一种多糖微凝胶的制备方法
一种多糖微凝胶的制备方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于微凝胶制备方法领域，更具体地，设及一种能够负载药物或者无机纳米粒子的多糖微凝胶的制备方法。【
背景技术：
】[0002]高分子微凝胶是聚合物通过物理或化学交联形成的具有稳定=维网络结构的胶体粒子，其颗粒尺寸在纳米或微米级。具有生物相容性的高分子微凝胶在水中能充分溶胀并保持其稳定分散的胶体性质，从而具有很多优异的特性；多孔性、形态可塑性及尺寸可调性等。因此，水溶性高分子微凝胶在生物和制药等方面倍受重视。当被用作药物载体时，纳米凝胶表现出如下优势；1)在药物传输过程中，微凝胶能很好地稳定和保护所装载的小分子药物；2)当受到外界环境刺激时，微凝胶能调控自身尺寸，达到释放小分子药物的目的；3)微凝胶能可逆地调节自身物理化学性质，达到释放小分子的目的。[0003]在作为药物载体时，具有生物相容性且可降解的高分子微凝胶体系倍受关注。该类材料在体内可W被水解或者酶解，释放药物后很容易被人体代谢。例如，葡聚糖具有很好的生物相容性和可降解性，在药物载体构建方面展现出其独特优势。葡聚糖来源经济，无毒性，侧链基团易于功能化；与蛋白质相比，不易受环境影响而变性，且糖单元之间的碳氧键在抑值变化时可W发生水解。通过物理或化学方法制备的葡聚糖微凝胶具有温度或抑值敏感特性，可作为智能凝胶，在药物缓释、酶固载、膜分离等方面有很好的应用前景。[0004]由于葡聚糖凝胶广泛的应用前景，葡聚糖水凝胶的制备方法已有许多文献报道，但该些方法制备的水凝胶尺寸不可控，并不适用于作为药物载体。例如，Hennink课题组【1】于1998年在化arm.Res.上首次报道了基于葡聚糖和甲基丙己締酸哲已脂共聚物微凝胶的合成。随后，Zhang等人【2】于2004年，Shoichet等人【3】于2006年在Biomaterials分别报道了马来酸酢和硫酸酢修饰的葡聚糖微凝胶和合成方法（文献详细信息）。该些方法的前期单体制备过程复杂，成本较高，且合成的纳米粒子粒径分布较宽，难W用于药物的准确装载和释放。化rreira等人【4】于2005年在Biomaterials上报道了在结晶诱导作用下通过物理交联来制备葡聚糖微凝胶颗粒（文献详细信息），该方法制备的纳米粒子可调控性也较差。此外，该些水凝胶作为药物载体或者其他功能性无机纳米粒子的载体时，受水凝胶本身属性的制约和负载过程的限制，往往无法准确的装载W及释放药物粒子和其他功能性无机纳米粒子。[0005][1]StenekesR.,Franssen0.,vanRommelE.,etal.ThePreparationofDextranMicrospheresinanAll-AqueousSystem:EffectoftheFormulationParametersOnParticleCharacteristics.PharmaceuticalResearch1998,15(4):557~561.[0006][2]ZhangX.,WuD.,ChuC.SynthesisandCharacterizationofPartiallyBiodegradable,TemperatureandpHSensitiveDex-MA/PNIPAAmHydrogels.Biomaterials2004,25(19):4719~4730.[0007][3]加ptaD.,TatorC.H.,ShoichetM.S.Fast-GellingInjectableBlendofHyaluronanandMethylcelluloseforIntrathecal,LocalizedDeliverytotheIn_juredSpinalCord.Biomaterials2006,27(11):2370~2379.[000引[4]FerreiraL.,GilM.H.,C油ritaA.M.S.,etal.BiocatalyticSynthesisofHighlyOrderedDegradableDextran-BasedHydrogels.Biomaterials2005,26(23):4707~4716.【
发明内容】[0009]针对现有技术的W上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种多糖微凝胶的制备方法，其中通过对关键的多糖微凝胶的制备工艺、W及与之配合的粒子负载过程等进行改进，与现有技术相比能够有效解决微凝胶尺寸不可控的问题，该微凝胶能够对疏水性药物、功能性纳米粒子等进行有效包覆，实现药物的准确装载和释放，起到有效负载药物的作用，并且，该制备方法的产率高，能够有效降低多糖微凝胶的制备成本。[0010]为实现上述目的，按照本发明，提供了一种多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，包括W下步骤：[0011](1)制备1,6-己二异氯酸醋胆固醇单醋：[001引将3g~5g胆固醇与20血~28血1,6-己二异氯酸醋混合，向其中分别加入80血~150血甲苯和2血~6血化晚，并在70°C~90°C下反应40h~6化得到第一混合体系；接着，于30°C~60°C减压蒸馈除去所述第一混合体系中的溶剂，然后向其中加入200血~500血石油離，在-20°C~-5°C下保存至少1化得到第二混合体系；接着，过滤该第二混合体系得到滤渣，将该滤渣真空干燥后即得到1,6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；[0013](2)制备疏水性多糖衍生物：[0014]将0.2g~0.5g所述步骤（1)得到的1,6-己二异氯酸醋胆固醇单醋加入到80血~150血二甲亚讽中，并向其中加入2g~6g的天然多糖和6血~10血化晚，在70°C~90°C下反应她~1化得到第S混合体系；接着，向该第S混合体系中加入300血~600血己醇，于0°C~15°C下保存至少1化后得到沉淀；然后，收集沉淀，并将所述沉淀在水中透析3天~5天，保留下的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物；[0015](3)制备无负载或者负载有药物或纳米粒子的多糖水凝胶：[0016]向二甲亚讽溶剂中加入所述步骤（2)得到的胆固醇修饰的多糖衍生物，形成胆固醇修饰的多糖衍生物质量百分浓度为0.Ig/血~Ig/血的第一溶液；向二甲亚讽溶剂或者四氨快喃溶剂中加入待负载物，形成待负载物质量百分浓度为Img/mL~lOmg/mL的第二溶液，所述待负载物为药物和纳米粒子中的一种或其混合物；接着，将10yL~100yL的所述第一溶液与0yL~80yL的所述第二溶液混合得到前驱体，剧烈揽拌所述前驱体，并向其中加入0.8血~10血&0,在50°C~80°C或者10°C~30°C下揽拌12h~2化，然后用40W~60W探头式超声波在20°C~50°C或者0°C~20°C下超声处理所述前驱体lOmin~15min;接着重复所述在50°C~80°C或者10°C~30°C下的揽拌处理、W及在20°C~50°C或者0°C~20°C下的超声处理至少2次，即得到无负载或者负载有药物或纳米粒子的多糖水凝胶。[0017]作为本发明的进一步优选，所述步骤（3)中向前驱体中加入0.8~lOmL&0是用注射累10~30min加入0.8~lOmL&0。[001引作为本发明的进一步优选，所述步骤（2)中的天然多糖为葡聚糖，所述葡聚糖的分子量为3000~2000000。[0019]作为本发明的进一步优选，所述步当前第1页1 2 3 4 骤（3)中待负载的药物为紫杉醇或者为B-raf抑制剂。
[0020] 作为本发明的进一步优选，所述步骤（3)中待负载的纳米粒子为量子点或者磁性 纳米粒子。
[0021] 通过本发明所构思的W上技术方案，与现有技术相比，具有W下有益效果：
[0022] 1.本发明利用胆固醇对天然多糖进行改性，通过1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋 将胆固醇引入到天然多糖中，制备方法简单可行、产率高。在利用胆固醇对天然多糖（如葡 聚糖等）进行疏水改性的步骤中，通过对制备过程中的各种参数（包括原料、原料配比及浓 度、反应温度及时间等）进行调整，在确保生成胆固醇修饰的多糖衍生物（即CHP)的基础 上，有效保证了胆固醇修饰的多糖衍生物的产率，采用的原料经济，合成方法简单易行，生 成的胆固醇修饰的多糖衍生物生物相容性好，可直接应用于药物负载。
[0023] 2.本发明通过采用特定的方式将药物或小分子（即纳米粒子）负载到多糖微 凝胶上，使多糖微凝胶的负载效果大大提高，并且适用于高温不稳定、易变性药物的负载， 非常适于实际应用。本发明通过采用探头式超声波，功率高，超声效果好，能保证凝胶的快 速成形；并且配合使用特定的反应参数（包括浓度、反应时间等），使得在室温范围内（即 10°C~30°C的温度范围内）能够有效的将药物或者纳米粒子包覆至疏水性多糖衍生物中， 保持了药物或者纳米粒子本身的活性，方法简单易行。
[0024] 本发明中的药物/纳米粒子的负载步骤紧密结合葡聚糖的疏水性改性步骤，负载 方法中的各种参数（包括溶液浓度、反应温度及时间、凝胶产生手段等）均与胆固醇修饰的 多糖衍生物的制备方法相对应，有效的保证了疏水性多糖衍生物的药物负载效果。在负载 步骤中，优选采用注射累在一定时间内注入一定量的馬0,该样缓慢的加入&0能使微凝胶 缓慢的形成，从而确保药物能更好的负载进微凝胶。
[0025] 通过采用本发明的负载方法，在微凝胶上既能成功负载各种药物，也能根据需要 负载各种功能性纳米粒子。通过采用与微凝胶配合的方式，对于高温不稳定的药物，在不影 响药物活性的前提下，能成功进行负载当负载药物时，由于很多药物是疏水性的，用常规方 法不能进行给药，本发明通过对天然多糖进行胆固醇修饰，W胆固醇作为疏水性基团，使生 成的多糖衍生物具有疏水性；提供的多糖微凝胶可W包覆疏水性药物，从而实现疏水性药 物的生物给药。当负载纳米粒子（如磁性纳米粒子或者量子点）时，磁性纳米粒子的包覆 使得在磁场调控下能进行药物的祀向输送和远程调控，量子点的巧光效应则能监测纳米粒 子在体内的分布。
[0026] 综上，本方法的前期单体制备过程简单，可有效的降低成本；并且，由于合成的纳 米粒子粒径分布较为集中，可通过参数（如浓度、反应温度等）有效控制颗粒的粒径，可调 控性好；当用于负载药物或者其他功能性纳米粒子时，微凝胶能够可逆的调节自身物理化 学性质，做到准确装载W及释放。
【附图说明】
[0027] 图1中，图la是纳米凝胶的透射电子显微镜图，图化是纳米凝胶的动态激光光散 射值L巧粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL中快速 加入1血H20,60°C下揽拌12h;上述溶液用探头式超声装置在40W和常温下超声lOmin，反 复3次即得到纳米凝胶；
[002引图2中，图2a是纳米凝胶的透射电子显微镜图，图化是动态激光光散射值LS)粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mL CHP/DMSO溶液10 y L分别与2mg/mL PTX/DMSO溶液80 y L混合均匀，剧烈揽拌，快速加入ImL &0,60°C揽拌12h，溶液用探头式 超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶；
[0029] 图3中，图3a是纳米凝胶的透射电子显微镜图，图3b是动态激光光散射值LS) 粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL分别与2mg/mL PTX/DMSO溶液80yL混合均匀，剧烈揽拌，利用注射累lOmin加入1血&0,常温揽拌12h， 溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶；
[0030] 图4是PTX/DMSO紫外吸收标准曲线及负载PTX的纳米凝胶的紫外吸收图；
[0031] 图5中，图5a是纳米凝胶的透射电子显微镜图，图化是动态激光光散射值城粒 径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL与2mg/mlB-raf 抑制剂的DMSO溶液80yL混合均匀，剧烈揽拌，利用注射累lOmin加入ImL&0,常温揽拌 12h，溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶；
[0032] 图6是负载B-raf抑制剂的纳米凝胶的紫外吸收图；
[0033] 图7中，图7a是纳米凝胶的透射电镜图，图化是巧光图，图7c是动态激光光散 射值L巧粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向100mg/mLCHP/DMSO溶液lOuL与 化-Zn-Ln-S孤s/THF溶液混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式 超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶
[0034] 图8中，图8a是纳米凝胶的透射电镜图，图8b是巧光图，图8c是动态激光光散射 值L巧粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL与CdSe/ ZnS孤s/THF溶液混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在 40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶；
[0035] 图9中，图9a是纳米凝胶的磁响应示例图，图9b是动态激光光散射值L巧粒径分 布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL与4皿化3〇御米粒子 /THF溶液混合均匀，剧烈揽拌，加入ImL&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在40W和 常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶。
【具体实施方式】
[0036] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所设及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可W相互组合。
[0037] 本发明中的葡聚糖衍生物CHP采用下面的制备方法制备，其中，使用的葡聚糖分 子量为50000 ;胆固醇为分析纯（来自国药集团化学试剂有限公司）；1，6-己二异氯酸醋为 TCI公司生产；所用试剂二甲亚讽值MSO)、甲苯、化晚均经过干燥除水；实施例使用的其他 试剂（如石油離、己醇等）除特别说明外，均为化学纯，购自于国药集团化学试剂有限公司。 本发明提供的葡聚糖衍生物CHP的制备方法具体包括W下步骤：
[003引 （1)合成1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；取3. 9g胆固醇与24mL1，6-己二异氯 酸醋，向其中依次加入lOOmL甲苯和2mL化晚（其中甲苯和化晚为溶剂），于80°C反应4她 得到第一混合体系，该第一混合体系只有液相。反应结束后，减压蒸馈除去溶剂（即甲苯和 化晚），加入300mL石油離。在-10°C保存过夜（一般是12小时W上，确保白色产物析出） 得到第二混合体系，该第二混合体系为固液两相。将该第二混合体系过滤得到滤渣，真空干 燥滤渣得到白色粉末状1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋。
[0039] (2)合成胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP;取1,6-己二异氯酸醋胆固醇单醋 0. 344g与葡聚糖4.OOg，向其中依次加入100血DMS0和8血化晚，于80°C反应她 。反应结 束后，将500mL己醇加入到反应体系中，于4°C保存过夜（一般是12小时W上，确保白色产 物析出，收集沉淀，水中透析（透析是为了除去没有反应完全的反应物、溶剂等，本发明中 的透析使用透析袋的截留分子量为14000,透析3天，每6小时换一次水），干燥得白色粉末 状胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP。
[0040] 紫杉醇（PTX)、Vemurafenib(PLX4032,RG7204)B-raf抑制剂、量子点（记为孤S) 或者磁性纳米粒子均可负载于胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP上，形成葡聚糖衍生物纳米 凝胶，本发明提供的葡聚糖衍生物纳米凝胶的制备方法有W下两种方法：
[004U (1)对于一般药物、功能性纳米粒子，将CHP/DMS0溶液与药物或者纳米粒子的 DMS0(即二甲亚讽）或者THF(即四氨快喃）溶液混合均匀，剧烈揽拌，加入1血H20,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，接着在60°C揽拌12h，并将溶液 用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，如此反复至少3次得到的纳米凝胶。
[0042] (2)对于高温不稳定，易变性的药物，将CHP/DMS0溶液与药物或者纳米粒子的 DMS0或者THF溶液混合均匀，剧烈揽拌，用注射累lOmin加入1血&0,常温揽拌12h，并将 溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，接着再常温揽拌12h，并将溶液用探头式 超声波在40W和常温下超声lOmin，如此反复至少3次得到的纳米凝胶。
[0043] 本发明提供的纳米凝胶直径约在200nm至300nm之间，为葡聚糖衍生物纳米水凝 胶。该葡聚糖衍生物纳米水凝胶的应用实施例如下：
[0044] 实施例 1 ;将lOOmg/血CHP/DMS0 溶液 10y1 分别与 2mg/血PTX/DMS0 溶液 0yL、 10yL、20yL、40yL、80yL混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式 超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到没有负载PTX、负载不同浓度PTX的纳 米凝胶。图2a、2b即对应其中一种生长参数。
[0045] 实施例 2 ;将lOOmg/血CHP/DMS0 溶液 10yL分别与 2mg/mLPTX/DMS0 溶液 0yL、 10yL、20yL、40yL、80yL混合均匀，剧烈揽拌，利用注射累lOmin加入1血&0,常温揽拌 12h，溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到没有负载PTX、负载 不同浓度PTX的纳米凝胶。图3a、3b即对应其中一种生长参数。
[0046] 实施例1/2中的微凝胶对紫杉醇的包覆率可W通过紫外标准曲线法来测定，如图 4所示。下表1是实施例1中微凝胶对紫杉醇的载药率示例。
[0047] 表1微凝胶负载不同体积紫杉醇溶液时的载药率
[0048]
[0049]实施例 3 ;将lOOmg/血CHP/DMSO溶液 10yL与 2mg/mLB-raf抑制剂的DMSO溶 液20yL、80化混合均匀，剧烈揽拌，利用注射累lOmin加入1血馬0,常温揽拌12h，溶液 用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到没有负载B-raf抑制剂、负载 不同浓度B-raf抑制剂的纳米凝胶。图5a、5b即对应其中一种生长参数。
[0050] 实施例3中的微凝胶对B-raf抑制剂有较好的负载，如图6所示，其载药率如下表 2所示。
[0化1] 表2微凝胶负载不同体积B-raf抑制剂溶液时的载药率
[0化2]
[0053] 实施例 4 ;将lOOmg/mLCHP/DMSO溶液 10yL与lOmg/mLCu-Zn-Ln-S孤s/THF溶 液20yL混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在40W和 常温下超声lOmin，反复3次即得到负载化-Zn-Ln-S孤S的纳米凝胶，见图7a、7b、7c。
[0054] 实施例 5 ;将lOOmg/mLCHP/DMSO溶液 10yL与lOmg/mLCdSe/aiSQDs/THF溶液 20yL混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在40W和常温 下超声lOmin，反复3次即得到负载CdSe/ZnS孤S的纳米凝胶，见图8a、8b、8c。
[00巧]实施例6 ;将lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL与lOmg/血的直径4nm化3〇4磁性纳 米粒子/THF溶液20化混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超 声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到负载化3〇4磁性纳米粒子的纳米凝胶，见 图9a、9b。如图9a所示，该纳米凝胶经磁响应反应后，集中在了试样瓶壁的局部部分（如图 9a试样下部瓶壁的灰色区域），磁响应性质良好。
[0化6] 实施例7 ;葡聚糖衍生物CHP的制备方法
[0057] 合成1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；将3g胆固醇与20血1，6 -己二异氯酸醋混 合，向其中分别加入80mL甲苯，2mL化晚，并在90°C反应4化得到第一体系浪着，30°C减压 蒸馈除去所述第一体系中的溶剂甲苯和化晚，然后向其中加入200mL石油離，在-20°C下保 存至少1化得到第二混合体系；接着，过滤该第二混合体系得到滤渣，将该滤渣真空干燥 后即得到1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；
[0化引合成胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP;将0. 2g所述步骤（1)得到的1，6-己二异 氯酸醋胆固醇单醋加入到80血DMS0中，并向其中加入2.OOg葡聚糖（分子量为3000)，和 6mL化晚，在90°C下反应她得到第S混合体系；接着，向该第S混合体系中加入300mL己 醇，于0°C下保存至少1化后得到沉淀；然后，收集沉淀，并将所述沉淀在水中透析，保留下 的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物。
[0059] 实施例8 ;葡聚糖衍生物CHP的制备方法
[0060] 合成1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；将5g胆固醇与28血1，6 -己二异氯酸醋混 合，向其中分别加入150血甲苯，6血化晚，并在70°C反应6化得到第一体系浪着，60°C减 压蒸馈除去所述第一体系中的溶剂甲苯和化晚，然后向其中加入500mL石油離，在-5°C下 保存2化得到第二混合体系；接着，过滤该第二混合体系得到滤渣，将该滤渣真空干燥后即 得到1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；
[0061] 合成胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP;将0. 5g所述步骤（1)得到的1，6-己二异 氯酸醋胆固醇单醋加入到150血DMS0中，并向其中加入6g葡聚糖（分子量为2000000)，和 lOmL化晚，在70°C下反应1化得到第S混合体系；接着，向该第S混合体系中加入600mL己 醇，于15°C下保存至少1化后得到沉淀；然后，收集沉淀，并将所述沉淀在水中透析，保留下 的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物。
[006引实施例9;制备负载有紫杉醇（PT幻的多糖水凝胶
[0063]将 0.Ig/mLCHP/DMSO溶液 10y1 与Img/血PTX/DMSO溶液 10yL混合均匀，剧烈 揽拌上述溶液，并向其中加入〇.8mL&0,在50°C下揽拌12h，溶液用40W探头式超声波在 20°C下超声lOmin，再在50°C下揽拌12h，然后再用40探头式超声波在20°C下超声处理所 述前驱体10min,反复3次即得到负载PTX的纳米凝胶。
[0064] 实施例10 ;制备负载有紫杉醇（PT幻的多糖水凝胶
[00化]将Ig/mLCHP/DMSO溶液 100y1 与lOmg/mLPTX/DMSO溶液 80yL混合均匀，剧烈 揽拌，加入lOm L&0,在80°C揽拌2化，溶液用60W探头式超声波在60°C下超声15min，再在 80°C下揽拌2化，然后再用60W探头式超声波在60°C下超声处理所述前驱体15min，反复3 次即得到负载PTX的纳米凝胶。
[0066] 实施例11 ;制备负载有B-raf抑制剂的多糖水凝胶
[0067] 将 0.Ig/mLCHP/DMSO溶液 10y1 与Img/血B-raf抑制剂/DMSO溶液 10yL混合 均匀，剧烈揽拌，用注射累lOmin加入0. 8mL&0,在10°C下揽拌12h，溶液用40W探头式超 声波在0°C下超声lOmin，再在10°C下揽拌12h，然后再用40W探头式超声波在0°C下超声处 理所述前驱体lOmin，反复3次即得到负载B-raf抑制剂的纳米凝胶。
[0068] 实施例12 ;制备负载有B-raf抑制剂的多糖水凝胶
[0069]将Ig/mLCHP/DMSO溶液 10y1 与lOmg/mLPTX/DMSO溶液 10yL混合均匀，剧烈 揽拌，用注射累30min加入10血&0,在30°C下揽拌2化，溶液用60W探头式超声波在20°C 下超声15min，再在30°C下揽拌2化，然后再用60W探头式超声波在20°C下超声处理所述前 驱体15min，反复3次即得到负载B-raf抑制剂的纳米凝胶。
[0070] 如图1、2、3、5、7、8、9中的b图所示，本发明中的负载有药物或者纳米粒子的多糖 水凝胶（包括没有负载的多糖水凝胶），其粒径分布较为集中（直径集中在200nm至300nm 之间），尺寸可调控性好，非常适用于药物或者纳米粒子的准确装载和释放，成本低廉，可作 为智能凝胶用于药物缓释、酶固载、膜分离等领域。根据实际需要，多糖水凝胶也可同时负 载有药物和纳米粒子，制备和负载过程与上述单独负载药物或者纳米粒子的多糖水凝胶的 制备和负载过程基本相同。
[0071] 上述实施例中使用的葡聚糖分子量为50000(含292. 12mol当量葡萄糖单元），也 可采用其他分子量的葡聚糖，只需在胆固醇改性过程中改变相应的胆固醇的量即可，优选 使名义上每100个葡萄糖单元上有1. 6个胆固醇。本发明中的葡聚糖也可采用其他天然多 糖替换，只要该些天然多糖分子中富含活性基团（如一NH,，一OH)就能够成功的进行疏水 改性，例如壳聚糖等亲水性聚合物，确保能够负载药物/纳米粒子的微凝胶。
[0072] 当使用分子量不同于上述实施例的葡聚糖时（如选择分子量在3000~2000000 的其他葡聚糖），除透析步骤使用的透析袋截留分子量可能需要相应变动外，其他参数基 本保持不变；透析是为了除去没有反应完全的反应物、溶剂等，透析袋截留分子量只需大 于1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋，并小于生成的相应的胆固醇修饰的多糖衍生物即可；并 且，透析袋的截留分子量越大，透析时间则越短（有时为了进一步缩短透析反应时间，往往 选择满足上述截留分子量条件的最大的截留分子量）。W上述实施例为例，1，6-己二异氯 酸醋胆固醇单醋分子量为555,则透析袋的分子量需大于555,并小于生成的多糖衍生物分 子量（例如，截留分子量可W小于所用葡聚糖的分子量，该是由于葡聚糖会溶于水，透析结 束后会溶解在水中，其他反应试剂，如DMSO、化晚、己醇等也会溶于水，仅有生成物胆固醇修 饰的多糖衍生物不溶于水，并作为沉淀保留；另外，透析步骤完成后，也可将保留下来的胆 固醇修饰的多糖衍生物离屯、处理，W进一步提高纯度）。
[0073] 本领域的技术人员容易理解，W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W 限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含 在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备1，6-己二异氰酸酯胆固醇单酯： 将3g~5g胆固醇与20mL~28mL1，6-己二异氰酸醋混合，向其中分别加入80mL~ 150mL甲苯和2mL~6mL吡啶，并在70°C~90°C下反应40h~60h得到第一混合体系；接着， 于30°C~60°C减压蒸馏除去所述第一混合体系中的溶剂，然后向其中加入200mL~500mL 石油醚，在_20°C~_5°C下保存至少12h得到第二混合体系；接着，过滤该第二混合体系得 到滤渣，将该滤渣真空干燥后即得到1，6-己二异氰酸酯胆固醇单酯； (2) 制备疏水性多糖衍生物： 将0. 2g~0. 5g所述步骤（1)得到的1，6-己二异氰酸醋胆固醇单醋加入到80mL~ 150mL二甲亚砜中，并向其中加入2g~6g的天然多糖和6mL~IOmL吡啶，在70°C~90°C下 反应8h~12h得到第三混合体系；接着，向该第三混合体系中加入300mL~600mL乙醇，于 (TC~15°C下保存至少12h后得到沉淀；然后，收集沉淀，并将所述沉淀在水中透析3天~5 天，保留下的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物； (3) 制备无负载或者负载有药物或纳米粒子的多糖水凝胶： 向二甲亚砜溶剂中加入所述步骤（2)得到的胆固醇修饰的多糖衍生物，形成胆固醇修 饰的多糖衍生物质量百分浓度为〇.lg/mL~lg/mL的第一溶液；向二甲亚砜溶剂或者四氢 呋喃溶剂中加入待负载物，形成待负载物质量百分浓度为lmg/mL~10mg/mL的第二溶液， 所述待负载物为药物和纳米粒子中的一种或其混合物；接着，将10UL~100yL的所述第 一溶液与0yL~80yL的所述第二溶液混合得到前驱体，剧烈搅拌所述前驱体，并向其中 加入0? 8mL~IOmLH2O，在50°C~80°C或者10°C~30°C下搅拌12h~24h，然后用40W~ 60W探头式超声波在20 °C~50 °C或者0 °C~20 °C下超声处理所述前驱体IOmin~15min;接 着重复所述在50°C~80°C或者10°C~30°C下的搅拌处理、以及在20°C~50°C或者0°C~ 20°C下的超声处理至少2次，即得到无负载或者负载有药物或纳米粒子的多糖水凝胶。2. 如权利要求1所述多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤⑶中向前驱体中 加入0? 8~IOmLH2O是用注射泵10~30min加入0? 8~IOmLH20。3. 如权利要求1所述多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中的天然多糖 为葡聚糖，所述葡聚糖的分子量为3000~2000000。4. 如权利要求1 一 3任意一项所述多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（3) 中待负载的药物为紫杉醇或者为B-raf抑制剂。5. 如权利要求1 一 4任意一项所述多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（3) 中待负载的纳米粒子为量子点或者磁性纳米粒子。
【专利摘要】本发明公开了一种葡聚糖微凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)制备1,6-己二异氰酸酯胆固醇单酯；(2)制备疏水性多糖衍生物：将1,6-己二异氰酸酯胆固醇单酯加入到二甲亚砜中，并加入天然多糖和吡啶，在70～90℃下反应；加入乙醇在0～15℃下保存得到沉淀；收集沉淀，并将沉淀在水中透析，保留下的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物；(3)制备有负载或无负载的多糖水凝胶。本发明通过对葡聚糖微凝胶的制备工艺、以及与之配合的粒子负载过程等进行改进，能够有效解决微凝胶尺寸不可控的问题，制得的微凝胶能够对疏水性药物、功能性纳米粒子等进行有效包覆，实现药物的准确装载和释放，起到有效负载药物的作用。
【IPC分类】C08B37/02, A61K31/337, A61K47/36
【公开号】CN104906588
【申请号】CN201510326329
【发明人】朱锦涛, 李慕林, 沈雷, 王奎
【申请人】华中科技大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月15日
技术领域：
】[0001]本发明属于微凝胶制备方法领域，更具体地，设及一种能够负载药物或者无机纳米粒子的多糖微凝胶的制备方法。【
背景技术：
】[0002]高分子微凝胶是聚合物通过物理或化学交联形成的具有稳定=维网络结构的胶体粒子，其颗粒尺寸在纳米或微米级。具有生物相容性的高分子微凝胶在水中能充分溶胀并保持其稳定分散的胶体性质，从而具有很多优异的特性；多孔性、形态可塑性及尺寸可调性等。因此，水溶性高分子微凝胶在生物和制药等方面倍受重视。当被用作药物载体时，纳米凝胶表现出如下优势；1)在药物传输过程中，微凝胶能很好地稳定和保护所装载的小分子药物；2)当受到外界环境刺激时，微凝胶能调控自身尺寸，达到释放小分子药物的目的；3)微凝胶能可逆地调节自身物理化学性质，达到释放小分子的目的。[0003]在作为药物载体时，具有生物相容性且可降解的高分子微凝胶体系倍受关注。该类材料在体内可W被水解或者酶解，释放药物后很容易被人体代谢。例如，葡聚糖具有很好的生物相容性和可降解性，在药物载体构建方面展现出其独特优势。葡聚糖来源经济，无毒性，侧链基团易于功能化；与蛋白质相比，不易受环境影响而变性，且糖单元之间的碳氧键在抑值变化时可W发生水解。通过物理或化学方法制备的葡聚糖微凝胶具有温度或抑值敏感特性，可作为智能凝胶，在药物缓释、酶固载、膜分离等方面有很好的应用前景。[0004]由于葡聚糖凝胶广泛的应用前景，葡聚糖水凝胶的制备方法已有许多文献报道，但该些方法制备的水凝胶尺寸不可控，并不适用于作为药物载体。例如，Hennink课题组【1】于1998年在化arm.Res.上首次报道了基于葡聚糖和甲基丙己締酸哲已脂共聚物微凝胶的合成。随后，Zhang等人【2】于2004年，Shoichet等人【3】于2006年在Biomaterials分别报道了马来酸酢和硫酸酢修饰的葡聚糖微凝胶和合成方法（文献详细信息）。该些方法的前期单体制备过程复杂，成本较高，且合成的纳米粒子粒径分布较宽，难W用于药物的准确装载和释放。化rreira等人【4】于2005年在Biomaterials上报道了在结晶诱导作用下通过物理交联来制备葡聚糖微凝胶颗粒（文献详细信息），该方法制备的纳米粒子可调控性也较差。此外，该些水凝胶作为药物载体或者其他功能性无机纳米粒子的载体时，受水凝胶本身属性的制约和负载过程的限制，往往无法准确的装载W及释放药物粒子和其他功能性无机纳米粒子。[0005][1]StenekesR.,Franssen0.,vanRommelE.,etal.ThePreparationofDextranMicrospheresinanAll-AqueousSystem:EffectoftheFormulationParametersOnParticleCharacteristics.PharmaceuticalResearch1998,15(4):557~561.[0006][2]ZhangX.,WuD.,ChuC.SynthesisandCharacterizationofPartiallyBiodegradable,TemperatureandpHSensitiveDex-MA/PNIPAAmHydrogels.Biomaterials2004,25(19):4719~4730.[0007][3]加ptaD.,TatorC.H.,ShoichetM.S.Fast-GellingInjectableBlendofHyaluronanandMethylcelluloseforIntrathecal,LocalizedDeliverytotheIn_juredSpinalCord.Biomaterials2006,27(11):2370~2379.[000引[4]FerreiraL.,GilM.H.,C油ritaA.M.S.,etal.BiocatalyticSynthesisofHighlyOrderedDegradableDextran-BasedHydrogels.Biomaterials2005,26(23):4707~4716.【
发明内容】[0009]针对现有技术的W上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种多糖微凝胶的制备方法，其中通过对关键的多糖微凝胶的制备工艺、W及与之配合的粒子负载过程等进行改进，与现有技术相比能够有效解决微凝胶尺寸不可控的问题，该微凝胶能够对疏水性药物、功能性纳米粒子等进行有效包覆，实现药物的准确装载和释放，起到有效负载药物的作用，并且，该制备方法的产率高，能够有效降低多糖微凝胶的制备成本。[0010]为实现上述目的，按照本发明，提供了一种多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，包括W下步骤：[0011](1)制备1,6-己二异氯酸醋胆固醇单醋：[001引将3g~5g胆固醇与20血~28血1,6-己二异氯酸醋混合，向其中分别加入80血~150血甲苯和2血~6血化晚，并在70°C~90°C下反应40h~6化得到第一混合体系；接着，于30°C~60°C减压蒸馈除去所述第一混合体系中的溶剂，然后向其中加入200血~500血石油離，在-20°C~-5°C下保存至少1化得到第二混合体系；接着，过滤该第二混合体系得到滤渣，将该滤渣真空干燥后即得到1,6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；[0013](2)制备疏水性多糖衍生物：[0014]将0.2g~0.5g所述步骤（1)得到的1,6-己二异氯酸醋胆固醇单醋加入到80血~150血二甲亚讽中，并向其中加入2g~6g的天然多糖和6血~10血化晚，在70°C~90°C下反应她~1化得到第S混合体系；接着，向该第S混合体系中加入300血~600血己醇，于0°C~15°C下保存至少1化后得到沉淀；然后，收集沉淀，并将所述沉淀在水中透析3天~5天，保留下的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物；[0015](3)制备无负载或者负载有药物或纳米粒子的多糖水凝胶：[0016]向二甲亚讽溶剂中加入所述步骤（2)得到的胆固醇修饰的多糖衍生物，形成胆固醇修饰的多糖衍生物质量百分浓度为0.Ig/血~Ig/血的第一溶液；向二甲亚讽溶剂或者四氨快喃溶剂中加入待负载物，形成待负载物质量百分浓度为Img/mL~lOmg/mL的第二溶液，所述待负载物为药物和纳米粒子中的一种或其混合物；接着，将10yL~100yL的所述第一溶液与0yL~80yL的所述第二溶液混合得到前驱体，剧烈揽拌所述前驱体，并向其中加入0.8血~10血&0,在50°C~80°C或者10°C~30°C下揽拌12h~2化，然后用40W~60W探头式超声波在20°C~50°C或者0°C~20°C下超声处理所述前驱体lOmin~15min;接着重复所述在50°C~80°C或者10°C~30°C下的揽拌处理、W及在20°C~50°C或者0°C~20°C下的超声处理至少2次，即得到无负载或者负载有药物或纳米粒子的多糖水凝胶。[0017]作为本发明的进一步优选，所述步骤（3)中向前驱体中加入0.8~lOmL&0是用注射累10~30min加入0.8~lOmL&0。[001引作为本发明的进一步优选，所述步骤（2)中的天然多糖为葡聚糖，所述葡聚糖的分子量为3000~2000000。[0019]作为本发明的进一步优选，所述步当前第1页1 2 3 4 骤（3)中待负载的药物为紫杉醇或者为B-raf抑制剂。
[0020] 作为本发明的进一步优选，所述步骤（3)中待负载的纳米粒子为量子点或者磁性 纳米粒子。
[0021] 通过本发明所构思的W上技术方案，与现有技术相比，具有W下有益效果：
[0022] 1.本发明利用胆固醇对天然多糖进行改性，通过1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋 将胆固醇引入到天然多糖中，制备方法简单可行、产率高。在利用胆固醇对天然多糖（如葡 聚糖等）进行疏水改性的步骤中，通过对制备过程中的各种参数（包括原料、原料配比及浓 度、反应温度及时间等）进行调整，在确保生成胆固醇修饰的多糖衍生物（即CHP)的基础 上，有效保证了胆固醇修饰的多糖衍生物的产率，采用的原料经济，合成方法简单易行，生 成的胆固醇修饰的多糖衍生物生物相容性好，可直接应用于药物负载。
[0023] 2.本发明通过采用特定的方式将药物或小分子（即纳米粒子）负载到多糖微 凝胶上，使多糖微凝胶的负载效果大大提高，并且适用于高温不稳定、易变性药物的负载， 非常适于实际应用。本发明通过采用探头式超声波，功率高，超声效果好，能保证凝胶的快 速成形；并且配合使用特定的反应参数（包括浓度、反应时间等），使得在室温范围内（即 10°C~30°C的温度范围内）能够有效的将药物或者纳米粒子包覆至疏水性多糖衍生物中， 保持了药物或者纳米粒子本身的活性，方法简单易行。
[0024] 本发明中的药物/纳米粒子的负载步骤紧密结合葡聚糖的疏水性改性步骤，负载 方法中的各种参数（包括溶液浓度、反应温度及时间、凝胶产生手段等）均与胆固醇修饰的 多糖衍生物的制备方法相对应，有效的保证了疏水性多糖衍生物的药物负载效果。在负载 步骤中，优选采用注射累在一定时间内注入一定量的馬0,该样缓慢的加入&0能使微凝胶 缓慢的形成，从而确保药物能更好的负载进微凝胶。
[0025] 通过采用本发明的负载方法，在微凝胶上既能成功负载各种药物，也能根据需要 负载各种功能性纳米粒子。通过采用与微凝胶配合的方式，对于高温不稳定的药物，在不影 响药物活性的前提下，能成功进行负载当负载药物时，由于很多药物是疏水性的，用常规方 法不能进行给药，本发明通过对天然多糖进行胆固醇修饰，W胆固醇作为疏水性基团，使生 成的多糖衍生物具有疏水性；提供的多糖微凝胶可W包覆疏水性药物，从而实现疏水性药 物的生物给药。当负载纳米粒子（如磁性纳米粒子或者量子点）时，磁性纳米粒子的包覆 使得在磁场调控下能进行药物的祀向输送和远程调控，量子点的巧光效应则能监测纳米粒 子在体内的分布。
[0026] 综上，本方法的前期单体制备过程简单，可有效的降低成本；并且，由于合成的纳 米粒子粒径分布较为集中，可通过参数（如浓度、反应温度等）有效控制颗粒的粒径，可调 控性好；当用于负载药物或者其他功能性纳米粒子时，微凝胶能够可逆的调节自身物理化 学性质，做到准确装载W及释放。
【附图说明】
[0027] 图1中，图la是纳米凝胶的透射电子显微镜图，图化是纳米凝胶的动态激光光散 射值L巧粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL中快速 加入1血H20,60°C下揽拌12h;上述溶液用探头式超声装置在40W和常温下超声lOmin，反 复3次即得到纳米凝胶；
[002引图2中，图2a是纳米凝胶的透射电子显微镜图，图化是动态激光光散射值LS)粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mL CHP/DMSO溶液10 y L分别与2mg/mL PTX/DMSO溶液80 y L混合均匀，剧烈揽拌，快速加入ImL &0,60°C揽拌12h，溶液用探头式 超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶；
[0029] 图3中，图3a是纳米凝胶的透射电子显微镜图，图3b是动态激光光散射值LS) 粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL分别与2mg/mL PTX/DMSO溶液80yL混合均匀，剧烈揽拌，利用注射累lOmin加入1血&0,常温揽拌12h， 溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶；
[0030] 图4是PTX/DMSO紫外吸收标准曲线及负载PTX的纳米凝胶的紫外吸收图；
[0031] 图5中，图5a是纳米凝胶的透射电子显微镜图，图化是动态激光光散射值城粒 径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL与2mg/mlB-raf 抑制剂的DMSO溶液80yL混合均匀，剧烈揽拌，利用注射累lOmin加入ImL&0,常温揽拌 12h，溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶；
[0032] 图6是负载B-raf抑制剂的纳米凝胶的紫外吸收图；
[0033] 图7中，图7a是纳米凝胶的透射电镜图，图化是巧光图，图7c是动态激光光散 射值L巧粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向100mg/mLCHP/DMSO溶液lOuL与 化-Zn-Ln-S孤s/THF溶液混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式 超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶
[0034] 图8中，图8a是纳米凝胶的透射电镜图，图8b是巧光图，图8c是动态激光光散射 值L巧粒径分布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL与CdSe/ ZnS孤s/THF溶液混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在 40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶；
[0035] 图9中，图9a是纳米凝胶的磁响应示例图，图9b是动态激光光散射值L巧粒径分 布图；该纳米凝胶的制备过程是；向lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL与4皿化3〇御米粒子 /THF溶液混合均匀，剧烈揽拌，加入ImL&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在40W和 常温下超声lOmin，反复3次即得到纳米凝胶。
【具体实施方式】
[0036] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所设及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可W相互组合。
[0037] 本发明中的葡聚糖衍生物CHP采用下面的制备方法制备，其中，使用的葡聚糖分 子量为50000 ;胆固醇为分析纯（来自国药集团化学试剂有限公司）；1，6-己二异氯酸醋为 TCI公司生产；所用试剂二甲亚讽值MSO)、甲苯、化晚均经过干燥除水；实施例使用的其他 试剂（如石油離、己醇等）除特别说明外，均为化学纯，购自于国药集团化学试剂有限公司。 本发明提供的葡聚糖衍生物CHP的制备方法具体包括W下步骤：
[003引 （1)合成1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；取3. 9g胆固醇与24mL1，6-己二异氯 酸醋，向其中依次加入lOOmL甲苯和2mL化晚（其中甲苯和化晚为溶剂），于80°C反应4她 得到第一混合体系，该第一混合体系只有液相。反应结束后，减压蒸馈除去溶剂（即甲苯和 化晚），加入300mL石油離。在-10°C保存过夜（一般是12小时W上，确保白色产物析出） 得到第二混合体系，该第二混合体系为固液两相。将该第二混合体系过滤得到滤渣，真空干 燥滤渣得到白色粉末状1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋。
[0039] (2)合成胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP;取1,6-己二异氯酸醋胆固醇单醋 0. 344g与葡聚糖4.OOg，向其中依次加入100血DMS0和8血化晚，于80°C反应她 。反应结 束后，将500mL己醇加入到反应体系中，于4°C保存过夜（一般是12小时W上，确保白色产 物析出，收集沉淀，水中透析（透析是为了除去没有反应完全的反应物、溶剂等，本发明中 的透析使用透析袋的截留分子量为14000,透析3天，每6小时换一次水），干燥得白色粉末 状胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP。
[0040] 紫杉醇（PTX)、Vemurafenib(PLX4032,RG7204)B-raf抑制剂、量子点（记为孤S) 或者磁性纳米粒子均可负载于胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP上，形成葡聚糖衍生物纳米 凝胶，本发明提供的葡聚糖衍生物纳米凝胶的制备方法有W下两种方法：
[004U (1)对于一般药物、功能性纳米粒子，将CHP/DMS0溶液与药物或者纳米粒子的 DMS0(即二甲亚讽）或者THF(即四氨快喃）溶液混合均匀，剧烈揽拌，加入1血H20,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，接着在60°C揽拌12h，并将溶液 用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，如此反复至少3次得到的纳米凝胶。
[0042] (2)对于高温不稳定，易变性的药物，将CHP/DMS0溶液与药物或者纳米粒子的 DMS0或者THF溶液混合均匀，剧烈揽拌，用注射累lOmin加入1血&0,常温揽拌12h，并将 溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，接着再常温揽拌12h，并将溶液用探头式 超声波在40W和常温下超声lOmin，如此反复至少3次得到的纳米凝胶。
[0043] 本发明提供的纳米凝胶直径约在200nm至300nm之间，为葡聚糖衍生物纳米水凝 胶。该葡聚糖衍生物纳米水凝胶的应用实施例如下：
[0044] 实施例 1 ;将lOOmg/血CHP/DMS0 溶液 10y1 分别与 2mg/血PTX/DMS0 溶液 0yL、 10yL、20yL、40yL、80yL混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式 超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到没有负载PTX、负载不同浓度PTX的纳 米凝胶。图2a、2b即对应其中一种生长参数。
[0045] 实施例 2 ;将lOOmg/血CHP/DMS0 溶液 10yL分别与 2mg/mLPTX/DMS0 溶液 0yL、 10yL、20yL、40yL、80yL混合均匀，剧烈揽拌，利用注射累lOmin加入1血&0,常温揽拌 12h，溶液用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到没有负载PTX、负载 不同浓度PTX的纳米凝胶。图3a、3b即对应其中一种生长参数。
[0046] 实施例1/2中的微凝胶对紫杉醇的包覆率可W通过紫外标准曲线法来测定，如图 4所示。下表1是实施例1中微凝胶对紫杉醇的载药率示例。
[0047] 表1微凝胶负载不同体积紫杉醇溶液时的载药率
[0048]
[0049]实施例 3 ;将lOOmg/血CHP/DMSO溶液 10yL与 2mg/mLB-raf抑制剂的DMSO溶 液20yL、80化混合均匀，剧烈揽拌，利用注射累lOmin加入1血馬0,常温揽拌12h，溶液 用探头式超声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到没有负载B-raf抑制剂、负载 不同浓度B-raf抑制剂的纳米凝胶。图5a、5b即对应其中一种生长参数。
[0050] 实施例3中的微凝胶对B-raf抑制剂有较好的负载，如图6所示，其载药率如下表 2所示。
[0化1] 表2微凝胶负载不同体积B-raf抑制剂溶液时的载药率
[0化2]
[0053] 实施例 4 ;将lOOmg/mLCHP/DMSO溶液 10yL与lOmg/mLCu-Zn-Ln-S孤s/THF溶 液20yL混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在40W和 常温下超声lOmin，反复3次即得到负载化-Zn-Ln-S孤S的纳米凝胶，见图7a、7b、7c。
[0054] 实施例 5 ;将lOOmg/mLCHP/DMSO溶液 10yL与lOmg/mLCdSe/aiSQDs/THF溶液 20yL混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超声波在40W和常温 下超声lOmin，反复3次即得到负载CdSe/ZnS孤S的纳米凝胶，见图8a、8b、8c。
[00巧]实施例6 ;将lOOmg/mLCHP/DMSO溶液10yL与lOmg/血的直径4nm化3〇4磁性纳 米粒子/THF溶液20化混合均匀，剧烈揽拌，加入1血&0,60°C揽拌12h，溶液用探头式超 声波在40W和常温下超声lOmin，反复3次即得到负载化3〇4磁性纳米粒子的纳米凝胶，见 图9a、9b。如图9a所示，该纳米凝胶经磁响应反应后，集中在了试样瓶壁的局部部分（如图 9a试样下部瓶壁的灰色区域），磁响应性质良好。
[0化6] 实施例7 ;葡聚糖衍生物CHP的制备方法
[0057] 合成1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；将3g胆固醇与20血1，6 -己二异氯酸醋混 合，向其中分别加入80mL甲苯，2mL化晚，并在90°C反应4化得到第一体系浪着，30°C减压 蒸馈除去所述第一体系中的溶剂甲苯和化晚，然后向其中加入200mL石油離，在-20°C下保 存至少1化得到第二混合体系；接着，过滤该第二混合体系得到滤渣，将该滤渣真空干燥 后即得到1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；
[0化引合成胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP;将0. 2g所述步骤（1)得到的1，6-己二异 氯酸醋胆固醇单醋加入到80血DMS0中，并向其中加入2.OOg葡聚糖（分子量为3000)，和 6mL化晚，在90°C下反应她得到第S混合体系；接着，向该第S混合体系中加入300mL己 醇，于0°C下保存至少1化后得到沉淀；然后，收集沉淀，并将所述沉淀在水中透析，保留下 的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物。
[0059] 实施例8 ;葡聚糖衍生物CHP的制备方法
[0060] 合成1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；将5g胆固醇与28血1，6 -己二异氯酸醋混 合，向其中分别加入150血甲苯，6血化晚，并在70°C反应6化得到第一体系浪着，60°C减 压蒸馈除去所述第一体系中的溶剂甲苯和化晚，然后向其中加入500mL石油離，在-5°C下 保存2化得到第二混合体系；接着，过滤该第二混合体系得到滤渣，将该滤渣真空干燥后即 得到1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋；
[0061] 合成胆固醇修饰的葡聚糖衍生物CHP;将0. 5g所述步骤（1)得到的1，6-己二异 氯酸醋胆固醇单醋加入到150血DMS0中，并向其中加入6g葡聚糖（分子量为2000000)，和 lOmL化晚，在70°C下反应1化得到第S混合体系；接着，向该第S混合体系中加入600mL己 醇，于15°C下保存至少1化后得到沉淀；然后，收集沉淀，并将所述沉淀在水中透析，保留下 的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物。
[006引实施例9;制备负载有紫杉醇（PT幻的多糖水凝胶
[0063]将 0.Ig/mLCHP/DMSO溶液 10y1 与Img/血PTX/DMSO溶液 10yL混合均匀，剧烈 揽拌上述溶液，并向其中加入〇.8mL&0,在50°C下揽拌12h，溶液用40W探头式超声波在 20°C下超声lOmin，再在50°C下揽拌12h，然后再用40探头式超声波在20°C下超声处理所 述前驱体10min,反复3次即得到负载PTX的纳米凝胶。
[0064] 实施例10 ;制备负载有紫杉醇（PT幻的多糖水凝胶
[00化]将Ig/mLCHP/DMSO溶液 100y1 与lOmg/mLPTX/DMSO溶液 80yL混合均匀，剧烈 揽拌，加入lOm L&0,在80°C揽拌2化，溶液用60W探头式超声波在60°C下超声15min，再在 80°C下揽拌2化，然后再用60W探头式超声波在60°C下超声处理所述前驱体15min，反复3 次即得到负载PTX的纳米凝胶。
[0066] 实施例11 ;制备负载有B-raf抑制剂的多糖水凝胶
[0067] 将 0.Ig/mLCHP/DMSO溶液 10y1 与Img/血B-raf抑制剂/DMSO溶液 10yL混合 均匀，剧烈揽拌，用注射累lOmin加入0. 8mL&0,在10°C下揽拌12h，溶液用40W探头式超 声波在0°C下超声lOmin，再在10°C下揽拌12h，然后再用40W探头式超声波在0°C下超声处 理所述前驱体lOmin，反复3次即得到负载B-raf抑制剂的纳米凝胶。
[0068] 实施例12 ;制备负载有B-raf抑制剂的多糖水凝胶
[0069]将Ig/mLCHP/DMSO溶液 10y1 与lOmg/mLPTX/DMSO溶液 10yL混合均匀，剧烈 揽拌，用注射累30min加入10血&0,在30°C下揽拌2化，溶液用60W探头式超声波在20°C 下超声15min，再在30°C下揽拌2化，然后再用60W探头式超声波在20°C下超声处理所述前 驱体15min，反复3次即得到负载B-raf抑制剂的纳米凝胶。
[0070] 如图1、2、3、5、7、8、9中的b图所示，本发明中的负载有药物或者纳米粒子的多糖 水凝胶（包括没有负载的多糖水凝胶），其粒径分布较为集中（直径集中在200nm至300nm 之间），尺寸可调控性好，非常适用于药物或者纳米粒子的准确装载和释放，成本低廉，可作 为智能凝胶用于药物缓释、酶固载、膜分离等领域。根据实际需要，多糖水凝胶也可同时负 载有药物和纳米粒子，制备和负载过程与上述单独负载药物或者纳米粒子的多糖水凝胶的 制备和负载过程基本相同。
[0071] 上述实施例中使用的葡聚糖分子量为50000(含292. 12mol当量葡萄糖单元），也 可采用其他分子量的葡聚糖，只需在胆固醇改性过程中改变相应的胆固醇的量即可，优选 使名义上每100个葡萄糖单元上有1. 6个胆固醇。本发明中的葡聚糖也可采用其他天然多 糖替换，只要该些天然多糖分子中富含活性基团（如一NH,，一OH)就能够成功的进行疏水 改性，例如壳聚糖等亲水性聚合物，确保能够负载药物/纳米粒子的微凝胶。
[0072] 当使用分子量不同于上述实施例的葡聚糖时（如选择分子量在3000~2000000 的其他葡聚糖），除透析步骤使用的透析袋截留分子量可能需要相应变动外，其他参数基 本保持不变；透析是为了除去没有反应完全的反应物、溶剂等，透析袋截留分子量只需大 于1，6-己二异氯酸醋胆固醇单醋，并小于生成的相应的胆固醇修饰的多糖衍生物即可；并 且，透析袋的截留分子量越大，透析时间则越短（有时为了进一步缩短透析反应时间，往往 选择满足上述截留分子量条件的最大的截留分子量）。W上述实施例为例，1，6-己二异氯 酸醋胆固醇单醋分子量为555,则透析袋的分子量需大于555,并小于生成的多糖衍生物分 子量（例如，截留分子量可W小于所用葡聚糖的分子量，该是由于葡聚糖会溶于水，透析结 束后会溶解在水中，其他反应试剂，如DMSO、化晚、己醇等也会溶于水，仅有生成物胆固醇修 饰的多糖衍生物不溶于水，并作为沉淀保留；另外，透析步骤完成后，也可将保留下来的胆 固醇修饰的多糖衍生物离屯、处理，W进一步提高纯度）。
[0073] 本领域的技术人员容易理解，W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W 限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含 在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备1，6-己二异氰酸酯胆固醇单酯： 将3g~5g胆固醇与20mL~28mL1，6-己二异氰酸醋混合，向其中分别加入80mL~ 150mL甲苯和2mL~6mL吡啶，并在70°C~90°C下反应40h~60h得到第一混合体系；接着， 于30°C~60°C减压蒸馏除去所述第一混合体系中的溶剂，然后向其中加入200mL~500mL 石油醚，在_20°C~_5°C下保存至少12h得到第二混合体系；接着，过滤该第二混合体系得 到滤渣，将该滤渣真空干燥后即得到1，6-己二异氰酸酯胆固醇单酯； (2) 制备疏水性多糖衍生物： 将0. 2g~0. 5g所述步骤（1)得到的1，6-己二异氰酸醋胆固醇单醋加入到80mL~ 150mL二甲亚砜中，并向其中加入2g~6g的天然多糖和6mL~IOmL吡啶，在70°C~90°C下 反应8h~12h得到第三混合体系；接着，向该第三混合体系中加入300mL~600mL乙醇，于 (TC~15°C下保存至少12h后得到沉淀；然后，收集沉淀，并将所述沉淀在水中透析3天~5 天，保留下的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物； (3) 制备无负载或者负载有药物或纳米粒子的多糖水凝胶： 向二甲亚砜溶剂中加入所述步骤（2)得到的胆固醇修饰的多糖衍生物，形成胆固醇修 饰的多糖衍生物质量百分浓度为〇.lg/mL~lg/mL的第一溶液；向二甲亚砜溶剂或者四氢 呋喃溶剂中加入待负载物，形成待负载物质量百分浓度为lmg/mL~10mg/mL的第二溶液， 所述待负载物为药物和纳米粒子中的一种或其混合物；接着，将10UL~100yL的所述第 一溶液与0yL~80yL的所述第二溶液混合得到前驱体，剧烈搅拌所述前驱体，并向其中 加入0? 8mL~IOmLH2O，在50°C~80°C或者10°C~30°C下搅拌12h~24h，然后用40W~ 60W探头式超声波在20 °C~50 °C或者0 °C~20 °C下超声处理所述前驱体IOmin~15min;接 着重复所述在50°C~80°C或者10°C~30°C下的搅拌处理、以及在20°C~50°C或者0°C~ 20°C下的超声处理至少2次，即得到无负载或者负载有药物或纳米粒子的多糖水凝胶。2. 如权利要求1所述多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤⑶中向前驱体中 加入0? 8~IOmLH2O是用注射泵10~30min加入0? 8~IOmLH20。3. 如权利要求1所述多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中的天然多糖 为葡聚糖，所述葡聚糖的分子量为3000~2000000。4. 如权利要求1 一 3任意一项所述多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（3) 中待负载的药物为紫杉醇或者为B-raf抑制剂。5. 如权利要求1 一 4任意一项所述多糖微凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（3) 中待负载的纳米粒子为量子点或者磁性纳米粒子。
【专利摘要】本发明公开了一种葡聚糖微凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)制备1,6-己二异氰酸酯胆固醇单酯；(2)制备疏水性多糖衍生物：将1,6-己二异氰酸酯胆固醇单酯加入到二甲亚砜中，并加入天然多糖和吡啶，在70～90℃下反应；加入乙醇在0～15℃下保存得到沉淀；收集沉淀，并将沉淀在水中透析，保留下的沉淀干燥后即得到胆固醇修饰的多糖衍生物；(3)制备有负载或无负载的多糖水凝胶。本发明通过对葡聚糖微凝胶的制备工艺、以及与之配合的粒子负载过程等进行改进，能够有效解决微凝胶尺寸不可控的问题，制得的微凝胶能够对疏水性药物、功能性纳米粒子等进行有效包覆，实现药物的准确装载和释放，起到有效负载药物的作用。
【IPC分类】C08B37/02, A61K31/337, A61K47/36
【公开号】CN104906588
【申请号】CN201510326329
【发明人】朱锦涛, 李慕林, 沈雷, 王奎
【申请人】华中科技大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月15日
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