一种pH响应性蛋白质-高分子结合体及其制备和组装方法
一种pH响应性蛋白质-高分子结合体及其制备和组装方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种刺激响应性蛋白质-高分子结合体及其制备和组装方法，属于药 物载体材料制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 通过精屯、设计的纳米药物载体可将药物包埋或溶解在纳米粒内部，也可吸附或偶 合在其表面。利用祀向制剂对纳米载体进行修饰，将祀向配体连接到纳米粒子表面，通过配 体对细胞膜上受体的特异性识别，修饰后的载药纳米粒子可W祀向到癌细胞，进而进入细 胞释放药物实现药物的祀向输送，同时具有缓释、保护药物、提高疗效、降低毒副作用等优 点。
[0003] 纳米粒子进入细胞后，只有将携带的治疗剂释放出来才能让治疗剂发挥作用，实 现对肿瘤细胞的杀伤。理想的纳米载体应可实现对治疗剂的可控释放。随着材料科学的发 展，越来越多的刺激响应性材料被用于纳米载体的制备。该些材料包括；抑敏感材料、温度 敏感材料、光敏感材料W及氧化还原敏感材料等。利用细胞内本身的特性如内涵体的pH值 偏酸（抑在5. 0-6. 5之间），使进入细胞内的纳米粒子在该些刺激下发生崩解，从而释放出 治疗剂，达到可控释放。如聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)具有优越的抑响应性， 在人体正常生理环境抑值7. 2~7. 6时因其等电点特性作为疏水端，在人体某些病变部位 pH值下降或进入细胞内涵体抑值较低时发生强烈质子化，改变其疏水性能，控释负载的治 疗性药物，是一种很好的医用高分子材料，广泛的用于抑响应性的药物载体及缓释剂。
[0004] 到目前为止，在纳米载体的设计方面已取得了显著的进展，有效地提高了治疗剂 的治疗效果，但大部分尚处于实验阶段，很少转化为临床和投入市场，仍需要科学家们进一 步努力。同时，由于制备技术等方面的原因，纳米载体的大小与形貌的可控性方面也是限制 其发展的一个重要原因。除此之外，用于制备纳米载体的材料的生物安全性和生物相容性 也是纳米载体设计中需要考虑的的一个重要方面。
[0005] 为了提高材料的生物安全性和生物相容性，将蛋白质作为亲水端，刺激响应性疏 水高分子作为疏水端构成巨型双亲性蛋白质-高分子结合体，集蛋白质和连接的高分子的 性能和优势于一体，同时还显示出一些新的性能。蛋白质具有安全无毒、无免疫原性、可生 物降解、生物相容性好等优点，蛋白质的存在赋予结合体优异的生物相容性和生物功能，而 高分子链的引入可W增加蛋白质的稳定性，同时可W赋予结合体双亲性能和高分子链本身 的性能，如引入温度敏感的高分子链可赋予结合体温度敏感性。由于蛋白质对药物具有很 高结合性，蛋白质高分子纳米粒可W高效率的负载药物。利用蛋白质高分子纳米粒表面的 功能基团如胺基和駿基可W用来偶联药物和祀向配体。目前应用最广泛的蛋白质有牛血清 白蛋白炬SA)和人血清白蛋白化SA)等。
[0006] 研究发现，该种的双亲性蛋白质-刺激响应性高分子结合体在水溶液中表现出与 传统的双亲性小分子和嵌段共聚物相似的组装性能，可W自组装形成多种形貌的组装体， 制备好的可生物相容性的纳米载体可有效的将治疗剂运输到癌症细胞内，减少抗癌药物对 正常器官和组织毒副作用，并实现治疗剂的可控释放，提高药物局部浓度，有效增强治疗剂 的治疗效果，实现对癌症的祀向治疗。
【发明内容】
[0007] 本发明中，首先设计合成一种牛血清白蛋白炬SA)大分子原子转移自由基聚合 (ATR巧引发剂，引发甲基丙締酸二异丙基氨基己醋值PA)单体的ATRP聚合，制备一种抑响 应性的牛血清白蛋白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)双亲性结合体。BSA 作为亲水部分的存在赋予结合体优异的生物相容性，可控活性聚合引入的疏水端PDPA增 加BSA的稳定性，使得该蛋白质一高分子结合体具有双亲性和抑响应性，可进行自组装并 pH介导装载治疗药物，且在肿瘤微环境或细胞内涵体内pH值较低的环境下PDPA发生强烈 质子化，控释负载的药物，有效提高治疗效果，是一种的药物载体材料。本制备方法可W实 现PDPA的定点结合W及数目可控。
[000引本发明制备了一种抑响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，选用牛血清白蛋白 炬SA)和聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)，利用BSA上的琉基（-SH)通过迈克尔加 成反应结合马来酷亚胺化的小分子引发剂，后引发PDPA聚合，形成抑响应性BSA-PDPA结 合体。并且该结合体可W组装形成BSA-PDPA球形纳米载体。
[0009] 本发明的技术方案如下；
[0010] 一种抑响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，其特征是BSA-PDPA结构式如下；
[0011] CHj r ?2 11 因图A"f-C-- s i g c^=o 貧 CHz CHj n_ HC。。- W j /、州3 HjC HjC
[0012] 其中聚合度n大于等于5,即高分子链分子量大于1000 ;
[0013] 最佳聚合度范围为10~200,即高分子链分子量为2000~40000。
[0014] 本发明的抑响应性蛋白质-高分子双亲性结合体组装形成BSA-PDPA球形纳米载 体。
[001引本发明的抑响应性蛋白质-高分子结合体的制备方法，步骤如下：
[0016] 1)制备牛血清白蛋白大分子ATRP引发剂；
[0017] 将牛血清白蛋白炬SA)溶于PBS缓冲液形成BSA溶液，2-漠代-2-甲基丙酸 2-(2, 5-二氧杂-3-二氨化化咯-1-基）己醋（产品D)溶于N，N-二甲基甲酯胺中形成产 品D溶液，产品D溶液滴加至BSA溶液中，在氣气保护下室温反应24~36h，纯水透析24~ 4她后冻干得到蛋白质ATRP引发剂；
[0018] 2)ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)聚 合；
[0019] ①在Schlenk管中，将ATRP引发剂、单体DPA依次溶于溶剂中，引发剂和单体的摩 尔比例为1:10~200 ;
[0020] ②通过抽真空-充氮气各一次作为一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后加入催化剂 化(I)Br，再进行抽真空-充氮气一个循环；
[002U⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至50~70°C反应12~16h;后处理 得到白色固体产品即BSA-PDPA结合体。
[002引所述的牛血清白蛋白；2-漠代-2-甲基丙酸2-化5-二氧杂-3-二氨化化 咯-1-基）己醋的质量比优选为12~15:1。
[002引所述反应体系的溶剂为N，N-二甲基甲酯胺值M巧与异丙醇一种或两种的组合，单 体浓度优选为115~240g/L。
[0024] 所述的BSA溶于PBS缓冲液浓度优选为22~25g/L。
[0025] 所述的产品D溶于N，N-二甲基甲酯胺浓度优选为6. 5~9g/L。
[0026] 所述的引发剂与PM邸TA、化(I)化的摩尔比例优选为1:2:1。
[0027] 所述的后处理具体步骤为反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终 止聚合反应；用四氨快喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进 行洗脱，得无色溶液；将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到 透析袋中，先在四氨快喃中进行透析24~48小时，之后转移至水中透析液透析3~5天。 最后通过冻干得到白色固体产品。
[0028] 本发明的BSA-PDPA结合体球形纳米载体组装方法，取pH响应性BSA-PDPA结合体 溶解在去离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入机溶剂为，超声结束， 将得到的乳液在25~30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10~15分钟，除去有机相，得到抑 响应性BSA-PDPA结合体的组装体溶液。
[0029] 所述的BSA-PDPA溶于去离子水浓度优选为为1~5g/L。
[0030] 所述的有机溶剂：离子水体积比优选为为1:1~20。
[0031] 所述的有机溶剂机溶剂为二氯甲烧或=氯甲烧
[0032] 组成的抑响应性BSA-PDPA结合体的自组装纳米载体，制剂粒径在80至1] 140纳米 之间，在抑降低时，Zeta电位值由负电转 为正电。粒径均匀，分散性好。
[0033] 有益效果
[0034] 本发明设及的可组装的抑响应性蛋白质-高分子结合体有益效果包括；制备的 牛血清白蛋白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)结合体生物相容性好，毒性 低。牛血清白蛋白炬SA)具有很好的亲水性，聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)具有 很好的疏水性，使得BSA-PDPA结合体具有双亲性和抑响应性，且可进行自组装和负载药 物。本发明中制备BSA-PDPA结合体的制备方法可实现PDPA的定点键接和数目可控。组装 的BSA-PDPA结合体有效粒径在80~140nm，粒径更均匀；在抑值由7下降5时Zeta电位 由负电变为正电，具有良好抑响应性；稳定性好，可在水溶液中保存至少两个月；制备产率 高，适合大批量生产。
[0035] 本发明的目的是设计并制备一种可组装的抑响应性蛋白质-高分子结合体。与 现有技术相比，本制备方法可W实现疏水高分子PDPA的定点结合W及数目可控，所制得的 自组装药物基因载体保持了均匀较小粒径同时，生物相容性更好，且具有抑响应性，可在 肿瘤微环境或细胞内涵体内抑值较低的环境下PDPA发生强烈质子化，控释负载的药物，有 效提高治疗效果，更高效发挥载体作用。
【附图说明】
[0036] 图1 ;抑响应性蛋白质-高分子即BSA-PDPA自组装体粒度分析图。
[0037] 图2 ;抑响应性蛋白质-高分子即BSA-PDPA自组装体透射照片。
[003引图3 ;抑响应性蛋白质-高分子即BSA-PDPA结合体凝胶电泳谱图。
【具体实施方式】
[0039] W下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0040] 1)制备牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂；
[0041] 取质量比12~15:1的BSA;产品D(2-漠代-2-甲基丙酸2-化5-二氧杂-3-二 氨化化咯-1-基）己醋），将BSA溶于PBS缓冲液（pH= 6. 8, 0. 1M)(浓度为22~25g/L) 形成BSA溶液，产品D溶于N，N-二甲基甲酯胺（浓度为6. 5~9g/L)中形成产品D溶液， 产品D溶液滴加至BSA溶液中，氣气保护下室温反应24~36h，反应结束后，纯水透析24~ 4她后冻干得到蛋白质ATRP引发剂。
[0042] 。由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸 二异丙基氨基己醋（PDPA)聚合；
[0043] ①在Schlenk管中，将ATRP引发剂、单体DPA依次溶于溶剂中，引发剂和单体的摩 尔比例为1:10~200 ;
[0044] ②通过抽真空-充氮气各一次作为一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PM邸TA)，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后加入 催化剂化(I)Br，再进行抽真空-充氮气一个循环。引发剂与PMEDTAXu(I)化的摩尔比例 为 1:2:1。
[0045] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至50~70°C反应12~16h。后处 理得到白色固体产品即BSA-PDPA结合体。
[0046] 步骤2)--①中所述反应体系的溶剂为N，N-二甲基甲酯胺值M巧与异丙醇一种或 两种的组合，单体浓度为115~240g/L。
[0047] 步骤2)--⑨所述的后处理具体步骤为反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温， 通入空气，终止聚合反应；用四氨快喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快 喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液；将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然 后体系转移到透析袋中，先在四氨快喃中进行透析24~48小时，之后转移至水中透析液透 析3~5天。最后通过冻干得到白色固体产品。
[0048] 参貝gDesignandsynthesisofN-maleimido-functionalizedhydrophilic polymersviacopper-mediatedlivingradicalpolymerization:asuitable alternativeto阳G}dationchemist;ry[i]文献中制备方法合成出2-漠代-2-甲基丙酸 2-(2, 5-二氧杂-3-二氨化化咯-1-基）己醋（产品D)。
[0049] 抑响应性蛋白质-高分子纳米载体的组装方法，技术方案如下：
[0050] 抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体 通过乳化-溶剂蒸发法制备。
[CK)5U 取抑响应性BSA-PDPA结合体溶解在去离子水（浓度为1~5g/L)中，将溶液置 于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入二氯甲烧或S氯甲烧（有机 溶剂；离子水体积比为1:1~20)，超声时间为8~10分钟，超声功率为150W。超声结束， 将得到的乳液在25~30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10~15分钟，除去有机相，转速为 80~90转/分钟。待有机溶剂完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体溶液。 [0052] 实施例1 ;
[0化引牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂的合成。
[0化4] ①取30g马来酸酢分散在150ml甲苯中，油浴揽拌加热至80°C，33. 3ml快喃用注 射器缓慢注入，冷凝回流反应化。反应结束，降至室温，静置比，减压过滤，用石油離洗3次， 得白色产品A。
[0化5] ②取产品AlOg，分散在100ml甲醇中，冰浴揽拌冷却至0 °C，缓慢滴加己醇胺 3. 6ml至上述溶液，在0°C下揽拌20min，然后室温下揽拌35min，揽拌油浴80°C下回流2化。 反应结束后，冷却重结晶，减压过滤，得白色晶体B。
[0056] ⑨取产品B3g，^己胺2. 16ml，加到0°C170mlTHF中，在55mlTHF中溶2-漠异 了酷漠1. 89ml，并缓慢加入上述溶液，0°C揽拌化，随后室温过夜。反应结束后，减压过滤除 去锭盐，加入大量己離，再将析出的锭盐减压过滤除去，冷却重结晶，减压过滤得白色晶体 C。
[0057] ④取Ig产品C溶于50ml甲苯中，130°C揽拌回流15h，热过滤后冷却重结晶，减压 过滤得脱去快喃保护的白色产品D。
[0化引⑥取牛血清白蛋白炬SA) 332mg溶于12mlPBS缓冲液（pH= 6. 8, 0. 1M)，取产品D18. 15mg溶于2mlDMF滴加至蛋白质溶液中，氣气保护下室温反应2化，反应后纯水透析 2化，冻干得牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂。
[0059]
[0060] 实施例2 ;
[0061] 牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂的合成。
[006引①取40g马来酸酢分散在180ml甲苯中，油浴揽拌加热至90°C，44. 4ml快喃用注 射器缓慢注入，冷凝回流反应她。反应结束，降至室温，静置化，减压过滤，用石油離洗2次， 得白色产品A。
[0063] ②取产品A20g，分散在80ml甲醇中，冰浴揽拌冷却至0°C，缓慢滴加己醇胺7. 2ml 至上述溶液，在〇°C下揽拌15min，然后室温下揽拌40min，揽拌油浴90°C下回流36h。反应 结束后，冷却重结晶，减压过滤，得白色晶体B。
[0064] ⑨取产品B6g，S己胺 4. 32ml，jra到 0°C170mlTHF中，在 55mlTHF中溶 2-漠异 了酷漠3. 78ml，并缓慢加入上述溶液，0°C揽拌化，随后室温过夜。反应结束后，减压过滤除 去锭盐，加入大量己離，再将析出的锭盐减压过滤除去，冷却重结晶，减压过滤得白色晶体 C。
[0065] ④取2g产品C溶于50ml甲苯中，140°C揽拌回流1化，热过滤后冷却重结晶，减压 过滤得脱去快喃保护的白色产品D。
[0066] ⑥取BSA664mg溶于 30mlPBS缓冲液（抑=6. 8, 0. 1M)，取产品D36. 3mg溶于 5ml DMF滴加至蛋白质溶液中，氣气保护下室温反应2她，反应后纯水透析36h，冻干得牛血清白 蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂。
[0067] 实施例3 ;
[0068] 牛血清白蛋白炬SA)大分子ATR P引发剂的合成。
[0069] ①取20g马来酸酢分散在120ml甲苯中，油浴揽拌加热至100°C，22. 2ml快喃用注 射器缓慢注入，冷凝回流反应化。反应结束，降至室温，静置化，减压过滤，用石油離洗3次， 得白色广品A。
[0070] ②取产品A15g，分散在90ml甲醇中，冰浴揽拌冷却至0°C，缓慢滴加己醇胺5.4ml 至上述溶液，在〇°C下揽拌25min，然后室温下揽拌30min，揽拌油浴100°C下回流4她。反应 结束后，冷却重结晶，减压过滤，得白色晶体B。
[007U ⑨取产品B4g，^己胺 2. 88ml，jra到 0°C150mlTHF中，在 45mlTHF中溶 2-漠异 了酷漠2. 52ml，并缓慢加入上述溶液，0°C揽拌化，随后室温过夜。反应结束后，减压过滤除 去锭盐，加入大量己離，再将析出的锭盐减压过滤除去，冷却重结晶，减压过滤得白色晶体 C。
[0072] ④取3g产品C溶于70ml甲苯中，150°C揽拌回流13h，热过滤后冷却重结晶，减压 过滤得脱去快喃保护的白色产品D。
[0073] ⑥取BSA498mg溶于 20mlPBS缓冲液（pH= 6. 8, 0. 1M)，取产品D27. 23mg溶于 4mlDMF滴加至蛋白质溶液中，氣气保护下室温反应30h，反应后纯水透析4她，冻干得牛血 清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂。
[0074] 实施例4 ;
[0075] 由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合；
[0076] ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂0.Olmol、单体DPA0.Imol(聚合度n =10)，溶剂DMF与异丙醇各2ml。
[0077] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PM邸TA) 7y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后 加入催化剂化(I)Br4. 5mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[0078] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至50°C反应16h。
[0079] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。
[0080] ⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析24小时，之后采用去离子水为透析液透析5天。最后通过冻 干得到白色固体抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA) 结合体。
[0081] 如图3凝胶电泳测试结果所示，结合PDPA后，由于分子量的增加，使其在凝胶电泳 中的迁移速率减慢，因此其条带位于纯BSA条带的上方。分析证明，抑响应性牛血清白蛋 白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)结合体合成成功。
[0082] 实施例5 ;
[008引由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合；
[0084] ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂2mmol、单体DPA60mmol(聚合度n= 30)，溶剂DMF与异丙醇各1ml。
[0085] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PMEDTA) 3. 5y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然 后加入催化剂化(I)Br2. 25mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[0086] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至60°C反应15h。
[0087] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。 [008引⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析36小时，之后采用去离子水为透析液透析4天。最后通过冻 干得到白色固体产品BSA-PDPA。
[0089] 实施例6 ;
[0090] 由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合；
[0091] ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂Immol、单体DPA50mmol(聚合度n= 50)，溶剂DMF与异丙醇各2ml。
[0092] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PMEDTA) 7y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后 加入催化剂化(I)Br4. 5mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[009引⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至70°C反应1化。
[0094] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。
[0095] ⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析30小时，之后采用去离子水为透析液透析3天。最后通过冻 干得到白色固体产品BSA-PDPA。
[00M] 实施例7 ;
[0097] 由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合：
[009引 ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂0. 8mmol、单体DPASOmmol(聚合度n =100)，溶剂DMF与异丙醇各1ml。
[0099] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PMEDTA) 2. 3y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然 后加入催化剂化(I)Brl. 5mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[0100] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至80°C反应13h。
[0101] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。
[0102] ⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析28小时，之后采用去离子水为透析液透析4天。最后通过冻 干得到白色固体产品BSA-PDPA。
[0103] 实施例8;
[0104] 由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合：
[0105] ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂0. 5mmol、单体DPAlOOmmol(聚合度n =200)，溶剂DMF与异丙醇各2. 5ml。
[0106] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PM邸TA) 7y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后 加入催化剂化(I)Br4. 5mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[0107] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至65°C反应12h。
[0108] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。
[0109] ⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析26小时，之后采用去离子水为透析液透析5天。最后通过冻 干得到白色固体产品BSA-PDPA。
[0110] 实施例9;
[011U 乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[0112] 精确称取 20mgBSA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在 探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入1ml二氯甲烧，超声时间为10分钟，超声功 率为150W。超声结束，将得到的乳液在30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸13分钟，除去有机 相，转速为80转/分钟。待二氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。
[011引如图1粒度分析测试结果所示，所制备的BSA-PDPA自组装体有效粒径为110皿； 如下表，电位分析测试结果所示，所制备的BSA-PDPA自组装体在抑降低时，Zeta电位值由 负电转为正电，即PDPA在较低抑值时发生强烈质子化，使得自组装体具有优越的抑响应 性；如图2透射照片所示，所制备的BSA-PDPA自组装体粒径均匀，分散性好。
[0114]
[011引实施例10:
[0116] 乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[0117] 精确称取12m浊SA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探 头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0. 8ml=氯甲烧，超声时间为8分钟，超声功 率为145W。超声结束，将得到的乳液在25°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸15分钟，除去有机 相，转速为85转/分钟。待S氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。所制备的BSA-PDPA的组装体有效粒径为107nm。
[011引实施例11 ;
[0119] 乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[0120] 精确称取8m浊SA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探 头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0. 5ml二氯甲烧，超声时间为9分钟，超声功 率为130W。超声结束，将得到的乳液在27°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸14分钟，除去有机 相，转速为90转/分钟。待二氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。所制备的BSA-PDPA的组装体有效粒径为98nm。
[0121] 实施例12 ;
[0122] 乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[0123] 精确称取6m浊SA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探 头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0. 4mlS氯甲烧，超声时间为10分钟，超声功 率为135W。超声结束，将得到的乳液在26°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸11分钟，除去有机 相，转速为85转/分钟。待S氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。所制备的BSA-PDPA的组装体有效粒径为95皿。
[0124] 实施例13 ;
[01巧]乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[01 %] 精确称取4m浊SA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探 头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0. 2ml二氯甲烧，超声时间为8分钟，超声功 率为150W。超声结束，将得到的乳液在29°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸12分钟，除去有机 相，转速为88转/分钟。待二氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。所制备的BSA-PDPA的组装体有效粒径为90nm。
[0127] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 巧应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围么内。
[012引 参考文献：
[0129][IjMantovaniG,LecolleyF,TaoL,etal.Designandsynthesisof N-maleimido-functionalizedhydrophilicpolymersviacopper-mediatedliving radicalpolymerization:asuitablealternativetoPEGylationchemistry[J]. Journalof化eAmericanQiemicalSociety,2005, 127巧）：2966-2973.
【主权项】
1. 一种pH响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，其特征是BSA-PDPA结构式如下：其中聚合度n大于等于5。2. 权利要求1的pH响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，其特征是聚合度nlO~200， 尚分子链分子量为2000~40000。3. 权利要求1的pH响应性蛋白质-高分子双亲性结合体组装形成BSA-PDPA球形纳米 载体。4. 权利要求1或2的pH响应性蛋白质-高分子结合体的制备方法，其特征在于步骤如 下： 1) 制备牛血清白蛋白大分子ATRP引发剂； 将牛血清白蛋白（BSA)溶于PBS缓冲液形成BSA溶液，2 -溴代-2 -甲基丙酸2 - (2, 5 -二氧杂-3 -二氢化吡咯-1 -基）乙酯（产品D)溶于N，N-二甲基甲酰胺中形成产品D溶 液，将产品D溶液滴加至BSA溶液中，在氩气保护下室温反应24~36h，纯水透析24~48h 后冻干得到蛋白质ATRP引发剂； 2)ATRP引发剂引发pH响应性高分子聚甲基丙烯酸二异丙基氨基乙酯（PDPA)聚合； ① 在Schlenk管中，将ATRP引发剂、单体DPA依次溶于溶剂中，引发剂和单体的摩尔比 例为1:10~200 ; ② 通过抽真空-充氮气各一次作为一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N" -五甲基二亚乙基三胺，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后加入催化剂 Cu(I)Br，再进行抽真空-充氮气一个循环； ③ 将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至50~70°C反应12~16h;后处理得到 白色固体产品即BSA-PDPA结合体。5. 权利要求4所述的方法，其特征是所述的牛血清白蛋白：2 -溴代-2 -甲基丙酸2 -(2, 5 -二氧杂-3 -二氢化吡咯-1 -基）乙酯的质量比12~15:1。6. 权利要求4所述的方法，其特征是所述的步骤2) -①中所述反应体系的溶剂为 N，N-二甲基甲酰胺与异丙醇一种或两种的组合。7. 权利要求4所述的方法，其特征是所述的引发剂与PMEDTA、Cu⑴Br的摩尔比例为 1:2:1〇8. 权利要求3的BSA-PDPA结合体球形纳米载体组装方法，其特征是pH响应性 BSA-PDPA结合体溶解在去离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入有 机溶剂，超声结束，将得到的乳液在25~30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10~15分钟，除 去有机相，得到pH响应性BSA-PDPA结合体的组装体溶液。9. 权利要求8所述的方法，其特征是所述的有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
【专利摘要】本发明涉及一种pH响应性蛋白质-高分子结合体及其制备和组装方法；合成一种牛血清白蛋白大分子原子转移自由基聚合引发剂，引发甲基丙烯酸二异丙基氨基乙酯单体的ATRP聚合，制备一种pH响应性的牛血清白蛋白-聚甲基丙烯酸二异丙基氨基乙酯双亲性结合体。BSA作为亲水部分的存在赋予结合体优异的生物相容性，可控活性聚合引入的疏水端PDPA增加BSA的稳定性，使得该蛋白质—高分子结合体具有双亲性和pH响应性，进行自组装并pH介导装载治疗药物，且在肿瘤微环境或细胞内涵体内pH值较低的环境下PDPA发生强烈质子化，控释负载的药物，有效提高治疗效果。本制备方法可以实现PDPA的定点结合以及数目可控。
【IPC分类】A61K47/42
【公开号】CN104906589
【申请号】CN201510306407
【发明人】常津, 房蕾, 刘中云, 宫晓群, 杨文涛
【申请人】天津大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月5日
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种刺激响应性蛋白质-高分子结合体及其制备和组装方法，属于药 物载体材料制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 通过精屯、设计的纳米药物载体可将药物包埋或溶解在纳米粒内部，也可吸附或偶 合在其表面。利用祀向制剂对纳米载体进行修饰，将祀向配体连接到纳米粒子表面，通过配 体对细胞膜上受体的特异性识别，修饰后的载药纳米粒子可W祀向到癌细胞，进而进入细 胞释放药物实现药物的祀向输送，同时具有缓释、保护药物、提高疗效、降低毒副作用等优 点。
[0003] 纳米粒子进入细胞后，只有将携带的治疗剂释放出来才能让治疗剂发挥作用，实 现对肿瘤细胞的杀伤。理想的纳米载体应可实现对治疗剂的可控释放。随着材料科学的发 展，越来越多的刺激响应性材料被用于纳米载体的制备。该些材料包括；抑敏感材料、温度 敏感材料、光敏感材料W及氧化还原敏感材料等。利用细胞内本身的特性如内涵体的pH值 偏酸（抑在5. 0-6. 5之间），使进入细胞内的纳米粒子在该些刺激下发生崩解，从而释放出 治疗剂，达到可控释放。如聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)具有优越的抑响应性， 在人体正常生理环境抑值7. 2~7. 6时因其等电点特性作为疏水端，在人体某些病变部位 pH值下降或进入细胞内涵体抑值较低时发生强烈质子化，改变其疏水性能，控释负载的治 疗性药物，是一种很好的医用高分子材料，广泛的用于抑响应性的药物载体及缓释剂。
[0004] 到目前为止，在纳米载体的设计方面已取得了显著的进展，有效地提高了治疗剂 的治疗效果，但大部分尚处于实验阶段，很少转化为临床和投入市场，仍需要科学家们进一 步努力。同时，由于制备技术等方面的原因，纳米载体的大小与形貌的可控性方面也是限制 其发展的一个重要原因。除此之外，用于制备纳米载体的材料的生物安全性和生物相容性 也是纳米载体设计中需要考虑的的一个重要方面。
[0005] 为了提高材料的生物安全性和生物相容性，将蛋白质作为亲水端，刺激响应性疏 水高分子作为疏水端构成巨型双亲性蛋白质-高分子结合体，集蛋白质和连接的高分子的 性能和优势于一体，同时还显示出一些新的性能。蛋白质具有安全无毒、无免疫原性、可生 物降解、生物相容性好等优点，蛋白质的存在赋予结合体优异的生物相容性和生物功能，而 高分子链的引入可W增加蛋白质的稳定性，同时可W赋予结合体双亲性能和高分子链本身 的性能，如引入温度敏感的高分子链可赋予结合体温度敏感性。由于蛋白质对药物具有很 高结合性，蛋白质高分子纳米粒可W高效率的负载药物。利用蛋白质高分子纳米粒表面的 功能基团如胺基和駿基可W用来偶联药物和祀向配体。目前应用最广泛的蛋白质有牛血清 白蛋白炬SA)和人血清白蛋白化SA)等。
[0006] 研究发现，该种的双亲性蛋白质-刺激响应性高分子结合体在水溶液中表现出与 传统的双亲性小分子和嵌段共聚物相似的组装性能，可W自组装形成多种形貌的组装体， 制备好的可生物相容性的纳米载体可有效的将治疗剂运输到癌症细胞内，减少抗癌药物对 正常器官和组织毒副作用，并实现治疗剂的可控释放，提高药物局部浓度，有效增强治疗剂 的治疗效果，实现对癌症的祀向治疗。
【发明内容】
[0007] 本发明中，首先设计合成一种牛血清白蛋白炬SA)大分子原子转移自由基聚合 (ATR巧引发剂，引发甲基丙締酸二异丙基氨基己醋值PA)单体的ATRP聚合，制备一种抑响 应性的牛血清白蛋白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)双亲性结合体。BSA 作为亲水部分的存在赋予结合体优异的生物相容性，可控活性聚合引入的疏水端PDPA增 加BSA的稳定性，使得该蛋白质一高分子结合体具有双亲性和抑响应性，可进行自组装并 pH介导装载治疗药物，且在肿瘤微环境或细胞内涵体内pH值较低的环境下PDPA发生强烈 质子化，控释负载的药物，有效提高治疗效果，是一种的药物载体材料。本制备方法可W实 现PDPA的定点结合W及数目可控。
[000引本发明制备了一种抑响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，选用牛血清白蛋白 炬SA)和聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)，利用BSA上的琉基（-SH)通过迈克尔加 成反应结合马来酷亚胺化的小分子引发剂，后引发PDPA聚合，形成抑响应性BSA-PDPA结 合体。并且该结合体可W组装形成BSA-PDPA球形纳米载体。
[0009] 本发明的技术方案如下；
[0010] 一种抑响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，其特征是BSA-PDPA结构式如下；
[0011] CHj r ?2 11 因图A"f-C-- s i g c^=o 貧 CHz CHj n_ HC。。- W j /、州3 HjC HjC
[0012] 其中聚合度n大于等于5,即高分子链分子量大于1000 ;
[0013] 最佳聚合度范围为10~200,即高分子链分子量为2000~40000。
[0014] 本发明的抑响应性蛋白质-高分子双亲性结合体组装形成BSA-PDPA球形纳米载 体。
[001引本发明的抑响应性蛋白质-高分子结合体的制备方法，步骤如下：
[0016] 1)制备牛血清白蛋白大分子ATRP引发剂；
[0017] 将牛血清白蛋白炬SA)溶于PBS缓冲液形成BSA溶液，2-漠代-2-甲基丙酸 2-(2, 5-二氧杂-3-二氨化化咯-1-基）己醋（产品D)溶于N，N-二甲基甲酯胺中形成产 品D溶液，产品D溶液滴加至BSA溶液中，在氣气保护下室温反应24~36h，纯水透析24~ 4她后冻干得到蛋白质ATRP引发剂；
[0018] 2)ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)聚 合；
[0019] ①在Schlenk管中，将ATRP引发剂、单体DPA依次溶于溶剂中，引发剂和单体的摩 尔比例为1:10~200 ;
[0020] ②通过抽真空-充氮气各一次作为一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后加入催化剂 化(I)Br，再进行抽真空-充氮气一个循环；
[002U⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至50~70°C反应12~16h;后处理 得到白色固体产品即BSA-PDPA结合体。
[002引所述的牛血清白蛋白；2-漠代-2-甲基丙酸2-化5-二氧杂-3-二氨化化 咯-1-基）己醋的质量比优选为12~15:1。
[002引所述反应体系的溶剂为N，N-二甲基甲酯胺值M巧与异丙醇一种或两种的组合，单 体浓度优选为115~240g/L。
[0024] 所述的BSA溶于PBS缓冲液浓度优选为22~25g/L。
[0025] 所述的产品D溶于N，N-二甲基甲酯胺浓度优选为6. 5~9g/L。
[0026] 所述的引发剂与PM邸TA、化(I)化的摩尔比例优选为1:2:1。
[0027] 所述的后处理具体步骤为反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终 止聚合反应；用四氨快喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进 行洗脱，得无色溶液；将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到 透析袋中，先在四氨快喃中进行透析24~48小时，之后转移至水中透析液透析3~5天。 最后通过冻干得到白色固体产品。
[0028] 本发明的BSA-PDPA结合体球形纳米载体组装方法，取pH响应性BSA-PDPA结合体 溶解在去离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入机溶剂为，超声结束， 将得到的乳液在25~30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10~15分钟，除去有机相，得到抑 响应性BSA-PDPA结合体的组装体溶液。
[0029] 所述的BSA-PDPA溶于去离子水浓度优选为为1~5g/L。
[0030] 所述的有机溶剂：离子水体积比优选为为1:1~20。
[0031] 所述的有机溶剂机溶剂为二氯甲烧或=氯甲烧
[0032] 组成的抑响应性BSA-PDPA结合体的自组装纳米载体，制剂粒径在80至1] 140纳米 之间，在抑降低时，Zeta电位值由负电转 为正电。粒径均匀，分散性好。
[0033] 有益效果
[0034] 本发明设及的可组装的抑响应性蛋白质-高分子结合体有益效果包括；制备的 牛血清白蛋白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)结合体生物相容性好，毒性 低。牛血清白蛋白炬SA)具有很好的亲水性，聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)具有 很好的疏水性，使得BSA-PDPA结合体具有双亲性和抑响应性，且可进行自组装和负载药 物。本发明中制备BSA-PDPA结合体的制备方法可实现PDPA的定点键接和数目可控。组装 的BSA-PDPA结合体有效粒径在80~140nm，粒径更均匀；在抑值由7下降5时Zeta电位 由负电变为正电，具有良好抑响应性；稳定性好，可在水溶液中保存至少两个月；制备产率 高，适合大批量生产。
[0035] 本发明的目的是设计并制备一种可组装的抑响应性蛋白质-高分子结合体。与 现有技术相比，本制备方法可W实现疏水高分子PDPA的定点结合W及数目可控，所制得的 自组装药物基因载体保持了均匀较小粒径同时，生物相容性更好，且具有抑响应性，可在 肿瘤微环境或细胞内涵体内抑值较低的环境下PDPA发生强烈质子化，控释负载的药物，有 效提高治疗效果，更高效发挥载体作用。
【附图说明】
[0036] 图1 ;抑响应性蛋白质-高分子即BSA-PDPA自组装体粒度分析图。
[0037] 图2 ;抑响应性蛋白质-高分子即BSA-PDPA自组装体透射照片。
[003引图3 ;抑响应性蛋白质-高分子即BSA-PDPA结合体凝胶电泳谱图。
【具体实施方式】
[0039] W下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0040] 1)制备牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂；
[0041] 取质量比12~15:1的BSA;产品D(2-漠代-2-甲基丙酸2-化5-二氧杂-3-二 氨化化咯-1-基）己醋），将BSA溶于PBS缓冲液（pH= 6. 8, 0. 1M)(浓度为22~25g/L) 形成BSA溶液，产品D溶于N，N-二甲基甲酯胺（浓度为6. 5~9g/L)中形成产品D溶液， 产品D溶液滴加至BSA溶液中，氣气保护下室温反应24~36h，反应结束后，纯水透析24~ 4她后冻干得到蛋白质ATRP引发剂。
[0042] 。由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸 二异丙基氨基己醋（PDPA)聚合；
[0043] ①在Schlenk管中，将ATRP引发剂、单体DPA依次溶于溶剂中，引发剂和单体的摩 尔比例为1:10~200 ;
[0044] ②通过抽真空-充氮气各一次作为一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PM邸TA)，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后加入 催化剂化(I)Br，再进行抽真空-充氮气一个循环。引发剂与PMEDTAXu(I)化的摩尔比例 为 1:2:1。
[0045] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至50~70°C反应12~16h。后处 理得到白色固体产品即BSA-PDPA结合体。
[0046] 步骤2)--①中所述反应体系的溶剂为N，N-二甲基甲酯胺值M巧与异丙醇一种或 两种的组合，单体浓度为115~240g/L。
[0047] 步骤2)--⑨所述的后处理具体步骤为反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温， 通入空气，终止聚合反应；用四氨快喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快 喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液；将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然 后体系转移到透析袋中，先在四氨快喃中进行透析24~48小时，之后转移至水中透析液透 析3~5天。最后通过冻干得到白色固体产品。
[0048] 参貝gDesignandsynthesisofN-maleimido-functionalizedhydrophilic polymersviacopper-mediatedlivingradicalpolymerization:asuitable alternativeto阳G}dationchemist;ry[i]文献中制备方法合成出2-漠代-2-甲基丙酸 2-(2, 5-二氧杂-3-二氨化化咯-1-基）己醋（产品D)。
[0049] 抑响应性蛋白质-高分子纳米载体的组装方法，技术方案如下：
[0050] 抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体 通过乳化-溶剂蒸发法制备。
[CK)5U 取抑响应性BSA-PDPA结合体溶解在去离子水（浓度为1~5g/L)中，将溶液置 于冰浴中。在探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入二氯甲烧或S氯甲烧（有机 溶剂；离子水体积比为1:1~20)，超声时间为8~10分钟，超声功率为150W。超声结束， 将得到的乳液在25~30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10~15分钟，除去有机相，转速为 80~90转/分钟。待有机溶剂完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体溶液。 [0052] 实施例1 ;
[0化引牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂的合成。
[0化4] ①取30g马来酸酢分散在150ml甲苯中，油浴揽拌加热至80°C，33. 3ml快喃用注 射器缓慢注入，冷凝回流反应化。反应结束，降至室温，静置比，减压过滤，用石油離洗3次， 得白色产品A。
[0化5] ②取产品AlOg，分散在100ml甲醇中，冰浴揽拌冷却至0 °C，缓慢滴加己醇胺 3. 6ml至上述溶液，在0°C下揽拌20min，然后室温下揽拌35min，揽拌油浴80°C下回流2化。 反应结束后，冷却重结晶，减压过滤，得白色晶体B。
[0056] ⑨取产品B3g，^己胺2. 16ml，加到0°C170mlTHF中，在55mlTHF中溶2-漠异 了酷漠1. 89ml，并缓慢加入上述溶液，0°C揽拌化，随后室温过夜。反应结束后，减压过滤除 去锭盐，加入大量己離，再将析出的锭盐减压过滤除去，冷却重结晶，减压过滤得白色晶体 C。
[0057] ④取Ig产品C溶于50ml甲苯中，130°C揽拌回流15h，热过滤后冷却重结晶，减压 过滤得脱去快喃保护的白色产品D。
[0化引⑥取牛血清白蛋白炬SA) 332mg溶于12mlPBS缓冲液（pH= 6. 8, 0. 1M)，取产品D18. 15mg溶于2mlDMF滴加至蛋白质溶液中，氣气保护下室温反应2化，反应后纯水透析 2化，冻干得牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂。
[0059]
[0060] 实施例2 ;
[0061] 牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂的合成。
[006引①取40g马来酸酢分散在180ml甲苯中，油浴揽拌加热至90°C，44. 4ml快喃用注 射器缓慢注入，冷凝回流反应她。反应结束，降至室温，静置化，减压过滤，用石油離洗2次， 得白色产品A。
[0063] ②取产品A20g，分散在80ml甲醇中，冰浴揽拌冷却至0°C，缓慢滴加己醇胺7. 2ml 至上述溶液，在〇°C下揽拌15min，然后室温下揽拌40min，揽拌油浴90°C下回流36h。反应 结束后，冷却重结晶，减压过滤，得白色晶体B。
[0064] ⑨取产品B6g，S己胺 4. 32ml，jra到 0°C170mlTHF中，在 55mlTHF中溶 2-漠异 了酷漠3. 78ml，并缓慢加入上述溶液，0°C揽拌化，随后室温过夜。反应结束后，减压过滤除 去锭盐，加入大量己離，再将析出的锭盐减压过滤除去，冷却重结晶，减压过滤得白色晶体 C。
[0065] ④取2g产品C溶于50ml甲苯中，140°C揽拌回流1化，热过滤后冷却重结晶，减压 过滤得脱去快喃保护的白色产品D。
[0066] ⑥取BSA664mg溶于 30mlPBS缓冲液（抑=6. 8, 0. 1M)，取产品D36. 3mg溶于 5ml DMF滴加至蛋白质溶液中，氣气保护下室温反应2她，反应后纯水透析36h，冻干得牛血清白 蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂。
[0067] 实施例3 ;
[0068] 牛血清白蛋白炬SA)大分子ATR P引发剂的合成。
[0069] ①取20g马来酸酢分散在120ml甲苯中，油浴揽拌加热至100°C，22. 2ml快喃用注 射器缓慢注入，冷凝回流反应化。反应结束，降至室温，静置化，减压过滤，用石油離洗3次， 得白色广品A。
[0070] ②取产品A15g，分散在90ml甲醇中，冰浴揽拌冷却至0°C，缓慢滴加己醇胺5.4ml 至上述溶液，在〇°C下揽拌25min，然后室温下揽拌30min，揽拌油浴100°C下回流4她。反应 结束后，冷却重结晶，减压过滤，得白色晶体B。
[007U ⑨取产品B4g，^己胺 2. 88ml，jra到 0°C150mlTHF中，在 45mlTHF中溶 2-漠异 了酷漠2. 52ml，并缓慢加入上述溶液，0°C揽拌化，随后室温过夜。反应结束后，减压过滤除 去锭盐，加入大量己離，再将析出的锭盐减压过滤除去，冷却重结晶，减压过滤得白色晶体 C。
[0072] ④取3g产品C溶于70ml甲苯中，150°C揽拌回流13h，热过滤后冷却重结晶，减压 过滤得脱去快喃保护的白色产品D。
[0073] ⑥取BSA498mg溶于 20mlPBS缓冲液（pH= 6. 8, 0. 1M)，取产品D27. 23mg溶于 4mlDMF滴加至蛋白质溶液中，氣气保护下室温反应30h，反应后纯水透析4她，冻干得牛血 清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂。
[0074] 实施例4 ;
[0075] 由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合；
[0076] ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂0.Olmol、单体DPA0.Imol(聚合度n =10)，溶剂DMF与异丙醇各2ml。
[0077] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PM邸TA) 7y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后 加入催化剂化(I)Br4. 5mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[0078] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至50°C反应16h。
[0079] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。
[0080] ⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析24小时，之后采用去离子水为透析液透析5天。最后通过冻 干得到白色固体抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA) 结合体。
[0081] 如图3凝胶电泳测试结果所示，结合PDPA后，由于分子量的增加，使其在凝胶电泳 中的迁移速率减慢，因此其条带位于纯BSA条带的上方。分析证明，抑响应性牛血清白蛋 白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)结合体合成成功。
[0082] 实施例5 ;
[008引由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合；
[0084] ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂2mmol、单体DPA60mmol(聚合度n= 30)，溶剂DMF与异丙醇各1ml。
[0085] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PMEDTA) 3. 5y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然 后加入催化剂化(I)Br2. 25mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[0086] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至60°C反应15h。
[0087] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。 [008引⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析36小时，之后采用去离子水为透析液透析4天。最后通过冻 干得到白色固体产品BSA-PDPA。
[0089] 实施例6 ;
[0090] 由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合；
[0091] ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂Immol、单体DPA50mmol(聚合度n= 50)，溶剂DMF与异丙醇各2ml。
[0092] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PMEDTA) 7y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后 加入催化剂化(I)Br4. 5mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[009引⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至70°C反应1化。
[0094] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。
[0095] ⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析30小时，之后采用去离子水为透析液透析3天。最后通过冻 干得到白色固体产品BSA-PDPA。
[00M] 实施例7 ;
[0097] 由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合：
[009引 ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂0. 8mmol、单体DPASOmmol(聚合度n =100)，溶剂DMF与异丙醇各1ml。
[0099] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PMEDTA) 2. 3y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然 后加入催化剂化(I)Brl. 5mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[0100] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至80°C反应13h。
[0101] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。
[0102] ⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析28小时，之后采用去离子水为透析液透析4天。最后通过冻 干得到白色固体产品BSA-PDPA。
[0103] 实施例8;
[0104] 由牛血清白蛋白炬SA)大分子ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二 异丙基氨基己醋（PDPA)聚合：
[0105] ①在Schlenk管中，加入BSA大分子引发剂0. 5mmol、单体DPAlOOmmol(聚合度n =200)，溶剂DMF与异丙醇各2. 5ml。
[0106] ②通过抽真空-充氮气一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺（PM邸TA) 7y1，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后 加入催化剂化(I)Br4. 5mg，再进行抽真空-充氮气一个循环。
[0107] ⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至65°C反应12h。
[0108] ④反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终止聚合反应。用四氨快 喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进行洗脱，得无色溶液。
[0109] ⑥将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到透析袋 中，先在四氨快喃中进行透析26小时，之后采用去离子水为透析液透析5天。最后通过冻 干得到白色固体产品BSA-PDPA。
[0110] 实施例9;
[011U 乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[0112] 精确称取 20mgBSA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在 探头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入1ml二氯甲烧，超声时间为10分钟，超声功 率为150W。超声结束，将得到的乳液在30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸13分钟，除去有机 相，转速为80转/分钟。待二氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。
[011引如图1粒度分析测试结果所示，所制备的BSA-PDPA自组装体有效粒径为110皿； 如下表，电位分析测试结果所示，所制备的BSA-PDPA自组装体在抑降低时，Zeta电位值由 负电转为正电，即PDPA在较低抑值时发生强烈质子化，使得自组装体具有优越的抑响应 性；如图2透射照片所示，所制备的BSA-PDPA自组装体粒径均匀，分散性好。
[0114]
[011引实施例10:
[0116] 乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[0117] 精确称取12m浊SA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探 头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0. 8ml=氯甲烧，超声时间为8分钟，超声功 率为145W。超声结束，将得到的乳液在25°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸15分钟，除去有机 相，转速为85转/分钟。待S氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。所制备的BSA-PDPA的组装体有效粒径为107nm。
[011引实施例11 ;
[0119] 乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[0120] 精确称取8m浊SA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探 头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0. 5ml二氯甲烧，超声时间为9分钟，超声功 率为130W。超声结束，将得到的乳液在27°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸14分钟，除去有机 相，转速为90转/分钟。待二氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。所制备的BSA-PDPA的组装体有效粒径为98nm。
[0121] 实施例12 ;
[0122] 乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[0123] 精确称取6m浊SA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探 头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0. 4mlS氯甲烧，超声时间为10分钟，超声功 率为135W。超声结束，将得到的乳液在26°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸11分钟，除去有机 相，转速为85转/分钟。待S氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。所制备的BSA-PDPA的组装体有效粒径为95皿。
[0124] 实施例13 ;
[01巧]乳化-溶剂蒸发法。采用乳化-溶剂蒸发法制备抑响应性牛血清白蛋白炬SA)-聚 甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)自组装体的过程如下：
[01 %] 精确称取4m浊SA-PDPA结合体溶解在4ml去离子水中，将溶液置于冰浴中。在探 头式超声波发生器作用下，用注射器匀速注入0. 2ml二氯甲烧，超声时间为8分钟，超声功 率为150W。超声结束，将得到的乳液在29°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸12分钟，除去有机 相，转速为88转/分钟。待二氯甲烧完全挥发，得到抑响应性BSA-PDPA结合体的组装体 溶液。所制备的BSA-PDPA的组装体有效粒径为90nm。
[0127] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 巧应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围么内。
[012引 参考文献：
[0129][IjMantovaniG,LecolleyF,TaoL,etal.Designandsynthesisof N-maleimido-functionalizedhydrophilicpolymersviacopper-mediatedliving radicalpolymerization:asuitablealternativetoPEGylationchemistry[J]. Journalof化eAmericanQiemicalSociety,2005, 127巧）：2966-2973.
【主权项】
1. 一种pH响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，其特征是BSA-PDPA结构式如下：其中聚合度n大于等于5。2. 权利要求1的pH响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，其特征是聚合度nlO~200， 尚分子链分子量为2000~40000。3. 权利要求1的pH响应性蛋白质-高分子双亲性结合体组装形成BSA-PDPA球形纳米 载体。4. 权利要求1或2的pH响应性蛋白质-高分子结合体的制备方法，其特征在于步骤如 下： 1) 制备牛血清白蛋白大分子ATRP引发剂； 将牛血清白蛋白（BSA)溶于PBS缓冲液形成BSA溶液，2 -溴代-2 -甲基丙酸2 - (2, 5 -二氧杂-3 -二氢化吡咯-1 -基）乙酯（产品D)溶于N，N-二甲基甲酰胺中形成产品D溶 液，将产品D溶液滴加至BSA溶液中，在氩气保护下室温反应24~36h，纯水透析24~48h 后冻干得到蛋白质ATRP引发剂； 2)ATRP引发剂引发pH响应性高分子聚甲基丙烯酸二异丙基氨基乙酯（PDPA)聚合； ① 在Schlenk管中，将ATRP引发剂、单体DPA依次溶于溶剂中，引发剂和单体的摩尔比 例为1:10~200 ; ② 通过抽真空-充氮气各一次作为一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N" -五甲基二亚乙基三胺，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后加入催化剂 Cu(I)Br，再进行抽真空-充氮气一个循环； ③ 将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至50~70°C反应12~16h;后处理得到 白色固体产品即BSA-PDPA结合体。5. 权利要求4所述的方法，其特征是所述的牛血清白蛋白：2 -溴代-2 -甲基丙酸2 -(2, 5 -二氧杂-3 -二氢化吡咯-1 -基）乙酯的质量比12~15:1。6. 权利要求4所述的方法，其特征是所述的步骤2) -①中所述反应体系的溶剂为 N，N-二甲基甲酰胺与异丙醇一种或两种的组合。7. 权利要求4所述的方法，其特征是所述的引发剂与PMEDTA、Cu⑴Br的摩尔比例为 1:2:1〇8. 权利要求3的BSA-PDPA结合体球形纳米载体组装方法，其特征是pH响应性 BSA-PDPA结合体溶解在去离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入有 机溶剂，超声结束，将得到的乳液在25~30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10~15分钟，除 去有机相，得到pH响应性BSA-PDPA结合体的组装体溶液。9. 权利要求8所述的方法，其特征是所述的有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
【专利摘要】本发明涉及一种pH响应性蛋白质-高分子结合体及其制备和组装方法；合成一种牛血清白蛋白大分子原子转移自由基聚合引发剂，引发甲基丙烯酸二异丙基氨基乙酯单体的ATRP聚合，制备一种pH响应性的牛血清白蛋白-聚甲基丙烯酸二异丙基氨基乙酯双亲性结合体。BSA作为亲水部分的存在赋予结合体优异的生物相容性，可控活性聚合引入的疏水端PDPA增加BSA的稳定性，使得该蛋白质—高分子结合体具有双亲性和pH响应性，进行自组装并pH介导装载治疗药物，且在肿瘤微环境或细胞内涵体内pH值较低的环境下PDPA发生强烈质子化，控释负载的药物，有效提高治疗效果。本制备方法可以实现PDPA的定点结合以及数目可控。
【IPC分类】A61K47/42
【公开号】CN104906589
【申请号】CN201510306407
【发明人】常津, 房蕾, 刘中云, 宫晓群, 杨文涛
【申请人】天津大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月5日
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