一种盐酸伊立替康复合磷脂组合物、制备方法及其应用
一种盐酸伊立替康复合磷脂组合物、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种盐酸伊立替康复合磯脂组合物、制备方 法及其在制备治疗肿瘤或耐药性肿瘤的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 盐酸伊立替康（Irinotecan，CPT-11)是半合成水溶性喜树碱衍生物，是DNA拓扑 异构酶I(TopoI)的抑制剂。伊立替康与其活性代谢产物SN-38通过与DNA-Topo-1复合 体的稳定结合引起DNA单链的断裂，使DNA产生不可逆的损伤而死亡。伊立替康是治疗转 移性结直肠癌的有效药物，对氣尿嚼巧耐药病例仍有效，而且具有很广的抗肿瘤谱。I期、II 期临床研究结果表明，该药对化疗抗拒性肿瘤，如非小细胞肺癌、卵巢癌和宫颈癌有肯定疗 效；另外它对胃癌、恶性淋己瘤（非霍奇金淋己瘤）、乳腺癌、小细胞肺癌、皮肤癌、膜腺癌也 有一定疗效。
[0003]目前，国内上市的产品为盐酸伊立替康的注射剂，该药抗癌活性强，但不良反应亦 较多，常见不良反应为食欲缺乏、恶也、呕吐、腹泻，白细胞和中性粒细胞减少、贫血及血小 板减少，脱发和己醜胆碱能综合症，该些不良反应大大限制了该药在临床上的使用。
[0004] 另外，因盐酸伊立替康结构中的内醋环具有抑依赖性，在碱性、中性甚至弱酸性 (如抑大于6时）溶液中会形成无活性的駿酸盐形式，因此在药物进入体内后会有相当一 部分药物转化为无活性的駿酸盐形式，从而降低了药效。
[0005]而且，多药耐药（Multi化ugResistance,MDR)是另外一个限制盐酸伊立替康临床 应用的主要问题。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构 和作用机理不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。多药耐药是导致抗癌药化疗失败的主要原 因。肿瘤的多药耐药会大大降低盐酸伊立替康和其它抗癌药的疗效。
[0006] 由此看来，目前上市剂型在安全性、有效性及克服多药耐药性方面均存在较大的 改进空间，该无疑限制了其在临床上更为广泛地应用。
[0007]为了增强药物的祀向性，延长体内滞留时间，增强疗效，降低毒性，美国 化armaEngine公司研发了CPT-11脂质体注射液，目前正在进行II期临床试验。在台湾进行 的I期临床试验结果表明，CPT-11脂质体注射液对晚期顽固性肿瘤受试者呈现出良好的有 效性、耐受性和药代动力学特性。
[0008] 中国专利申请CN101953792A公开了伊立替康长循环纳米脂质体及其制备方法， 该专利限定脂质体处方组成为磯脂、胆固醇、泊洛沙姆188、聚己二醇类化合物、伊立替康， 其制备方法为，将磯脂、胆固醇、泊洛沙姆188溶于己醇制备空白脂质体，透析法除硫酸馈， 再载药，该一工艺存在W下几个问题；（0在透析法除硫酸胺过程中容易将泊洛沙姆188和 聚己二醇类化合物如PEG2000 -并除掉，造成处方比例改变；（2)透析法所需时间长，难W 实现工业大生产；（3)载药过程中需调节脂质体外水相抑到7-7. 5,易造成脂质体稳定性 差、药物失活等问题。
[0009] 中国专利申请公开CN102485213A、CN103120645也公开了盐酸伊立替康脂质体及 制备方法，但在处方的经济性、合理性，工艺的可放大性、操作简便性，w及药物的安全性及 有效性方面仍然存在较多问题，而且上述专利文献均未提及脂质体制剂的体内外稳定性及 克服多药耐药问题。
[0010] 脂质体作为药物载体，既起到了对药物的保护作用，又提高了药物对机体特定部 位的祀向性，因此在提高药效方面具有很多优越的特性。然而，脂质体的体内外稳定性限制 了脂质体作为药物载体在临床的应用，其不稳定性主要表现在W下H个方面；
[0011] (1)脂质体的化学稳定性：构成脂质体的主要成分磯脂易发生氧化水解，造成双分 子膜流动性下降，脂质体稳定性降低，药物渗漏加剧；
[0012] (2)脂质体的物理稳定性：脂质体属胶体分散系，磯脂膜为对称双分子膜，分子间 为弱相互作用（疏水相互作用、范德华力、氨键等），因而它具有热力学不稳定性，主要表现 如下：脂质体膜是动态膜，磯脂分子间不断互换位置，其膜内外物质可自由跨膜交换，且交 换是随机的，无选择性；脂质体粒子可自发聚集、沉淀。另外，脂质体膜通常为双层凝胶相， 磯脂分子间排列紧密，碳氨链高度有序，膜流动性小，但常因温度、抑值和含水量等因素 的变化发生相变和相分离。当发生凝胶相一液晶相（LB-LA)相变，膜分子间隔加大，流 动性和通透性显著增加；当发生凝胶相一六角相（LB-HI或HII)相分离，膜上形成孔 洞或发生膜融合，所载药物迅速渗漏；
[0013] (3)脂质体的生物学稳定性：脂质体在血液中的稳定性是发挥药物载体作用的关 键。血液中有多种破坏因素：高密度脂蛋白（皿L)是破坏脂质体的主要成分，apoA-1蛋 白质易从皿L上脱落并与脂质体磯脂结合，且皿L和脂质体易发生apoA-1蛋白质与磯 脂的互换，脂质体膜形成孔洞；同时脂质体在血液中激活补体系统，最终形成攻膜复合体 (MAC),脂质体膜出现亲水性通道，引起药物渗漏和水、电解质的大量进入，最终渗透裂解 脂质体；血清白蛋白与脂质体磯脂结合形成复合物，降低其稳定性；血液中的磯脂酶可水 解磯脂，该反应强弱由磯脂结构决定；脂质体进入体内后，各种调理素如抗体、补体等与脂 质体结合，促进网状内皮系统对其快速清除。
[0014] 另外，常规制备伊立替康脂质体的方法包括抑梯度法和硫酸馈梯度法，其中WpH 梯度法制备的脂质体稳定性差，通常需设计成H个分装单元W提高制剂稳定性，但该种分 包装的脂质体制剂给生产、运输及临床使用带来极大不便；W硫酸馈梯度法制备脂质体过 程中，通常采用透析、柱层析、超滤等方法除外水相硫酸馈，该些方法存在样品处理量小、耗 时、样品稀释、膜孔易堵塞超滤效率低等问题，只适合少量样品的制备，不适合工业化大生 产，因而延缓伊立替康脂质体进入临床的进程。
【发明内容】
[001引技术问题
[0016] 本申请的发明人发现：已公开的伊立替康脂质体虽然较市售注射液有一定优势， 但存在W下缺陷：
[0017] (1)脂质体体外稳定性差，通常需采用H瓶装的特殊设计或冻干处理W解决长期 胆存过程中脂质体聚集、药物易泄露的问题；
[001引（2)脂质体体内稳定性差，脂质体进入体内后，由于血液中白蛋白、调理素、抗体等 各种因素的作用W及所用脂质相变温度低于体温等原因，包封药物快速泄露，大大削弱脂 质体制剂的优势，限制其疗效的发挥；
[0019] (3)所采用的脂质体制备方法及工艺难W实现工业化生产，且制得的脂质体粒径 难W控制，分布不均匀，包封率低、稳定性差；
[0020] (4)已公开的伊立替康脂质体未针对肿瘤的多药耐药问题提出解决方案和应对策 略。
[0021] 因此，对于盐酸伊立替康该个特定的药物来说，必须针对其稳定性问题、工业化生 产的要求及肿瘤多药耐药问题，寻找特定的制剂及制备工艺，W实现提高制剂稳定性及疗 效、降低毒副作用、克服肿瘤多药耐药的目的。
[00过技术方案
[0023] 为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明人进行了广泛深入的研究，最终 得到本发明。
[0024] 本发明的目的之一是为临床提供一种稳定的盐酸伊立替康复合磯脂组合物，所述 盐酸伊立替康复合磯脂组合物主要解决了现有脂质体制剂体内外稳定性差、药物易泄漏等 问题，能大大提高脂质体制剂的稳定性及盐酸伊立替康的抗肿瘤作用，克服其肿瘤的多药 耐药。
[00巧]本发明的另一目的是提供一种上述盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备方法。
[0026] 为了实现上述发明目的，本发明提供了 一种盐酸伊立替康复合磯脂组合物，其包 含盐酸伊立替康、复合磯脂、胆固醇、长循环膜材、非离子表面活性剂和缓冲介质；其中所述 复合磯脂由氨化大豆磯脂（HSPC)和其它脂质组成。
[0027] 本发明中，盐酸伊立替康和服PC的质量比为约1:5 -约1:50,优选为约1:5 -约 1:20。
[0028] 脂质体制剂稳定性与其组成直接相关。不同磯脂形成的脂质制剂稳定性明显不 同，而且由单一组分磯脂形成的脂质制剂极不稳定，所W本发明中采用复合磯脂作为组合 物的膜材。相比于单一磯脂组成的脂质体制剂，复合磯脂可通过分子间相互作用，提高脂膜 的刚性，使磯脂分子间的排列更加紧密有序，可W提高药物的包封率，减少药物在体内外的 泄露，从而大大提局其稳定性。
[0029] 本发明中，所述复合磯脂中的氨化大豆磯脂和其它脂质的质量比为20:1-200:1， 优选为 50:1-150:1，更优选为 50:1-100:1。
[0030] 本 发明中，所述的其它脂质是能够用于制备脂质体制剂的任何一种药学上可接受 的磯脂，优选可W为选自大豆磯脂（SPC)、蛋黄卵磯脂巧PC)、氨化卵磯脂（肥PC)、銷磯脂 (SM)、也磯脂、二硬脂醜磯脂醜胆碱（DSPC)、二踪搁醜磯脂醜胆碱（DPPC)、二肉豆證醜磯脂 醜胆碱（DMPC)、二油醜磯脂醜胆碱（D0PC)、二硬脂醜磯脂醜己醇胺（DSPE)、二踪搁醜磯脂 醜己醇胺值PP巧、二肉豆證醜磯脂醜己醇胺值M阳）、二油醜磯脂醜己醇胺值0P巧、二硬脂 醜磯脂醜甘油值SPG)、二踪搁醜磯脂醜甘油值PPG)、二肉豆證醜磯脂醜甘油值MPG)和二油 醜磯脂醜甘油值0PG)中的一种或多种，更优选为选自SPC、EPC、肥PC、DSPC和DSPG中的一 种或多种，更优选为DSPC。
[0031] 本发明中，所述胆固醇作为脂质体制剂的构成成分，起到稳定剂的作用，其用量对 制剂的稳定性和释放行为有显著影响。在本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中，氨化 大豆磯脂与胆固醇质量比为约2:1-约20:1，优选为约2:1-约10:1，更优选为约2:1-约 6:1。
[0032] 本发明中，所述长循环膜材用于实现脂质体制剂的长循环功能，延长药物在血液 中的循环时间，增加药物在肿瘤部位的蓄积，W进一步提高疗效，降低毒性。
[0033] 在根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中，氨化大豆磯脂与长循环膜材质 量比为约2:1-约20:1，优选为约2 ;1-约10:1。
[0034] 本发明中，优选地，所述长循环膜材为聚己二醇衍生化磯脂，其是聚己二醇分子通 过共价键与磯脂分子上的活性基团结合而成。优选地，聚己二醇衍生化磯脂为选自聚己 二醇-磯脂醜己醇胺（PEG-PE)、聚己二醇-二肉豆證醜磯脂醜己醇胺（PEG-DM阳）、聚己二 醇-二踪搁醜磯脂醜己醇胺（PEG-DPPE)、聚己二醇-二硬脂醜磯脂醜己醇胺（PEG-DSPE)中 的一种或多种。聚己二醇衍生化磯脂中所述PEG链段的分子量没有特殊限定，但是优选平 均分子量(数均)为约500-约5000化，更优选为约1000-约5000化，最优选为约2000Da。所 述分子量采用凝胶渗透色谱（GPC)方法检测。
[0035] 本发明中，非离子表面活性剂使脂质混息液中存在胶团和乳剂，其疏水端插入双 子膜，亲水端使脂质体高度亲水，防止了脂质制剂相互聚集融合和沉淀。它还改变磯脂分子 的排列和运动方式，导致膜纵向有序性（磯脂分子碳氨链间的紧密堆积情况）增大，流动性 降低，稳定性升高，该种影响随其浓度增大而增大。而且在血液中该类脂质制剂表面被高度 亲水的白蛋白覆盖，保护它不被MI^S吞瞻，延长脂质组合物在血液中的循环时间，因而非 离子表面活性剂的加入不仅能大大提高脂质组合物在体内外的稳定性，还有助于延长药物 在体内的循环时间，提高疗效。此外，非离子表面活性剂如普朗尼克（pluronic)、天然水溶 性维生素E(TPGSX15-羟基硬脂酸聚己二醇醋（HS15)等能通过W下作用机制逆转肿瘤的 多药耐药；第一；与MDR细胞膜相互作用，减少膜的微粘度，抑制PgpATP酶活性，从而抑制 Pgp外排粟的功能；第二；抑制MDR细胞线粒体的呼吸链，减少细胞膜电位，诱导细胞色素C 的释放，增加细胞质活性氧（R0S)的水平，减少ATP的含量；第H;抑制GSH/GST解毒系统的 功能；第四；增加促调亡信号并减少MDR细胞的抗调亡防御，因而配方中加入非离子表面活 性剂可增强耐药性肿瘤对药物的敏感型，逆转肿瘤的多药耐药。
[0036] 在根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中，氨化大豆磯脂与非离子表面活 性剂质量比为约50:1-约150:1，优选为约50:1-约100:1。
[0037] 本发明中，优选地，非离子表面活性剂为选自普朗尼克F68、普朗尼克F127、普朗 尼克P123、普朗尼克P85、普朗尼克L61、TPGS和服15中的一种或多种。
[003引研究表明卵磯脂、饱和大豆磯脂和磯脂醜甘油等的水解都受抑值的影响。水解产 物可W使脂质混息液的抑值下降，加速脂质制剂的进一步水解。因此，本发明在复合磯脂 组合物的混息液中加入缓冲介质，使抑稳定在脂质制剂最稳定的抑范围，W提高组合物的 稳定性。
[0039] 本发明中，优选地，所述盐酸伊立替康复合磯脂组合物中的缓冲介质可W为任何 药学上可接受的缓冲介质，优选的，所述缓冲介质为选自组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磯 酸盐缓冲液和4-轻己基脈嗦己賴酸（肥PES)缓冲液中的一种或多种，其浓度范围可W为约 10-约 50mM，pH为约 5. 5-约 7. 5。
[0040] 复合磯脂组合物粒径会影响其在体内的循环时间。本发明中，优选地，所述盐酸伊 立替康复合磯脂组合物的平均粒径狂均粒径）为约50-约200nm，优选为约50-约120nm。 所述粒径采用英国马尔文（Malvern)公司的NanoSizer90检测。本发明中，优选地，所述盐 酸伊立替康复合磯脂组合物可W进一步包含冻干保护剂。所述冻干保护剂用于将所得复合 磯脂组合物冷冻干燥制备成其冻干粉。在根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中， 氨化大豆磯脂与冻干保护剂的质量比为约1:0. 1-约1:5,优选为约1:0. 5-约1:4。
[0041]本发明中，优选地，所述冻干保护剂为选自藏糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糖等 中的一种或多种。
[0042] 在一个优选的实施方式中，W重量份计，根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组 合物包含：
[0043]
[0044] 优选地，在上述优选实施方式中，所述盐酸伊立替康复合磯脂组合物可W进一步 包含约10-500重量份，优选为约50-400重量份的冻干保护剂。
[0045] 在上述优选实施方式中的各组分的描述与前述内容相同，在此不再费述。
[0046] 本发明所述的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中，优选药物包封率大于80%，W便脂 质制剂能通过EPR效应聚集在肿瘤组织，减少在其它正常组织的分布，从而提高药效，降低 毒性。本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中的药物包封率甚至大于85%，甚至更大于 90〇/〇。
[0047]制剂胆存稳定性是影响药物疗效及毒性的关键所在。本发明所述的盐酸伊立替康 复合磯脂组合物，优选在2-8C存放，至少可稳定半年。
[0048] 根据本发明的另一目的，提供了所述盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备方法， 其采用切向流超滤技术结合硫酸馈梯度法制备。该方法可实现工业化规模，高效率生产出 质量稳定的产品。
[0049] 因此，根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备方法包括W下步骤：
[0050]a称取配方量的服PC、其它脂质、长循环膜材和胆固醇溶于无水己醇得有机相，将 有机相注入到浓度为约100-约400mmol/L的硫酸馈水溶液中高速(优选转速约5000-约 30000巧m)揽拌，经高压(优选约10000-约3000化si)均质、超声或挤出工艺，形成空白脂质 体息液；
[0051] 或者，称取配方量的服PC、其它脂质、胆固醇和长循环材料溶于叔下醇中，经冷冻 干燥后，加入浓度为约100-约400mmol/L的硫酸馈水溶液分散，形成空白脂质体息液；
[0052]b将步骤a所得空白脂质体息液W纯水或藏糖水溶液(浓度为300mM)通过切向流 超滤装置(膜分子量；1〇-1〇〇邸a;流速；20-400ml/min;压力；0-5bar)，置换脂质体体积的 约5-约30倍，W除去外水相硫酸馈建立硫酸馈梯度；
[0053] C将盐酸伊立替康加入经步骤b处理所得空白脂质体息液中，在高于脂质体相转 变温度的温度下(优选37C-7(TC)赔育lOmin-lh进行载药；
[0054] d在经载药脂质体息液中W固体形式加入缓冲盐和非离子表面活性剂，揽拌溶解， 调节抑到5. 5-7. 5范围，即得盐酸伊立替康复合磯脂组合物；
[00巧]或者将载药脂质体息液经切相流超滤装置置换为药学可接受的缓冲液，再加入非 离子表面活性剂，调节抑到5. 5-7. 5范围，即得盐酸伊立替康复合磯脂组合物。
[0056] 进一步地，本发明的制备方法中，可上述步骤d之后包括加入冻干保护剂的步骤。
[0057] 本发明的制备方法中，在上述步骤d之后或者在加入冻干保护剂之后，可W采用 微孔滤膜过滤除菌得到无菌制剂。
[0058] 该里所说的超声、高压均质或挤出工艺是为了减小空白脂质息液的粒径，控制产 品的质量；所述切向流超滤工艺是为除去空白脂质息液外水相中的硫酸馈，W建立离子梯 度用于载药。
[0059] 上述制备过程中，一个最关键的步骤就是除去外水相的硫酸馈，产生硫酸馈梯度。 目前，常用除外水相硫酸馈方法是透 析、柱层析、超滤。该H种方法均存在一定问题，其中透 析法样品处理量少，透析时间长；柱层析会造成样品大大稀释；超滤过程中会出现膜孔堵 塞、超滤效率下降，因此只适合实验室小量样品的处理，不适合工业化大规模生产。
[0060] 切向流过滤是指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式。传统的液体死 端（deadend)过滤是大部分微孔过滤，包括除菌过滤所采用的过滤形式，其液体的流动方 向与过滤方向一致，随着过滤的进行，过滤膜表面形成的滤饼层或凝胶层厚度逐渐增大，流 速逐渐降低。当过滤介质为孔径细小的超滤膜或微滤膜时料液中固形物含量很高时，采取 死端过滤方式，流速将急速降低，因此死端过滤只能处理小体积的料液。采用切向流过滤方 式，液体流动在过滤介质表面产生剪切力，减小了滤饼层或凝胶层的堆积，保证了稳定的过 滤速度。目前在医药领域主要是应用于细胞收集、蛋白浓缩、蛋白脱盐、抗生素纯化等方面， 本发明将其应用于脂质体外水相硫酸馈的去除，具有较大创新性。
[0061] 本发明所用切向流过滤装置中，滤膜材料选自聚離讽树脂（PES)和H醋酸纤维素 (CT)，滤膜分子量为10-100邸a,流速为约20-约400ml/分钟，压力为0-5Bar。
[006引采用切向流超滤，还有如下的优势。
[0063] 采用切向流超滤技术置换外水相中硫酸馈时，样品处理量可达工业生产规模，所 需时间短，工作效率高，形成的离子浓度梯度大，所得脂质组合物包封率高，便于工业化生 产，减低生产成本；采用切向流超滤技术不会改变脂质制剂的性质如粒径及其分布；采用 切向流超滤，整个体系可W处于密封状态，所有管道可W清洗，防止操作过程细菌微生物的 影响，为整个制备过程的无菌提供保证，该对于注射剂的质量控制至关重要。
[0064] 所述相转变温度是指脂质凝胶态和液晶态之间相互转变时的温度。在高于脂质相 转变温度的温度下赔育，可使脂质膜通透性增强，伊立替康在离子梯度的驱动下更易透膜， 聚集于脂质体的内水相中。
[0065] 本发明又一方面提供了一种上述盐酸伊立替康复合磯脂组合物在制备治疗肿瘤， 尤其是耐药性肿瘤的药物中的用途，其中，所述肿瘤为结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、宫 颈癌、胃癌、恶性淋己瘤、乳腺癌、皮肤癌或膜腺癌。
[0066] 本发明与现有技术相比具有W下优点。
[0067] 本发明采用复合磯脂作脂质组合物的材料，相比于单一磯脂，可通过两种磯脂间 的相互作用，改变脂膜的结构，增强膜的刚性，使磯脂分子间的排列更加紧密有序，降低脂 膜的通透性，大大减少药物在存放过程或体内循环过程中药物的泄露，从而有助于提高疗 效。该一技术优势在其它相关专利文献中未见报道。
[0068] 本发明配方中非离子表面活性剂的加入，使脂质混息液中存在胶团，其疏水端插 入双分子膜，亲水端使脂质制剂高度亲水，防止了脂质制剂间相互聚集融合和沉淀。它还改 变磯脂分子的排列和运动方式，导致膜纵向有序性（磯脂分子碳氨链间的紧密堆积情况） 增大，流动性降低，稳定性提高；在血液中该类脂质制剂表面被高度亲水的白蛋白覆盖，保 护它不被MI^S吞瞻，延长复合磯脂组合物在血液中的循环时间，可大大提高复合磯脂组合 物的物理稳定性和生物学稳定性。而且，表面活性剂如普朗尼克、HS15、TPGS还可增强耐药 性肿瘤对药物的敏感型，逆转肿瘤的多药耐药。
[0069] 缓冲介质则可维持复合磯脂组合物的抑值在一定范围，减少复合磯脂材料的氧 化水解，提高复合磯脂组合物的化学稳定性。
[0070] 采用复合磯脂组合物作为盐酸伊立替康的载体，将药物包封于复合磯脂组合物 中，能明显提高药物在体内的稳定性，保持其活性内醋环结构形式，更好的发挥抗癌作用； 因盐酸伊立替康复合磯脂组合物属纳米制剂范畴，能显著延长药物在血液中的循环时间， 改善其体内分布，增加药物在肿瘤部位的聚集，提高药效，降低毒副作用，从而提高治疗指 数。
[0071] 本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物的平均粒径为约50-约200nm，能有效穿 透肿瘤血管，通过增强渗透和滞留作用（EH?效应）聚集在肿瘤部位，实现被动祀向作用。
[0072] 本发明盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备采用新型切向流超滤技术结合硫酸 馈梯度法，较现有制备方法更易实现工业化生产，并能解决现有制备技术粒径大且不均匀 的问题，更好控制产品的质量；采用硫酸馈梯度法将空白脂质体、盐酸伊立替康混合赔育， 就能制得包封率大于80%的盐酸伊立替康复合磯脂组合物，该方法操作简单且为该制剂的 临床应用提供了一个方便简单快捷的方法。
【附图说明】
[0073] 图1为根据本发明实施例1制备的盐酸伊立替康复合磯脂组合物的粒径分布图。
[0074] 图2为根据本发明实施例2制备的盐酸伊立替康复合磯脂组合物的zeta电位图。
[0075] 图3为根据本发明实施例1制备的盐酸伊立替康复合磯脂组合物和根据比较实施 例1制备的脂质体的体外释放测试结果图。
[0076] 图4为W生理盐水为对照，根据本发明实施例1制备的盐酸伊立替康复合磯脂组 合物及实施例2制备的脂质体的药效测试结果图。
【具体实施方式】
[0077] 下面结合实施例对本发明加W进一步说明，W下实施方式只W举例的方式描述本 发明。但该些实施例并不意味着对本发明加W任何限制。很明显，本领域普通技术人员可 在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖 在所附权利要求书中包括的变通和修改。
[0078] 试剂和药品
[0079] 大豆磯脂(上海太伟药业有限公司）巧SPC(上海艾韦特医药科技有限公司）； 阳G-DSPE(上海艾韦特医药科技有限公司）；PEG-PE(上海艾韦特医药科技有限公司）； 阳G-DPPE(上海艾韦特医药科技有限公司）；銷磯脂（上海紫一试剂厂）；蛋黄卵磯脂(上海 艾韦特医药科技有限公司）；胆固醇(南京新百药业有限公司）；se地adexG-50(美国GE公 司）；盐酸伊立替康(上海创诺制药有限公司）。
[0080] 实施例1盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备：
[0081] 将服PC1. 2g、DSPC0. 012g、胆固醇 0. 3g、阳G2000-DS阳0. 4gW1. 5ml无水己醇超 声溶解，将其注入到预热至65C的30ml250mM硫酸馈水溶液，高速(转速为200(K)巧m)揽拌 得初品，再于200(K)psi下高压均质4次，W超纯水经切向流超滤系统(膜分子量30kDa，流速 为200ml/min，压力为化ar)置换10倍体积除外水相硫酸馈，即得到空白脂质体息液；将所 得空白脂质体息液与盐酸伊立替康水溶液(浓度为lOmg/ml)按药物与服PC重量比1:10混 合，65°C赔育30min，再加入0. 012gF68、4. 3g藏糖、0. 065g组氨酸，调节抑=6. 0,即得盐酸 伊立替康复合磯脂组合物。
[0082] 实施例2盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备：
[0083]称取服PC1. 5g、大豆磯脂 0. 02g、胆固醇 0. 15g、PEG2000-DSPE0. 15g，W1. 5ml无 水己醇溶解，将其注入到预热至65°C的30ml200mM硫酸馈水溶液，高速(转速为2500化pm) 揽拌得初品，再于150(K)psi下高压均质4次，W300mM藏糖水溶液经切向流超滤系统(膜分 子量30kDa，流速300ml/min，压力为1.化ar)置换20倍体积除外水相硫酸馈，即得到空白 脂质体息液。将所得空白脂质体息液与盐酸伊立替康溶液(浓度为lOmg/ml)按药物与服PC 重量比1:20混合，55C赔育比后，再经切向流超滤系统除去未包封的药物，并将其外水相 置换为300mM藏糖、lOmM组氨酸缓冲液（pH=6. 5)，再加入0.02gHS15,揽拌溶解后，无菌过 滤分装，于4C胆存备用。
[0084] 实施例3盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备
[0085]称取服PC1. 2g、蛋黄卵磯脂 0. 024g、胆固醇 0. 12g、阳G2000-DPPE0. 4g，W1. 5ml无 水己醇溶解，将其注入到预热至65°C的30ml250mM硫酸馈水溶液，高速(转速为200(K)巧m) 揽拌得初品，再WlOOnm孔径的聚碳醋膜挤出4次，W300mM藏糖水溶液经切向流超滤系统 (膜分子量30kDa，流速lOOml/min，压力为1.化ar)置换5倍体积W除去外水相硫酸馈，即 得到空白脂质体息液。将所得空白脂质体息液与盐酸伊立替康水溶液(浓度为5mg/ml)按 药物与服PC重量比1:5混合，6(TC赔育lOmin后，再经切向流超滤系统除去未包封的药物， 并将其外水相置换为300mM藏糖、2 0mM磯酸盐缓冲液（pH=7. 4)，再加入0. 02gTPGS，溶解后 即得。
[0086] 实施例4盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备：
[0087]称取服PC1. 5g、DSPG0. 015g、胆固醇 0. 4g、PEG2000-DSPE0. 4g，W1. 5ml无水己醇 溶解，将其注入到预热至65°C的30ml250mM硫酸馈水溶液，高速(转速为200(K)巧m)揽拌得 初品，再WlOOnm孔径的聚碳醋膜挤出4次，W300mM藏糖水溶液经切向流超滤系统(膜分 子量30kDa，流速lOOml/min，压力为1.化ar)置换5倍体积W除去外水相硫酸馈，即得到 空白脂质体息液。将所得空白脂质体息液与盐酸伊立替康水溶液(浓度为5mg/ml)按药物 服PC重量比1:10混合，6(TC赔育lOmin后，再经切向流超滤系统除去未包封的药物，并将其 外水相置换为300mM藏糖、20mM肥阳S缓冲液（pH=7. 4)，再加入泊洛沙姆F680. 015g，揽拌 溶解后即得。
[0088] 实施例5盐酸伊立替康复合磯脂组合物冻干粉的制备：
[0089]称取服PC1. 6g、肥PCO. 032g、胆固醇 0. 16g、阳G2000-DM阳0. 5gW5ml叔下醇溶解， 于冻干机上冷冻干燥，再加入30ml200mM硫酸馈溶液水合超声至半透明，W超纯水经切向 流超滤系统(膜分子量lOkDa，流速200ml/min，压力为1.化ar)置换15倍体积W除去外水 相硫酸馈，即得到空白脂质体息液。取上述空白脂质体息液30ml与盐酸伊立替康溶液10ml (含盐酸伊立替康80mg)混合，6(TC赔育比后，加入普朗尼克F1270. 008g、甘氨酸0. 03g、藏 糖0. 2g、甘露醇0. 5g、乳糖Ig，揽拌溶解，并调节抑为7. 4,于冻干机中冻干即得盐酸伊立 替康复合磯脂组合物冻干粉。
[0090] 比较实施例1
[0091] 盐酸伊立替康现有脂质体的制备：
[009引按照中国专利申请公开CN101953792A公开的配方及方法制备，具体如下：
[0093] 称取大豆磯脂3g、胆固醇Ig、泊洛沙姆1880.6g、维生素E0.Ig溶解于无水己醇 1. 5ml中，在55C水浴条件下注入溶解了 0. 3评EG-DSPE的硫酸馈溶液（200mM) 30ml中，通 氮气条件下保温揽拌比，所得长循环空白脂质体在生理盐水中透析过夜，氨氧化轴调节外 水相抑为7. 4,再加入盐酸伊立替康溶液30ml(lOmg/ml)，55C赔育lOmin，过滤除菌后， 按4ml/瓶分装于西林瓶中。
[0094] 比较实施例2
[0095] 盐酸伊立替康现有脂质体的制备
[0096] 按照中国专利申请CN103120645A公开的配方及方法制备，具体如下：
[0097] 将Ig氨化大豆卵磯脂（HSPCX0. 25g胆固醇（CH0L)溶于适量无水己醇得脂质溶 液，与250Mml00ml硫酸馈溶液混合，减压除掉己醇得到空白脂质体粗品。之后采用高压 均质机lOOObar均质5次循环，之后通过挤出设备挤出脂质体控制其粒径(挤出器铺2张 0. 1ym挤出膜，挤出5次)。之后加入配制好的0.IgDS阳-PEG2000水溶液，揽拌赔育20分 钟。采用超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充注射用水，即得空白脂质体。
[0098] 用注射用水配制盐酸伊立替康水溶液，按照盐酸伊立替康与服PC的重量比例为 1:3. 5加入到上述具有离子梯度的空白脂质体分散液中，6(TC加热揽拌，赔育20分钟即得 载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓缩至约50ml，加入 0. 45g氯化轴调节渗透压。调整药物浓度，定容，0. 22ym滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶 中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。
[009引性能测试
[0100] 粒径及分布测试：
[0101] 取实施例1制得的伊立替康复合磯脂组合物用水稀释后，经粒径测定仪(型号： NanoSizer90,厂商；英国马尔文（Malvern)公司）测定其粒径及分布。结果如图1，其Z均 粒径为71. 53nm，多分散指数为0. 107,粒子分布较为均匀。
[0102] 同法测得其它实施例中复合磯脂脂质组合物的粒径和分布结果见表1。
[0103]表1
[0104]
[0105]Zeta电位的测定
[0106] 取实施例2制得的酒石酸长春瑞滨长循环脂质体，用nanosizer90测定其zeta电 位。结果如图2,其zeta电位为-12. 4mv。
[0107] 包封率的测定：
[010引取实施例1-5制得的盐酸伊立替康复合磯脂组合物进行包封率的测定。
[010引 色谱条件；色谱柱WatersSunFire*〔18柱（4. 6mmX250mm，5]im);流动相为己 膳-26mmol/L磯酸二氨轴溶液(含8mmol/L辛烷基賴酸轴）（32 : 68);流速Iml/min;柱温 4(TC;检测波长254nm;进样量20y1。
[0110] 取充分溶胀的Se地adexG-50葡聚糖凝胶适量，制备凝胶柱（30cmX1cm)，精密量 取盐酸伊立替康复合磯脂组合物0. 5ml上柱，WPBS(PH=7. 4)洗脱，收集含组合物的流份 共14ml，置50ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀后精密量取0. 5ml置10ml量瓶中，用酸化甲醇定 容，采用HPLC测定复合磯脂组合物中包裹的药量W;另取盐酸伊立替康复合磯脂0. 5ml置 于50ml量瓶中，同法操作，测定临床载药纳米制剂中的总药量W。。计算得盐酸伊立替康临 床载药纳米制剂的平均包封率为91. 27%。
[0111] 表 2
[0112]
[0113] 体外释放测定：
[0114] 取实施例1制得的伊立替康复合磯脂组合物、比较实施例1中的伊立替康脂质体 及盐酸伊立替康溶液进行体外释放的测定，其中盐酸伊立替康溶液配制方法为：称取一定 量盐酸伊立替康W超纯水配成浓度为2mg/ml的溶液。
[0115]精密量取伊立替康复合磯脂组合物、伊立替康脂质体1ml，加至透析袋(透析袋分 子量8000-14000Da)中，扎紧两端，置于装有20ml释放介质（pH7. 4磯酸盐缓冲液）的锥形 瓶中，于（37. 0 + 0. 5) °C条件下恒速振荡（lOOr/min)。分别在0. 5、1、2、4、8、12、2化取样， 进样测定，计算累积释放率（％)。同时考查伊立替康溶液的释放情况。W累积释放率（Q)对 时间（t)作图，释放曲线见图3。
[0116] 由图3可见，相比于伊立替康脂质体，伊立替康复合磯脂组合物药物释放较为缓 慢，2化时累积释放率为52%，表明本发明复合磯脂组合物较比较实施例1中的脂质体稳定 性更好。
[0117] 稳定性实验：
[0118] 取实施例1制得的盐酸伊立替康复合磯脂组合物和比较实施例2制得的盐酸伊立 替康脂质体进行稳定性试验。
[0119] 将实施例1制得的伊立替康复合磯脂组合物放置于2-8C，于0、1、2、3、6月取样， 并测定盐酸伊立替康总含量、有关物质(有关物质是残留合成原料、中间体、副产物及可能 降解产物的统称)、包封率、粒径等质量指标；将比较实施例2制得的盐酸伊立替康脂质体 相同条件放置后直接取样测定上述质量指标。
[0120] 从表3可W看出，比较实施例2制得的伊立替康脂质体在2-8C放置6个月后，盐 酸伊立替康总含量下降5. 6%，有关物质增加3. 53% ;而根据本发明的伊立替康复合磯脂组 合物在放置6个月后，各项质量指标与0月相比无明显变化，表明根据本发明的盐酸伊立替 康复合磯脂组合物稳定性较现有制剂有极大程度提高，更具有临床应用价值。
[0121] 表3现有脂质体与本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物稳定性
[0122]
[0123] 药动学测试：
[0124] 取健康雄性SD大鼠(来源：上海实验动物中也）8只（体重200-220g)，随机分成2 组。尾静脉按lOmg/kg的剂量分别尾静脉注射给予实施例1和比较实施例2的盐酸伊立 替康复合磯脂组合物和伊立替康脂质体及伊立替康注射液后，分别于0. 08化、0. 2化、0. 5K lh、2h、化、6h、她、2化由大鼠眼框静脉丛取血，取血量约0. 3ml,置于肝素化离也管中，于 10000巧111下离也lOmin，取lOOy1血浆，加入lOy110%甲酸和500y1甲醇，润旋lmin，-20 度放置比用W沉淀蛋白，然后于20000g离也lOmin。取上清液进样测定血液中伊立替康药 物浓度。药代动力学参 数用WinNonlinProfessionalv6. 3 (Pdayarsi曲t,USA)软件采用 非房室模型分析处理。
[01巧]表4
[0126]
[0127] 注；K,i为消除速度常数，ti/2为半衰期，AUC为血药浓度时间曲线下面积
[0128] 由表4可W看出，本发明盐酸伊立替康复合磯脂组合物的半衰期和AUC分别是比 较实施例2中伊立替康脂质体的9. 06倍和41倍，表明本发明盐酸伊立替康复合磯脂组合 物较脂质体具有更好的体内稳定性，大大延长了盐酸伊利替康的生物半衰期，提高了药物 的生物利用度。
[0129] 抗肿瘤活性测试：
[0130] Ba化/c裸鼠（购自上海实验动物中也）适应环境5山将对数生长期的MCF-7/ADR 细胞消化后制成1Xl〇7ml细胞息液，在Ba化/c裸鼠右前肢皮下注射0. 1ml细胞息液，建立 荷瘤模型。待小鼠肿瘤平均体积长至50-100皿3左右时，将裸鼠随机分为3组，每组10只。 各组分别于第1、4、7天通过尾静脉注射给药，给药剂量为实施例1中的CPT-11复合磯脂组 合物20mg/kg，比较实施例2中的CPT-1120mg/kg和生理盐水(对照组)，用卡尺测量各裸鼠 肿瘤的长径（a)及短径化），按（aXb2) / 2公式计算肿瘤体积。
[0131] 由图4可W看出，盐酸伊立替康复合磯脂组合物及盐酸伊立替康脂质体对裸鼠耐 药性乳腺癌均有较好的抑制作用，各剂量组肿瘤体积与对照组（即生理盐水组）相比均显著 降低（P<0. 05,0. 01)，且同剂量的复合磯脂组合物组较比较实施例2中的盐酸伊立替康脂 质体组有更好的抑瘤效果（P<〇. 05)，表明本发明盐酸伊立替康复合磯脂组合物在一定程度 上可逆转肿瘤耐药。
【主权项】
1. 一种盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其包含盐酸伊立替康、复合磷脂、胆固醇、长循 环膜材、非离子表面活性剂和缓冲介质；其中所述复合磷脂由氢化大豆磷脂（HSPC)和其它 脂质组成。2. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，盐酸伊立替康和HSPC 的质量比为1:5 - 1:50,优选为1:5 - 1:20。3. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述复合磷脂中 的氢化大豆磷脂和其它脂质的质量比为20:1-200:1，优选为50:1-150:1，更优选为 50:1-100:1 ； 优选地，所述其它脂质选自选自大豆磷脂（SPC)、蛋黄卵磷脂（EPC)、氢化卵磷脂 (HEPC)、鞘磷脂（SM)、心磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC)、 二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱（DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE)、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺（DMPE)、二油酰磷脂酰 乙醇胺（DOPE)、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG)、二肉豆蘧酰磷 脂酰甘油（DMPG)和二油酰磷脂酰甘油（D0PG)中的一种或多种，更优选为选自SPC、EPC、 HEPC、DSPC和DSPG中的一种或多种，更优选为DSPC。4. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，氢化大豆磷脂与胆固 醇质量比为2:1-20:1，优选为2:1-10:1，更优选为2:1-6:1。5. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，氢化大豆磷脂与长循 环膜材质量比为2:1-20:1，优选为2 :1-10:1; 优选地，所述长循环膜材为聚乙二醇衍生化磷脂，其是聚乙二醇分子通过共价键与磷 脂分子上的活性基团结合而成； 优选地，所述聚乙二醇衍生化磷脂为选自聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺（PEG-PE)、聚 乙二醇-二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DMPE)、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 (PEG-DPPE)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE)中的一种或多种。6. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，氢化大豆磷脂与非离 子表面活性剂质量比为50:1-150:1，优选为50:1-100:1 ; 优选地，所述非离子表面活性剂为选自普朗尼克F68、普朗尼克F127、普朗尼克P123、 普朗尼克P85、普朗尼克L61、TPGS和HS15中的一种或多种。7. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述缓冲介质为选自 组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)缓冲液中的 一种或多种，其浓度范围可以为约10-约50mM，pH为5. 5-7. 5。8. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述盐酸伊立替康复 合磷脂组合物的Z均平均粒径为50-200nm，优选为50-120nm。9. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，氢化大豆磷脂与冻干 保护剂的质量比为1:0. 1-1:5,优选为1:0. 5-1:4 ; 优选地，所述冻干保护剂为选自蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糖等中的一种或多 种。10. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，以重量份计，其包含： 魏化大:口.磷脂 100 艽他磷脂 0.5-5,优选0,67-2 胆同醇 5-50,优选10-50 L<:循环膜材 5-50，优选〗0-50 非离了浚丽活性剂 0.67-2，优选1-2 盐酸伊立荇康 2-20,优选5-20 缓冲介质 适茕，稳定为pH5. 5-7. 5"11. 根据权利要求10所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述盐酸伊立替康 复合磷脂组合物进一步包含约10-500重量份，优选为约50-400重量份的冻干保护剂。12. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述组合物中的药物 包封率大于80%，优选大于85%，更优选大于90%。13. 根据权利要求1至12中任一项所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物的制备方法， 其包括以下步骤： a称取配方量的HSPC、其它脂质、长循环膜材和胆固醇溶于无水乙醇得有机相，将有 机相注入到浓度为约100-约400mmol/L的硫酸铵水溶液中高速(优选转速约5000-约 30000rpm)搅拌，经高压(优选约10000-约30000psi)均质、超声或挤出工艺，形成空白脂质 体悬液； 或者，称取配方量的HSPC、其它脂质、胆固醇和长循环材料溶于叔丁醇中，经冷冻干燥 后，加入浓度为约100-约400mmol/L的硫酸铵水溶液分散，形成空白脂质体悬液； b将步骤a所得空白脂质体悬液以纯水或蔗糖水溶液(浓度为300mM)通过切向流超 滤装置(膜分子量：l〇-l〇〇KDa ;流速：20-400ml/min ;压力：0-5bar)，置换脂质体体积的约 5_约30倍，以除去外水相硫酸铵建立硫酸铵梯度； c将盐酸伊立替康加入经步骤b处理所得空白脂质体悬液中，在高于脂质体相转变温 度的温度(优选37°C-70°C)下孵育10min-lh进行载药； d在经载药脂质体悬液中以固体形式加入缓冲盐和非离子表面活性剂，搅拌溶解，调节pH到5. 5-7. 5范围，即得盐酸伊立替康复合磷脂组合物； 或者将载药脂质体悬液经切相流超滤装置置换为药学可接受的缓冲液，再加入非离子 表面活性剂，调节pH到5. 5-7. 5范围，即得盐酸伊立替康复合磷脂组合物。14. 根据权利要求13所述的制备方法，其进一步在步骤d之后包括加入冻干保护剂的 步骤。15. 根据权利要求13或14所述的制备方法，其中，在步骤d之后或者在加入冻干保护 剂之后，采用微孔滤膜过滤除菌得到无菌制剂。16. 根据权利要求1-11中任一项所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物在制备治疗肿 瘤，尤其是耐药性肿瘤的药物中的用途，其中，所述肿瘤为结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢 癌、宫颈癌、胃癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、皮肤癌或胰腺癌。
【专利摘要】本发明公开了一种盐酸伊立替康复合磷脂组合物、制备方法及其在制备治疗肿瘤或耐药性肿瘤的药物中的用途。所述复合磷脂组合物包含盐酸伊立替康、复合磷脂、胆固醇、长循环膜材、表面活性剂、缓冲介质。该组合物主要解决了现有脂质制剂体内外稳定性差、药物易泄漏等问题，能大大提高脂质制剂的稳定性及盐酸伊立替康的抗肿瘤作用，并可克服肿瘤的多药耐药。
【IPC分类】A61K47/18, A61K31/4745, A61K47/22, A61K47/24
【公开号】CN104906586
【申请号】CN201410085842
【发明人】李亚平, 陈伶俐, 郑召磊, 张志文, 顾王文
【申请人】中国科学院上海药物研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月10日
【公告号】WO2015135441A1
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种盐酸伊立替康复合磯脂组合物、制备方 法及其在制备治疗肿瘤或耐药性肿瘤的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 盐酸伊立替康（Irinotecan，CPT-11)是半合成水溶性喜树碱衍生物，是DNA拓扑 异构酶I(TopoI)的抑制剂。伊立替康与其活性代谢产物SN-38通过与DNA-Topo-1复合 体的稳定结合引起DNA单链的断裂，使DNA产生不可逆的损伤而死亡。伊立替康是治疗转 移性结直肠癌的有效药物，对氣尿嚼巧耐药病例仍有效，而且具有很广的抗肿瘤谱。I期、II 期临床研究结果表明，该药对化疗抗拒性肿瘤，如非小细胞肺癌、卵巢癌和宫颈癌有肯定疗 效；另外它对胃癌、恶性淋己瘤（非霍奇金淋己瘤）、乳腺癌、小细胞肺癌、皮肤癌、膜腺癌也 有一定疗效。
[0003]目前，国内上市的产品为盐酸伊立替康的注射剂，该药抗癌活性强，但不良反应亦 较多，常见不良反应为食欲缺乏、恶也、呕吐、腹泻，白细胞和中性粒细胞减少、贫血及血小 板减少，脱发和己醜胆碱能综合症，该些不良反应大大限制了该药在临床上的使用。
[0004] 另外，因盐酸伊立替康结构中的内醋环具有抑依赖性，在碱性、中性甚至弱酸性 (如抑大于6时）溶液中会形成无活性的駿酸盐形式，因此在药物进入体内后会有相当一 部分药物转化为无活性的駿酸盐形式，从而降低了药效。
[0005]而且，多药耐药（Multi化ugResistance,MDR)是另外一个限制盐酸伊立替康临床 应用的主要问题。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构 和作用机理不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。多药耐药是导致抗癌药化疗失败的主要原 因。肿瘤的多药耐药会大大降低盐酸伊立替康和其它抗癌药的疗效。
[0006] 由此看来，目前上市剂型在安全性、有效性及克服多药耐药性方面均存在较大的 改进空间，该无疑限制了其在临床上更为广泛地应用。
[0007]为了增强药物的祀向性，延长体内滞留时间，增强疗效，降低毒性，美国 化armaEngine公司研发了CPT-11脂质体注射液，目前正在进行II期临床试验。在台湾进行 的I期临床试验结果表明，CPT-11脂质体注射液对晚期顽固性肿瘤受试者呈现出良好的有 效性、耐受性和药代动力学特性。
[0008] 中国专利申请CN101953792A公开了伊立替康长循环纳米脂质体及其制备方法， 该专利限定脂质体处方组成为磯脂、胆固醇、泊洛沙姆188、聚己二醇类化合物、伊立替康， 其制备方法为，将磯脂、胆固醇、泊洛沙姆188溶于己醇制备空白脂质体，透析法除硫酸馈， 再载药，该一工艺存在W下几个问题；（0在透析法除硫酸胺过程中容易将泊洛沙姆188和 聚己二醇类化合物如PEG2000 -并除掉，造成处方比例改变；（2)透析法所需时间长，难W 实现工业大生产；（3)载药过程中需调节脂质体外水相抑到7-7. 5,易造成脂质体稳定性 差、药物失活等问题。
[0009] 中国专利申请公开CN102485213A、CN103120645也公开了盐酸伊立替康脂质体及 制备方法，但在处方的经济性、合理性，工艺的可放大性、操作简便性，w及药物的安全性及 有效性方面仍然存在较多问题，而且上述专利文献均未提及脂质体制剂的体内外稳定性及 克服多药耐药问题。
[0010] 脂质体作为药物载体，既起到了对药物的保护作用，又提高了药物对机体特定部 位的祀向性，因此在提高药效方面具有很多优越的特性。然而，脂质体的体内外稳定性限制 了脂质体作为药物载体在临床的应用，其不稳定性主要表现在W下H个方面；
[0011] (1)脂质体的化学稳定性：构成脂质体的主要成分磯脂易发生氧化水解，造成双分 子膜流动性下降，脂质体稳定性降低，药物渗漏加剧；
[0012] (2)脂质体的物理稳定性：脂质体属胶体分散系，磯脂膜为对称双分子膜，分子间 为弱相互作用（疏水相互作用、范德华力、氨键等），因而它具有热力学不稳定性，主要表现 如下：脂质体膜是动态膜，磯脂分子间不断互换位置，其膜内外物质可自由跨膜交换，且交 换是随机的，无选择性；脂质体粒子可自发聚集、沉淀。另外，脂质体膜通常为双层凝胶相， 磯脂分子间排列紧密，碳氨链高度有序，膜流动性小，但常因温度、抑值和含水量等因素 的变化发生相变和相分离。当发生凝胶相一液晶相（LB-LA)相变，膜分子间隔加大，流 动性和通透性显著增加；当发生凝胶相一六角相（LB-HI或HII)相分离，膜上形成孔 洞或发生膜融合，所载药物迅速渗漏；
[0013] (3)脂质体的生物学稳定性：脂质体在血液中的稳定性是发挥药物载体作用的关 键。血液中有多种破坏因素：高密度脂蛋白（皿L)是破坏脂质体的主要成分，apoA-1蛋 白质易从皿L上脱落并与脂质体磯脂结合，且皿L和脂质体易发生apoA-1蛋白质与磯 脂的互换，脂质体膜形成孔洞；同时脂质体在血液中激活补体系统，最终形成攻膜复合体 (MAC),脂质体膜出现亲水性通道，引起药物渗漏和水、电解质的大量进入，最终渗透裂解 脂质体；血清白蛋白与脂质体磯脂结合形成复合物，降低其稳定性；血液中的磯脂酶可水 解磯脂，该反应强弱由磯脂结构决定；脂质体进入体内后，各种调理素如抗体、补体等与脂 质体结合，促进网状内皮系统对其快速清除。
[0014] 另外，常规制备伊立替康脂质体的方法包括抑梯度法和硫酸馈梯度法，其中WpH 梯度法制备的脂质体稳定性差，通常需设计成H个分装单元W提高制剂稳定性，但该种分 包装的脂质体制剂给生产、运输及临床使用带来极大不便；W硫酸馈梯度法制备脂质体过 程中，通常采用透析、柱层析、超滤等方法除外水相硫酸馈，该些方法存在样品处理量小、耗 时、样品稀释、膜孔易堵塞超滤效率低等问题，只适合少量样品的制备，不适合工业化大生 产，因而延缓伊立替康脂质体进入临床的进程。
【发明内容】
[001引技术问题
[0016] 本申请的发明人发现：已公开的伊立替康脂质体虽然较市售注射液有一定优势， 但存在W下缺陷：
[0017] (1)脂质体体外稳定性差，通常需采用H瓶装的特殊设计或冻干处理W解决长期 胆存过程中脂质体聚集、药物易泄露的问题；
[001引（2)脂质体体内稳定性差，脂质体进入体内后，由于血液中白蛋白、调理素、抗体等 各种因素的作用W及所用脂质相变温度低于体温等原因，包封药物快速泄露，大大削弱脂 质体制剂的优势，限制其疗效的发挥；
[0019] (3)所采用的脂质体制备方法及工艺难W实现工业化生产，且制得的脂质体粒径 难W控制，分布不均匀，包封率低、稳定性差；
[0020] (4)已公开的伊立替康脂质体未针对肿瘤的多药耐药问题提出解决方案和应对策 略。
[0021] 因此，对于盐酸伊立替康该个特定的药物来说，必须针对其稳定性问题、工业化生 产的要求及肿瘤多药耐药问题，寻找特定的制剂及制备工艺，W实现提高制剂稳定性及疗 效、降低毒副作用、克服肿瘤多药耐药的目的。
[00过技术方案
[0023] 为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明人进行了广泛深入的研究，最终 得到本发明。
[0024] 本发明的目的之一是为临床提供一种稳定的盐酸伊立替康复合磯脂组合物，所述 盐酸伊立替康复合磯脂组合物主要解决了现有脂质体制剂体内外稳定性差、药物易泄漏等 问题，能大大提高脂质体制剂的稳定性及盐酸伊立替康的抗肿瘤作用，克服其肿瘤的多药 耐药。
[00巧]本发明的另一目的是提供一种上述盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备方法。
[0026] 为了实现上述发明目的，本发明提供了 一种盐酸伊立替康复合磯脂组合物，其包 含盐酸伊立替康、复合磯脂、胆固醇、长循环膜材、非离子表面活性剂和缓冲介质；其中所述 复合磯脂由氨化大豆磯脂（HSPC)和其它脂质组成。
[0027] 本发明中，盐酸伊立替康和服PC的质量比为约1:5 -约1:50,优选为约1:5 -约 1:20。
[0028] 脂质体制剂稳定性与其组成直接相关。不同磯脂形成的脂质制剂稳定性明显不 同，而且由单一组分磯脂形成的脂质制剂极不稳定，所W本发明中采用复合磯脂作为组合 物的膜材。相比于单一磯脂组成的脂质体制剂，复合磯脂可通过分子间相互作用，提高脂膜 的刚性，使磯脂分子间的排列更加紧密有序，可W提高药物的包封率，减少药物在体内外的 泄露，从而大大提局其稳定性。
[0029] 本发明中，所述复合磯脂中的氨化大豆磯脂和其它脂质的质量比为20:1-200:1， 优选为 50:1-150:1，更优选为 50:1-100:1。
[0030] 本 发明中，所述的其它脂质是能够用于制备脂质体制剂的任何一种药学上可接受 的磯脂，优选可W为选自大豆磯脂（SPC)、蛋黄卵磯脂巧PC)、氨化卵磯脂（肥PC)、銷磯脂 (SM)、也磯脂、二硬脂醜磯脂醜胆碱（DSPC)、二踪搁醜磯脂醜胆碱（DPPC)、二肉豆證醜磯脂 醜胆碱（DMPC)、二油醜磯脂醜胆碱（D0PC)、二硬脂醜磯脂醜己醇胺（DSPE)、二踪搁醜磯脂 醜己醇胺值PP巧、二肉豆證醜磯脂醜己醇胺值M阳）、二油醜磯脂醜己醇胺值0P巧、二硬脂 醜磯脂醜甘油值SPG)、二踪搁醜磯脂醜甘油值PPG)、二肉豆證醜磯脂醜甘油值MPG)和二油 醜磯脂醜甘油值0PG)中的一种或多种，更优选为选自SPC、EPC、肥PC、DSPC和DSPG中的一 种或多种，更优选为DSPC。
[0031] 本发明中，所述胆固醇作为脂质体制剂的构成成分，起到稳定剂的作用，其用量对 制剂的稳定性和释放行为有显著影响。在本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中，氨化 大豆磯脂与胆固醇质量比为约2:1-约20:1，优选为约2:1-约10:1，更优选为约2:1-约 6:1。
[0032] 本发明中，所述长循环膜材用于实现脂质体制剂的长循环功能，延长药物在血液 中的循环时间，增加药物在肿瘤部位的蓄积，W进一步提高疗效，降低毒性。
[0033] 在根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中，氨化大豆磯脂与长循环膜材质 量比为约2:1-约20:1，优选为约2 ;1-约10:1。
[0034] 本发明中，优选地，所述长循环膜材为聚己二醇衍生化磯脂，其是聚己二醇分子通 过共价键与磯脂分子上的活性基团结合而成。优选地，聚己二醇衍生化磯脂为选自聚己 二醇-磯脂醜己醇胺（PEG-PE)、聚己二醇-二肉豆證醜磯脂醜己醇胺（PEG-DM阳）、聚己二 醇-二踪搁醜磯脂醜己醇胺（PEG-DPPE)、聚己二醇-二硬脂醜磯脂醜己醇胺（PEG-DSPE)中 的一种或多种。聚己二醇衍生化磯脂中所述PEG链段的分子量没有特殊限定，但是优选平 均分子量(数均)为约500-约5000化，更优选为约1000-约5000化，最优选为约2000Da。所 述分子量采用凝胶渗透色谱（GPC)方法检测。
[0035] 本发明中，非离子表面活性剂使脂质混息液中存在胶团和乳剂，其疏水端插入双 子膜，亲水端使脂质体高度亲水，防止了脂质制剂相互聚集融合和沉淀。它还改变磯脂分子 的排列和运动方式，导致膜纵向有序性（磯脂分子碳氨链间的紧密堆积情况）增大，流动性 降低，稳定性升高，该种影响随其浓度增大而增大。而且在血液中该类脂质制剂表面被高度 亲水的白蛋白覆盖，保护它不被MI^S吞瞻，延长脂质组合物在血液中的循环时间，因而非 离子表面活性剂的加入不仅能大大提高脂质组合物在体内外的稳定性，还有助于延长药物 在体内的循环时间，提高疗效。此外，非离子表面活性剂如普朗尼克（pluronic)、天然水溶 性维生素E(TPGSX15-羟基硬脂酸聚己二醇醋（HS15)等能通过W下作用机制逆转肿瘤的 多药耐药；第一；与MDR细胞膜相互作用，减少膜的微粘度，抑制PgpATP酶活性，从而抑制 Pgp外排粟的功能；第二；抑制MDR细胞线粒体的呼吸链，减少细胞膜电位，诱导细胞色素C 的释放，增加细胞质活性氧（R0S)的水平，减少ATP的含量；第H;抑制GSH/GST解毒系统的 功能；第四；增加促调亡信号并减少MDR细胞的抗调亡防御，因而配方中加入非离子表面活 性剂可增强耐药性肿瘤对药物的敏感型，逆转肿瘤的多药耐药。
[0036] 在根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中，氨化大豆磯脂与非离子表面活 性剂质量比为约50:1-约150:1，优选为约50:1-约100:1。
[0037] 本发明中，优选地，非离子表面活性剂为选自普朗尼克F68、普朗尼克F127、普朗 尼克P123、普朗尼克P85、普朗尼克L61、TPGS和服15中的一种或多种。
[003引研究表明卵磯脂、饱和大豆磯脂和磯脂醜甘油等的水解都受抑值的影响。水解产 物可W使脂质混息液的抑值下降，加速脂质制剂的进一步水解。因此，本发明在复合磯脂 组合物的混息液中加入缓冲介质，使抑稳定在脂质制剂最稳定的抑范围，W提高组合物的 稳定性。
[0039] 本发明中，优选地，所述盐酸伊立替康复合磯脂组合物中的缓冲介质可W为任何 药学上可接受的缓冲介质，优选的，所述缓冲介质为选自组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磯 酸盐缓冲液和4-轻己基脈嗦己賴酸（肥PES)缓冲液中的一种或多种，其浓度范围可W为约 10-约 50mM，pH为约 5. 5-约 7. 5。
[0040] 复合磯脂组合物粒径会影响其在体内的循环时间。本发明中，优选地，所述盐酸伊 立替康复合磯脂组合物的平均粒径狂均粒径）为约50-约200nm，优选为约50-约120nm。 所述粒径采用英国马尔文（Malvern)公司的NanoSizer90检测。本发明中，优选地，所述盐 酸伊立替康复合磯脂组合物可W进一步包含冻干保护剂。所述冻干保护剂用于将所得复合 磯脂组合物冷冻干燥制备成其冻干粉。在根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中， 氨化大豆磯脂与冻干保护剂的质量比为约1:0. 1-约1:5,优选为约1:0. 5-约1:4。
[0041]本发明中，优选地，所述冻干保护剂为选自藏糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糖等 中的一种或多种。
[0042] 在一个优选的实施方式中，W重量份计，根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组 合物包含：
[0043]
[0044] 优选地，在上述优选实施方式中，所述盐酸伊立替康复合磯脂组合物可W进一步 包含约10-500重量份，优选为约50-400重量份的冻干保护剂。
[0045] 在上述优选实施方式中的各组分的描述与前述内容相同，在此不再费述。
[0046] 本发明所述的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中，优选药物包封率大于80%，W便脂 质制剂能通过EPR效应聚集在肿瘤组织，减少在其它正常组织的分布，从而提高药效，降低 毒性。本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物中的药物包封率甚至大于85%，甚至更大于 90〇/〇。
[0047]制剂胆存稳定性是影响药物疗效及毒性的关键所在。本发明所述的盐酸伊立替康 复合磯脂组合物，优选在2-8C存放，至少可稳定半年。
[0048] 根据本发明的另一目的，提供了所述盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备方法， 其采用切向流超滤技术结合硫酸馈梯度法制备。该方法可实现工业化规模，高效率生产出 质量稳定的产品。
[0049] 因此，根据本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备方法包括W下步骤：
[0050]a称取配方量的服PC、其它脂质、长循环膜材和胆固醇溶于无水己醇得有机相，将 有机相注入到浓度为约100-约400mmol/L的硫酸馈水溶液中高速(优选转速约5000-约 30000巧m)揽拌，经高压(优选约10000-约3000化si)均质、超声或挤出工艺，形成空白脂质 体息液；
[0051] 或者，称取配方量的服PC、其它脂质、胆固醇和长循环材料溶于叔下醇中，经冷冻 干燥后，加入浓度为约100-约400mmol/L的硫酸馈水溶液分散，形成空白脂质体息液；
[0052]b将步骤a所得空白脂质体息液W纯水或藏糖水溶液(浓度为300mM)通过切向流 超滤装置(膜分子量；1〇-1〇〇邸a;流速；20-400ml/min;压力；0-5bar)，置换脂质体体积的 约5-约30倍，W除去外水相硫酸馈建立硫酸馈梯度；
[0053] C将盐酸伊立替康加入经步骤b处理所得空白脂质体息液中，在高于脂质体相转 变温度的温度下(优选37C-7(TC)赔育lOmin-lh进行载药；
[0054] d在经载药脂质体息液中W固体形式加入缓冲盐和非离子表面活性剂，揽拌溶解， 调节抑到5. 5-7. 5范围，即得盐酸伊立替康复合磯脂组合物；
[00巧]或者将载药脂质体息液经切相流超滤装置置换为药学可接受的缓冲液，再加入非 离子表面活性剂，调节抑到5. 5-7. 5范围，即得盐酸伊立替康复合磯脂组合物。
[0056] 进一步地，本发明的制备方法中，可上述步骤d之后包括加入冻干保护剂的步骤。
[0057] 本发明的制备方法中，在上述步骤d之后或者在加入冻干保护剂之后，可W采用 微孔滤膜过滤除菌得到无菌制剂。
[0058] 该里所说的超声、高压均质或挤出工艺是为了减小空白脂质息液的粒径，控制产 品的质量；所述切向流超滤工艺是为除去空白脂质息液外水相中的硫酸馈，W建立离子梯 度用于载药。
[0059] 上述制备过程中，一个最关键的步骤就是除去外水相的硫酸馈，产生硫酸馈梯度。 目前，常用除外水相硫酸馈方法是透 析、柱层析、超滤。该H种方法均存在一定问题，其中透 析法样品处理量少，透析时间长；柱层析会造成样品大大稀释；超滤过程中会出现膜孔堵 塞、超滤效率下降，因此只适合实验室小量样品的处理，不适合工业化大规模生产。
[0060] 切向流过滤是指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式。传统的液体死 端（deadend)过滤是大部分微孔过滤，包括除菌过滤所采用的过滤形式，其液体的流动方 向与过滤方向一致，随着过滤的进行，过滤膜表面形成的滤饼层或凝胶层厚度逐渐增大，流 速逐渐降低。当过滤介质为孔径细小的超滤膜或微滤膜时料液中固形物含量很高时，采取 死端过滤方式，流速将急速降低，因此死端过滤只能处理小体积的料液。采用切向流过滤方 式，液体流动在过滤介质表面产生剪切力，减小了滤饼层或凝胶层的堆积，保证了稳定的过 滤速度。目前在医药领域主要是应用于细胞收集、蛋白浓缩、蛋白脱盐、抗生素纯化等方面， 本发明将其应用于脂质体外水相硫酸馈的去除，具有较大创新性。
[0061] 本发明所用切向流过滤装置中，滤膜材料选自聚離讽树脂（PES)和H醋酸纤维素 (CT)，滤膜分子量为10-100邸a,流速为约20-约400ml/分钟，压力为0-5Bar。
[006引采用切向流超滤，还有如下的优势。
[0063] 采用切向流超滤技术置换外水相中硫酸馈时，样品处理量可达工业生产规模，所 需时间短，工作效率高，形成的离子浓度梯度大，所得脂质组合物包封率高，便于工业化生 产，减低生产成本；采用切向流超滤技术不会改变脂质制剂的性质如粒径及其分布；采用 切向流超滤，整个体系可W处于密封状态，所有管道可W清洗，防止操作过程细菌微生物的 影响，为整个制备过程的无菌提供保证，该对于注射剂的质量控制至关重要。
[0064] 所述相转变温度是指脂质凝胶态和液晶态之间相互转变时的温度。在高于脂质相 转变温度的温度下赔育，可使脂质膜通透性增强，伊立替康在离子梯度的驱动下更易透膜， 聚集于脂质体的内水相中。
[0065] 本发明又一方面提供了一种上述盐酸伊立替康复合磯脂组合物在制备治疗肿瘤， 尤其是耐药性肿瘤的药物中的用途，其中，所述肿瘤为结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、宫 颈癌、胃癌、恶性淋己瘤、乳腺癌、皮肤癌或膜腺癌。
[0066] 本发明与现有技术相比具有W下优点。
[0067] 本发明采用复合磯脂作脂质组合物的材料，相比于单一磯脂，可通过两种磯脂间 的相互作用，改变脂膜的结构，增强膜的刚性，使磯脂分子间的排列更加紧密有序，降低脂 膜的通透性，大大减少药物在存放过程或体内循环过程中药物的泄露，从而有助于提高疗 效。该一技术优势在其它相关专利文献中未见报道。
[0068] 本发明配方中非离子表面活性剂的加入，使脂质混息液中存在胶团，其疏水端插 入双分子膜，亲水端使脂质制剂高度亲水，防止了脂质制剂间相互聚集融合和沉淀。它还改 变磯脂分子的排列和运动方式，导致膜纵向有序性（磯脂分子碳氨链间的紧密堆积情况） 增大，流动性降低，稳定性提高；在血液中该类脂质制剂表面被高度亲水的白蛋白覆盖，保 护它不被MI^S吞瞻，延长复合磯脂组合物在血液中的循环时间，可大大提高复合磯脂组合 物的物理稳定性和生物学稳定性。而且，表面活性剂如普朗尼克、HS15、TPGS还可增强耐药 性肿瘤对药物的敏感型，逆转肿瘤的多药耐药。
[0069] 缓冲介质则可维持复合磯脂组合物的抑值在一定范围，减少复合磯脂材料的氧 化水解，提高复合磯脂组合物的化学稳定性。
[0070] 采用复合磯脂组合物作为盐酸伊立替康的载体，将药物包封于复合磯脂组合物 中，能明显提高药物在体内的稳定性，保持其活性内醋环结构形式，更好的发挥抗癌作用； 因盐酸伊立替康复合磯脂组合物属纳米制剂范畴，能显著延长药物在血液中的循环时间， 改善其体内分布，增加药物在肿瘤部位的聚集，提高药效，降低毒副作用，从而提高治疗指 数。
[0071] 本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物的平均粒径为约50-约200nm，能有效穿 透肿瘤血管，通过增强渗透和滞留作用（EH?效应）聚集在肿瘤部位，实现被动祀向作用。
[0072] 本发明盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备采用新型切向流超滤技术结合硫酸 馈梯度法，较现有制备方法更易实现工业化生产，并能解决现有制备技术粒径大且不均匀 的问题，更好控制产品的质量；采用硫酸馈梯度法将空白脂质体、盐酸伊立替康混合赔育， 就能制得包封率大于80%的盐酸伊立替康复合磯脂组合物，该方法操作简单且为该制剂的 临床应用提供了一个方便简单快捷的方法。
【附图说明】
[0073] 图1为根据本发明实施例1制备的盐酸伊立替康复合磯脂组合物的粒径分布图。
[0074] 图2为根据本发明实施例2制备的盐酸伊立替康复合磯脂组合物的zeta电位图。
[0075] 图3为根据本发明实施例1制备的盐酸伊立替康复合磯脂组合物和根据比较实施 例1制备的脂质体的体外释放测试结果图。
[0076] 图4为W生理盐水为对照，根据本发明实施例1制备的盐酸伊立替康复合磯脂组 合物及实施例2制备的脂质体的药效测试结果图。
【具体实施方式】
[0077] 下面结合实施例对本发明加W进一步说明，W下实施方式只W举例的方式描述本 发明。但该些实施例并不意味着对本发明加W任何限制。很明显，本领域普通技术人员可 在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖 在所附权利要求书中包括的变通和修改。
[0078] 试剂和药品
[0079] 大豆磯脂(上海太伟药业有限公司）巧SPC(上海艾韦特医药科技有限公司）； 阳G-DSPE(上海艾韦特医药科技有限公司）；PEG-PE(上海艾韦特医药科技有限公司）； 阳G-DPPE(上海艾韦特医药科技有限公司）；銷磯脂（上海紫一试剂厂）；蛋黄卵磯脂(上海 艾韦特医药科技有限公司）；胆固醇(南京新百药业有限公司）；se地adexG-50(美国GE公 司）；盐酸伊立替康(上海创诺制药有限公司）。
[0080] 实施例1盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备：
[0081] 将服PC1. 2g、DSPC0. 012g、胆固醇 0. 3g、阳G2000-DS阳0. 4gW1. 5ml无水己醇超 声溶解，将其注入到预热至65C的30ml250mM硫酸馈水溶液，高速(转速为200(K)巧m)揽拌 得初品，再于200(K)psi下高压均质4次，W超纯水经切向流超滤系统(膜分子量30kDa，流速 为200ml/min，压力为化ar)置换10倍体积除外水相硫酸馈，即得到空白脂质体息液；将所 得空白脂质体息液与盐酸伊立替康水溶液(浓度为lOmg/ml)按药物与服PC重量比1:10混 合，65°C赔育30min，再加入0. 012gF68、4. 3g藏糖、0. 065g组氨酸，调节抑=6. 0,即得盐酸 伊立替康复合磯脂组合物。
[0082] 实施例2盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备：
[0083]称取服PC1. 5g、大豆磯脂 0. 02g、胆固醇 0. 15g、PEG2000-DSPE0. 15g，W1. 5ml无 水己醇溶解，将其注入到预热至65°C的30ml200mM硫酸馈水溶液，高速(转速为2500化pm) 揽拌得初品，再于150(K)psi下高压均质4次，W300mM藏糖水溶液经切向流超滤系统(膜分 子量30kDa，流速300ml/min，压力为1.化ar)置换20倍体积除外水相硫酸馈，即得到空白 脂质体息液。将所得空白脂质体息液与盐酸伊立替康溶液(浓度为lOmg/ml)按药物与服PC 重量比1:20混合，55C赔育比后，再经切向流超滤系统除去未包封的药物，并将其外水相 置换为300mM藏糖、lOmM组氨酸缓冲液（pH=6. 5)，再加入0.02gHS15,揽拌溶解后，无菌过 滤分装，于4C胆存备用。
[0084] 实施例3盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备
[0085]称取服PC1. 2g、蛋黄卵磯脂 0. 024g、胆固醇 0. 12g、阳G2000-DPPE0. 4g，W1. 5ml无 水己醇溶解，将其注入到预热至65°C的30ml250mM硫酸馈水溶液，高速(转速为200(K)巧m) 揽拌得初品，再WlOOnm孔径的聚碳醋膜挤出4次，W300mM藏糖水溶液经切向流超滤系统 (膜分子量30kDa，流速lOOml/min，压力为1.化ar)置换5倍体积W除去外水相硫酸馈，即 得到空白脂质体息液。将所得空白脂质体息液与盐酸伊立替康水溶液(浓度为5mg/ml)按 药物与服PC重量比1:5混合，6(TC赔育lOmin后，再经切向流超滤系统除去未包封的药物， 并将其外水相置换为300mM藏糖、2 0mM磯酸盐缓冲液（pH=7. 4)，再加入0. 02gTPGS，溶解后 即得。
[0086] 实施例4盐酸伊立替康复合磯脂组合物的制备：
[0087]称取服PC1. 5g、DSPG0. 015g、胆固醇 0. 4g、PEG2000-DSPE0. 4g，W1. 5ml无水己醇 溶解，将其注入到预热至65°C的30ml250mM硫酸馈水溶液，高速(转速为200(K)巧m)揽拌得 初品，再WlOOnm孔径的聚碳醋膜挤出4次，W300mM藏糖水溶液经切向流超滤系统(膜分 子量30kDa，流速lOOml/min，压力为1.化ar)置换5倍体积W除去外水相硫酸馈，即得到 空白脂质体息液。将所得空白脂质体息液与盐酸伊立替康水溶液(浓度为5mg/ml)按药物 服PC重量比1:10混合，6(TC赔育lOmin后，再经切向流超滤系统除去未包封的药物，并将其 外水相置换为300mM藏糖、20mM肥阳S缓冲液（pH=7. 4)，再加入泊洛沙姆F680. 015g，揽拌 溶解后即得。
[0088] 实施例5盐酸伊立替康复合磯脂组合物冻干粉的制备：
[0089]称取服PC1. 6g、肥PCO. 032g、胆固醇 0. 16g、阳G2000-DM阳0. 5gW5ml叔下醇溶解， 于冻干机上冷冻干燥，再加入30ml200mM硫酸馈溶液水合超声至半透明，W超纯水经切向 流超滤系统(膜分子量lOkDa，流速200ml/min，压力为1.化ar)置换15倍体积W除去外水 相硫酸馈，即得到空白脂质体息液。取上述空白脂质体息液30ml与盐酸伊立替康溶液10ml (含盐酸伊立替康80mg)混合，6(TC赔育比后，加入普朗尼克F1270. 008g、甘氨酸0. 03g、藏 糖0. 2g、甘露醇0. 5g、乳糖Ig，揽拌溶解，并调节抑为7. 4,于冻干机中冻干即得盐酸伊立 替康复合磯脂组合物冻干粉。
[0090] 比较实施例1
[0091] 盐酸伊立替康现有脂质体的制备：
[009引按照中国专利申请公开CN101953792A公开的配方及方法制备，具体如下：
[0093] 称取大豆磯脂3g、胆固醇Ig、泊洛沙姆1880.6g、维生素E0.Ig溶解于无水己醇 1. 5ml中，在55C水浴条件下注入溶解了 0. 3评EG-DSPE的硫酸馈溶液（200mM) 30ml中，通 氮气条件下保温揽拌比，所得长循环空白脂质体在生理盐水中透析过夜，氨氧化轴调节外 水相抑为7. 4,再加入盐酸伊立替康溶液30ml(lOmg/ml)，55C赔育lOmin，过滤除菌后， 按4ml/瓶分装于西林瓶中。
[0094] 比较实施例2
[0095] 盐酸伊立替康现有脂质体的制备
[0096] 按照中国专利申请CN103120645A公开的配方及方法制备，具体如下：
[0097] 将Ig氨化大豆卵磯脂（HSPCX0. 25g胆固醇（CH0L)溶于适量无水己醇得脂质溶 液，与250Mml00ml硫酸馈溶液混合，减压除掉己醇得到空白脂质体粗品。之后采用高压 均质机lOOObar均质5次循环，之后通过挤出设备挤出脂质体控制其粒径(挤出器铺2张 0. 1ym挤出膜，挤出5次)。之后加入配制好的0.IgDS阳-PEG2000水溶液，揽拌赔育20分 钟。采用超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充注射用水，即得空白脂质体。
[0098] 用注射用水配制盐酸伊立替康水溶液，按照盐酸伊立替康与服PC的重量比例为 1:3. 5加入到上述具有离子梯度的空白脂质体分散液中，6(TC加热揽拌，赔育20分钟即得 载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓缩至约50ml，加入 0. 45g氯化轴调节渗透压。调整药物浓度，定容，0. 22ym滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶 中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。
[009引性能测试
[0100] 粒径及分布测试：
[0101] 取实施例1制得的伊立替康复合磯脂组合物用水稀释后，经粒径测定仪(型号： NanoSizer90,厂商；英国马尔文（Malvern)公司）测定其粒径及分布。结果如图1，其Z均 粒径为71. 53nm，多分散指数为0. 107,粒子分布较为均匀。
[0102] 同法测得其它实施例中复合磯脂脂质组合物的粒径和分布结果见表1。
[0103]表1
[0104]
[0105]Zeta电位的测定
[0106] 取实施例2制得的酒石酸长春瑞滨长循环脂质体，用nanosizer90测定其zeta电 位。结果如图2,其zeta电位为-12. 4mv。
[0107] 包封率的测定：
[010引取实施例1-5制得的盐酸伊立替康复合磯脂组合物进行包封率的测定。
[010引 色谱条件；色谱柱WatersSunFire*〔18柱（4. 6mmX250mm，5]im);流动相为己 膳-26mmol/L磯酸二氨轴溶液(含8mmol/L辛烷基賴酸轴）（32 : 68);流速Iml/min;柱温 4(TC;检测波长254nm;进样量20y1。
[0110] 取充分溶胀的Se地adexG-50葡聚糖凝胶适量，制备凝胶柱（30cmX1cm)，精密量 取盐酸伊立替康复合磯脂组合物0. 5ml上柱，WPBS(PH=7. 4)洗脱，收集含组合物的流份 共14ml，置50ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀后精密量取0. 5ml置10ml量瓶中，用酸化甲醇定 容，采用HPLC测定复合磯脂组合物中包裹的药量W;另取盐酸伊立替康复合磯脂0. 5ml置 于50ml量瓶中，同法操作，测定临床载药纳米制剂中的总药量W。。计算得盐酸伊立替康临 床载药纳米制剂的平均包封率为91. 27%。
[0111] 表 2
[0112]
[0113] 体外释放测定：
[0114] 取实施例1制得的伊立替康复合磯脂组合物、比较实施例1中的伊立替康脂质体 及盐酸伊立替康溶液进行体外释放的测定，其中盐酸伊立替康溶液配制方法为：称取一定 量盐酸伊立替康W超纯水配成浓度为2mg/ml的溶液。
[0115]精密量取伊立替康复合磯脂组合物、伊立替康脂质体1ml，加至透析袋(透析袋分 子量8000-14000Da)中，扎紧两端，置于装有20ml释放介质（pH7. 4磯酸盐缓冲液）的锥形 瓶中，于（37. 0 + 0. 5) °C条件下恒速振荡（lOOr/min)。分别在0. 5、1、2、4、8、12、2化取样， 进样测定，计算累积释放率（％)。同时考查伊立替康溶液的释放情况。W累积释放率（Q)对 时间（t)作图，释放曲线见图3。
[0116] 由图3可见，相比于伊立替康脂质体，伊立替康复合磯脂组合物药物释放较为缓 慢，2化时累积释放率为52%，表明本发明复合磯脂组合物较比较实施例1中的脂质体稳定 性更好。
[0117] 稳定性实验：
[0118] 取实施例1制得的盐酸伊立替康复合磯脂组合物和比较实施例2制得的盐酸伊立 替康脂质体进行稳定性试验。
[0119] 将实施例1制得的伊立替康复合磯脂组合物放置于2-8C，于0、1、2、3、6月取样， 并测定盐酸伊立替康总含量、有关物质(有关物质是残留合成原料、中间体、副产物及可能 降解产物的统称)、包封率、粒径等质量指标；将比较实施例2制得的盐酸伊立替康脂质体 相同条件放置后直接取样测定上述质量指标。
[0120] 从表3可W看出，比较实施例2制得的伊立替康脂质体在2-8C放置6个月后，盐 酸伊立替康总含量下降5. 6%，有关物质增加3. 53% ;而根据本发明的伊立替康复合磯脂组 合物在放置6个月后，各项质量指标与0月相比无明显变化，表明根据本发明的盐酸伊立替 康复合磯脂组合物稳定性较现有制剂有极大程度提高，更具有临床应用价值。
[0121] 表3现有脂质体与本发明的盐酸伊立替康复合磯脂组合物稳定性
[0122]
[0123] 药动学测试：
[0124] 取健康雄性SD大鼠(来源：上海实验动物中也）8只（体重200-220g)，随机分成2 组。尾静脉按lOmg/kg的剂量分别尾静脉注射给予实施例1和比较实施例2的盐酸伊立 替康复合磯脂组合物和伊立替康脂质体及伊立替康注射液后，分别于0. 08化、0. 2化、0. 5K lh、2h、化、6h、她、2化由大鼠眼框静脉丛取血，取血量约0. 3ml,置于肝素化离也管中，于 10000巧111下离也lOmin，取lOOy1血浆，加入lOy110%甲酸和500y1甲醇，润旋lmin，-20 度放置比用W沉淀蛋白，然后于20000g离也lOmin。取上清液进样测定血液中伊立替康药 物浓度。药代动力学参 数用WinNonlinProfessionalv6. 3 (Pdayarsi曲t,USA)软件采用 非房室模型分析处理。
[01巧]表4
[0126]
[0127] 注；K,i为消除速度常数，ti/2为半衰期，AUC为血药浓度时间曲线下面积
[0128] 由表4可W看出，本发明盐酸伊立替康复合磯脂组合物的半衰期和AUC分别是比 较实施例2中伊立替康脂质体的9. 06倍和41倍，表明本发明盐酸伊立替康复合磯脂组合 物较脂质体具有更好的体内稳定性，大大延长了盐酸伊利替康的生物半衰期，提高了药物 的生物利用度。
[0129] 抗肿瘤活性测试：
[0130] Ba化/c裸鼠（购自上海实验动物中也）适应环境5山将对数生长期的MCF-7/ADR 细胞消化后制成1Xl〇7ml细胞息液，在Ba化/c裸鼠右前肢皮下注射0. 1ml细胞息液，建立 荷瘤模型。待小鼠肿瘤平均体积长至50-100皿3左右时，将裸鼠随机分为3组，每组10只。 各组分别于第1、4、7天通过尾静脉注射给药，给药剂量为实施例1中的CPT-11复合磯脂组 合物20mg/kg，比较实施例2中的CPT-1120mg/kg和生理盐水(对照组)，用卡尺测量各裸鼠 肿瘤的长径（a)及短径化），按（aXb2) / 2公式计算肿瘤体积。
[0131] 由图4可W看出，盐酸伊立替康复合磯脂组合物及盐酸伊立替康脂质体对裸鼠耐 药性乳腺癌均有较好的抑制作用，各剂量组肿瘤体积与对照组（即生理盐水组）相比均显著 降低（P<0. 05,0. 01)，且同剂量的复合磯脂组合物组较比较实施例2中的盐酸伊立替康脂 质体组有更好的抑瘤效果（P<〇. 05)，表明本发明盐酸伊立替康复合磯脂组合物在一定程度 上可逆转肿瘤耐药。
【主权项】
1. 一种盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其包含盐酸伊立替康、复合磷脂、胆固醇、长循 环膜材、非离子表面活性剂和缓冲介质；其中所述复合磷脂由氢化大豆磷脂（HSPC)和其它 脂质组成。2. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，盐酸伊立替康和HSPC 的质量比为1:5 - 1:50,优选为1:5 - 1:20。3. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述复合磷脂中 的氢化大豆磷脂和其它脂质的质量比为20:1-200:1，优选为50:1-150:1，更优选为 50:1-100:1 ； 优选地，所述其它脂质选自选自大豆磷脂（SPC)、蛋黄卵磷脂（EPC)、氢化卵磷脂 (HEPC)、鞘磷脂（SM)、心磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC)、 二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱（DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE)、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺（DMPE)、二油酰磷脂酰 乙醇胺（DOPE)、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG)、二肉豆蘧酰磷 脂酰甘油（DMPG)和二油酰磷脂酰甘油（D0PG)中的一种或多种，更优选为选自SPC、EPC、 HEPC、DSPC和DSPG中的一种或多种，更优选为DSPC。4. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，氢化大豆磷脂与胆固 醇质量比为2:1-20:1，优选为2:1-10:1，更优选为2:1-6:1。5. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，氢化大豆磷脂与长循 环膜材质量比为2:1-20:1，优选为2 :1-10:1; 优选地，所述长循环膜材为聚乙二醇衍生化磷脂，其是聚乙二醇分子通过共价键与磷 脂分子上的活性基团结合而成； 优选地，所述聚乙二醇衍生化磷脂为选自聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺（PEG-PE)、聚 乙二醇-二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DMPE)、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 (PEG-DPPE)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE)中的一种或多种。6. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，氢化大豆磷脂与非离 子表面活性剂质量比为50:1-150:1，优选为50:1-100:1 ; 优选地，所述非离子表面活性剂为选自普朗尼克F68、普朗尼克F127、普朗尼克P123、 普朗尼克P85、普朗尼克L61、TPGS和HS15中的一种或多种。7. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述缓冲介质为选自 组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)缓冲液中的 一种或多种，其浓度范围可以为约10-约50mM，pH为5. 5-7. 5。8. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述盐酸伊立替康复 合磷脂组合物的Z均平均粒径为50-200nm，优选为50-120nm。9. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，氢化大豆磷脂与冻干 保护剂的质量比为1:0. 1-1:5,优选为1:0. 5-1:4 ; 优选地，所述冻干保护剂为选自蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糖等中的一种或多 种。10. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，以重量份计，其包含： 魏化大:口.磷脂 100 艽他磷脂 0.5-5,优选0,67-2 胆同醇 5-50,优选10-50 L<:循环膜材 5-50，优选〗0-50 非离了浚丽活性剂 0.67-2，优选1-2 盐酸伊立荇康 2-20,优选5-20 缓冲介质 适茕，稳定为pH5. 5-7. 5"11. 根据权利要求10所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述盐酸伊立替康 复合磷脂组合物进一步包含约10-500重量份，优选为约50-400重量份的冻干保护剂。12. 根据权利要求1所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物，其中，所述组合物中的药物 包封率大于80%，优选大于85%，更优选大于90%。13. 根据权利要求1至12中任一项所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物的制备方法， 其包括以下步骤： a称取配方量的HSPC、其它脂质、长循环膜材和胆固醇溶于无水乙醇得有机相，将有 机相注入到浓度为约100-约400mmol/L的硫酸铵水溶液中高速(优选转速约5000-约 30000rpm)搅拌，经高压(优选约10000-约30000psi)均质、超声或挤出工艺，形成空白脂质 体悬液； 或者，称取配方量的HSPC、其它脂质、胆固醇和长循环材料溶于叔丁醇中，经冷冻干燥 后，加入浓度为约100-约400mmol/L的硫酸铵水溶液分散，形成空白脂质体悬液； b将步骤a所得空白脂质体悬液以纯水或蔗糖水溶液(浓度为300mM)通过切向流超 滤装置(膜分子量：l〇-l〇〇KDa ;流速：20-400ml/min ;压力：0-5bar)，置换脂质体体积的约 5_约30倍，以除去外水相硫酸铵建立硫酸铵梯度； c将盐酸伊立替康加入经步骤b处理所得空白脂质体悬液中，在高于脂质体相转变温 度的温度(优选37°C-70°C)下孵育10min-lh进行载药； d在经载药脂质体悬液中以固体形式加入缓冲盐和非离子表面活性剂，搅拌溶解，调节pH到5. 5-7. 5范围，即得盐酸伊立替康复合磷脂组合物； 或者将载药脂质体悬液经切相流超滤装置置换为药学可接受的缓冲液，再加入非离子 表面活性剂，调节pH到5. 5-7. 5范围，即得盐酸伊立替康复合磷脂组合物。14. 根据权利要求13所述的制备方法，其进一步在步骤d之后包括加入冻干保护剂的 步骤。15. 根据权利要求13或14所述的制备方法，其中，在步骤d之后或者在加入冻干保护 剂之后，采用微孔滤膜过滤除菌得到无菌制剂。16. 根据权利要求1-11中任一项所述的盐酸伊立替康复合磷脂组合物在制备治疗肿 瘤，尤其是耐药性肿瘤的药物中的用途，其中，所述肿瘤为结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢 癌、宫颈癌、胃癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、皮肤癌或胰腺癌。
【专利摘要】本发明公开了一种盐酸伊立替康复合磷脂组合物、制备方法及其在制备治疗肿瘤或耐药性肿瘤的药物中的用途。所述复合磷脂组合物包含盐酸伊立替康、复合磷脂、胆固醇、长循环膜材、表面活性剂、缓冲介质。该组合物主要解决了现有脂质制剂体内外稳定性差、药物易泄漏等问题，能大大提高脂质制剂的稳定性及盐酸伊立替康的抗肿瘤作用，并可克服肿瘤的多药耐药。
【IPC分类】A61K47/18, A61K31/4745, A61K47/22, A61K47/24
【公开号】CN104906586
【申请号】CN201410085842
【发明人】李亚平, 陈伶俐, 郑召磊, 张志文, 顾王文
【申请人】中国科学院上海药物研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月10日
【公告号】WO2015135441A1
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