用于与蛋白质和肽缀合的四个支链的树枝状大分子peg的制作方法
用于与蛋白质和肽缀合的四个支链的树枝状大分子peg的制作方法
【专利说明】用于与蛋白质和化缀合的四个支链的树枝状大分子PEG
[0001] 本申请是申请号为200680049165. 1的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及具有四个支链的聚己二醇（PEG)的树枝状大分子样聚合结构，用于获 得药学目的的缀合物。
【背景技术】
[0003] 治疗性蛋白质与聚己二醇的缀合对于一些药理学性质的益处是众所周知的。例 如，由于不同的原因，在血中的半衰期延长，其中：聚合残基可W防止蛋白酶的攻击和通过 免疫系统进行的药物的识别，至于天然蛋白质，缀合物的流体力学体积显著地减少了肾滤 过。尽管在很多情况中，阳G化会影响蛋白质的体外生物活性，但是在血中寿命的显著延 长使得其治疗作用更为有效化arrisJ.M.yQiessR.B. (2003化ffectofpeg}dationon pharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov. 2 ;214-21)。
[0004] 阳G化也从立体上阻止了疏水性相互作用诱导的降解途径，产生了立体非特异性 障碍，从而减小了与蛋白质热不稳定性有关的分子间作用力。所有该些使得PEG化的蛋白 质比未修饰的分子具有了更高的物理稳定性，该是一种对于最终药物制剂的制备非常有用 的性质(HarrisJ.M.yChessR.B. (2003)Effectofpegylationonpharmaceuticals. 化1:.Rev.DrugDiscov. 2 ;214-21)。
[0005] 常用于蛋白质缀合的试剂是在其一个末端甲基化的聚己二醇，称作单甲氧基聚己 二醇（mPEG)。甲基保护PEG链的一个末端的事实使得其仅能通过另一个末端激活，成为单 官能化试剂。该对于治疗性蛋白质的缀合是非常重要的，因为一般与双官能化或多官能化 试剂的缀合会导致交联，从而影响蛋白质的生物活性。mPEG分子总是具有一小部分的非甲 基化聚合物，即二醇部分。由于更难W控制非常长的链的聚合过程，因此在较高分子量的 mPEG中二醇部分的比例更高（Robe;rtsM.J. ,Bentl巧M.D. ,Har;risJ.M. (2002)Qiemistry forpeptide和蛋白质阳Gylation.Adv.DrugDeliv.Reviews54 ;459-76)。
[0006] 由PEG衍生的第一类分子中的一种是通过与氯化氯反应而合成的。但是该试剂的 缀合试验引起了广泛的PEG化。该是治疗性蛋白质所不期望的，因为PEG化的程度较高会 导致生物活性突然降低，原因在于直接阻断活性位点，或是掩盖了易接触的蛋白质表面的 该些位点的拓扑变化。通常，期望的缀合物是在每个蛋白质分子上仅有一个阳G残基；该分 子已知是单-PEG化的。
[0007] 从80年代开始，开始使用"更软"的活性基团。尽管也可W使用其他基团，但 该些基团主要是N-哲基班巧酷亚胺醋。S种最常见的基团是；班巧酷亚胺班巧酸醋、 S氣己基横酸醋（tres^ate)和班巧酷亚胺碳酸醋。该时的活化阳G被称作第一代活 化阳G(Robe;rtsM.J.,Bentl巧M.D.'HarrisJ.M. (2002)QiemistryforP邱tideand proteinPEGylation.Adv.DrugDeliv.Reviews54:459-76)。
[0008] 90年代后半期出现了第二代的活化PEG。它有两个重要的进步：能够更为 选择性地PEG化的基团（例如：优选通过蛋白质的N末端缀合的醒基）和支链结构(RobertsM.J. ,BentleyM.D. ,HarrisJ.M. (2002)Chemistryforpeptideandprotein 阳Gylation.Adv.DrugDeliv.Reviews54 ;459-76)。支链阳G的例子是用两个支链单官能 化的扣S5, 932, 462)，用四个支链四官能化的和用八个支链八官能化的。缀合治疗性蛋白 质的更有用的活化PEG是单官能化的，因为它们避免了蛋白质和聚合物之间的交联。支链 PEG也具有伞样的结构，从而更好地保护蛋白质的表面。
[0009] 两个支链的单官能化的阳G能够得到具有干扰素a-2a的缀合物，该缀合物比天 然蛋白质在临床中显示出更好的效果（RajenderReddyK.,ModiM.W.,PedderS. (2002) Useofpeginterferonalfa-2a(40KD)(Pegasys)forthetreatmentofhepatitis C.Adv.DrugDeliv.Reviews54:571-86)。
[0010] 至于mPEG合成的现有技术，仅仅能获得30kDa的链，原因在于具有两个支链的试 剂能够获得最大为60kDa的分子量。人们期望具有更高分子量的单官能化的PEG的结构， 其可W用于探索更宽范围的缀合物，W在某些蛋白质中得到最佳的值。但是，在上述的报告 中都没有使用、表征或提及单官能化和具有两个W上的PEG链的PEG化试剂。在获得具有 两个W上的阳G链的试剂的情况中，可W获得更高分子量的缀合物，除了上述的优点W外， 它允许使用更短的mPEG线性支链使类似分子量的阳G化试剂成为两个支链的结构。该些 较小的支链含有的二醇部分量更小，该使得合成过程更容易。
【发明内容】
[0011] 本发明解决了上述问题，提供了具有四个mPEG支链的单官能化树枝状大分子样 结构。该结构能够获得具有高达120kDa的聚合残基的缀合物。该个事实可W用于探索具有 广泛不同的分子量的缀合物，包括具有高分子量的缀合物。此外，使用该个方法，可W获得 分子量与其他支链化的单官能化试剂类似的PEG分子，但是它具有较低分子量的线性链。
[0012] 在本发明一个优选的实施方案中，获得了一种聚合结构，其中PEG链的分子量为 5, 000 到 30,OOODa，总分子量为 20, 000 到 120,OOODa。
[0013] 使用小的线性链几乎消除了在较大的线性PEG分子中的二醇污染。出人意料地， 与类似分子量但是用仅有两个支链的结构制备的缀合物相比，具有本发明所述结构的缀合 物具有高得多的物理-化学稳定性（耐高温和蛋白酶降解）。同时出人意料的是，它们在血 中具有更高的平均寿命。另一个出人意料的结果是具有本发明树枝状大分子样结构的缀合 物更为同质，与具有类似分子量但仅有两个支链的缀合物所获得的结果相比，具有更少的 位置异构体。
[0014] 树枝状大分子样四个支链的单官能化的PEG是在两个主要步骤中获得的。第一个 步骤是通过两个线性PEG分子与核结合来合成两支链-衍生物，其中该核可W是例如赖氨 酸。其他作者已经使用类似方法获得了良好的结果扣S5, 932, 462)。第二个步骤是与前 一步骤类似，将两分子的两支链-衍生物与核结合，获得四支链-衍生物。为了在第一步骤 中将两个线性PEG支链与核结合，它们需要具有活性基团。该基团可W选自现有技术水平 已知的基团。例如，其中包括班巧酷亚胺班巧酸醋、班巧酷亚胺碳酸醋、对硝基苯基碳酸醋、 班巧酷亚胺丙酸醋、班巧酷亚胺了酸醋。在本发明中优选的线性活化阳G是班巧酷亚胺碳 酸醋。该主要是由于下列主要的不同原因；该试剂和具有游离氨基的核之间具有良好的反 应性，制备官能化阳G的方法简便。合成方法（MironT.，WilchekM. (1993)ASimplified MethodforthePreparationof班巧酷亚胺碳酸醋化lyethyleneGlycolforCoupling toProteins.Biocoru'ugateQiem. 4:568-69)是本领域技术人员公知的；
[0015]
[0016] 当准备好线性的活化PEG时，通过与选作核的分子进行反应可W容易地完成第一 个步骤。在本发明一个优选的实施方案中，由于其生物适合性，核是k赖氨酸，它具有两个 游离的氨基和一个駿基，它们可W在随后用于被激活。
[0017] 通过色谱法可W从反应混合物中容易地纯化两支链-衍生物。用核分子激活该两 支链-衍生物W用于后续的反应并合成四支链-衍生物。可不同方法激活该产品，但 是根据效力和简便性优选的一种方法是形成N-哲基班巧酷亚胺醋。
[0018]
[0019] 该方法已经成功地用于激活具有包含阳G链的结构的駿基，使其成为N-哲基班巧 酷亚胺醋扣S4, 732, 863,US5, 932, 462)。
[0020] 制备四支链-衍生物的第二个阶段包括两支链-衍生物与核分子的反应，其与本 发明的第一个阶段类似；本发明的一个优选实施方案是使用心赖氨酸作为核。
[0021]
[0022] 通过色谱法可W容易地从反应混合物中纯化感兴趣的衍生物。
[0023] 使用不同的反应性基团与蛋白质缀合可W激活树 枝状大分子样PEG分子。用于激 活其他阳G结构的任意官能团同样可用于本专利所述的树枝状大分子样PEG。该些基团的 一些例子是；N-哲基班巧酷亚胺醋、班巧酷亚胺碳酸醋、不同类型的醒、马来酷亚胺等等。 可W使其结构与蛋白质结合的其它类型的基团是馨合基次氮基S己酸醋（NTA)，其可W通 过过渡金属与肤骨架中存在的组氨酸残基缀合。反应性基团的选择将取决于欲与PEG分子 结合的蛋白质残基。
[0024] 例如，如果优选与游离的氨基结合，那么树枝状大分子样聚合物可W激活成N-哲 基班巧酷亚胺醋。该样，根据与阶段1中激活两支链-结构所述相同的方法，本发明的一个 实施方案是获得N-哲基班巧酷亚胺醋。
[00巧]
[0026] 蛋白质与激活的PEG的缀合发生在适当的缓冲溶液中。除了其他因素，缓冲溶液 的性质取决于聚合物的官能团和缀合的目的。例如，如果需要通过游离氨基与官能化的PEG 缀合而成N-哲基班巧酷亚胺醋，那么用预定的抑将可W在一定程度上预测缀合位点。抑 值约为9对于通过赖氨酸的e-氨基进行缀合是有利的。
[0027]
[0028] 另一个例子是，当与醒基官能团缀合时，稍酸性的抑将允许PEG化优选发生在蛋 白质的N-末端上。然后可W通过不同的色谱技术进行感兴趣的缀合物的纯化。
[0029] 在本发明的一个实施方案中，所述的缀合物是，其中的亲核基团包含在选自蛋白 质、肤和多肤的生物分子中。
[0030] 必须分析缀合物的某些化学、物理和生物学性质，尽可能地完成对纯化的缀合物 的特征描述。例如，通常可W通过紫外线光谱法（在280皿处的吸光度）来确定缀合物的 浓度，该是因为PEG残基几乎不会影响蛋白质的消光系数。必须通过十二烷基硫酸钢聚丙 締酷胺凝胶电泳法（SDS-PAG巧确定纯化产品的纯度，该是因为色谱法例如凝胶过滤很难 分辨感兴趣的缀合物和污染物所对应的信号。通过常用方法可W研究其他的物理-化学性 质。
[0031] 该操作的结果是，本发明的一个优选的成果是描述了缀合物的制备，其中蛋白质 选自；干扰素a-2b、链激酶、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素或表皮生长因子。
【附图说明】
[003引附图1.保护免受蛋白酶的降解。X-轴表示时间，单位为小时；Y-轴是未降解的蛋 白质的量，单位是对时间为0时的量的百分比。
[003引附图2.耐热性。X-轴表示时间，单位为天；Y-轴是未降解的蛋白质的量，单位是 对时间为0时的量的百分比。
【具体实施方式】 [0034] /实施例
[00巧]实施例1.激活为N-哲基班巧酷亚胺醋的阳G的合成
[0036] 结构的获得和激活
[0037] 获得单甲氧基聚己二醇的班巧酷亚胺碳酸醋（SC-PEG)
[003引将分子量为12, 000化(mPEGi2K)的15g单甲氧基聚己二醇溶解于500血甲苯中，并 共沸干燥3小时。然后将体积减小至250111以反应混合物冷却至室温。向该溶液中加入下 列试剂；60mL的干燥二氯甲烧，溶解于15mL干燥丙酬中的2g二班巧酷亚胺碳酸醋值SC)， 和溶解于甲苯；DCM为3 ;1混合物lOmL中的Ig二甲氨基化晚。反应在揽拌下过夜（16小 时）。用1L的冷己離沉淀反应混合物，过滤收集沉淀。将产物溶解于丙酬中，并用己離沉淀， 如此重结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贬存于-20°C的氮气下。该方法的最终收率在 90%W上。通过与甘氨酷（glycil)-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过与TNBS反 应来定量游离的氨基。
[0039] 获得二阳G化的赖氨酸（Lys-2阳G)
[0040] 将12g的SC-PEGi2k与溶解于lOOmM棚酸盐缓冲液的抑8. 5的浓度为0. 2mg/mL 的46mgL-(+)-赖氨酸反应。反应在室温下揽拌过夜（16小时）。然后用重蒸馈水将反应 混合物稀释5倍，并用盐酸调节抑。用1体积的DCM将PEG萃取3次。用无水硫酸钢干燥 合并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩阳G的DCM溶液直至20mL。用120mL 的冷己離沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。用DEAE琼脂糖通过离子交换色谱从反 应混合物的剩余组分中分离Lys-2PEG。
[0041]用3体积的lOOmM棚酸盐缓冲液，pH7. 5使包含1L色谱基质的柱达到平衡，然后 用5体积的重蒸馈水洗漆。将lOg的反应混合物W5mg/mL溶解于重蒸馈水中。用2体积 的重蒸馈水洗漆该柱，清除未反应的PEG,用ImM的氯化钢溶液洗脱Lys-2PEG。用盐酸将该 部分的抑调节至3并用1体积的DCM萃取3次。用无水硫酸钢干燥合并的3次萃取部分 并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩阳G的DCM溶液直至lOmL。用60mL的冷己離沉淀该浓缩 物，过滤收集并高真空下干燥。通过SDS-PAGE确定纯度，用5%的氯化领溶液和lOOmM舰给 凝胶染色。通过MLDI-T0F确定的分子量是23. 0-24. 5kDa。该方法的总收率在40%W上。 [004引激活二阳G化的赖氨酸成为N-哲基班巧酷亚胺醋（PEG2,12K-N服）
[0043] 将6g的Lys-2PEG溶解于20血的干燥DCM中，并加入60mg的N-哲基班巧酷亚胺 和250mg的N，N'-二环己基碳二亚胺值CC)。将反应在室温和揽拌下保持24小时。过滤 混合物，并通过旋转蒸发浓缩至5mL。用20血的冷己離沉淀产物，将其溶解于丙酬并用己離 沉淀，如此重结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贬存于-20°C的氮气下。该方法的总收 率在95%W上。通过与甘氨酷-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过与TNBS反应来 定量游离氨基的个数。
[0044] 获得树枝状大分子样四支链-PEG
[004引将5g的阳G2,12K-N服与溶解于lOOmM棚酸盐缓冲液的抑8. 5的浓度0.Img/mL的 7mgL-(+)-赖氨酸反应。反应在室温下揽拌16小时进行。然后用重蒸馈水将反应混合物 5倍稀释，并用盐酸调节抑至3。用1体积的DCM将阳G萃取3次。用无水硫酸钢干燥合 并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩阳G的DCM溶液直至5mL。用30mL的 冷己離沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。在G3000PW柱中通过大小排阻层析法纯 化树枝状大分子样四支链-PEG。用盐酸将包含所需结构的部分的抑调节至3,用1体积 的DCM萃取3次。用无水硫酸钢干燥合并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩 阳G的DCM溶液直至5血。用30血的冷己離沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。通 过SDS-PAGE确定纯度，用5%的氯化领溶液和lOOmM舰给凝胶染色，纯度在98%W上。通 过MLDI-T0F确定的分子量是45. 5-50kDa。该方法的总收率在30%W上。
[0046] 树枝状大分子样四支链-PEG官能化为N-哲基班巧酷亚胺醋牌G4,12K-N服）
[0047] 将1. 5g的树枝状大分子样四支链-PEG溶解于5mL的干燥DCM中，并加入9mg的 N-哲基班巧酷亚胺和37mg的N，N'-二环己基碳二亚胺。将反应在室温和揽拌下保持24 小时。过滤产物，并用20mL的冷己離沉淀。将其溶解于丙酬并用己離沉淀，如此将沉淀重 结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贬存于-20°C的氮气下。该方法的总收率在95%W 上。通过与甘氨酷-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过与TNBS反应来定量游离的 氨基个数。
[004引实施例2.用阳G4,CK-N服获得IFN-a化缀合物[004引缀合反应
[0050] 将活化成N-哲基班巧酷亚胺醋牌G4J2K-N服）的4g树枝状大分子样四支链-PEG 加入到溶液中，该溶液是包含浓度为6mg/mL的IgIFN-a化的120mM棚酸盐缓冲液，且抑 8. 5的溶液。温和揽拌下将反应在4°C下保持1小时，然后用抑4的lOmM己酸钢缓冲溶 液稀释50倍来停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收率，用考马斯亮藍 R-250染色。含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化IFN-a化的份数在40%W上。
[0051] 纯化含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化IFN- a化
[005引用3体积的抑4的lOmM己酸盐缓冲液，W40血/分钟的流速使包含500血的触 须型树脂填料化actogelEMD650(M)C00-的XK50/60柱（Pharmacia公司）达到平衡。W 相同流速将包含反应混合物的溶液应用于该柱。用pH4的40mM己酸盐缓冲液、和25mM的 氯化钢进行2小时的洗漆，W清除未反应的PEG和具有一个W上的PEG残基的缀合物。用 pH4的50mM己酸钢缓冲液、和150mM的氯化钢洗脱单阳G化的缀合物。纯度在96%W上， 主要的污染物是未变性的干扰素和二阳G化的缀合物。浓缩感兴趣的部分直至200mU并应 用于XK50/60柱（Pharmacia)上，该柱 包含用抑7的50mM磯酸盐缓冲溶液，及用lOOmM氯 化钢平衡的1L的Se地adexG-25。通过0. 2ym孔径的己酸纤维素膜过滤含有树枝状大分 子样四支链-PEG的单PEG化的干扰素，并在4°C下贬存。
[005引实施例3.阳G4,CK-IFN-a化的物理-化学性质[0054]确定缀合物的浓度
[00巧]通过在280nm的UV-吸光度确定作为蛋白质残基的函数的缀合物浓度。认为一个 吸光度单位等于Img/mL的浓度。
[0056] 确定缀合物的分子量
[0057] 通过MLDI-T0F确定缀合物的分子量。期望的树枝状大分子样四支链-PEG的平 均分子量是48, 000化，IFN-a化的平均分子量是19, 200化，因此该缀合物的理论分子量是 67, 200Da。阳G4，i2k-IFN-a化的计算分子量是 64, 000-70,OOODa。
[005引实施例4.阳G4, CK-IFN- a化缀合物的生物学性质
[0059] 在ELISA-型分析中缀合物的免疫鉴定
[0060] 将不同浓度的缀合物样品和阴性对照物应用于化ISA微量滴定板上，该滴定板 上补充有对抗IFN-a化的单克隆抗体。接着，加入另一种单克隆抗体，其中该抗体识别 IFN- a化的另一个表位，与辣根过氧化物酶结合。我们认为，当缀合物样品的吸光度高于阴 性样品的吸光度的平均值加上该些值的标准差的3倍时，该样品就是免疫识别的。在所有 情况中，该些样品都被识别。
[0061] 体外抗病毒活性
[0062] 通过抑制脑屯、肌炎病毒对化P-2细胞（ATCCNo. (XL23)产生的细胞病变效应来确 定体外抗病毒活性。在96-孔微量滴定板的细胞单层中混合缀合物的最小必需培养基的系 列稀释液（1 ;2)，其中该培养基含有2%胎牛血清和40yg/mL的庆大霉素。将该板在3%二 氧化碳大气、95%相对湿度和37°C下培养24小时。加入病毒（107TCID)，培养该板，直至细 胞病变效应变得明显（90%细胞溶解）。通过用结晶紫将细胞染色来测定细胞破坏的程度。 用国际单位（IU)表示每种样品的活性，用世界卫生组织的IFN-a化国际标准69/19计算， 表1是所得到的结果。
[006引表1.天然IFN- a化和与树枝状大分子样四支链-PEG缀合的IFN- a化的体外抗 病毒活性
[0064]
[0065] 体外抗增殖活性
[0066] 通过缀合的IFN-a化抑制Daudi细胞炬urkittLymphoma)生长的能力来测定体 外抗增殖活性。结果表明，PEG4，i2K-IFN-a化的体外活性等于未变性的IFN-a化的5%。
[0067] 实施例5.阳G4,CK-IFN-a化的物理-化学稳定性
[0068] 对于蛋白酶降解的抵抗性
[0069] 将包含400 yg/mL天然IFN-a化与类似分子量的两或四支链-PEG的缀合物的40 微升4%碳酸氨钢溶液，抑8与10 y L的160 y g/mL膜岛素溶液混合。将样品在37°C下培 养一段时间。用lOuL的S氣己酸使反应停止。通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价 蛋白质（缀合或未缀合）的残留量，用考马斯亮藍染色。结果（附图1)表明，四个支链的 PEG结构(▲)对IFN-a化缀合物降解的保护优于类似分子量的两个支链-结构（?）产 生的保护。
[0070] 热稳定性
[0071] 为了确定具有树枝状大分子样四支链-PEG的IFN-a化缀合物的稳定性，将天 然和缀合后的蛋白质样品在60°C的磯酸盐缓冲溶液中进行培养。使用类似分子量的两支 链-PEG的IFN-a化缀合物样品作为对照。在某些时间分离样品，通过SDS-PAGE分析中谱 带的消失来评价蛋白质（缀合或未缀合）的残留量，用考马斯亮藍染色。结果（附图2)表 明，具有四个支链的结构的缀合物的热稳定性高于其他两种情况[天然IFN( )，与 两个支链结构的IFN缀合物（?）]。
[00刮实施例6.阳G4,CK-IFN-a化的药代动力学
[0073] 在平均重量为化g的新西兰兔中进行未变性干扰素和与树枝状大分子样四支 链-PEG的蛋白质缀合物之间的比较药代动力学研究。使用两支链-PEG的IFN-a化缀合 物作为对照。通过每kg体重150yg蛋白质的皮下途径来注射生物分子。在144小时的间 隔里，在预定时间取血样。离屯、样品，分离血清，并在-20°C下贬存至分析。用对该细胞因子 具有特异性的单克隆抗体通过化ISA-型分析来确定IFN- a化浓度（缀合或未缀合）。判 读是基于经典的房室乳突模型。结果如表2所示。
[0074] 表2.天然IFN- a 2b、与两支链-PEG缀合的IFN- a化和阳G4, CK-IFN- a化的比较 药代动力学
[00巧]
[0076] 实施例7.其他治疗性蛋白质与树枝状大分子样四支链-PEG的缀合
[0077] 其他治疗性蛋白质例如重组链激酶（r-SK)、红细胞生成素巧P0)、粒细胞集落刺 激因子（G-CS巧和表皮生长因子巧G巧可W与树枝状大分子样四支链-PEG缀合。评价缀 合对蛋白酶降解率的效应。
[0078] 激活为N-哲基班巧酷亚胺醋的树枝状大分子样四支链-PEG的缀合
[0079] 将lOOmg的激活为N-哲基班巧酷亚胺醋的树枝状大分子样四支 链-PEG(PEG4，i2k-N服）加入到溶液中，该溶液是包含6mg/血的25mg治疗性蛋白质的120mM 棚酸盐缓冲溶液、抑8. 5的溶液。温和揽拌下将反应在4°C下保持1小时，然后用lOmM己 酸钢缓冲溶液，pH4稀释50倍来停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收 率，用考马斯亮藍R-250将样品染色。在所有情况中，含有树枝状大分子样四支链-PEG的 单PEG化的蛋白质的比例都在30 %W上。
[0080] 用激活为醒的树枝状大分子样PEG进行缀合
[0081] 将lOOmg的激活为醒的树枝状大分子样四支链-PEG(PEG4，i2k-ALD)加入到溶液中， 该溶液是包含4mg/mL的15mg治疗性蛋白质的lOOmM己酸盐缓冲溶液、pH5并包含20mM氯 基棚氨化钢的溶液。温和揽拌下将反应在4°C下持续24小时，然后用ImMHC1稀释20倍来 停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收率，用考马斯亮藍R-250将样品染 色。在所有情况中，含有树枝状大分子样四支链-PEG的单阳G化的蛋白质的比例都在30% 社。
[0082] 树枝状大分子样四支链-PEG的缀合对于蛋白酶降解蛋白质的效应
[0083] 将包含400yg/mL天然蛋白质、或与四支链-PEG的缀合物的40微升4%碳酸氨 钢溶液，pH8与10yL的160yg/mL膜岛素溶液混合。将样品在37°C和温和揽拌下培养4 小时。然后用10UL的S氣己酸使反应停止。通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价蛋 白质（缀合或未缀合）的残留量，用考马斯亮藍染色。结果（表3)表明，与树枝状大分子 样四支链-PEG的缀合保护了缀合的蛋白质免受膜岛素的降解。在所有情况中，不依赖于所 使用的化学缀合方法，在与膜岛素反应4小时后，超过35%的蛋白质都没有消化。但是，天 然蛋白质在该反应时间后，没有检测到任何信号。
[0084] 表3 ;相对于反应前的蛋白质量，未消化的蛋白质的份数（％ )
[0085]
【主权项】
1. 一种缀合物，其包含a)聚合树枝状大分子样结构，包括四个支链的单甲氧基-聚乙 二醇，其可以表示为：其中总分子量是45, 500-50,OOODa;和 b)亲核基团，其包含干扰素a2-b。2. 权利要求1的缀合物，其中所述聚合结构被活化用于与所述亲核基团缀合，通过羧 基官能化获得。
【专利摘要】本发明涉及具有四个支链的单甲氧基-聚乙二醇的聚合树枝状大分子样结构，其可以表示为：可以将前述结构的羧基官能化，以产生药学目的的缀合物，该树枝状大分子样聚乙二醇与治疗性蛋白质的结合改善了它们的体外和体内稳定性。
【IPC分类】A61K47/48, A61K38/21
【公开号】CN104906594
【申请号】CN201510340715
【发明人】J·A·拉蒙赫尔南德兹, F·R·卡斯特罗奥迪澳, V·M·赛兹玛提内兹, R·派斯梅雷莱斯, E·菲尔南德兹萨恩彻兹
【申请人】遗传工程与生物技术中心
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2006年11月20日
【公告号】CA2631335A1, CA2631335C, CN101389354A, EP1967212A2, US8703893, US20090082537, WO2007062610A2, WO2007062610A3
【专利说明】用于与蛋白质和化缀合的四个支链的树枝状大分子PEG
[0001] 本申请是申请号为200680049165. 1的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及具有四个支链的聚己二醇（PEG)的树枝状大分子样聚合结构，用于获 得药学目的的缀合物。
【背景技术】
[0003] 治疗性蛋白质与聚己二醇的缀合对于一些药理学性质的益处是众所周知的。例 如，由于不同的原因，在血中的半衰期延长，其中：聚合残基可W防止蛋白酶的攻击和通过 免疫系统进行的药物的识别，至于天然蛋白质，缀合物的流体力学体积显著地减少了肾滤 过。尽管在很多情况中，阳G化会影响蛋白质的体外生物活性，但是在血中寿命的显著延 长使得其治疗作用更为有效化arrisJ.M.yQiessR.B. (2003化ffectofpeg}dationon pharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov. 2 ;214-21)。
[0004] 阳G化也从立体上阻止了疏水性相互作用诱导的降解途径，产生了立体非特异性 障碍，从而减小了与蛋白质热不稳定性有关的分子间作用力。所有该些使得PEG化的蛋白 质比未修饰的分子具有了更高的物理稳定性，该是一种对于最终药物制剂的制备非常有用 的性质(HarrisJ.M.yChessR.B. (2003)Effectofpegylationonpharmaceuticals. 化1:.Rev.DrugDiscov. 2 ;214-21)。
[0005] 常用于蛋白质缀合的试剂是在其一个末端甲基化的聚己二醇，称作单甲氧基聚己 二醇（mPEG)。甲基保护PEG链的一个末端的事实使得其仅能通过另一个末端激活，成为单 官能化试剂。该对于治疗性蛋白质的缀合是非常重要的，因为一般与双官能化或多官能化 试剂的缀合会导致交联，从而影响蛋白质的生物活性。mPEG分子总是具有一小部分的非甲 基化聚合物，即二醇部分。由于更难W控制非常长的链的聚合过程，因此在较高分子量的 mPEG中二醇部分的比例更高（Robe;rtsM.J. ,Bentl巧M.D. ,Har;risJ.M. (2002)Qiemistry forpeptide和蛋白质阳Gylation.Adv.DrugDeliv.Reviews54 ;459-76)。
[0006] 由PEG衍生的第一类分子中的一种是通过与氯化氯反应而合成的。但是该试剂的 缀合试验引起了广泛的PEG化。该是治疗性蛋白质所不期望的，因为PEG化的程度较高会 导致生物活性突然降低，原因在于直接阻断活性位点，或是掩盖了易接触的蛋白质表面的 该些位点的拓扑变化。通常，期望的缀合物是在每个蛋白质分子上仅有一个阳G残基；该分 子已知是单-PEG化的。
[0007] 从80年代开始，开始使用"更软"的活性基团。尽管也可W使用其他基团，但 该些基团主要是N-哲基班巧酷亚胺醋。S种最常见的基团是；班巧酷亚胺班巧酸醋、 S氣己基横酸醋（tres^ate)和班巧酷亚胺碳酸醋。该时的活化阳G被称作第一代活 化阳G(Robe;rtsM.J.,Bentl巧M.D.'HarrisJ.M. (2002)QiemistryforP邱tideand proteinPEGylation.Adv.DrugDeliv.Reviews54:459-76)。
[0008] 90年代后半期出现了第二代的活化PEG。它有两个重要的进步：能够更为 选择性地PEG化的基团（例如：优选通过蛋白质的N末端缀合的醒基）和支链结构(RobertsM.J. ,BentleyM.D. ,HarrisJ.M. (2002)Chemistryforpeptideandprotein 阳Gylation.Adv.DrugDeliv.Reviews54 ;459-76)。支链阳G的例子是用两个支链单官能 化的扣S5, 932, 462)，用四个支链四官能化的和用八个支链八官能化的。缀合治疗性蛋白 质的更有用的活化PEG是单官能化的，因为它们避免了蛋白质和聚合物之间的交联。支链 PEG也具有伞样的结构，从而更好地保护蛋白质的表面。
[0009] 两个支链的单官能化的阳G能够得到具有干扰素a-2a的缀合物，该缀合物比天 然蛋白质在临床中显示出更好的效果（RajenderReddyK.,ModiM.W.,PedderS. (2002) Useofpeginterferonalfa-2a(40KD)(Pegasys)forthetreatmentofhepatitis C.Adv.DrugDeliv.Reviews54:571-86)。
[0010] 至于mPEG合成的现有技术，仅仅能获得30kDa的链，原因在于具有两个支链的试 剂能够获得最大为60kDa的分子量。人们期望具有更高分子量的单官能化的PEG的结构， 其可W用于探索更宽范围的缀合物，W在某些蛋白质中得到最佳的值。但是，在上述的报告 中都没有使用、表征或提及单官能化和具有两个W上的PEG链的PEG化试剂。在获得具有 两个W上的阳G链的试剂的情况中，可W获得更高分子量的缀合物，除了上述的优点W外， 它允许使用更短的mPEG线性支链使类似分子量的阳G化试剂成为两个支链的结构。该些 较小的支链含有的二醇部分量更小，该使得合成过程更容易。
【发明内容】
[0011] 本发明解决了上述问题，提供了具有四个mPEG支链的单官能化树枝状大分子样 结构。该结构能够获得具有高达120kDa的聚合残基的缀合物。该个事实可W用于探索具有 广泛不同的分子量的缀合物，包括具有高分子量的缀合物。此外，使用该个方法，可W获得 分子量与其他支链化的单官能化试剂类似的PEG分子，但是它具有较低分子量的线性链。
[0012] 在本发明一个优选的实施方案中，获得了一种聚合结构，其中PEG链的分子量为 5, 000 到 30,OOODa，总分子量为 20, 000 到 120,OOODa。
[0013] 使用小的线性链几乎消除了在较大的线性PEG分子中的二醇污染。出人意料地， 与类似分子量但是用仅有两个支链的结构制备的缀合物相比，具有本发明所述结构的缀合 物具有高得多的物理-化学稳定性（耐高温和蛋白酶降解）。同时出人意料的是，它们在血 中具有更高的平均寿命。另一个出人意料的结果是具有本发明树枝状大分子样结构的缀合 物更为同质，与具有类似分子量但仅有两个支链的缀合物所获得的结果相比，具有更少的 位置异构体。
[0014] 树枝状大分子样四个支链的单官能化的PEG是在两个主要步骤中获得的。第一个 步骤是通过两个线性PEG分子与核结合来合成两支链-衍生物，其中该核可W是例如赖氨 酸。其他作者已经使用类似方法获得了良好的结果扣S5, 932, 462)。第二个步骤是与前 一步骤类似，将两分子的两支链-衍生物与核结合，获得四支链-衍生物。为了在第一步骤 中将两个线性PEG支链与核结合，它们需要具有活性基团。该基团可W选自现有技术水平 已知的基团。例如，其中包括班巧酷亚胺班巧酸醋、班巧酷亚胺碳酸醋、对硝基苯基碳酸醋、 班巧酷亚胺丙酸醋、班巧酷亚胺了酸醋。在本发明中优选的线性活化阳G是班巧酷亚胺碳 酸醋。该主要是由于下列主要的不同原因；该试剂和具有游离氨基的核之间具有良好的反 应性，制备官能化阳G的方法简便。合成方法（MironT.，WilchekM. (1993)ASimplified MethodforthePreparationof班巧酷亚胺碳酸醋化lyethyleneGlycolforCoupling toProteins.Biocoru'ugateQiem. 4:568-69)是本领域技术人员公知的；
[0015]
[0016] 当准备好线性的活化PEG时，通过与选作核的分子进行反应可W容易地完成第一 个步骤。在本发明一个优选的实施方案中，由于其生物适合性，核是k赖氨酸，它具有两个 游离的氨基和一个駿基，它们可W在随后用于被激活。
[0017] 通过色谱法可W从反应混合物中容易地纯化两支链-衍生物。用核分子激活该两 支链-衍生物W用于后续的反应并合成四支链-衍生物。可不同方法激活该产品，但 是根据效力和简便性优选的一种方法是形成N-哲基班巧酷亚胺醋。
[0018]
[0019] 该方法已经成功地用于激活具有包含阳G链的结构的駿基，使其成为N-哲基班巧 酷亚胺醋扣S4, 732, 863,US5, 932, 462)。
[0020] 制备四支链-衍生物的第二个阶段包括两支链-衍生物与核分子的反应，其与本 发明的第一个阶段类似；本发明的一个优选实施方案是使用心赖氨酸作为核。
[0021]
[0022] 通过色谱法可W容易地从反应混合物中纯化感兴趣的衍生物。
[0023] 使用不同的反应性基团与蛋白质缀合可W激活树 枝状大分子样PEG分子。用于激 活其他阳G结构的任意官能团同样可用于本专利所述的树枝状大分子样PEG。该些基团的 一些例子是；N-哲基班巧酷亚胺醋、班巧酷亚胺碳酸醋、不同类型的醒、马来酷亚胺等等。 可W使其结构与蛋白质结合的其它类型的基团是馨合基次氮基S己酸醋（NTA)，其可W通 过过渡金属与肤骨架中存在的组氨酸残基缀合。反应性基团的选择将取决于欲与PEG分子 结合的蛋白质残基。
[0024] 例如，如果优选与游离的氨基结合，那么树枝状大分子样聚合物可W激活成N-哲 基班巧酷亚胺醋。该样，根据与阶段1中激活两支链-结构所述相同的方法，本发明的一个 实施方案是获得N-哲基班巧酷亚胺醋。
[00巧]
[0026] 蛋白质与激活的PEG的缀合发生在适当的缓冲溶液中。除了其他因素，缓冲溶液 的性质取决于聚合物的官能团和缀合的目的。例如，如果需要通过游离氨基与官能化的PEG 缀合而成N-哲基班巧酷亚胺醋，那么用预定的抑将可W在一定程度上预测缀合位点。抑 值约为9对于通过赖氨酸的e-氨基进行缀合是有利的。
[0027]
[0028] 另一个例子是，当与醒基官能团缀合时，稍酸性的抑将允许PEG化优选发生在蛋 白质的N-末端上。然后可W通过不同的色谱技术进行感兴趣的缀合物的纯化。
[0029] 在本发明的一个实施方案中，所述的缀合物是，其中的亲核基团包含在选自蛋白 质、肤和多肤的生物分子中。
[0030] 必须分析缀合物的某些化学、物理和生物学性质，尽可能地完成对纯化的缀合物 的特征描述。例如，通常可W通过紫外线光谱法（在280皿处的吸光度）来确定缀合物的 浓度，该是因为PEG残基几乎不会影响蛋白质的消光系数。必须通过十二烷基硫酸钢聚丙 締酷胺凝胶电泳法（SDS-PAG巧确定纯化产品的纯度，该是因为色谱法例如凝胶过滤很难 分辨感兴趣的缀合物和污染物所对应的信号。通过常用方法可W研究其他的物理-化学性 质。
[0031] 该操作的结果是，本发明的一个优选的成果是描述了缀合物的制备，其中蛋白质 选自；干扰素a-2b、链激酶、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素或表皮生长因子。
【附图说明】
[003引附图1.保护免受蛋白酶的降解。X-轴表示时间，单位为小时；Y-轴是未降解的蛋 白质的量，单位是对时间为0时的量的百分比。
[003引附图2.耐热性。X-轴表示时间，单位为天；Y-轴是未降解的蛋白质的量，单位是 对时间为0时的量的百分比。
【具体实施方式】 [0034] /实施例
[00巧]实施例1.激活为N-哲基班巧酷亚胺醋的阳G的合成
[0036] 结构的获得和激活
[0037] 获得单甲氧基聚己二醇的班巧酷亚胺碳酸醋（SC-PEG)
[003引将分子量为12, 000化(mPEGi2K)的15g单甲氧基聚己二醇溶解于500血甲苯中，并 共沸干燥3小时。然后将体积减小至250111以反应混合物冷却至室温。向该溶液中加入下 列试剂；60mL的干燥二氯甲烧，溶解于15mL干燥丙酬中的2g二班巧酷亚胺碳酸醋值SC)， 和溶解于甲苯；DCM为3 ;1混合物lOmL中的Ig二甲氨基化晚。反应在揽拌下过夜（16小 时）。用1L的冷己離沉淀反应混合物，过滤收集沉淀。将产物溶解于丙酬中，并用己離沉淀， 如此重结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贬存于-20°C的氮气下。该方法的最终收率在 90%W上。通过与甘氨酷（glycil)-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过与TNBS反 应来定量游离的氨基。
[0039] 获得二阳G化的赖氨酸（Lys-2阳G)
[0040] 将12g的SC-PEGi2k与溶解于lOOmM棚酸盐缓冲液的抑8. 5的浓度为0. 2mg/mL 的46mgL-(+)-赖氨酸反应。反应在室温下揽拌过夜（16小时）。然后用重蒸馈水将反应 混合物稀释5倍，并用盐酸调节抑。用1体积的DCM将PEG萃取3次。用无水硫酸钢干燥 合并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩阳G的DCM溶液直至20mL。用120mL 的冷己離沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。用DEAE琼脂糖通过离子交换色谱从反 应混合物的剩余组分中分离Lys-2PEG。
[0041]用3体积的lOOmM棚酸盐缓冲液，pH7. 5使包含1L色谱基质的柱达到平衡，然后 用5体积的重蒸馈水洗漆。将lOg的反应混合物W5mg/mL溶解于重蒸馈水中。用2体积 的重蒸馈水洗漆该柱，清除未反应的PEG,用ImM的氯化钢溶液洗脱Lys-2PEG。用盐酸将该 部分的抑调节至3并用1体积的DCM萃取3次。用无水硫酸钢干燥合并的3次萃取部分 并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩阳G的DCM溶液直至lOmL。用60mL的冷己離沉淀该浓缩 物，过滤收集并高真空下干燥。通过SDS-PAGE确定纯度，用5%的氯化领溶液和lOOmM舰给 凝胶染色。通过MLDI-T0F确定的分子量是23. 0-24. 5kDa。该方法的总收率在40%W上。 [004引激活二阳G化的赖氨酸成为N-哲基班巧酷亚胺醋（PEG2,12K-N服）
[0043] 将6g的Lys-2PEG溶解于20血的干燥DCM中，并加入60mg的N-哲基班巧酷亚胺 和250mg的N，N'-二环己基碳二亚胺值CC)。将反应在室温和揽拌下保持24小时。过滤 混合物，并通过旋转蒸发浓缩至5mL。用20血的冷己離沉淀产物，将其溶解于丙酬并用己離 沉淀，如此重结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贬存于-20°C的氮气下。该方法的总收 率在95%W上。通过与甘氨酷-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过与TNBS反应来 定量游离氨基的个数。
[0044] 获得树枝状大分子样四支链-PEG
[004引将5g的阳G2,12K-N服与溶解于lOOmM棚酸盐缓冲液的抑8. 5的浓度0.Img/mL的 7mgL-(+)-赖氨酸反应。反应在室温下揽拌16小时进行。然后用重蒸馈水将反应混合物 5倍稀释，并用盐酸调节抑至3。用1体积的DCM将阳G萃取3次。用无水硫酸钢干燥合 并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩阳G的DCM溶液直至5mL。用30mL的 冷己離沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。在G3000PW柱中通过大小排阻层析法纯 化树枝状大分子样四支链-PEG。用盐酸将包含所需结构的部分的抑调节至3,用1体积 的DCM萃取3次。用无水硫酸钢干燥合并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩 阳G的DCM溶液直至5血。用30血的冷己離沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。通 过SDS-PAGE确定纯度，用5%的氯化领溶液和lOOmM舰给凝胶染色，纯度在98%W上。通 过MLDI-T0F确定的分子量是45. 5-50kDa。该方法的总收率在30%W上。
[0046] 树枝状大分子样四支链-PEG官能化为N-哲基班巧酷亚胺醋牌G4,12K-N服）
[0047] 将1. 5g的树枝状大分子样四支链-PEG溶解于5mL的干燥DCM中，并加入9mg的 N-哲基班巧酷亚胺和37mg的N，N'-二环己基碳二亚胺。将反应在室温和揽拌下保持24 小时。过滤产物，并用20mL的冷己離沉淀。将其溶解于丙酬并用己離沉淀，如此将沉淀重 结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贬存于-20°C的氮气下。该方法的总收率在95%W 上。通过与甘氨酷-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过与TNBS反应来定量游离的 氨基个数。
[004引实施例2.用阳G4,CK-N服获得IFN-a化缀合物[004引缀合反应
[0050] 将活化成N-哲基班巧酷亚胺醋牌G4J2K-N服）的4g树枝状大分子样四支链-PEG 加入到溶液中，该溶液是包含浓度为6mg/mL的IgIFN-a化的120mM棚酸盐缓冲液，且抑 8. 5的溶液。温和揽拌下将反应在4°C下保持1小时，然后用抑4的lOmM己酸钢缓冲溶 液稀释50倍来停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收率，用考马斯亮藍 R-250染色。含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化IFN-a化的份数在40%W上。
[0051] 纯化含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化IFN- a化
[005引用3体积的抑4的lOmM己酸盐缓冲液，W40血/分钟的流速使包含500血的触 须型树脂填料化actogelEMD650(M)C00-的XK50/60柱（Pharmacia公司）达到平衡。W 相同流速将包含反应混合物的溶液应用于该柱。用pH4的40mM己酸盐缓冲液、和25mM的 氯化钢进行2小时的洗漆，W清除未反应的PEG和具有一个W上的PEG残基的缀合物。用 pH4的50mM己酸钢缓冲液、和150mM的氯化钢洗脱单阳G化的缀合物。纯度在96%W上， 主要的污染物是未变性的干扰素和二阳G化的缀合物。浓缩感兴趣的部分直至200mU并应 用于XK50/60柱（Pharmacia)上，该柱 包含用抑7的50mM磯酸盐缓冲溶液，及用lOOmM氯 化钢平衡的1L的Se地adexG-25。通过0. 2ym孔径的己酸纤维素膜过滤含有树枝状大分 子样四支链-PEG的单PEG化的干扰素，并在4°C下贬存。
[005引实施例3.阳G4,CK-IFN-a化的物理-化学性质[0054]确定缀合物的浓度
[00巧]通过在280nm的UV-吸光度确定作为蛋白质残基的函数的缀合物浓度。认为一个 吸光度单位等于Img/mL的浓度。
[0056] 确定缀合物的分子量
[0057] 通过MLDI-T0F确定缀合物的分子量。期望的树枝状大分子样四支链-PEG的平 均分子量是48, 000化，IFN-a化的平均分子量是19, 200化，因此该缀合物的理论分子量是 67, 200Da。阳G4，i2k-IFN-a化的计算分子量是 64, 000-70,OOODa。
[005引实施例4.阳G4, CK-IFN- a化缀合物的生物学性质
[0059] 在ELISA-型分析中缀合物的免疫鉴定
[0060] 将不同浓度的缀合物样品和阴性对照物应用于化ISA微量滴定板上，该滴定板 上补充有对抗IFN-a化的单克隆抗体。接着，加入另一种单克隆抗体，其中该抗体识别 IFN- a化的另一个表位，与辣根过氧化物酶结合。我们认为，当缀合物样品的吸光度高于阴 性样品的吸光度的平均值加上该些值的标准差的3倍时，该样品就是免疫识别的。在所有 情况中，该些样品都被识别。
[0061] 体外抗病毒活性
[0062] 通过抑制脑屯、肌炎病毒对化P-2细胞（ATCCNo. (XL23)产生的细胞病变效应来确 定体外抗病毒活性。在96-孔微量滴定板的细胞单层中混合缀合物的最小必需培养基的系 列稀释液（1 ;2)，其中该培养基含有2%胎牛血清和40yg/mL的庆大霉素。将该板在3%二 氧化碳大气、95%相对湿度和37°C下培养24小时。加入病毒（107TCID)，培养该板，直至细 胞病变效应变得明显（90%细胞溶解）。通过用结晶紫将细胞染色来测定细胞破坏的程度。 用国际单位（IU)表示每种样品的活性，用世界卫生组织的IFN-a化国际标准69/19计算， 表1是所得到的结果。
[006引表1.天然IFN- a化和与树枝状大分子样四支链-PEG缀合的IFN- a化的体外抗 病毒活性
[0064]
[0065] 体外抗增殖活性
[0066] 通过缀合的IFN-a化抑制Daudi细胞炬urkittLymphoma)生长的能力来测定体 外抗增殖活性。结果表明，PEG4，i2K-IFN-a化的体外活性等于未变性的IFN-a化的5%。
[0067] 实施例5.阳G4,CK-IFN-a化的物理-化学稳定性
[0068] 对于蛋白酶降解的抵抗性
[0069] 将包含400 yg/mL天然IFN-a化与类似分子量的两或四支链-PEG的缀合物的40 微升4%碳酸氨钢溶液，抑8与10 y L的160 y g/mL膜岛素溶液混合。将样品在37°C下培 养一段时间。用lOuL的S氣己酸使反应停止。通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价 蛋白质（缀合或未缀合）的残留量，用考马斯亮藍染色。结果（附图1)表明，四个支链的 PEG结构(▲)对IFN-a化缀合物降解的保护优于类似分子量的两个支链-结构（?）产 生的保护。
[0070] 热稳定性
[0071] 为了确定具有树枝状大分子样四支链-PEG的IFN-a化缀合物的稳定性，将天 然和缀合后的蛋白质样品在60°C的磯酸盐缓冲溶液中进行培养。使用类似分子量的两支 链-PEG的IFN-a化缀合物样品作为对照。在某些时间分离样品，通过SDS-PAGE分析中谱 带的消失来评价蛋白质（缀合或未缀合）的残留量，用考马斯亮藍染色。结果（附图2)表 明，具有四个支链的结构的缀合物的热稳定性高于其他两种情况[天然IFN( )，与 两个支链结构的IFN缀合物（?）]。
[00刮实施例6.阳G4,CK-IFN-a化的药代动力学
[0073] 在平均重量为化g的新西兰兔中进行未变性干扰素和与树枝状大分子样四支 链-PEG的蛋白质缀合物之间的比较药代动力学研究。使用两支链-PEG的IFN-a化缀合 物作为对照。通过每kg体重150yg蛋白质的皮下途径来注射生物分子。在144小时的间 隔里，在预定时间取血样。离屯、样品，分离血清，并在-20°C下贬存至分析。用对该细胞因子 具有特异性的单克隆抗体通过化ISA-型分析来确定IFN- a化浓度（缀合或未缀合）。判 读是基于经典的房室乳突模型。结果如表2所示。
[0074] 表2.天然IFN- a 2b、与两支链-PEG缀合的IFN- a化和阳G4, CK-IFN- a化的比较 药代动力学
[00巧]
[0076] 实施例7.其他治疗性蛋白质与树枝状大分子样四支链-PEG的缀合
[0077] 其他治疗性蛋白质例如重组链激酶（r-SK)、红细胞生成素巧P0)、粒细胞集落刺 激因子（G-CS巧和表皮生长因子巧G巧可W与树枝状大分子样四支链-PEG缀合。评价缀 合对蛋白酶降解率的效应。
[0078] 激活为N-哲基班巧酷亚胺醋的树枝状大分子样四支链-PEG的缀合
[0079] 将lOOmg的激活为N-哲基班巧酷亚胺醋的树枝状大分子样四支 链-PEG(PEG4，i2k-N服）加入到溶液中，该溶液是包含6mg/血的25mg治疗性蛋白质的120mM 棚酸盐缓冲溶液、抑8. 5的溶液。温和揽拌下将反应在4°C下保持1小时，然后用lOmM己 酸钢缓冲溶液，pH4稀释50倍来停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收 率，用考马斯亮藍R-250将样品染色。在所有情况中，含有树枝状大分子样四支链-PEG的 单PEG化的蛋白质的比例都在30 %W上。
[0080] 用激活为醒的树枝状大分子样PEG进行缀合
[0081] 将lOOmg的激活为醒的树枝状大分子样四支链-PEG(PEG4，i2k-ALD)加入到溶液中， 该溶液是包含4mg/mL的15mg治疗性蛋白质的lOOmM己酸盐缓冲溶液、pH5并包含20mM氯 基棚氨化钢的溶液。温和揽拌下将反应在4°C下持续24小时，然后用ImMHC1稀释20倍来 停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收率，用考马斯亮藍R-250将样品染 色。在所有情况中，含有树枝状大分子样四支链-PEG的单阳G化的蛋白质的比例都在30% 社。
[0082] 树枝状大分子样四支链-PEG的缀合对于蛋白酶降解蛋白质的效应
[0083] 将包含400yg/mL天然蛋白质、或与四支链-PEG的缀合物的40微升4%碳酸氨 钢溶液，pH8与10yL的160yg/mL膜岛素溶液混合。将样品在37°C和温和揽拌下培养4 小时。然后用10UL的S氣己酸使反应停止。通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价蛋 白质（缀合或未缀合）的残留量，用考马斯亮藍染色。结果（表3)表明，与树枝状大分子 样四支链-PEG的缀合保护了缀合的蛋白质免受膜岛素的降解。在所有情况中，不依赖于所 使用的化学缀合方法，在与膜岛素反应4小时后，超过35%的蛋白质都没有消化。但是，天 然蛋白质在该反应时间后，没有检测到任何信号。
[0084] 表3 ;相对于反应前的蛋白质量，未消化的蛋白质的份数（％ )
[0085]
【主权项】
1. 一种缀合物，其包含a)聚合树枝状大分子样结构，包括四个支链的单甲氧基-聚乙 二醇，其可以表示为：其中总分子量是45, 500-50,OOODa;和 b)亲核基团，其包含干扰素a2-b。2. 权利要求1的缀合物，其中所述聚合结构被活化用于与所述亲核基团缀合，通过羧 基官能化获得。
【专利摘要】本发明涉及具有四个支链的单甲氧基-聚乙二醇的聚合树枝状大分子样结构，其可以表示为：可以将前述结构的羧基官能化，以产生药学目的的缀合物，该树枝状大分子样聚乙二醇与治疗性蛋白质的结合改善了它们的体外和体内稳定性。
【IPC分类】A61K47/48, A61K38/21
【公开号】CN104906594
【申请号】CN201510340715
【发明人】J·A·拉蒙赫尔南德兹, F·R·卡斯特罗奥迪澳, V·M·赛兹玛提内兹, R·派斯梅雷莱斯, E·菲尔南德兹萨恩彻兹
【申请人】遗传工程与生物技术中心
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2006年11月20日
【公告号】CA2631335A1, CA2631335C, CN101389354A, EP1967212A2, US8703893, US20090082537, WO2007062610A2, WO2007062610A3
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