p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用
p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明设及p50基因的新用途，具体是p50基因在制备抗癌药物中的应用。
【背景技术】：
[000引NF-KB是哺乳动物体内重要的转录因子蛋白家族，有5个成员组成；Rel(cRel)、p65(RelA)、RelB和p50(NF-kB1)、p52(NF-kB2)。该家族成员通过亚基结合形成同源或 异源二聚体，与祀基因上特定的序列（-KB位点）结合调苄基因转录，对不同基因的表达进 行精细调节。其中p50含有N端Rel同源区化elhomologydomain,RHD)，不含C端的反式 激活结构域（transactivationdomain,TD)，其形成的同源二聚体并不能激活基因转录，常 W其前体P105的形式作为抑制分子而存在。
[0003] 在肿瘤研究中，通常认为NF-KB通路通过活化后对相关基因转录调控，促进肿瘤 的发生、增殖、侵袭和转移。NF-KB活化后诱导RAS引起的致癌作用，也能激活人端粒末端 转移酶的活性而促进致癌作用，在人类肝癌、T淋己细胞白血病、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、甲 状腺癌、恶性黑色素瘤的活化，NF-KB中的p65也在脑胶质瘤和脑转移癌的发展、侵袭和血 管发生中具有重要作用。NF-kB在膀脱癌中通过与IL-8互作促进细胞的生长、侵袭和转 移。
[0004] 但NF-kB家族也具有抑制肿瘤的作用。NF-kB活化能可逆地抑制永生化的 relA^/^小鼠成纤维细胞的转化。RelA(p65)的失活能抑制p53诱导的调亡，说明其活化可 能促进调亡而抑制肿瘤。在p53为野生型的肿瘤中抑制NF-kB活性，会降低化疗效果。但 并没有对p50的肿瘤抑制作用进行报道。本发明首次提供p50基因对膀脱癌细胞的抑制作 用，为膀脱癌抗癌药物的制备提供新思路。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的在于提供p50基因的一种新用途。
[0006] 本发明提供p50基因在制备抗癌药物中的应用，特别是p50基因在制备抗膀脱癌 药物中的应用。所述的p50基因，其核巧酸序列为SEQIDN0;1。
[0007] 本发明通过构建p50基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明；转染后的肿瘤 细胞中p50基因的mRNA水平均显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性显著降 低，最终出现死亡。
[000引本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药祀的发现及肿瘤药物设计 提供基础数据。
【附图说明】：
[0009] 图1 ;p50超表达后mRNA水平表达；qPCR结果（PCDNA3. 1为空载体；PCDNA3.l-p50 为带有p50基因的超表达载体）
[0010] 图2 ;超表达p50后肿瘤细胞形态变化；A重组质粒PCDNA3. 1-P50转染到T24细胞 2化后细胞形态；B重组质粒PCDNA3.l-p50转染到T24细胞4她后细胞形态
[0011] 图3 ;p50超表达后细胞活性检测
【具体实施方式】：
[0012] 实施例1 ;p50基因抑制膀脱癌T24细胞
[0013] 一、重组表达载体的构建
[0014] 1、PCR产物的制备
[0015] WT24细胞RNA反转录的cDNA为模板，基于p50基因的全长cDNA序列佑ene ID:4971)设计用带有酶切位点的表达引物进行PCR扩增。反应条件为；94°C预变性3min， 94^变性3〇3,60^退火4〇3,72^延伸3111111，共35个循环，72^保温1〇111111，引物序列见表 1。PCR产物回收过程严格按照OMEGA公司的GelExtractionKit的说明书进行。
[0016] 表lp50表达引物
[0017]
[001引 2、目的基因全长验证
[0019] 将PCR获得的目的基因连接到Zero Vector上，送往北京奥科生物公司进行测序。
[0020] 3、PCR产物及表达载体的双酶切反应
[002U 选取测序成功的质粒，在2个巧pendorf管中分别进行PCR产物和PCDNA3. 1双酶 切反应，反应体系参照化ndIII、EcoRI说明书（肥B)进行。
[0022] 4、胶回收酶切产物
[002引将上述双酶切产物进行胶回收，回收过程严格按照OMEGA公司的GelExtraction Kit的说明书进行。
[0024] 5、目的基因p50与PCDNA3. 1的连接
[002引将含目的基因p50的胶回收产物连接到PCDNA3. 1上，在离屯、管中建立如下反应体 系：
[0026]
[0027] 轻轻混匀，瞬时离屯、收集液体于管底，置于16°C过夜连接。
[002引二、重组表达载体的转化
[0029] 1、将Trans-Tl化ageResistant感受态细胞置于冰上；
[0030] 2、在离屯、管中依次加入50yL感受态细胞核5yL的连接产物，轻轻混匀，置于冰 上 30min;
[0031] 3、42°C水浴热激30s，然后快速将管置于冰上，冰浴2min;
[003引 4、加入500yL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37°C2(K)巧m振荡培养 比；
[0033] 5、取200yL重悬菌液，均匀涂布于提前放置在37°C培养箱中氨节抗性的平板上， 过夜培养。
[0034] S、重组表达载体的验证
[0035] 1、用灭菌的枪头小屯、挑取白色单菌落，将枪头置于ImLLB液体培养基（含有 0. 1%氨节）中，在37°C、200rpm的振荡培养箱中培养比。
[0036] 2、菌液PCR检测（1)中菌液是否含有重组质粒，PCR体系为：
[0037]
[0038] PCR反应条件；94°C预变性 3min，94°C30s，6(TC40s，72°C3min30s，35 个循环； 72°C5min，4°C保存。之后，用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，将检测到目的片段的 对应菌液送往北京奥科生物公司进行测序。
[0039] 四、重组质粒转染T24细胞
[0040] 取对数生长期细胞，重悬于不含抗生素的RPMI1640培养基中，接种于6孔板中。实 验分为2组，对照组；PCDNA3. 1空质粒及EGFP-N1，实验组；pcDM3.l-p50及EGFP-N1。每 组3个重复。采用Invitroen公司Lipofectamine2000将构建好的质粒pcDNA3.l-p50与 EGFP-N1共转染到T24细胞，具体操作参照说明书。
[004U五、qPCR检测转染后P50mRNA表达水平
[00创 将PCDNA3.l-p50与EGFP-N1共转染到T24细胞4她后，Trizol法提取总RNA，步 骤按照RNAisoPlus(TaKaRa)说明书进行。反转录后qPCR检测p50mRNA表达水平（见图1)。
[0043] 六、形态学观察
[0044] 重组质粒转入T24细胞2化及4她后显微镜（OLYMPUS1X71)观察细胞形态（见 图2)。
[0045] MTT检测转染后细胞活性
[0046] 转染2化后，对照组和处理组分别接种于96孔板中。每组设置3个复孔，继续培 养。培养2化后，弃去培养液，加入180yL新鲜培养基，再加入20yL5mg/mLMTT(终浓度 为0. 5mg/血)，继续培养化。待到时间后，终止培养，小屯、吸去孔内培养液，每孔加入150化 DMSO,摇床低速振摇lOmin，使藍紫色结晶充分溶解，在酶标仪490nm处读取吸光度值。处理 数据，计算己西苏木素对细胞的抑制率，绘制细胞生长曲线。每个样本均设置6个重复，取 平均值为最终结果（见图3)。
【主权项】
1. p50基因在制备抗癌药物中的应用；所述的p50基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1。 2. p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用；所述的p50基因，其核苷酸序列为SEQID NO:1〇
【专利摘要】本发明提供p50基因在制备抗癌药物中的应用，特别是p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。本发明通过构建p50基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明：转染后的肿瘤细胞中p50基因的mRNA显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性下降21.8％，最终出现死亡。本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。
【IPC分类】A61K48/00, A61P35/00
【公开号】CN104906596
【申请号】CN201510259320
【发明人】张婷婷, 张建珍, 任璐, 马恩波, 郑耀武, 任连生
【申请人】山西大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月20日
【技术领域】：
[0001] 本发明设及p50基因的新用途，具体是p50基因在制备抗癌药物中的应用。
【背景技术】：
[000引NF-KB是哺乳动物体内重要的转录因子蛋白家族，有5个成员组成；Rel(cRel)、p65(RelA)、RelB和p50(NF-kB1)、p52(NF-kB2)。该家族成员通过亚基结合形成同源或 异源二聚体，与祀基因上特定的序列（-KB位点）结合调苄基因转录，对不同基因的表达进 行精细调节。其中p50含有N端Rel同源区化elhomologydomain,RHD)，不含C端的反式 激活结构域（transactivationdomain,TD)，其形成的同源二聚体并不能激活基因转录，常 W其前体P105的形式作为抑制分子而存在。
[0003] 在肿瘤研究中，通常认为NF-KB通路通过活化后对相关基因转录调控，促进肿瘤 的发生、增殖、侵袭和转移。NF-KB活化后诱导RAS引起的致癌作用，也能激活人端粒末端 转移酶的活性而促进致癌作用，在人类肝癌、T淋己细胞白血病、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、甲 状腺癌、恶性黑色素瘤的活化，NF-KB中的p65也在脑胶质瘤和脑转移癌的发展、侵袭和血 管发生中具有重要作用。NF-kB在膀脱癌中通过与IL-8互作促进细胞的生长、侵袭和转 移。
[0004] 但NF-kB家族也具有抑制肿瘤的作用。NF-kB活化能可逆地抑制永生化的 relA^/^小鼠成纤维细胞的转化。RelA(p65)的失活能抑制p53诱导的调亡，说明其活化可 能促进调亡而抑制肿瘤。在p53为野生型的肿瘤中抑制NF-kB活性，会降低化疗效果。但 并没有对p50的肿瘤抑制作用进行报道。本发明首次提供p50基因对膀脱癌细胞的抑制作 用，为膀脱癌抗癌药物的制备提供新思路。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的在于提供p50基因的一种新用途。
[0006] 本发明提供p50基因在制备抗癌药物中的应用，特别是p50基因在制备抗膀脱癌 药物中的应用。所述的p50基因，其核巧酸序列为SEQIDN0;1。
[0007] 本发明通过构建p50基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明；转染后的肿瘤 细胞中p50基因的mRNA水平均显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性显著降 低，最终出现死亡。
[000引本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药祀的发现及肿瘤药物设计 提供基础数据。
【附图说明】：
[0009] 图1 ;p50超表达后mRNA水平表达；qPCR结果（PCDNA3. 1为空载体；PCDNA3.l-p50 为带有p50基因的超表达载体）
[0010] 图2 ;超表达p50后肿瘤细胞形态变化；A重组质粒PCDNA3. 1-P50转染到T24细胞 2化后细胞形态；B重组质粒PCDNA3.l-p50转染到T24细胞4她后细胞形态
[0011] 图3 ;p50超表达后细胞活性检测
【具体实施方式】：
[0012] 实施例1 ;p50基因抑制膀脱癌T24细胞
[0013] 一、重组表达载体的构建
[0014] 1、PCR产物的制备
[0015] WT24细胞RNA反转录的cDNA为模板，基于p50基因的全长cDNA序列佑ene ID:4971)设计用带有酶切位点的表达引物进行PCR扩增。反应条件为；94°C预变性3min， 94^变性3〇3,60^退火4〇3,72^延伸3111111，共35个循环，72^保温1〇111111，引物序列见表 1。PCR产物回收过程严格按照OMEGA公司的GelExtractionKit的说明书进行。
[0016] 表lp50表达引物
[0017]
[001引 2、目的基因全长验证
[0019] 将PCR获得的目的基因连接到Zero Vector上，送往北京奥科生物公司进行测序。
[0020] 3、PCR产物及表达载体的双酶切反应
[002U 选取测序成功的质粒，在2个巧pendorf管中分别进行PCR产物和PCDNA3. 1双酶 切反应，反应体系参照化ndIII、EcoRI说明书（肥B)进行。
[0022] 4、胶回收酶切产物
[002引将上述双酶切产物进行胶回收，回收过程严格按照OMEGA公司的GelExtraction Kit的说明书进行。
[0024] 5、目的基因p50与PCDNA3. 1的连接
[002引将含目的基因p50的胶回收产物连接到PCDNA3. 1上，在离屯、管中建立如下反应体 系：
[0026]
[0027] 轻轻混匀，瞬时离屯、收集液体于管底，置于16°C过夜连接。
[002引二、重组表达载体的转化
[0029] 1、将Trans-Tl化ageResistant感受态细胞置于冰上；
[0030] 2、在离屯、管中依次加入50yL感受态细胞核5yL的连接产物，轻轻混匀，置于冰 上 30min;
[0031] 3、42°C水浴热激30s，然后快速将管置于冰上，冰浴2min;
[003引 4、加入500yL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37°C2(K)巧m振荡培养 比；
[0033] 5、取200yL重悬菌液，均匀涂布于提前放置在37°C培养箱中氨节抗性的平板上， 过夜培养。
[0034] S、重组表达载体的验证
[0035] 1、用灭菌的枪头小屯、挑取白色单菌落，将枪头置于ImLLB液体培养基（含有 0. 1%氨节）中，在37°C、200rpm的振荡培养箱中培养比。
[0036] 2、菌液PCR检测（1)中菌液是否含有重组质粒，PCR体系为：
[0037]
[0038] PCR反应条件；94°C预变性 3min，94°C30s，6(TC40s，72°C3min30s，35 个循环； 72°C5min，4°C保存。之后，用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，将检测到目的片段的 对应菌液送往北京奥科生物公司进行测序。
[0039] 四、重组质粒转染T24细胞
[0040] 取对数生长期细胞，重悬于不含抗生素的RPMI1640培养基中，接种于6孔板中。实 验分为2组，对照组；PCDNA3. 1空质粒及EGFP-N1，实验组；pcDM3.l-p50及EGFP-N1。每 组3个重复。采用Invitroen公司Lipofectamine2000将构建好的质粒pcDNA3.l-p50与 EGFP-N1共转染到T24细胞，具体操作参照说明书。
[004U五、qPCR检测转染后P50mRNA表达水平
[00创 将PCDNA3.l-p50与EGFP-N1共转染到T24细胞4她后，Trizol法提取总RNA，步 骤按照RNAisoPlus(TaKaRa)说明书进行。反转录后qPCR检测p50mRNA表达水平（见图1)。
[0043] 六、形态学观察
[0044] 重组质粒转入T24细胞2化及4她后显微镜（OLYMPUS1X71)观察细胞形态（见 图2)。
[0045] MTT检测转染后细胞活性
[0046] 转染2化后，对照组和处理组分别接种于96孔板中。每组设置3个复孔，继续培 养。培养2化后，弃去培养液，加入180yL新鲜培养基，再加入20yL5mg/mLMTT(终浓度 为0. 5mg/血)，继续培养化。待到时间后，终止培养，小屯、吸去孔内培养液，每孔加入150化 DMSO,摇床低速振摇lOmin，使藍紫色结晶充分溶解，在酶标仪490nm处读取吸光度值。处理 数据，计算己西苏木素对细胞的抑制率，绘制细胞生长曲线。每个样本均设置6个重复，取 平均值为最终结果（见图3)。
【主权项】
1. p50基因在制备抗癌药物中的应用；所述的p50基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1。 2. p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用；所述的p50基因，其核苷酸序列为SEQID NO:1〇
【专利摘要】本发明提供p50基因在制备抗癌药物中的应用，特别是p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。本发明通过构建p50基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明：转染后的肿瘤细胞中p50基因的mRNA显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性下降21.8％，最终出现死亡。本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。
【IPC分类】A61K48/00, A61P35/00
【公开号】CN104906596
【申请号】CN201510259320
【发明人】张婷婷, 张建珍, 任璐, 马恩波, 郑耀武, 任连生
【申请人】山西大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月20日
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