对抗小鼠IL-6受体的优选的单克隆抗体，可W列举MR16-1抗 体，但并不限于此。作为人源化抗IL-6受体抗体的优选的例子，可W列举人源化PM-1抗体 (Tocilizumab、MRA)。人源化抗IL-6受体抗体的其他优选的例子有；W0 2009/041621中 记载的抗体。并且，作为抗IL-6受体抗体的其他优选方案，可W列举；与人源化PM-1抗体 (Tocilizumab、MRA)所识别的表位识别相同表位的抗IL-6受体抗体。
[0127] 对于抗gpl30抗体的具体例子没有特别限定，可W列举：AM64抗体（日本公开公 报日本特开平3-219894)、4B11抗体、2H4抗体（美国专利公报US5571513)、B-P8抗体（日 本公开公报日本特开平8-291199)等。
[012引本发明中使用的IL-6修饰体是与IL-6受体具有结合活性、且不传递IL-6的生物 学活性的物质。目P，虽然IL-6修饰体和IL-6竞争与IL-6受体结合，但由于IL-6修饰体不 传递IL-6的生物学活性，所W其阻断由IL-6介导的信号传递。
[0129] 通过取代IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基来导入突变，制作IL-6修饰体。用作 IL-6修饰体的基础的IL-6,虽然对其来源没有限定，但考虑到抗原性等，优选为人IL-6。 具体而言，使用公知的分子模型程序、例如WHATIF(化iend等人，J.Mol.Graphics(1990)8， 52-56)预测IL-6的氨基酸序列的二级结构，再评价被取代的氨基酸残基对整体的影响，由 此进行氨基酸取代。确定了适当的取代氨基酸残基后，W包含编码人IL-6基因的核巧酸序 列的载体为模板，利用通常进行的PCR法导入突变，使氨基酸被取代，从而得到编码IL-6修 饰体的基因。根据需要，将该基因插入适当的表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、产 生及纯化方法，可W得到IL-6修饰体。
[0130]比-6 修饰体的具体例子有：化akenhoff等人，J.Biol.Chem. (1994)269,86-93 和 Savino等人，EMB0J. (1994) 13,1357-1367、W096-18648、W0 96-17869 中公开的IL-6 修饰 体。
[0131]IL-6受体部分肤是包含在IL-6受体的氨基酸序列中与IL-6和IL-6受体的结合 相关的区的一部分或全部的氨基酸序列的肤。该样的肤通常包含10~80个、优选20~50 个、更优选20~40个氨基酸残基。
[0132] 在IL-6受体的氨基酸序列中，特定与IL-6和IL-6受体的结合相关的区，根据该 特定的区的一部分或全部的氨基酸序列，利用通常已知的方法、例如基因工程学方法或肤 合成法，可W制作IL-6受体部分肤。
[0133] 利用基因工程学方法制作IL-6受体部分肤时，将编码所期望的肤的DNA序列插入 表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、产生及纯化方法可W得到IL-6受体部分肤。
[0134] 利用肤合成法制作IL-6受体部分肤时，可W采用肤合成中通常使用的方法、例如 固相合成法或液相合成法。
[0135] 具体而言，可W按照"続医薬品①開発第14卷乂文子F合成（续医药品的开发第 14卷肤合成）"监修矢岛治明广川书店1991年中记载的方法来进行。作为固相合成法，采用 W下方法；例如使欲合成的肤的C末端所对应的氨基酸与不溶于有机溶剂的支撑体结合， 交替重复进行使a-氨基和侧链官能团用适当的保护基保护起来的氨基酸按照C末端一N 末端方向依次缩合每1个氨基酸的反应、W及使树脂上结合的氨基酸或肤的a-氨基的该 保护基脱离的反应，从而使肤链伸长。根据所用保护基的种类，固相肤合成法大致分为Boc 法和Fmoc法。
[0136] 如此操作合成目标肤后，进行脱保护反应和从支撑体上切断肤链的反应。在肤链 的切断反应中，采用Boc法时，可W使用氣化氨或S氣甲横酸；采用Fmoc法时，通常可W使 用TFA。在Boc法中，例如在氣化氨中、在茵香離存在下处理上述保护肤树脂。然后，进行保 护基的脱离和从支撑体上切断肤链，回收肤。将其冷冻干燥，从而得到粗肤。而在Fmoc法 中，例如可W在TFA中、按照与上述相同的操作进行脱保护反应和从支撑体上切断肤链的 反应。
[0137] 通过将得到的粗肤应用于HPLC，可W分离、纯化。洗脱时，可W使用蛋白纯化中通 常使用的水-己膳系溶剂，在最佳条件下进行洗脱。分离收集得到的色谱图的峰所对应的 组分，将其冷冻干燥。对如此纯化的肤组分通过利用光谱分析进行的分子量解析、氨基酸组 成分析或氨基酸序列解析等进行鉴定。
[013引本发明的IL-6抑制剂可用于神经浸润的抑制。在本发明中，"神经浸润"是指癌 细胞及其他细胞侵入神经组织中生长的方式，有时还伴有组织破坏（破坏性生长）等。本 发明中，作为优选的神经浸润，可W列举；癌细胞的神经浸润。抑制癌细胞的浸润时，对作为 对象的癌症种类没有特别限定，可W是膜腺癌、胃癌、前列腺癌、头颈部癌、乳癌、肺癌、大肠 癌、卵巢癌等任何癌症种类，但优选抑制膜腺癌细胞的浸润。神经浸润的抑制可W是抑制向 末梢侧进行的神经浸润，也可W是抑制向中枢侧进行的神经浸润，但由于膜腺癌细胞存在 对中枢侧进行神经浸润的趋势，所W优选抑制向中枢侧进行的神经浸润（例如，从神经损 伤部位向中枢侧进行的神经浸润）。
[0139] 本发明中，"神经浸润的抑制"是指抑制神经浸润的发生、降低神经浸润的发生率、 缩短神经浸润距离、延缓神经浸润速度等。
[0140] 通过利用本发明的比-6抑制剂抑制神经浸润，可此治疗、抑制神经浸润所伴随的 各种症状（例如癌症性疼痛等疼痛、贫血、体力状态（P巧下降、营养不良等）。因此，本发明 还包括含有IL-6抑制剂的神经浸润所伴随的各种症状的治疗药、抑制剂。
[0141] 本发明的膜腺癌治疗药可W在膜腺癌的治疗和/或预防中使用。
[0142] 本发明中，"膜腺癌治疗"是指抑制膜腺癌的发生、降低膜腺癌的发生率、抑制膜腺 癌细胞的增殖、缩小膜腺癌组织、改善膜腺癌的症状、抑制膜腺癌的转移等。
[0143] 本发明中使用的IL-6抑制剂的效果例如可信号传递抑制活性为指标进行评 价，但并不限于此。IL-6抑制剂的信号传递抑制活性可W利用通常使用的方法进行评价。 具体而言，培养IL-6依赖性人骨髓瘤株（S6B45，KPMM2)、人LennertT淋己瘤细胞株KT3或 比-6依赖性细胞M册0.BSF2,向其中添加比-6,同时共存比-6抑制剂，由此可W测定比-6 依赖性细胞的巧-胸腺喀晚核巧摄入。另外，培养作为IL-6受体表达细胞的U266,并添加 issi标记IL-6,同时加入IL-6抑制剂，由此测定与IL-6受体表达细胞结合的1251标记IL-6。 在上述测定系统中，除存在IL-6抑制剂的组W外，还设置不含IL-6抑制剂的阴性对照组， 比较两者所得的结果，可W评价IL-6抑制剂的IL-6抑制活性。
[0144] 本发明的治疗药或抑制剂的给药对象为哺乳动物。哺乳动物优选为人。
[0145] 本发明的治疗药或抑制剂可药品形式进行给药，可W通过口服或胃肠外进行 全身或局部给药。例如，可W选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、 栓剂、灌肠剂、口服性肠溶剂等，根据患者的年龄、症状来选择适当的给药方法。有效给药 量可W在每次、每1kg体重0.Olmg~lOOmg的范围内选择。或者，可W选择每名患者1~ lOOOmg、优选5~50mg的给药量。关于优选的给药量、给药方法，例如当为抗比-6受体抗 体时，血中存在的游离抗体的程度的量为有效给药量，具体例子有下述方法：每1kg体重、1 个月（4周）给予0. 5mg~40mg、优选Img~20mg，分1次~数次、例如按照2次/周、1次 /周、1次/2周、1次/4周等给药时间表，通过点滴等静脉内注射、皮下注射等方法进行给药 等。还可W边观察患者的状态和血液检查值的动向，边由2次/周或1次/周延长给药间 隔至1次/2周、1次/3周、1次/4周等，W调整给药时间表。
[0146] 在本发明的治疗药或抑制剂中，可W添加保存剂或稳定剂等制剂上可接受的载 体。制剂上可接受的载体是指可W与上述药物一同给药的材料。作为制剂上可接受的材 料，可w列举；例如灭菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、馨合 剂巧DTA等）、粘合剂等。
[0147]本发明中，作为表面活性剂，可W列举非离子表面活性剂，典型例子有：例如脱水 山梨糖醇单辛酸醋、脱水山梨糖醇单月桂酸醋、脱水山梨糖醇单栋桐酸醋等脱水山梨糖醇 脂肪酸醋；单辛酸甘油醋、单肉豆違酸甘油醋、单硬脂酸甘油醋等脂肪酸甘油醋；单硬脂酸 十聚甘油醋、二硬脂酸十聚甘油醋、单亚油酸十聚甘油醋等脂肪酸聚甘油醋；聚氧己締脱水 山梨糖醇单月桂酸醋、聚氧己締脱水山梨糖醇单油酸醋、聚氧己締脱水山梨糖醇单硬脂酸 醋、聚氧己締脱水山梨糖醇单栋桐酸醋、聚氧己締脱水山梨糖醇=油酸醋、聚氧己締脱水山 梨糖醇=硬脂酸醋等聚氧己締脱水山梨糖醇脂肪酸醋；聚氧己締山梨糖醇四硬脂酸醋、聚 氧己締山梨糖醇四油酸醋等聚氧己締山梨糖醇脂肪酸醋；聚氧己締甘油单硬脂酸醋等聚氧 己締甘油脂肪酸醋；聚己二醇二硬脂酸醋等聚己二醇脂肪酸醋；聚氧己締月桂離等聚氧己 締烷基離；聚氧己締聚氧丙締二醇、聚氧己締聚氧丙締丙離、聚氧己締聚氧丙締嫁蜡離等聚 氧己締聚氧丙締烷基離；聚氧己締壬基苯基離等聚氧己締烷基苯基離；聚氧己締藍麻油、 聚氧己締硬化藍麻油（聚氧己締氨化藍麻油）等聚氧己締硬化藍麻油；聚氧己締山梨糖醇 蜂蜡等聚氧己締蜂蜡衍生物；聚氧己締羊毛脂等聚氧己締羊毛脂衍生物；聚氧己締硬脂酸 酷胺等聚氧己締脂肪酸酷胺等具有HLB6~18的非离子表面活性剂等。
[014引作为表面活性剂，还可W列举阴离子表面活性剂，典型例子有：例如十六烷基硫酸 钢、十二烷基硫酸钢、油締基硫酸钢等具有碳原子数为10~18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧 己締十二烷基硫酸钢等氧化己締的平均加成摩尔数为2~4、烷基的碳原子数为10~18的 聚氧己締烷基離硫酸盐；月桂基横基班巧酸醋钢等烷基的碳原子数为8~18的烷基横基班 巧酸醋盐；天然类的表面活性剂、例如卵磯脂、甘油磯脂；神经銷磯脂等銷磯脂；碳原子数 为12~18的脂肪酸的庶糖脂肪酸醋等。
[0149] 在本发明的药物中，可W组合添加1种或2种W上的上述表面活性剂。本发明的 制剂中使用的优选的表面活性剂为聚山梨醋任〇173〇&3*6)20、40、60或80等聚氧己締脱 水山梨糖醇脂肪酸醋，特别优选聚山梨醋20和80。此外，还优选泊洛沙姆（poloxamer) (PluronicF-68(注册商标）等）所代表的聚氧己締聚氧丙締二醇。
[0150] 表面活性剂的添加 量根据所用表面活性剂的种类而不同，当为聚山梨醋20或聚 山梨醋80时，其添加量通常为0. 001~lOOmg/mU优选为0. 003~50mg/mU进一步优选为 0.005 ~2mg/mL。
[0151] 在本发明中，作为缓冲剂，可W列举；磯酸、构檢酸缓冲液、己酸、苹果酸、酒石酸、 班巧酸、乳酸、磯酸钟、葡萄糖酸、癸酸、脱氧胆酸、水杨酸、=己醇胺、富马酸等、其他有机酸 等、或碳酸缓冲液、Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、咪挫缓冲液等。
[0152] 通过将本发明的药物溶解于溶液制剂领域中公知的水性缓冲液中，可W制备溶液 制剂。缓冲液的浓度通常为1~500mM，优选为5~lOOmM，进一步优选为10~20mM。
[0153] 本发明的药物可W含有其他低分子量的多肤、血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等 蛋白、氨基酸、多糖和单糖等糖类或碳水化合物、糖醇。
[0154]在本发明中，作为氨基酸，可W列举；碱性氨基酸、例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟 氨酸等、或该些氨基酸的无机盐（优选盐酸盐、磯酸盐的形式、即磯酸氨基酸）。使用游离氨 基酸时，优选的抑值通过添加适当的生理上可接受的缓冲物质、例如无机酸、特别是盐酸、 磯酸、硫酸、己酸、甲酸或它们的盐来调节。此时，使用磯酸盐可w得到特别稳定的冷冻干燥 物，因此特别有利。制备物中实质上不含有机酸、例如苹果酸、酒石酸、构檢酸、班巧酸、富马 酸等时或不存在对应的阴离子（苹果酸离子、酒石酸离子、构檢酸离子、班巧酸离子、富马 酸离子等）时，特别有利。优选的氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。并且，还可W 使用酸性氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸、及其盐的形式（优选钢盐）；或中性氨基酸、例如 异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、鄉氨酸、甲硫氨酸、半脱氨酸或丙氨酸；或芳族 氨基酸、例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、或衍生物的N-己酷色氨酸。
[0155] 本发明中，作为多糖和单糖等糖类或碳水化合物，可W列举；例如葡聚糖、葡萄糖、 果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、庶糖、海藻糖、蜜=糖等。
[0156] 本发明中，作为糖醇，可W列举；例如甘露醇、山梨醇、肌醇等。
[0157] 将本发明的药物制成注射用水溶液时，可W将其与例如生理盐水、含葡萄糖或其 他辅助药（例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钢）的等渗溶液混合。该水溶液还 可W与适当的助溶剂（例如醇（己醇等）、多元醇（丙二醇、PEG等）、非离子性表面活性剂 (聚山梨醋80、肥0-50)等）结合使用。
[0158]根据需要，可W进一步含有稀释剂、助溶剂、FiH调节剂、缓解剂（soothingagent)、 含硫还原剂、抗氧剂等。
[0159] 本发明中，作为含硫还原剂，可W列举；例如N-己酷半脱氨酸、N-己酷高半脱氨 酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代己醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、琉基己酸及其盐、硫代硫酸钢、 谷脱甘肤、W及碳原子数为1~7的硫代链烧酸等具有琉基的含硫还原剂等。
[0160] 本发明中，作为抗氧剂，可W列举；例如异抗坏血酸、二了基哲基甲苯、了基哲基茵 香離、a-生育酪、醋酸生育酪抗坏血酸及其盐、k抗坏血酸栋桐酸醋、k抗坏血酸硬脂 酸醋、亚硫酸氨钢、亚硫酸钢、没食子酸S戊醋、没食子酸丙醋或己二胺四己酸二钢巧DTA)、 焦磯酸钢、偏磯酸钢等馨合剂。
[0161] 根据需要，还可W将药物封入微囊（哲甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙締酸甲 醋]等的微囊）中，或者制成胶体药物传递系统（脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒 和纳米囊等）（参照"Remington's化armaceuticalScience16thedition",OsloEd.， 1980等）。并且，将药物制成缓释制剂的方法也是公知的，可应用于本发明（Langer等人， J.Biomed.Mater.Res. 1981,15 ; 167-277 ;Langer，Chem.Tech. 1982,12 ;98-105 ;美国专利 第3, 773, 919号；欧州专利申请公开巧巧第58, 481号；Sidman等人，Biopolymers1983， 22 ;547-556;EP第 133, 988 号）。
[0162] 所使用的制剂上可接受的载体，根据剂型从上述载体中适当或组合选择，但并不 限于该些。
[0163] 本发明设及在对象中抑制神经浸润的方法，该方法包括：对发生神经浸润的对象 或有可能发病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
[0164] 本发明还设及在对象中治疗和/或预防膜腺癌的方法，该方法包括：对患有膜腺 癌的对象或有可能患病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
[0165] 本发明中，"对象"是指给予本发明的治疗药或抑制剂的生物体、该生物体体内的 一部分。对生物体没有特别限定，包括动物（例如人、家畜动物种类、野生动物）。
[0166] 对"生物体体内的一部分"没有特别限定，可W优选列举；疾病部位等。
[0167] 本发明中，"给药"包括口服给药或胃肠外给药。作为口服给药，可W列举；W口服 审IJ剂的形式进行的给药；作为口服制剂，可W选择颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂 或悬浮剂等剂型。
[016引作为胃肠外给药，可W列举；W注射剂的形式进行的给药，注射剂的例子有；皮下 注射剂、肌肉注射剂或腹腔内注射剂等。通过利用基因疗法将应该给予的含有寡核巧酸的 基因导入生物体内，可W实现本发明的方法的效果。还可W将本发明的药物对欲实施处置 的部位进行局部给药。例如，还可W通过手术中的局部注入、插管的使用、或本发明的编码 肤的DNA祀向基因传递进行给药。
[0169] 实践本发明的方法时，可W将本发明的药物与至少一种其他药物（例如其他神经 浸润抑制剂或其他膜腺癌治疗药）一起作为药学组合物的一部分进行给药。在一个方案 中，本发明的药物和其他药物实质上可W同时给药。
[0170] 需要说明的是，本说明书中引用的所有先行技术文献均作为参照而纳入本说明书 中。
[0171] 实施例
[0172] 利用实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于此。本领域技术人员可W 进行各种变更、修饰，该些变更、修饰也包含在本发明中。
[0173] <材料和方法〉
[0174] (细胞）
[01巧]从AmericanTypeQiltureCollection(ATCC)购入人膜腺癌细胞株Capan-1、BxPC-3,按照ATCC推荐的操作指南，使用可W维持37度、5%C〇2的条件的恒温槽进行培养 和传代。
[0176](细胞数计测）
[0177] 从培养皿中采集细胞，使用台盼藍和血细胞计测盘计测活细胞。（趋化性分析） [017引将底面带有8ym的孔的细胞培养小室炬DFalcon)插入24个孔中，W细胞培养小 室作为上室，W孔作为下室。向下室中注入600y1用非血清培养液和人重组IL-6化rIL6) (R&Dsystems)制备的0、l、10、100ng/ml的虹IL6溶媒，向上室中注入100yl2Xl0e个/ ml的细胞悬浮液。培养24小时后，计测通过孔的细胞数。各组测定12次，再除WhrIL6为 Ong/ml时通过孔的平均细胞数，记录所得的数值，作为校正值。
[0179](伤口愈合分析）
[0180] 向24个孔中分别注入1ml3X105个/ml的细胞悬浮液，培养24小时。换成非血 清培养基，再培养24小时，之后用玻璃椿踏掉孔的中央部分，制作带状的无细胞区，计测其 宽度，交换培养基，使虹IL6溶媒达到0、1、10、lOOng/ml。培养24小时后，测定无细胞区的 宽度变化。各组测定12次，再除WhrIL6为化g/ml时的平均变化长度，记录所得的数值， 作为校正值。
[0181](抗体）
[0182]蛋白质印迹法中使用的一次抗体为：抗磯酸化STAT3抗体（Santa化UZ)、抗 STAT3 抗体（SantaCruz)、抗磯酸化化kl/2 抗体（CellSi即aling)、抗化kl/2 抗体（Cell Si即aling)、抗磯酸化Akt抗体（CellSi即aling)、抗Akt抗体（CellSi即aling)、抗Actin 抗体（Santa化uz)。巧光免疫染色中使用的一次抗体为：抗SlOO抗体值AKO)、抗小鼠IL-6 抗体（Santa化uz)，核染色使用DRAQ5(AXX0RA)。免疫染色中使用抗磯酸化STAT3抗体(SantaCruz)。
[0183](蛋白质印迹法）
[0184]使用裂解缓冲液（20mMH巧es-NaOHpH7. 0、0. 5%NP-40、15%甘油、300mM化C1、 ImM邸TA、10mMNaF)制作细胞溶解液。使用BCA蛋白测定试剂盒（PIERCE)测定蛋白浓 度后，使含有20mg蛋白的细胞溶解液在7. 5%或12%的丙締酷胺凝胶中进行电泳，之后转 移到聚偏二氣己締薄膜（Millipore)上。向薄膜上添加抗体，使用增强型化学发光试剂 (EnhancedChemiluminescenceReagent)(AmershamBiosciences)将蛋白表达图像化。
[0185](磯酸化STAT3免疫染色及其评价方法）
[0186] 使用微波在lOmM的构檢酸缓冲液中进行95°C、10分钟的加热处理W激活抗原，显 色时使用DAB。作为检体，使用从经过4周的26只小鼠神经浸润模型中采集的26根坐骨神 经。W神经浸润部的中枢侧顶端和末梢侧顶端作为目标区，使用40倍的物镜计测每个视野 的癌细胞数和磯酸化STAT3阳性癌细胞数，通过下式算出标记指数；（磯酸化STAT3阳性癌 细胞数）/(癌细胞数）。
[0187](神经浸润模型）
[018引所用小鼠为6周龄、雄性重度免疫功能不全小鼠（SCID小鼠）。按50mg/kg向小鼠 腹腔内给予己比妥，进行麻醉，露出左坐骨神经，使用微量注射器和30G针向坐骨神经内直 接注入2. 5y11. 0X104个/y1的癌细胞悬浮液。采集在评价时期注入了癌细胞的坐骨神 经，制作组织标本时，在4%低聚甲醒中、于4°C下静置一昼夜，W固定坐骨神经。将已固定 的上述坐骨神经切成3ym的厚度，进行苏木素-伊红染色或免疫染色，W测定神经浸润距 离。测定神经浸润距离时，使用沿神经长轴方向薄切的切片和物镜测微计啓），计测全 肿瘤范围的长轴。提取组织中的mRNA时，使用立即用Multi-Beads化ocker(安井器械） 破碎所采集的组织而得到的检体。
[0189](RNA提取和实时RT-PCR)
[0190]使用TRIzol(LifeTechnologies)，从自培养皿中采集的细胞团块（cell pellet)或破碎的组织断片中采集总RNA。使用ExScriptRT试剂试剂盒（Takara-bio) 和"TakaraPCRThermal切clerDice(Takara-bio)，按照"Takara-bio社推荐的操作指 南，由IXl〇3ng的总RNA合成cDNA。使用Smart切clerIISystem(Ce地eid)、SYBR RT-PCR试剂盒（Takara-bio)进行实时RT-PCR。引物使用分别特异性扩增人比-6a受 体（IL6R)、人比-6 0受体（甜130)、人GAPDH、小鼠比-6、小鼠EGF、小鼠GAPDH的cDNA 的引物。引物序列如下。人IL6R;正向tgagctcagatatcgggctgaac(SEQIDN0;1)、反向 cgtcgtggatgacacagtgatg(SEQIDNO；2)；人gpl30 ；正向gaagcaagtgggatcacctatgaa(SEQ IDN0;3)、反向ctgtagccttgagtatgggatgga(SEQIDN0;4);人GAPDH;正 向gcaccgtcaaggctgagaac(SEQIDNO；5)、 反向atggtgg tgaagacgccagt(SEQ IDN0;6);小鼠比-6;正向ccacttcacaagtcggaggctta(SEQIDN0;7)、反向 gcaagtgcatcatcgttgttcatac(SEQIDNO；8);小鼠EGF;正向catcatggtggtggctgtctg(SEQ IDN0;9)、反向cacttccgcttggctcatca(SEQIDN0;10);小鼠GAPDH;正向 aaatggtgaaggtcggtgtg(SEQIDN0;11)、反向tgaaggggtcgttgatgg(SEQIDN0;12)。利用 Takara-bio社推荐的方法进行定量。
[0191](mRNA击倒）
[019引 在mRNA表达的击倒中，使用Ambion社制作的siRNA。所用siRNA为人IL6RsiRNA、 人甜 130siRNA、NegatiVeControl#lsiRNA。在 3. 5cm的培养皿中播撒 2X105个癌细胞， 培养48小时后，加入20yM的siRNA和8y1Dharma阳CT转染试剂4Oharmacon)。24小 时后采集细胞，将其用于mRNA表达分析或神经浸润模型。
[0193](统计分析）
[0194] 分析软件使用STATVIEW5. 0。平均值之差的检验使用student-t双侧检验。图中 的误差椿按照显示标准偏差的方式制作。
[0195][实施例1]
[0196] 利用实时RT-PCR研究人膜腺癌细胞株中的IL-6a受体（IL6R)和IL-6 0受 体（甜130)的细胞内mRNA表达。在人膜腺癌细胞株中，确认到IL6RmRNA(图1A)和 甜130mRNA(图1B)的明确表达。
[0197][实施例2]
[0198]使用人重组IL-6,通过细胞数的经时性计测（图2A和B)、趋化性分析（图2C)、伤 口愈合分析（图2D)研究IL-6对人膜腺癌细胞株的增殖能力、趋化能力、迁移能力的影响。 明确了JL-6虽然对膜腺癌细胞株的细胞增殖没有影响，但使趋化能力和迁移能力亢进。
[0199][实施例3]
[0200]使用人重组比-6 (rhIL6)，对于磯酸化STAT3 (PSTAT3)(图3A)、磯酸化 化kl/2(p化kl/2)(图3B)、磯酸化Akt(pAkt)(图3C)，利用蛋白质印迹法评价比-6对人膜 腺癌细胞株Capan-1的细胞内信号的影响。在添加rhIL615分钟后，确认到细胞内的磯酸 化STAT3蛋白表达明显亢进，而在添加rhIL6 1小时后，确认到磯酸化化kl/2蛋白表达明 显亢进。没有确认到对磯酸化Akt表达的影响。
[0201] [实施例句
[0202] 膜腺癌的重要浸润方式为神经浸润距离。制作可W重现神经浸润、并且可W计测 神经浸润距离的小鼠神经浸润模型，该在研究控制膜腺癌的重要的肿瘤浸润方式的治疗方 法上至关重要。通过向免疫功能不全小鼠的坐骨神经内直接注入人膜腺癌细胞株Capan-1， 制作神经浸润模型。肉眼可见神经浸润部的表面不平整、且明显大于正常神经（图4A)。1 周后，组织学的神经浸润距离明显长于注入时Capan-1神经内扩散距离，该距离随时间而 增大（图4B)。另外，神经浸润从注入部向中枢侧进展（图4C)，该与人膜腺癌神经浸润是 相同的特征。
[020引[实施例引
[0204] 据报道，人膜腺癌神经浸润损伤肿瘤周围的神经组织。已经明确；神经损伤使 IL-6表达在损伤部位的末梢侧的神经组织中亢进。为了研究神经浸润引起的神经组织的IL-6表达动态，使用神经浸润模型，通过实时RT-PCR法分别评价在神经浸润中枢侧和末梢 侧的神经组织内（图地）表达的小鼠IL-6(mIL6)mRNA。虽然mIL6在神经浸润中枢侧高度 表达，但在其他神经损伤模型中没有确认到该趋势（图5B)。通过巧光免疫染色确认mIL6 蛋白表达时，与作为Schwann细胞的标志物的S100阳性细胞区一致，确认到IL6阳性颗粒 (图5C)。明确了；在神经浸润模型中，mIL6分泌细胞之一是Schwann细胞。虽然EGF是在 神经损伤中高度表达的分子，但小鼠EGF(mEGF)mRNA表达动态不同于mIL6,没有确认到其 在中枢侧高度表达的趋势。该结果暗示；IL-6与神经浸润部位的肿瘤-神经相互作用密切 相关。
[020引[实施例6]
[0206] 利用免疫染色研究IL-6的重要的细胞内信号即磯酸化STAT3(pSTAT3)蛋白在膜 腺癌细胞内表达时，磯酸化STAT3表达在神经浸润中枢方向亢进（图6)。该结果是；与在 神经浸润中枢侧的神经组织中IL-6表达的亢进分布一致。
[0207][实施例7]
[0208] 在比-6的细胞内信号中，必需有甜130的介在。使用用siRNA击倒了膜腺癌细胞 的gpl30mRNA表达的膜腺癌细胞株制作神经浸润模型时，神经浸润距离得到抑制（图7)。 该结果表明：由甜130介导的信号对于神经浸润是重要的，所述甜130包含来自IL-6的 甜 130。
[020引[实施例8]
[0210] 在IL-6的细胞内信号中，必需有IL-6受体（IL6R)的介在。使用用siRNA击倒了 膜腺癌细胞的IL6RmRNA表达的膜腺癌细胞株制作神经浸润模型时，神经浸润距离得到抑 制（图8)。该结果表明：由IL-6介导的信号对于神经浸润是重要的。
[0211] [实施例9]
[0212] 接下来，对小鼠神经浸润模型给予JAK抑制剂或抗IL-6受体抗体，确认该些抑制 剂对神经浸润的影响。
[0213](对小鼠神经浸润模型给予JAK抑制剂的实验）
[0214] 将抑制STAT3磯酸化的JAK抑制剂AG490 (CALBI0CHEM)溶于DMS0中，之后用生理 盐水进行稀释，制备1 %DMS0的AG490液。从制作神经浸润模型2天后起，向小鼠腹腔内 连日给予0. 5mgAG490,从制作模型起2周后采集注入有癌细胞的坐骨神经，测定神经浸润 距离。对照组则按照同样的方法给予1%DMS0液。AG490组和DMS0组中所用小鼠数均为 7只。
[0215](对小鼠神经浸润模型给予抗IL-6受体抗体的实验）
[0216] 将抑制人IL-6受体的抗IL-6受体抗体（中外制药、tocilizumab)溶于生理盐水 中，从制作模型1周后起，按5yg/g、每周2次对小鼠神经浸润模型给予抗IL-6抗体抑制抗 体。从制作模型起3周后采集注入有癌细胞的坐骨神经，测定神经浸润距离。对照组则按 照同样的方法W5yg/g给予溶解在生理盐水中的人IgG(Sigma)。抗IL-6受体抗体组中所 用小鼠数为6只，对照组中所用小鼠数为4只。
[0217](统计分析）
[021引分析软件使用STATVIEW5. 0。平均值之差的检验使用student-t双侧检验。图中 的误差椿按照显示标准偏差的方式制作。
[0219] 从注入癌细胞2天后起连续12天腹腔内给予对于IL-6的细胞内信号重要的 STAT3磯酸化的JAKQanusKinase)抑制剂AG490时，明确了神经浸润得到抑制（图9A)。 该结果表明；IL-6下游的细胞内信号即JAK-STAT对神经浸润是重要的。
[0220] 另外，为了发挥人IL-6的抑制作用，从注入癌细胞1周后起每周2次、连续2周给 予抗人IL-6受体抗体时，明确了神经浸润得到抑制（图9B)。由该结果认为：人膜腺癌神 经浸润被抗人IL-6受体抗体抑制。
[0221] 产业实用性
[0222] 本发明显示；通过给予抗IL-6受体抗体，在膜腺癌中可W抑制神经浸润。进一步 显示；通过给予抗IL-6受体抗体，可W治疗膜腺癌。
【主权项】
1. 胰腺癌治疗药，其以白介素6抑制剂、即IL-6抑制剂作为有效成分。2. 细胞的神经浸润抑制剂，其以IL-6抑制剂作为有效成分。3. 权利要求2所述的抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。4. 权利要求3所述的抑制剂，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。5. 权利要求2~4中任一项所述的抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸 润。6. 权利要求1~5中任一项所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是与 IL-6受体结合的物质。7. 权利要求6所述的治疗药或抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。8. 权利要求7所述的治疗药或抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体 或人抗体。9. 胰腺癌的治疗方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。10. 细胞的神经浸润抑制方法，该方法包括：将IL-6抑制剂给予对象的步骤。11. 权利要求10所述的方法，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。12. 权利要求11所述的方法，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。13. 权利要求10~12中任一项所述的方法，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸 润。14. 权利要求9~13中任一项所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体结 合的物质。15. 权利要求14所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。16. 权利要求15所述的方法，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗 体。 17. IL-6抑制剂在制备胰腺癌治疗药中的应用。 18. IL-6抑制剂在制备细胞的神经浸润抑制剂中的应用。19. 权利要求18所述的应用，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。20. 权利要求19所述的应用，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。21. 权利要求18~20中任一项所述的应用，其特征在于：抑制向中枢侧进行的神经浸 润。22. 权利要求17~21中任一项所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是与IL-6受体 结合的物质。23. 权利要求22所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。24. 权利要求23所述的应用，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗 体。 25. IL-6抑制剂，该IL-6抑制剂在治疗胰腺癌的方法中使用。 26. IL-6抑制剂，该IL-6抑制剂在用于抑制细胞的神经浸润的方法中使用。27. 权利要求26所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制癌细胞的神经浸润。28. 权利要求27所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制胰腺癌细胞的神经浸润。29. 权利要求26~28中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于：抑制向中枢侧进行 的神经浸润。30. 权利要求25~29中任一项所述的IL-6抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是与 IL-6受体结合的物质。31. 权利要求30所述的IL-6抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为抗IL-6受体抗体。32. 权利要求31所述的IL-6抑制剂，其中，抗IL-6受体抗体为嵌合抗体、人源化抗体 或人抗体。
【专利摘要】本发明人等发现：在胰腺癌的神经浸润模型中，通过抑制IL-6，神经浸润得到抑制，从而完成了本发明。进一步明确了：IL-6受体在人胰腺癌细胞株中表达、以及IL-6使胰腺癌细胞的趋化能力、迁移能力和细胞内信号亢进，发现通过抑制IL-6可以治疗胰腺癌。进一步发现：通过对小鼠神经浸润模型给予IL-6抑制剂，可以抑制人胰腺癌神经浸润。
【IPC分类】A61K45/06, A61K39/395, A61P35/00
【公开号】CN104906581
【申请号】CN201510206764
【发明人】光永修一, 落合淳志
【申请人】国立研究开发法人国立癌症研究中心, 中外制药株式会社
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2009年6月5日
【公告号】CA2728243A1, CN102256623A, EP2305306A1, EP2305306A4, US20110150869, WO2009148148A1
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