Actl6a基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用
Actl6a基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用
【技术领域】
[000。 本发明设及肝癌治疗领域，特别地，设及一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后 预防肝癌复发药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌化巧atocelluarCarcinoma,肥C)是一种严重威胁人类生命健康的常 见疾病，全世界每年约有超过700, 000人死于肥C，而中国每年新发病例约占全球总数的一 半。近年来随着诊断方法、手术技术和综合治疗手段的进步，为HCC的诊治提供了更多的选 择，使肥C的疗效得到了一定的提高。然而肥C是一种具有高度恶性生物学行为的肿瘤，极 易在早期发生侵袭、转移，大部分患者就诊时已到中晚期，失去了根治该疾病的机会，导致 总生存率仍不乐观，术后5年生存率徘徊在30%左右。因此有效控制肥C的侵袭和转移是 改善HCC患者治疗效果及获得长期生存的根本办法。
[0003] 近年来许多研究发现上皮性肿瘤细胞在侵袭转移过程中往往呈现出上皮细胞 表型丧失现象，从而使其获得间充质细胞表型的特点，该一现象称之为上皮-间质转变 巧pithelial-mesenchymaltransition,EMT)，EMT密切参与多种常见上皮性肿瘤的发生 发展。如最近研究通过微流体捕获技术发现乳腺癌患者血液中的癌细胞向间充质细胞表 型转变时，则提示复发、转移、治疗抵抗等现象发生。当癌细胞向上皮细胞表型转变（MET) 时，患者治疗转归逐渐好转，该一研究为EMT在肿瘤侵袭转移中所起作用提供了重要证据。 深入研究后发现，肿瘤侵袭转移级联反应的各步骤中均有EMT的参与，肿瘤细胞通过连续 的EMT-MET过程进行侵袭转移并最终在远处脏器形成新的转移灶。因此寻找能调控EMT与 HCC侵袭转移级联反应的基因，并根据其设计相应的祀向治疗药物，将为控制HCC的转移提 供有效的生物学治疗手段。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应 用，W解决现有技术中对于肝癌患者术后肝癌细胞容易在人体内侵袭转移导致癌细胞扩散 的技术问题。
[0005] 根据本发明的一个方面，提供了一种ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌 细胞侵袭转移的药物中的应用。
[0006] 进一步地，应用包括在慢病毒载体中敲除带有ACTL6A基因质粒的给药方式。
[0007] 进一步地，应用包括W电荷翻转载体为载体对肝癌肿瘤细胞核祀向给药的应用。
[0008] 进一步地，ACTL6A基因序列为序列表中a)~C)中的一种基因；a)序列表中SEQ IDNO. 1所示的基因序列；b)序列表中SEQIDNO. 2所示的基因序列；C)序列表中SEQID NO. 3所示的基因序列。
[0009] 进一步地，ACTL6A基因序列为序列表中SEQIDNO. 3所示的基因序列。
[0010] 根据本发明的另一方面还提供了一种药物组合物，包含敲除了表达ACTL6A基因 的慢病毒载体。
[0011] 根据本发明的另一方面还提供了一种药物组合物，ACTL6A基因与递送载体相连接 后用于药物组合物中。
[0012] 进一步地，载体为电荷翻转型药物载体。
[0013] 本发明具有W下有益效果：
[0014] 1.本发明提供通过实验发现ACTL6A基因编码的相应蛋白，在细胞核内存在高表 达时，患者术后癌症复发几率增高。通过已知各种给药方式，实现对ACTL6A基因编码的相 应蛋白的表达抑制，从而达到有效防止肝癌细胞术后在人体内的EMT作用，降低肝癌细胞 在体内的转移机会，从而提局患者术后的生存质量。
[0015] 2.本发明提供的ACTL6A基因的应用包括对肝癌的治疗或肝癌术后预防癌细胞在 人体内转移侵袭其他组织中的药物应用。
[0016] 3.本发明通过研究首次证实名为ACTL6A的基因在肝癌组织的核蛋白中存在高表 达，利用该基因的该一特性，可W用于制备检测潜在肝癌患者的试剂盒。
[0017] 除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。 下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
【附图说明】
[0018] 构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0019] 图1为ACTL6A基因在肝癌细胞和肝组织中的表达相关结果图；
[0020] 图2为ACTL6A高表达与肥C患者不良预后明显相关结果图；
[0021] 图3为细胞慢病毒转染效率验证相关结果图；
[0022] 图4为ACTL6A过表达/敲除效能验证相关结果图；
[0023] 图5为ACTL6A可在体外促进肝癌细胞的运动、侵袭和转移能力的相关结果图；
[0024] 图6为ACTL6A可在体内促进肝细胞癌生长及侵袭转移的相关结果图；
[00巧]图7为慢病毒转染敲除ACTL6A的质粒可抑制肝癌皮下瘤生长的相关结果图；W及
[0026] 图8为敲除ACTL6A可抑制肝癌原位瘤生长及侵袭转移的相关结果图。
【具体实施方式】
[0027]W下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可W由权利要求限定 和覆盖的多种不同方式实施。
[0028] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0029] 本文中设及到的百分号"％ "，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比， 除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时容量 的比例。
[0030] 本发明一方面提供了一种ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌细胞侵袭转 移的药物中的应用。
[0031]Actin-l;Lke6A(ACTL6A)是一种编码肌动蛋白相关蛋白（actin-related proteins，ARPs)的基因，基因定位于染色体3q26. 33。在哺乳动物中，ACTL6A主要具有调 节转录、胞核转移、染色质重构等重要功能。最新研究发现ACTL6A具有许多独特的特点，其 高表达能诱导上皮性细胞发生EMT并促进迁移、增殖，因此可能参与肿瘤的发生发展。我们 前期研究亦证实ACTL6A可能在肥C复发转移中发挥重要作用，针对ACTL6A设计抑制药物 将能很好的抑制肝癌的侵袭和转移。
[0032]肝癌细胞系（PLC/PRF5,SMMC7721，HepG2,Hep3B，Huh7,M肥C97-L]fflCC97-H， 肥化M3)上述是肝癌研究常用的肝癌细胞系名称，其中PLC/PRF5,化pG2,化p3B来源于美国 模式培养物保藏所，SMMC7721，Huh7,M肥C97-L]fflCC97-H，肥化M3来源于复旦大学肝癌研 究所。
[003引 ACTL6A基因的功能通过W下实验进行了验证：
[0034] 1.肝癌标本及临床资料收集
[00巧]随机捜集2006年1月至2009年12月间在湘雅医院手术切除，术后病理证实为肝 细胞癌，病例资料和随访资料及标本完整的病例100例。其中取小肝癌、孤立性大肝癌和结 节性肝癌冰冻标本各10例。肝癌组织切除后，立即切取黄豆粒大小的肝癌组织（T)和距离 肿瘤边缘1cm的邻近非肿瘤肝组织（ANLT)，将组织置于无菌离屯、管中，并立即于液氮中冻 存，然后转移至-80°C超低温冰箱（型号化ermo化rma905)。另切除带有癌旁肝组织的肝 癌标本，将之放入5%的福尔马林溶液中固定，再将肝癌组织标本依次置于50%己醇溶液、 75%己醇溶液、95%己醇溶液和无水己醇中各5分钟，进行梯度脱水后置于二甲苯中使肝 癌标本透明，将透明后的肝癌组织标本放入融化的石蜡中浸透。在包埋器中倒入融化的石 蜡，在石蜡凝固之前迅速将组织标本放入其中。石蜡凝固后将其切割成1cm3的方块。用切 片机切取4um的连续切片，用于免疫组织化学实验。
[0036] 详细收集上述100例患者的各项临床病理资料、手术资料及术后随访资料，如患 者性别、年龄、合并疾病、肝炎病史、有无肝硬化、肝功能化ild-化曲分级、凝血功能、血清 甲胎蛋白、肿瘤位置、手术方式、手术时间、止血方式、术中出血及输血量、术后并发症、围手 术期死亡、切除标本大小、肿块数目、有无包膜、血管浸润、病理类型、细胞分化程度及肿瘤 临床分期等。术后通过口诊复查、电话或面对面沟通的方式定期（前2年每3-6个月随访 1次，2年后每年随访1次）进行临床随访，建立完善的随访数据库。肝癌病人术后是否发 生复发转移则依据肝脏超声检查、CT、MRI、血清甲胎蛋白含量W及再次手术等方法确定。若 病人在此时间内发生死亡或者复发转移则作为随访的终止点；若患者未因肝癌死亡或者未 出现复发转移或因其他原因死亡者则作为删失数据。患者的生存时间为患者手术之日到患 者死亡的时间。患者的无瘤生存时间为患者手术之日起到出现复发转移的时间。
[0037] 2.巧光实时定量PCR与半定量RT-PCR
[0038] 细胞和新鲜冰冻组织RNA提取、测定及cDNA合成详见CelanoP等Celano P,VertinoPM,Casero民A Jr. Isolation of polyadenylated RNA from cultured cells and intact tissues. Biotechniques. 1993Jul ; 15 (1) : 26-8和Yang,L.Y.等Yang LY, Tao YM,Ou DP,et al. Increased expression of Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein 2correlated with poor prognosis of h邱atocellular carcinoma. Clin Cancer Res, 2006, 12:5673-5679.中公开的方法进行。
[0039] 实时定量PCR引物由上海生工生物技术公司设计并合成，引物的特异性和匹配性 经NCBI的Primer-BLAST验证。ACTL6A的正向引物序列为；5 '-GGTCGTTCTACTGGGCTGATT-3 '，ACTL6A的反向引物序列为；5' -AGCAAGAGGGGATTTCACAAT-3'，产物的大小为108bp。同 时应用人GAPDH(甘油醒-3磯 酸脱氨酶）基因来校正上样量差异，基因的正向引物序列 为；5, -agaaggctggggctcatttg-3,，反向引物序列为；5, -aggggccatccacagtcttc-3,，产 物的大小是258bp。将装有引物粉末的离屯、管在离屯、机上瞬时离屯、，加入无RNA酶水，弓I 物溶液的终浓度为30uM，于-20°C冰箱中储存。详细的实时定量PCR操作步骤及信使 RNA表达量测定见Wu,F.等WuF,YangLY,LiYF,etal.Novelroleforepidermal growthfactor-likedomainTinmetastasisofhumanhepatocellularcarcinoma. 化patology, 2009, 50:1839-1850。
[0040] 反转录聚合酶连反应的引物由上海生工生物技术公司设计，正向引物的序列为： 5 ' -CCAGGTCTCTATGGCAGTGTAA-3 '，反向引物序列为；5' -CGTAAGGTGACAAAAGGAAGGTA-3 '，产 物的大小为309bp，W上述人的GAPDH基因作为内参。将装有引物粉末的离屯、管在离屯、机上 瞬时离屯、，防止粉末飞扬，加入无RNA酶水，引物溶液的终浓度为10yM。详细RT-PCR操作 步骤及条带亮度值检测计算见Yang,L.Y.等（YangLY,TaoYM,0uDP,etal.Increased expressionofWiskott-Aldrichsyndromeproteinfamilyverprolin-homologons protein2correlatedwithpoorprognosisofhepatocellularcarcinoma.ClinCancer Res, 2006, 12:5673-5679。
[0041] 3.Western-blot
[0042]根据Yang,L.Y.等（YangLY,TaoYM,OuDP,etal.Increasedexpression ofWiskott-Aldrichsyndromeproteinfamilyverprolin-homologonsprotein 2correlatedwithpoorprognosisofhepatocellularcarcinoma.ClinCancer Res, 2006, 12:5673-5679.的描述提取细胞及新鲜冰冻组织的总蛋白及进行蛋白浓度测定， 并将目标蛋白稀释至浓度接近。
[0043] 根据Western-blot通用实验方法和自身实验要求进行了如下操作；配制12% 的聚丙締酷胺分离胶，配方为；6. 6ml的双蒸水，8. 0ml的30 %Acr-Bis，5. 0ml的1. 5M Tris(P服.8)，200y1的10%SDS，200y1的10%过硫酸锭和8y1的TEMED，将配好的分离 胶倒入夹好的两块玻璃板中并水封，待分离胶凝固后将上层水封倒掉，配制5%的浓缩胶， 配方为；3. 4ml的双蒸水，830y1 的 30%Acr-Bis，630y1 的 1. 5MTris(p服.8)，50y1 的 10%SDS，50y1的10%过硫酸锭和5y1的TEMED，将配制好成层胶缓慢倒入玻璃板中，倒 满后将梳子插入其中。将所提取的总蛋白和5XLoddingBuffer按4:1的比例混合，在沸水 中煮大约10分钟，然后将蛋白取出放在常温中冷却，蛋白冷却到大约60°C时，W120(K)巧m 的速度离屯、10分钟。将已经凝固好的丙締酷胺凝胶放到电泳槽中，把齿梳拔掉后相应孔 中添加Sul的蛋白Marker(Thermo,Waltham，CA)或蛋白样品，将miniProteanTetra Systerm小型垂直电泳系统炬lO-RAD，Hercules,CA)的电压设置为80V，当看到藍色指示线 到达折线W下的时候把电压调到120V，当藍色指示线到达绿线W下的时候停止电泳，把玻 璃板拿出来后用自来水冲洗一下，把两块玻璃板分离开来，取出凝胶放到盛有转膜缓冲液 的搪瓷盘中，在转膜夹板的无色透明一边放上一层海绵，然后依次放3层滤纸，甲醇浸透的 PVDF膜（Roche,化ankfud，Germany)，凝胶，再放3层滤纸和1层海绵，然后将合起的夹板 放入转膜电泳槽中，并将电泳槽中倒满转膜缓冲液，注意转膜夹板无色透明一边朝向正极， 黑色一边朝向负极，将转膜电泳槽放入冰盒中并连接电泳仪（六一，北京，中国），在200mA恒流的条件下转膜2小时。2小时过后，拆开夹板拿出PVDF膜，用磯酸盐缓冲液冲洗掉转膜 缓冲液，7%的封闭液中浸泡40分钟，封闭完成后用PBS-T溶液（1LPBS溶液中加入1ml的 Tween-20)洗净封闭液，用一抗稀释液（LEAGE肥，北京，中国）按需要的比例与一抗混合，把 PVDF膜放入其中，然后放到冷柜中14小时。第二天将PVDF膜从一抗溶液中取出，PBS-T溶 液洗S次每次3分钟，然后将PVDF膜放入适当稀释的二抗溶液中，室温下放置30-60分钟， 然后用PBS-T溶液洗S次每次10分钟洗净残余二抗。将PVDF膜放入盛有WesternBri曲tTM E化-sparyWesternblotingdetectionsystem显影剂（ADBANSTA，MenloPark,CA)无 色透明盘中，将透明盘放入BID-RADchemiDOCTMMP凝胶成像系统中炬lO-RAD，Hercules, CA)，在ImageLabTM软件中选择蛋白质印迹并自动成像，成像后将所成的相片导出，利用 ImageJ软件计算出各条带的灰度值，进行统计学分析。
[0044] 本实验所用的一抗为兔抗人ACTL6A蛋白（47kDa)单克隆抗体（Abeam， Massachusetts，USA)，鼠抗人P-Actin蛋白（42kDa)单克隆抗体（Sigma,Missouri,USA), 本实验所用的二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白抗体（中杉金桥，北京， 中国）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠免疫球蛋白抗体（中杉金桥，北京，中国）。
[0045] 4.免疫组织化学染色
[004引免疫组织化学法详见化ng,K.J.等（YongKJ,GaoC,LimJS,et al.OncofetalgeneSALL4inaggressivehepatocellularcarcinoma.NEnglJ Med, 2013, 368:2266-2276.)的描述。ACTL6A染色主要定位于细胞核，其阳性染色定义为 细胞核内的栋黄色颗粒样染色，免疫组织化学各标本染色程度的评级依据化ng，K.J.等描 述。按着色细胞数目多少的评分标准为；没有细胞染色记为0分，小于1/3的细胞染色记为 1分，小于2/3的细胞染色记为2分，大部分细胞染色记为3分。着色强度的评分标准为；0 分为阳性染色细胞数目少于5%，1分为阳性染色细胞数目为5-30%，2分为阳性染色细胞 数目为31-50%，3分为阳性染色细胞数目为51-80%，4分为阳性染色细胞数目大于80%。 将0-1分作为ACTL6A低表达组，2-4分作为ACTL6A高表达组进行统计分析。
[0047] 5.细胞培养及构建ACTL6A过表达和敲除质粒的慢病毒转染肝癌细胞株
[0048] 实验选取ACTL6A内源性低表达的化C/PR巧细胞和ACTL6A内源性高表达的化p3B 细胞进行研究。细胞复苏、传代和冻存按细胞培养说明常规进行。ACTL6A内源性低表达的 PLC/PR巧细胞拟进行ACTL6A全长质粒慢病毒转染构建化C/PRF5过表达ACTL6A细胞和相 应的化C/PR巧对照组细胞；ACTL6A内源性高表达的化p3B细胞拟进行ACTL6A的shRNA敲 除质粒慢病毒转染构建化p3B敲除ACTL6A细胞和相应的化p3B对照组细胞。质粒的慢病 毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司（上海，中国）构建，具体转染操作步骤根据吉凯 公司的protocol进行。
[0049] 慢病毒过表达质粒载体；GV287,元件顺序：化i-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位 点；AgelAgel，过表达引物序列 5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGAGCGGCGGCGTGTA CG-3'。
[0050]慢病毒shRNA敲除质粒载体；GV248,元件顺序；hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-p uromycin(hU6启动子-多克隆位点-泛素-绿巧光蛋白-内部核糖体进入位点-嚷岭霉 素），采用上述方法共构建ACTL6AshRNA序列3条；
[0051]ACTL6A-RNAi(26882-1) ;5, -TCCAAGTATGCGGTTGAAA-3' 为所附序列表中SEQID NO. 1所不的基因序列；
[0052]ACTL6A-RNAi(26883-1) ;5' -GTACTTCAAGTGTCAGATT-3'，为b)序列表中SEQID NO. 2所不的基因序列；
[0053]ACTL6A-RNAi(26884-l) ;5, -GGGATAGTTTCCAAGCTAT-3,为序列表中SEQIDNO. 3 所示的基因序列。通过后续实验发现，上述S条序列的ACTL6A基因对于肝癌均具有较优的 治疗效果和术后预防复发或转移效果。
[0054] 慢病毒质粒转染效率经镜下巧光观察，过表达/敲除效能分别提取RNA和蛋白经 实时定量PCR和Western-blot检测验证，PCR引物见前文所述。细胞转染成功后进行常规 培养、保种并进行后续的体内外功能学实验。
[005引 6.体外功能学实验
[0056] 6. 1细胞骨架免疫巧光染色
[0057] 细胞骨架免疫巧光实验参照Abeam公司的protocol说明进行，简要步骤如下；（1) 实验前将盖玻片放于75%的酒精中浸泡24小时，紫外线照射30分钟。（2)将盖玻片用无 菌PBS溶液清洗干净，在六孔板每孔放入一个盖玻片并加入2ml不完全细胞培基。（3)吸取 约IX105个细胞加入到六孔板各孔中，在培养箱中放置24小时。（4)24小时后，吸掉培基 后用PBS溶液清洗细胞两次，各孔分别加入1ml4%多聚甲醒固定并静置15分钟。（5)冰 PBS溶液洗漆3次，然后在每个孔中加入1ml0.25%TritonX-100,10分钟后吸掉。化)PBS 溶液洗漆3次，滴加1滴的5yg/ml的罗丹明鬼笔环肤（Sigma,StLouis,M0)在玻片上，在 避光的条件下染色30分钟。（7)DAPI染细胞核15秒，PBS溶液洗漆3次。（8)滴加防巧光 泽灭液并盖上盖玻片，在巧光正置显微镜下察看标本并扫描图 像。
[0058] 6. 2划痕愈合实验
[0059]细胞划痕实验参照Xu,J.等狂UJ，LiX，YangH，etal.SINlpromotes invasionandmetastasisofhepatocellularcarcinomabyfacilitating epithelial-mesenchymaltransition.Cancer, 2013, 119:2247-2257.的实验方法进行，并 根据实验要求进行了相应的调整，简要步骤如下；（1)细胞进入对数生长期后，消化、稀释 并计数，吸取约5X105个细胞加入到无菌六孔培养板中（NEST，无锡，中国），然后将其放置 在细胞培养箱中，当达到90%的细胞覆盖率时开展划痕实验。（2)将培养皿中的培基完全 吸掉后，用Tip头在培养皿中轻轻的快速划痕，注意不要划伤底部，然后用PBS缓冲液清洗 细胞数次，最后加入2ml细胞完全培养基。（3)将培养板放于倒置显微镜下观察并拍照，24 小时和48小时再次观察并拍照。根据两组细胞划痕的愈合率来进行统计分析。
[0060] 6. 3Transwell小室侵袭实验
[0061]侵袭小室实验参照Xu,J.等（XuJ,LiX,YangH,etal.SINlpromotes invasionandmetastasisofhepatocellularcarcinomabyfacilitating epithelial-mesenchymaltransition.Cancer, 2013, 119:2247-2257.)的实验方法进行， 简要步骤如下；（1)将Matrigel胶炬D，RranklinLakes，NJ)放于冰上缓慢融化，Matrigel 胶和PBS溶液按1:4混合，将20y1稀释后的Matrigel胶加入到Transwell板（Corning， NY，USA)的上室中，轻轻摇匀后放到细胞培养箱中培养24小时。（2)在下室中加入600 的完全培养基，并把Transwell小室放于其中，然后将培养板放于细胞培养箱中水化15分 钟。（3)在Transwell小室中加入2X105个细胞并添加200y1不含胎牛血清的细胞培养 基，在细胞培养箱中放置24小时。（4) 24小时后用棉团把上室内部的细胞和培养基擦掉，然 后放在冰甲醇中浸没10分钟。（5)将Tranwell小室倒扣在桌面上并在上面滴一滴结晶紫 溶液，染色15分钟。（6)15分钟后用蒸馈水洗掉结晶紫溶液，干燥后放于倒置显微镜下观 察。（7)在100倍显微镜下计数各组穿过的细胞数目，进行统计分析。7.裸鼠体内成瘤实 验
[0062] 7. 1裸鼠肝癌细胞皮下成瘤实验
[0063] BALB/c免疫缺陷鼠购买自长沙景达实验动物公司，并在中南大学动物学部SPF级 动物实验室中喂养。参照Yang, H.等（Yang H, Fang F, Qiang R, Yang L. MicroRNA-14〇-5p suppresses tumor growth and metastasis by targeting transforming growth factor beta receptor land fibroblast growth factor 9in hepatocellular carcinoma. 舶patology，2013, 58:205-217.)等的试验方法进行如下操作：将状态良好的细胞用膜酶 消化下来后用生理盐水制成悬浮液，并将细胞的浓度调整至SXloVml。裸鼠皮下瘤采取 皮下注射肿瘤细胞方法成瘤，注射部位选取左腹股沟，注射量为0. 1ml(约5 X 106细胞）， 接种时由裸鼠体侧腰部稍靠下的部位进针，要保证与接种点的距离小于针头的长度，向尾 部方穿行，绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层，当针头到达接种位点时注射，可看到鼓起的 小包，退出针头。从第二天开始通过每天测量皮下瘤的长径和短径来比较两组皮下瘤生长 速度的差异；一个月后待皮下瘤长到一定体积，将裸鼠用颈椎脱位法处死，取出皮下瘤并拍 照，用游标卡尺测量皮下瘤的长径和短径。皮下瘤体积的计算公式为：体积（皿3)=(长径 (mm) X短径（mm)2)/2。
[0064] 7. 2裸鼠肝癌细胞肝脏原位成瘤实验
[0065]原位成瘤实验方法参照Yang,H.等（YangH,FangF,ChangR,Yang L.MicroRNA-14〇-5psuppressestumorgrowthandmetastasisbytargeting transforminggrowthfactorbetareceptorlandfibroblastgrowthfactor9in hepatocellularcarcinoma.化patology, 2013, 58:205-217.的方法。将 7. 1 的皮下瘤分组 取出后生理盐水浸泡，用手术刀片切割成约1mm3的小块。采用10%水合氯醒腹腔注射麻醉， 每只裸鼠约注射60y1。麻醉后，用舰伏棉球擦拭消毒裸鼠胸腹部3次，切开剑突左侧皮肤， 再横向剪开腹壁肌层及腹膜层，显露肝脏，眼科剪将左肝被膜剪开，将皮下瘤小块塞入肝被 膜下，并用明胶海绵压迫止血，缝线关闭腹腔。种植2个月后，将裸鼠用颈椎脱位法处死，完 整取出裸鼠的肝脏和肺脏，将裸鼠的肝脏分组观察并拍照，并观察有无肉眼可见转移灶。然 后采用4%甲醒浸泡所取下来的肝脏和肺脏。将裸鼠肝脏和肺脏石蜡包埋后，用切片机切成 厚度约4ym的切片，肥染色后显微镜下观察裸鼠肝脏和肺脏内的有无转移灶。
[0066] 上述各实验的实验结果及其分析如下：
[0067] 1.ACTL6A信使RNA和蛋白在肝癌细胞和肝癌组织中呈显著高表达，且与侵袭转移 潜能密切相关。
[0068] 首先采用实时定量PCR方法检测ACTL6A在肥C细胞系中ACTL6A信使RNA的表达， 结果发现ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系中表达较L02细胞中表达明显增高；且其在高侵袭 转移能力的肝癌细胞系HCXLM3、M肥C97-H等中的表达水平也明显高于低侵袭转移能力的 肝癌细胞系SMMC772UPLC/PRF5等，RT-PCR检测也得到了一致的结果，由此可见ACTL6A与 肝癌细胞系的侵袭转移能力关系密切。同时，我们采用Western-bolt方法检测ACTL6A蛋白 在肝癌细胞系中的表达，与实时定量PCR结果完全一致，详见图1A1，A2，D1。图1中的A1: 实时定量PCR(实时定量巧光PCR，简称实时定量PCR)显示ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系 (PLC/PRF5,SMMC7721，HepG2,Hep3B，Huh7,M肥C97-L]fflCC97-H，肥化M3)中较L02 细胞相 对高表达。参见图1中的A2，RT-PCR同样显示ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系中表达较L02 中的表达增高，且在高转移潜能的细胞系化p3B，M肥C97-H，肥化M3中表达较低转移潜能细 胞系化C/PRF5，SMMC7721，化pG2中的高；图1中的DlWestern-blot(蛋白质印记法）显示 ACTL6A基因的蛋白表达在各肝癌细胞系中的表达较L02细胞中的高。
[0069] 接着我们检测ACTL6A在新鲜冰冻的肝癌组织（T)及配对的邻近非肿瘤正常肝组 织（ANLT)中的表达，实时定量PCR检测发现ACTL6A信使RNA在肝癌组织中较邻近非肿瘤 正常肝组织中表达明显增高，Western-bolt检测发现ACTL6A蛋白表达在肝癌组织中亦明 显较邻近非肿瘤正常肝组织中表达增高，详见图1B1，B2，D2。图1中的B1 ;实时定量PCR显 示ACTL6A信使RNA在30对肝癌组织（T)中的表达较配对的邻近非肿瘤肝组织（ANLT)中 表达明显增高；图1中的B2 ;RT-PCR检测结果显示肝血管瘤肝组织（L495)与4对肝癌组织 (T)和与T配对的邻近非肿瘤肝组织（ANLT)中ACTL6A信使RNA在肝癌组织中的表达较肝 组织及配对的ANLT中的表达明显增高；图1中的D2显示肝癌组织中ACTL6A基因的蛋白表 达较肝组织及与肝组织配对的ANLT中的表达明显增高。
[0070] 同时，根据不同临床类型的肝癌进行ACTL6A的检测，发现结节性肝癌中ACTL6A信 使RNA的表达水平明显高于孤立性大肝癌和小肝癌，详见图1C。图1中C;实时定量PCR显 示ACTL6A信使RNA的表达在结节性肝癌中较该基因在孤立性大肝癌和小肝癌中的表达均 明显增高。
[0071] 2.ACTL6A高表达与不良临床病理特征及预后密切相关
[007引进一步采用免疫组化法检测肥C组织中ACTL6A蛋白的表达，结果显示，ACTL6A蛋 白在肥C组织中高表达，而癌旁肝组织中则未见明显表达，详见图2A1。参见图2A1可见免 疫组化染色显示ACTL6A信使RNA在肝癌组织中表达明显高于相应癌旁肝组织。
[007引进一步分层研究我们发现小肝癌组和孤立性大肝癌组ACTL6A的高表达率相近， 但二者均显著低于结节性肝癌组，详见图2A2。图2A2 ;免疫组化染色显示ACTL6A在邻近非 肿瘤肝组织、无转移肝癌组织和有转移肝癌组织中表达呈现逐渐增高趋势。
[0074] 统计分析ACTL6A的高低表达与肥C患者临床病理特征的关系发现其与患者血清 甲胎蛋白水平，肿瘤结节数目，肿瘤包膜，Edmondson-Steiner分级，静脉浸润，TOM分期和 复发明显相关，详见表1。
[007引表1.ACTL6A表达水平与肝癌临床病理特征的相关性 [0076]
[0078] 注：不包括肝功能分级为化ild-化曲C级的患者。P< 0. 05结果有显著性差异。 ACTL6A低表达定义为：免疫组化评分为0-1 ;ACTL6A高表达定义为：免疫组化评分为2~ 4。
[0079] 生存分析发现ACTL6A高表达肥C患者的总生存时间及无瘤生存时间均明显短于 ACTL6A低表达者（详见图2BLB2)，且根据不同临床类型的肝癌分层分析发现ACTL6A高表 达小肝癌、孤立性大肝癌和结节性肝癌患者的总生存时间及无瘤生存时间均分别明显短于 ACTL6A低表达者（详见图 2(：1，〔2,01，02,61，62)。图281;1(3口1311-1116161'法绘制的1(-111曲 线生存分析显示ACTL6A高表达肝癌患者的总生存时间明显短于低表达的患者，图2B2显示 ACTL6A高表达肝癌患者的无瘤生存时间也明显短于低表达患者。参见图2中的C1和C2 ; 根据肝癌临床类型分层分析显示ACTL6A高表达的小肝癌患者总生存时间（C1)和无瘤生存 时间（C2)明显短于低表达患者。图2中D 1和D2图；ACTL6A高表达的孤立性大肝癌患者 总生存时间值1)和无瘤生存时间值2)明显短于低表达患者；图2中E1和E2 ;ACTL6A高表 达的结节性肝癌患者总生存时间巧1)和无瘤生存时间巧2)亦明显短于低表达患者。
[0080] 单多因素Cox比例风险回归模型分析发现ACTL6A的高表达是肥C总生存时间和 无瘤生存时间的独立危险预后因素，详见表2,表3。
[0081] 表2.肝癌总生存率的单因素及多因素COX回归分析
[0082]
[0084]P< 0. 05结果有显著性差异。皿，风险比；CI，可信区间。
[0085] 表3.肝癌无瘤生存率的单因素及多因素COX回归分析
[0086]
[0088] P< 0. 05结果有显著性差异。
[0089] 综合免疫组化与临床病理特征及预后的研究，提示ACTL6A高表达是肝细胞癌不 良临床类型及不良预后的重要标志，其可能促进肝癌袭转移及复发。
[0090] 3.体外实验中ACTL6A过表达可促进肝癌细胞侵袭转移，敲除ACTL6A可抑制肝癌 细胞侵袭转移
[0091] 为研究ACTL6A如何调控肝癌侵袭转移，首先根据ACTL6A表达水平不同，选择 ACTL6A低表达的化C/PR巧细胞系进行ACTL6A质粒过表达慢病毒转染，构建ACTL6A过表达 的化C/PR巧细胞株；选择ACTL6A高表达的化p3B细胞系进行ACTL6A短发夹RNA敲除质粒 慢病毒转染，构建ACTL6A低表达的化p3B细胞株；同时分别构建相应的空质粒病毒转染株 做为对照组，详见图3。图3中可见巧光显微镜拍照可见ACTL6A过表达和ACTL6A敲除的3 个序列（ACTL6A-敲除-1、ACTL6A-敲除-2和ACTL6A-敲除-3)相比肝癌细胞转染效率均 高于70%。
[0092] 转染效率经实时定量PCR和Western-blot验证发现化C/PRF5过表达ACTL6A细 胞较化C/PR巧对照组细胞的ACTL6A信使RNA和ACTL6A蛋白表达增高2倍W上；而敲除序 列经实时定量PCR和Western-blot验证发现SMCTL6A-3的效率最高，因此选择该序列进 行下一步实验，详见图4。参见图4中的A图为实时定量PCR证实化C/PRF5过表达ACTL6A 细胞的ACTL6A信使RNA表达量较对照组化C/PR巧对照组细胞超出2倍W上。参见图4中 的B图实时定量PCR验证各敲除序列的化p3B敲除ACTL6A细胞与对照组化p3B对照组细 胞中ACTL6A信使RNA表达量的差异，其中Hep3B敲除ACTL6A-3细胞敲除效率最高。参见 图4中的C图通过Western-blot验证ACTL6A蛋白在各不同转染处理的细胞中表达情况，结 果与实时定量PCR-致，后续体内外功能学实验选取化C/PR巧过表达ACTL6A细胞和化p3B 敲除ACTL6A-3细胞及相应对照组进行研究。
[0093]构建的细胞株分别进行细胞骨架免疫巧光实验、划痕愈合实验和transwell侵袭 小室实验W检测ACTL6A过表达/敲除对细胞运动、迁移和侵袭能力的影响。
[0094]采用了罗丹明鬼笔环肤标记肝癌细胞的肌动蛋白W此观察细胞骨架形态，对比PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞和化C/PR巧对照组细胞骨架形态的差异。在400倍巧光正置 显微镜下看W清楚地观察到相较于化C/PR巧对照组细胞，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞骨 架亮度更强，细胞的形态舒展呈狭长型，并伸出更多的伪足，说明细胞运动性增强。而对比 Ifep3B敲除ACTL6A细胞和化p3B对照组细胞，发现化p3B敲除ACTL6A细胞形态较化p3B对 照组细胞呈卵圆形，伪足等明显减少，说明细胞运动性可能降低，详见图5A1，A2。参见图5 中的A1和A2 ;细胞骨架免疫巧光实验显示过表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A 细胞形态较对照组化C/PR巧对照组明显变得舒展、细长，并有小伪足（A1);敲除ACTL6A的 Ifep3B敲除ACTL6A细胞形态较对照组化p3B对照组细胞明显呈鶴卵石样改变，细胞纤维丝 减少、密度降低，突触减少（A2)。 细胞划痕愈合实验则显示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于化C/PR巧对照组细胞 的愈合能力明显增强，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显增加，提示转染后细胞运 动、迁移能力明显增加，详见图5B1，B2。参见图5中的图B1和图B2 ;划痕愈合实验显示过 表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞迁移能力较化C/PR巧对照组细胞明显增 强。而化p3B敲除ACTL6A细胞的愈合能力较化p3B对照组细胞明显减弱，24小时及48小 时划痕的愈合面积均明显减少，提示提示敲除ACTL6A后细胞运动、迁移能力明显减弱，详 见图5CLC2。参见图5中的图C1和图C2;敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞迁移能 力较化p3B对照组细胞明显减弱。
[0095]细胞划痕愈合实验则显示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于化C/PR巧对照组 细胞的愈合能力明显增强，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显增加，提示转染后细胞 运动、迁移能力明显增加，详见图5B1，B2。参见图5中的图B1和图B2 ;划痕愈合实验显示 过表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞迁移能力较化C/PR巧对照组细胞明显 增强。而化p3B敲除ACTL6A细胞的愈合能力较化p3B对照组细胞明显减弱，24小时及48 小时划痕的愈合面积均明显减少，提不提不献除ACTL6A后细胞运动、迁移能力明显减弱， 详见图5CLC2。参见图5中的图C1和图C2 ;敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞迁移 能力较化p3B对照组细胞明显减弱。
[0096]Transwell侵袭小室实验表明化C/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于化C/PR巧对照 组细胞的侵袭能力明显增加，结果如图5D1-D2所示。参见图5中的D1和D2 ;Transwell侵 袭小室实验显示过表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞侵袭能力较化C/PRF5 对照组细胞明显增强；敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞侵袭能力较化p3B对照组细 胞明显减弱。说明24小时化C/PRF5过表达ACTL6A细胞穿过小室的数目要明显多于化C/ PR巧对照组细胞，提示转染ACTL6A后细胞的侵袭能力明显增强。而化p3B敲除ACTL6A细 胞的侵袭能力较化p3B对照组细胞明显减弱，如图抓1-D2所示，24小时化p3B敲除ACTL6A 细胞穿过小室的数目要明显少于化p3B对照组细胞，提示敲除ACTL6A后细胞的侵袭能力明 显减弱。
[0097] 综合细胞骨架免疫巧光、划痕愈合和Transwell侵袭小室实验结果，说明ACTL6A过表达能明显促进肝癌细胞的运动、迁移和侵袭能力，而敲除ACTL6A能减弱肝癌细胞的运 动、迁移和侵袭能力。
[0098] 4.裸鼠体内实验ACTL6A过表达可促进肝癌细胞生长和转移
[0099] 将化C/PRF5过表达ACTL6A细胞和化C/PR巧对照组细胞分别注射到裸鼠左腹股 沟皮下，每组各6只，一个月后将裸鼠处死，取出皮下瘤拍照并测量皮下瘤体积，结果列于 图6中的A1~A3中。参见图6中的A1图~A3图；裸鼠皮下成瘤实验显示化C/PRF5过表 达ACTL6A细胞皮下瘤明显较对照组化C/PR巧对照组细胞皮下瘤体积大（A1图，A2图）； 皮下瘤生长曲线亦提示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞皮下瘤形成速度快于化C/PR巧对照 组细胞（A3图）。如图6A1~A2显示，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞组所行成的皮下瘤体 积明显大于化C/PR巧对照组细胞所形成的皮下瘤体积。如图6A3所示，PLC/PR巧过表达 ACTL6A细胞组皮下瘤的生长曲线也明显快于LC/PRF5K°ntMi细胞组。
[0100] 进一步的肝脏原位种植成瘤实验中将各组皮下瘤切成约1皿3的小块后种植于裸 鼠肝被膜下，1个月后分别比较各组原位肝肿瘤体积的差异，结果列于图6中的B1~B3中。 参见图6中的B1~B3图：裸鼠肝脏原位成瘤实验显示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞肝脏 原位成瘤体积明显较对照组化C/PR巧对照组细胞原位瘤体积大，且差异有统计学意义；肝 脏原位瘤免疫组织化学提示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞原位瘤内ACTL6A呈细胞核内高 表达，而对照组化C/PR巧对照组内低表达炬3)。如图她1-B3,结果显示化C/PRF5过表达 ACTL6A细胞组所行成的肝脏肿瘤体积明显大于化C/PR巧对照组细胞所形成的肝脏肿瘤。 皮下成瘤及原位成瘤的实验结果充分证明，在肝癌细胞中过表达ACTL6A在体内同样可W 明显提高肝癌的生长能力。在获取肝脏原位肿瘤标本的同时，我们也检测了肿瘤的肝内转 移和肺转移情况，结果列于图6中的C1和C2 W及D1和D2中。参见图6中的C1和C2 ;肝 脏原位成瘤照片显示ACTL6A高表达的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞构建的原位瘤较化C/ PR巧对照组细胞易发生肝内转移；参见图6中的D1和D2;肺切片肥染色显示ACTL6A高表 达的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞较化C/PR巧对照组细胞构建的肝癌原位瘤容易发生肺 转移。如图6C1-C2，D1-D2所示，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞的肝内转移和肺转移明显高 于化C/PR巧对照组细胞组，提示过表达ACTL6A能在体内促进肝癌的侵袭和转移，该一研究 结果进一步提示ACTL6A可能成为治疗肝癌侵袭转移的重要生物祀点。
[010。 由W上实验结果及其分析可知ACTL6A在肝癌细胞系和肝癌组织中的高表达情况 及与侵袭转移潜能相关；临床病理特征及生存分析发现ACTL6A高表达患者具有不良临床 病理因素及不良生存时间和预后；细胞功能学实验亦提示了ACTL6A高表达可促进肝癌细 胞运动、迁移、侵袭和转移潜能，抑制ACTL6A可抑制肝癌细胞运动、侵袭和转移潜能。体内 实验亦证实过表达ACTL6A能促进肝癌生长。因此，ACTL6A可作为肝癌生物祀向治疗的一 个重要祀点。我们设计不同祀向给药系统进行实验，W了解祀向抑制ACTL6A治疗肝癌的潜 能。可将该基因通过基因给药的方式，调节该基因控制的蛋白在细胞核内的表达量，从而控 制患者的预后情况，防止肝癌细胞发生EMT-MET过程导致转移。显然此处的给药方式可W 为各种可W控制细胞核中相关蛋白表达量的给药方式。举例来说可W为祀向敲除ACTL6A 质粒可W经慢病毒载体包装后进行静脉注射给药，或经电荷翻转型药物载体将药物 输送到 细胞核中。优选采用上述两种方法给药。采用上述两种方法给药可W提高受体对药物的敏 感性，保证疗效。尤其优选为经电荷翻转型药物载体将药物输送到细胞核中。由于该给药方 法为将该基因直接携带至细胞核中ACTL6A基因处给药，药效持久可W避免耐药性的发生。
[0102] 本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该药物组合物主要作用为通过向癌细 胞核给药，从而抑制由ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式并不限于 W下两种，也可W为其他能实现输送作用的给药方式。优选该药物组合物中包含敲除了表 达ACTL6A基因的慢病毒载体。
[0103] 具体给药方式说明如下：
[0104] 1.慢病毒shRNA敲除ACTL6A质粒载体尾静脉注射给药。
[0105]载体；GV248,元件顺序；hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，敲除序列 5'-GGGATAGTTTCCAAGCTAT-3'。SMCTL6A质粒经慢病毒转染后进入宿主细胞，在宿主细胞内 经转录翻译，抑制ACTL6A蛋白的表达，从而在体内发挥作用。该方法在最近如Ambrogio, C. 等（Lentiviral-based approach for the validation of cancer therapeutic targets in vivo. Biotechniques，2014, 57(4):179, 181-187)的研究中被采用静脉注射法进行体 内实验，获得了良好的体内治疗效果。慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒，经改造的慢 病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。慢病毒载体可W将外源基因或外源的 ShRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方 面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、屯、肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的 细胞。使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的ShRNA的转导效率，且目的基因或目的 ShRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的 ShRNA的长期、稳定表达，从而达到良好的基因治疗效果。因慢病毒作用时间长且滴度稳定， 裸鼠成瘤一般在1-2个月W内，因此可在成瘤周期的第一周内仅注射一次即可。
[0106] 给药方法；裸鼠尾静脉注射方法；1.使用尾静脉注射架将裸鼠固定好，将尾己拉 直，綱紧；2.用酒精棉球擦拭尾己，使血管扩张，有利于注射，注射状态为尾己发白，紧靠白 色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉；3.用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾 己固定；4.注射时左手化尾，使尾己紧贴桌面，一般选择距裸鼠尾尖1/4或1/3处进针，使 用1ml膜岛素注射器注射，进针时针头与桌面平行，针尖稍稍朝下，从中指及无名指与拇指 接触处稍上方进针点针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，推 注时无阻力则成功。
[0107] 由上可见，采用上述敲除质粒方法给药时ACTL6A基因序列为序列表中SEQ ID NO. 3所不的基因序列疗效最优。其他a)序列表中SEQ ID NO. 1所不的基因序列；b)序列 表中SEQ ID NO. 2所示的基因序列；虽然也对肝癌有疗效，但效果相较该基因序列稍微差一 些。
[010引本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该药物组合物主要作用为通过向癌细 胞核给药，从而抑制由ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式并不限于W下两种，也可W为其他能实现输送作用的给药方式。优选该药物组合物中所述SMCTL6A 与递送载体相连接后用于所述药物组合物中。
[0109] 2.经电荷翻转型药物载体给药
[0110] 阳离子聚合物如聚己締亚胺（polyet的leneimine，阳I)和聚L赖氨酸 (pol^ysine，化L)W及聚酷胺胺（PAMAM)树枝状大分子等被广泛地用来作为基因载体。实 验表明它们能够进入细胞核内，也能够将生物活性物质输送到细胞核中。然而，该些带正电 荷的聚合物会被网状内皮系统（reticuloendothelialsystem,RE巧识别而很快被清除出 血液循环系统，因此，理想的方法是对该些阳离子聚合物进行可逆修饰，使其在血液中带负 电荷，W抑制它们与正常细胞和组织的作用，而到达肿瘤组织或癌细胞内后去掉该些修饰 而再生原来的阳离子聚合物，重新获得细胞核定位的能力。实体瘤组织间液和细胞的溶酶 体呈酸性，因此可W应用肿瘤组织和细胞中的酸性环境作为信号来触发阳离子保护基团的 离去。根据癌组织内容易产生代谢性酸中毒导致肿瘤细胞内PH低于7. 4,因此有关利用 pH响应的载体输送抗癌药物已有大量的报道。该些高分子载体能够在细胞间质和溶酶体的 酸性抑刺激下将药物释放在细胞间隙或溶酶体中，但是无法将药物输送至细胞核中。駿基 酷胺基团具有在酸性条件下自催化水解的性质。因此申有青（电荷翻转型药物载体用于肿 瘤细胞核祀向药物输送的研究。高分子通报，2010,（12):22-29。）等设计了对胺基进行可 逆保护，用1，2环己二酸酢与聚己内醋-聚己締亚胺的嵌段共聚物（P化bPEI)的阳I段反 应，将阳I的胺基酷胺化为駿基酷胺，得到带负电荷的酷胺化PEI(PEI/amide)。根据该一理 论将祀向敲除SMCTL6A治疗进一步引入到阳I/amide上。在正常生理条件下，双亲性的 P化阳I/amide-sMCTL6A自组装成为带负电的纳米颗粒；在抑小于6时，駿基酷胺基团自 催化水解，重新生成胺基，使得载体带正电荷。而在肿瘤组织、内涵体或溶酶体中显正电性， 使纳米颗粒在细胞内能够成功地实现电荷翻转。根据该一研究得到了得到不同结构的駿基 酷胺化的化L使原来阳离子聚合物化L呈负电性，避免了伯胺基团带来的系统生物毒性。
[0111] 因此，DNA毒化物类抗癌药物可经静脉注射或口服吸收入血被直接输送到它们在 细胞核中的祀点周围，避开了癌细胞在细胞膜和细胞浆中多种药耐药机制，大大提高了药 物的利用度及疗效。因此，可W利用电荷翻转载体进行肿瘤细胞核祀向SMCTL6A给药。W ACTL6A-RNAi(26884-1)为祀序列，按照短发夹RNA设计原理，构建得到的ACTL6A短发夹 RNA质粒。
[0112] 实施例 [011引实施例1
[0114]将化區病毒为载体，敲除质粒中的ACTL6A后进行动物体给药过程及结果如下；
[01巧]将Ifep3B敲除ACTL6A细胞和H巧3B对照组细胞分别约5X106个/只注射到裸鼠 左腹股沟皮下组织后，所得结果列于图7A中。参见图7中的A图：裸鼠皮下成瘤实验显示 敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞皮下瘤明显较对照组化p3B对照组细胞皮下成瘤体 积小。而如图7A显示，化p3B敲除ACTL6A细胞组所行成的皮下瘤体积明显小于化p3B对 照组细胞所形成的皮下瘤体积，进行体积的测量后成组比较亦得出类似结果，所得结果列 于图7B中。参见图7中的B图；统计分析两组皮下瘤大小可见化p3B敲除ACTL6A细胞皮 下瘤明显较对照组化p3B对照组细胞皮下成瘤体积小有统计学差异。
[011引实施例2
[0117]将经电荷翻转型药物载体P化阳I/amide作为载体携带SMCTL6A后进行动物体 给药后，实验过程及所得结果如下：
[0118]肝脏原位种植成瘤实验所得结果如图8中的A图和B图所示，参见图8中的A图； 肝脏原位成瘤图片显示化p3B敲除ACTL6A细胞肝脏原位成瘤体积明显较对照组化p3B对 照组细胞原位瘤体积小。参见图8中的B;两组体积差异有统计学意义。如图8A，B显示， Ifep3B敲除ACTL6A细胞组所行成的肝脏肿瘤体积明显小于化p3B对照组细胞所形成的肝脏 肿瘤。检测肝脏原位成瘤的肝内转移灶及肺转移灶情况发现，Hep3B敲除ACTL6A细胞组的 肝转移及肺转移率明显低于相应的化p3B对照组细胞组，结果参见图8中的C和D。参见 图8中的C;敲除ACTL6A的化p3B对照组细胞构建的原位瘤较化p3B敲除ACTL6A细胞易 发生肝内转移。参见图8中的D;敲除ACTL6A的化p3B对照组细胞构建的原位瘤较化p3B 敲除ACTL6A细胞易发生肺转移。
[0119] 由实施例1~2可知，通过上述两种给药方式给药后，小鼠体内的癌细胞转移受到 有效抑制，抑制肝癌原位瘤生长和转移。
[0120] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌细胞侵袭转移的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括在慢病毒载体中敲除带有 所述ACTL6A基因质粒的给药方式。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以电荷翻转载体为载体对 所述肝癌肿瘤细胞核靶向给药的应用。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的应用，其特征在于，所述ACTL6A基因序列为序 列表中a)~c)中的一种基因： a) 序列表中SEQIDNO. 1所示的基因序列； b) 序列表中SEQIDNO. 2所示的基因序列； c) 序列表中SEQIDNO. 3所示的基因序列。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述ACTL6A基因序列为序列表中SEQID NO. 3所不的基因序列。6. -种药物组合物，其特征在于，包含敲除了表达ACTL6A基因的慢病毒载体。7. -种药物组合物，其特征在于，ACTL6A基因与递送载体相连接后用于所述药物组合 物中。8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为电荷翻转型药物载体。
【专利摘要】本发明提供了一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用，本发明提供通过实验发现ACTL6A基因编码的相应蛋白，在细胞核内存在高表达时，患者术后癌症复发几率增高。通过已知各种给药方式，实现对ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达抑制，从而达到有效防止肝癌细胞在人体内的EMT作用，降低肝癌细胞在体内的转移机会，从而提高患者术后的生存时间和减少转移复发。
【IPC分类】A61P35/00, A61K48/00
【公开号】CN104906598
【申请号】CN201510290964
【发明人】杨连粤, 肖帅
【申请人】中南大学湘雅医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月1日
【技术领域】
[000。 本发明设及肝癌治疗领域，特别地，设及一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后 预防肝癌复发药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌化巧atocelluarCarcinoma,肥C)是一种严重威胁人类生命健康的常 见疾病，全世界每年约有超过700, 000人死于肥C，而中国每年新发病例约占全球总数的一 半。近年来随着诊断方法、手术技术和综合治疗手段的进步，为HCC的诊治提供了更多的选 择，使肥C的疗效得到了一定的提高。然而肥C是一种具有高度恶性生物学行为的肿瘤，极 易在早期发生侵袭、转移，大部分患者就诊时已到中晚期，失去了根治该疾病的机会，导致 总生存率仍不乐观，术后5年生存率徘徊在30%左右。因此有效控制肥C的侵袭和转移是 改善HCC患者治疗效果及获得长期生存的根本办法。
[0003] 近年来许多研究发现上皮性肿瘤细胞在侵袭转移过程中往往呈现出上皮细胞 表型丧失现象，从而使其获得间充质细胞表型的特点，该一现象称之为上皮-间质转变 巧pithelial-mesenchymaltransition,EMT)，EMT密切参与多种常见上皮性肿瘤的发生 发展。如最近研究通过微流体捕获技术发现乳腺癌患者血液中的癌细胞向间充质细胞表 型转变时，则提示复发、转移、治疗抵抗等现象发生。当癌细胞向上皮细胞表型转变（MET) 时，患者治疗转归逐渐好转，该一研究为EMT在肿瘤侵袭转移中所起作用提供了重要证据。 深入研究后发现，肿瘤侵袭转移级联反应的各步骤中均有EMT的参与，肿瘤细胞通过连续 的EMT-MET过程进行侵袭转移并最终在远处脏器形成新的转移灶。因此寻找能调控EMT与 HCC侵袭转移级联反应的基因，并根据其设计相应的祀向治疗药物，将为控制HCC的转移提 供有效的生物学治疗手段。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应 用，W解决现有技术中对于肝癌患者术后肝癌细胞容易在人体内侵袭转移导致癌细胞扩散 的技术问题。
[0005] 根据本发明的一个方面，提供了一种ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌 细胞侵袭转移的药物中的应用。
[0006] 进一步地，应用包括在慢病毒载体中敲除带有ACTL6A基因质粒的给药方式。
[0007] 进一步地，应用包括W电荷翻转载体为载体对肝癌肿瘤细胞核祀向给药的应用。
[0008] 进一步地，ACTL6A基因序列为序列表中a)~C)中的一种基因；a)序列表中SEQ IDNO. 1所示的基因序列；b)序列表中SEQIDNO. 2所示的基因序列；C)序列表中SEQID NO. 3所示的基因序列。
[0009] 进一步地，ACTL6A基因序列为序列表中SEQIDNO. 3所示的基因序列。
[0010] 根据本发明的另一方面还提供了一种药物组合物，包含敲除了表达ACTL6A基因 的慢病毒载体。
[0011] 根据本发明的另一方面还提供了一种药物组合物，ACTL6A基因与递送载体相连接 后用于药物组合物中。
[0012] 进一步地，载体为电荷翻转型药物载体。
[0013] 本发明具有W下有益效果：
[0014] 1.本发明提供通过实验发现ACTL6A基因编码的相应蛋白，在细胞核内存在高表 达时，患者术后癌症复发几率增高。通过已知各种给药方式，实现对ACTL6A基因编码的相 应蛋白的表达抑制，从而达到有效防止肝癌细胞术后在人体内的EMT作用，降低肝癌细胞 在体内的转移机会，从而提局患者术后的生存质量。
[0015] 2.本发明提供的ACTL6A基因的应用包括对肝癌的治疗或肝癌术后预防癌细胞在 人体内转移侵袭其他组织中的药物应用。
[0016] 3.本发明通过研究首次证实名为ACTL6A的基因在肝癌组织的核蛋白中存在高表 达，利用该基因的该一特性，可W用于制备检测潜在肝癌患者的试剂盒。
[0017] 除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。 下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
【附图说明】
[0018] 构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0019] 图1为ACTL6A基因在肝癌细胞和肝组织中的表达相关结果图；
[0020] 图2为ACTL6A高表达与肥C患者不良预后明显相关结果图；
[0021] 图3为细胞慢病毒转染效率验证相关结果图；
[0022] 图4为ACTL6A过表达/敲除效能验证相关结果图；
[0023] 图5为ACTL6A可在体外促进肝癌细胞的运动、侵袭和转移能力的相关结果图；
[0024] 图6为ACTL6A可在体内促进肝细胞癌生长及侵袭转移的相关结果图；
[00巧]图7为慢病毒转染敲除ACTL6A的质粒可抑制肝癌皮下瘤生长的相关结果图；W及
[0026] 图8为敲除ACTL6A可抑制肝癌原位瘤生长及侵袭转移的相关结果图。
【具体实施方式】
[0027]W下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可W由权利要求限定 和覆盖的多种不同方式实施。
[0028] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0029] 本文中设及到的百分号"％ "，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比， 除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时容量 的比例。
[0030] 本发明一方面提供了一种ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌细胞侵袭转 移的药物中的应用。
[0031]Actin-l;Lke6A(ACTL6A)是一种编码肌动蛋白相关蛋白（actin-related proteins，ARPs)的基因，基因定位于染色体3q26. 33。在哺乳动物中，ACTL6A主要具有调 节转录、胞核转移、染色质重构等重要功能。最新研究发现ACTL6A具有许多独特的特点，其 高表达能诱导上皮性细胞发生EMT并促进迁移、增殖，因此可能参与肿瘤的发生发展。我们 前期研究亦证实ACTL6A可能在肥C复发转移中发挥重要作用，针对ACTL6A设计抑制药物 将能很好的抑制肝癌的侵袭和转移。
[0032]肝癌细胞系（PLC/PRF5,SMMC7721，HepG2,Hep3B，Huh7,M肥C97-L]fflCC97-H， 肥化M3)上述是肝癌研究常用的肝癌细胞系名称，其中PLC/PRF5,化pG2,化p3B来源于美国 模式培养物保藏所，SMMC7721，Huh7,M肥C97-L]fflCC97-H，肥化M3来源于复旦大学肝癌研 究所。
[003引 ACTL6A基因的功能通过W下实验进行了验证：
[0034] 1.肝癌标本及临床资料收集
[00巧]随机捜集2006年1月至2009年12月间在湘雅医院手术切除，术后病理证实为肝 细胞癌，病例资料和随访资料及标本完整的病例100例。其中取小肝癌、孤立性大肝癌和结 节性肝癌冰冻标本各10例。肝癌组织切除后，立即切取黄豆粒大小的肝癌组织（T)和距离 肿瘤边缘1cm的邻近非肿瘤肝组织（ANLT)，将组织置于无菌离屯、管中，并立即于液氮中冻 存，然后转移至-80°C超低温冰箱（型号化ermo化rma905)。另切除带有癌旁肝组织的肝 癌标本，将之放入5%的福尔马林溶液中固定，再将肝癌组织标本依次置于50%己醇溶液、 75%己醇溶液、95%己醇溶液和无水己醇中各5分钟，进行梯度脱水后置于二甲苯中使肝 癌标本透明，将透明后的肝癌组织标本放入融化的石蜡中浸透。在包埋器中倒入融化的石 蜡，在石蜡凝固之前迅速将组织标本放入其中。石蜡凝固后将其切割成1cm3的方块。用切 片机切取4um的连续切片，用于免疫组织化学实验。
[0036] 详细收集上述100例患者的各项临床病理资料、手术资料及术后随访资料，如患 者性别、年龄、合并疾病、肝炎病史、有无肝硬化、肝功能化ild-化曲分级、凝血功能、血清 甲胎蛋白、肿瘤位置、手术方式、手术时间、止血方式、术中出血及输血量、术后并发症、围手 术期死亡、切除标本大小、肿块数目、有无包膜、血管浸润、病理类型、细胞分化程度及肿瘤 临床分期等。术后通过口诊复查、电话或面对面沟通的方式定期（前2年每3-6个月随访 1次，2年后每年随访1次）进行临床随访，建立完善的随访数据库。肝癌病人术后是否发 生复发转移则依据肝脏超声检查、CT、MRI、血清甲胎蛋白含量W及再次手术等方法确定。若 病人在此时间内发生死亡或者复发转移则作为随访的终止点；若患者未因肝癌死亡或者未 出现复发转移或因其他原因死亡者则作为删失数据。患者的生存时间为患者手术之日到患 者死亡的时间。患者的无瘤生存时间为患者手术之日起到出现复发转移的时间。
[0037] 2.巧光实时定量PCR与半定量RT-PCR
[0038] 细胞和新鲜冰冻组织RNA提取、测定及cDNA合成详见CelanoP等Celano P,VertinoPM,Casero民A Jr. Isolation of polyadenylated RNA from cultured cells and intact tissues. Biotechniques. 1993Jul ; 15 (1) : 26-8和Yang,L.Y.等Yang LY, Tao YM,Ou DP,et al. Increased expression of Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein 2correlated with poor prognosis of h邱atocellular carcinoma. Clin Cancer Res, 2006, 12:5673-5679.中公开的方法进行。
[0039] 实时定量PCR引物由上海生工生物技术公司设计并合成，引物的特异性和匹配性 经NCBI的Primer-BLAST验证。ACTL6A的正向引物序列为；5 '-GGTCGTTCTACTGGGCTGATT-3 '，ACTL6A的反向引物序列为；5' -AGCAAGAGGGGATTTCACAAT-3'，产物的大小为108bp。同 时应用人GAPDH(甘油醒-3磯 酸脱氨酶）基因来校正上样量差异，基因的正向引物序列 为；5, -agaaggctggggctcatttg-3,，反向引物序列为；5, -aggggccatccacagtcttc-3,，产 物的大小是258bp。将装有引物粉末的离屯、管在离屯、机上瞬时离屯、，加入无RNA酶水，弓I 物溶液的终浓度为30uM，于-20°C冰箱中储存。详细的实时定量PCR操作步骤及信使 RNA表达量测定见Wu,F.等WuF,YangLY,LiYF,etal.Novelroleforepidermal growthfactor-likedomainTinmetastasisofhumanhepatocellularcarcinoma. 化patology, 2009, 50:1839-1850。
[0040] 反转录聚合酶连反应的引物由上海生工生物技术公司设计，正向引物的序列为： 5 ' -CCAGGTCTCTATGGCAGTGTAA-3 '，反向引物序列为；5' -CGTAAGGTGACAAAAGGAAGGTA-3 '，产 物的大小为309bp，W上述人的GAPDH基因作为内参。将装有引物粉末的离屯、管在离屯、机上 瞬时离屯、，防止粉末飞扬，加入无RNA酶水，引物溶液的终浓度为10yM。详细RT-PCR操作 步骤及条带亮度值检测计算见Yang,L.Y.等（YangLY,TaoYM,0uDP,etal.Increased expressionofWiskott-Aldrichsyndromeproteinfamilyverprolin-homologons protein2correlatedwithpoorprognosisofhepatocellularcarcinoma.ClinCancer Res, 2006, 12:5673-5679。
[0041] 3.Western-blot
[0042]根据Yang,L.Y.等（YangLY,TaoYM,OuDP,etal.Increasedexpression ofWiskott-Aldrichsyndromeproteinfamilyverprolin-homologonsprotein 2correlatedwithpoorprognosisofhepatocellularcarcinoma.ClinCancer Res, 2006, 12:5673-5679.的描述提取细胞及新鲜冰冻组织的总蛋白及进行蛋白浓度测定， 并将目标蛋白稀释至浓度接近。
[0043] 根据Western-blot通用实验方法和自身实验要求进行了如下操作；配制12% 的聚丙締酷胺分离胶，配方为；6. 6ml的双蒸水，8. 0ml的30 %Acr-Bis，5. 0ml的1. 5M Tris(P服.8)，200y1的10%SDS，200y1的10%过硫酸锭和8y1的TEMED，将配好的分离 胶倒入夹好的两块玻璃板中并水封，待分离胶凝固后将上层水封倒掉，配制5%的浓缩胶， 配方为；3. 4ml的双蒸水，830y1 的 30%Acr-Bis，630y1 的 1. 5MTris(p服.8)，50y1 的 10%SDS，50y1的10%过硫酸锭和5y1的TEMED，将配制好成层胶缓慢倒入玻璃板中，倒 满后将梳子插入其中。将所提取的总蛋白和5XLoddingBuffer按4:1的比例混合，在沸水 中煮大约10分钟，然后将蛋白取出放在常温中冷却，蛋白冷却到大约60°C时，W120(K)巧m 的速度离屯、10分钟。将已经凝固好的丙締酷胺凝胶放到电泳槽中，把齿梳拔掉后相应孔 中添加Sul的蛋白Marker(Thermo,Waltham，CA)或蛋白样品，将miniProteanTetra Systerm小型垂直电泳系统炬lO-RAD，Hercules,CA)的电压设置为80V，当看到藍色指示线 到达折线W下的时候把电压调到120V，当藍色指示线到达绿线W下的时候停止电泳，把玻 璃板拿出来后用自来水冲洗一下，把两块玻璃板分离开来，取出凝胶放到盛有转膜缓冲液 的搪瓷盘中，在转膜夹板的无色透明一边放上一层海绵，然后依次放3层滤纸，甲醇浸透的 PVDF膜（Roche,化ankfud，Germany)，凝胶，再放3层滤纸和1层海绵，然后将合起的夹板 放入转膜电泳槽中，并将电泳槽中倒满转膜缓冲液，注意转膜夹板无色透明一边朝向正极， 黑色一边朝向负极，将转膜电泳槽放入冰盒中并连接电泳仪（六一，北京，中国），在200mA恒流的条件下转膜2小时。2小时过后，拆开夹板拿出PVDF膜，用磯酸盐缓冲液冲洗掉转膜 缓冲液，7%的封闭液中浸泡40分钟，封闭完成后用PBS-T溶液（1LPBS溶液中加入1ml的 Tween-20)洗净封闭液，用一抗稀释液（LEAGE肥，北京，中国）按需要的比例与一抗混合，把 PVDF膜放入其中，然后放到冷柜中14小时。第二天将PVDF膜从一抗溶液中取出，PBS-T溶 液洗S次每次3分钟，然后将PVDF膜放入适当稀释的二抗溶液中，室温下放置30-60分钟， 然后用PBS-T溶液洗S次每次10分钟洗净残余二抗。将PVDF膜放入盛有WesternBri曲tTM E化-sparyWesternblotingdetectionsystem显影剂（ADBANSTA，MenloPark,CA)无 色透明盘中，将透明盘放入BID-RADchemiDOCTMMP凝胶成像系统中炬lO-RAD，Hercules, CA)，在ImageLabTM软件中选择蛋白质印迹并自动成像，成像后将所成的相片导出，利用 ImageJ软件计算出各条带的灰度值，进行统计学分析。
[0044] 本实验所用的一抗为兔抗人ACTL6A蛋白（47kDa)单克隆抗体（Abeam， Massachusetts，USA)，鼠抗人P-Actin蛋白（42kDa)单克隆抗体（Sigma,Missouri,USA), 本实验所用的二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白抗体（中杉金桥，北京， 中国）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠免疫球蛋白抗体（中杉金桥，北京，中国）。
[0045] 4.免疫组织化学染色
[004引免疫组织化学法详见化ng,K.J.等（YongKJ,GaoC,LimJS,et al.OncofetalgeneSALL4inaggressivehepatocellularcarcinoma.NEnglJ Med, 2013, 368:2266-2276.)的描述。ACTL6A染色主要定位于细胞核，其阳性染色定义为 细胞核内的栋黄色颗粒样染色，免疫组织化学各标本染色程度的评级依据化ng，K.J.等描 述。按着色细胞数目多少的评分标准为；没有细胞染色记为0分，小于1/3的细胞染色记为 1分，小于2/3的细胞染色记为2分，大部分细胞染色记为3分。着色强度的评分标准为；0 分为阳性染色细胞数目少于5%，1分为阳性染色细胞数目为5-30%，2分为阳性染色细胞 数目为31-50%，3分为阳性染色细胞数目为51-80%，4分为阳性染色细胞数目大于80%。 将0-1分作为ACTL6A低表达组，2-4分作为ACTL6A高表达组进行统计分析。
[0047] 5.细胞培养及构建ACTL6A过表达和敲除质粒的慢病毒转染肝癌细胞株
[0048] 实验选取ACTL6A内源性低表达的化C/PR巧细胞和ACTL6A内源性高表达的化p3B 细胞进行研究。细胞复苏、传代和冻存按细胞培养说明常规进行。ACTL6A内源性低表达的 PLC/PR巧细胞拟进行ACTL6A全长质粒慢病毒转染构建化C/PRF5过表达ACTL6A细胞和相 应的化C/PR巧对照组细胞；ACTL6A内源性高表达的化p3B细胞拟进行ACTL6A的shRNA敲 除质粒慢病毒转染构建化p3B敲除ACTL6A细胞和相应的化p3B对照组细胞。质粒的慢病 毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司（上海，中国）构建，具体转染操作步骤根据吉凯 公司的protocol进行。
[0049] 慢病毒过表达质粒载体；GV287,元件顺序：化i-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位 点；AgelAgel，过表达引物序列 5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGAGCGGCGGCGTGTA CG-3'。
[0050]慢病毒shRNA敲除质粒载体；GV248,元件顺序；hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-p uromycin(hU6启动子-多克隆位点-泛素-绿巧光蛋白-内部核糖体进入位点-嚷岭霉 素），采用上述方法共构建ACTL6AshRNA序列3条；
[0051]ACTL6A-RNAi(26882-1) ;5, -TCCAAGTATGCGGTTGAAA-3' 为所附序列表中SEQID NO. 1所不的基因序列；
[0052]ACTL6A-RNAi(26883-1) ;5' -GTACTTCAAGTGTCAGATT-3'，为b)序列表中SEQID NO. 2所不的基因序列；
[0053]ACTL6A-RNAi(26884-l) ;5, -GGGATAGTTTCCAAGCTAT-3,为序列表中SEQIDNO. 3 所示的基因序列。通过后续实验发现，上述S条序列的ACTL6A基因对于肝癌均具有较优的 治疗效果和术后预防复发或转移效果。
[0054] 慢病毒质粒转染效率经镜下巧光观察，过表达/敲除效能分别提取RNA和蛋白经 实时定量PCR和Western-blot检测验证，PCR引物见前文所述。细胞转染成功后进行常规 培养、保种并进行后续的体内外功能学实验。
[005引 6.体外功能学实验
[0056] 6. 1细胞骨架免疫巧光染色
[0057] 细胞骨架免疫巧光实验参照Abeam公司的protocol说明进行，简要步骤如下；（1) 实验前将盖玻片放于75%的酒精中浸泡24小时，紫外线照射30分钟。（2)将盖玻片用无 菌PBS溶液清洗干净，在六孔板每孔放入一个盖玻片并加入2ml不完全细胞培基。（3)吸取 约IX105个细胞加入到六孔板各孔中，在培养箱中放置24小时。（4)24小时后，吸掉培基 后用PBS溶液清洗细胞两次，各孔分别加入1ml4%多聚甲醒固定并静置15分钟。（5)冰 PBS溶液洗漆3次，然后在每个孔中加入1ml0.25%TritonX-100,10分钟后吸掉。化)PBS 溶液洗漆3次，滴加1滴的5yg/ml的罗丹明鬼笔环肤（Sigma,StLouis,M0)在玻片上，在 避光的条件下染色30分钟。（7)DAPI染细胞核15秒，PBS溶液洗漆3次。（8)滴加防巧光 泽灭液并盖上盖玻片，在巧光正置显微镜下察看标本并扫描图 像。
[0058] 6. 2划痕愈合实验
[0059]细胞划痕实验参照Xu,J.等狂UJ，LiX，YangH，etal.SINlpromotes invasionandmetastasisofhepatocellularcarcinomabyfacilitating epithelial-mesenchymaltransition.Cancer, 2013, 119:2247-2257.的实验方法进行，并 根据实验要求进行了相应的调整，简要步骤如下；（1)细胞进入对数生长期后，消化、稀释 并计数，吸取约5X105个细胞加入到无菌六孔培养板中（NEST，无锡，中国），然后将其放置 在细胞培养箱中，当达到90%的细胞覆盖率时开展划痕实验。（2)将培养皿中的培基完全 吸掉后，用Tip头在培养皿中轻轻的快速划痕，注意不要划伤底部，然后用PBS缓冲液清洗 细胞数次，最后加入2ml细胞完全培养基。（3)将培养板放于倒置显微镜下观察并拍照，24 小时和48小时再次观察并拍照。根据两组细胞划痕的愈合率来进行统计分析。
[0060] 6. 3Transwell小室侵袭实验
[0061]侵袭小室实验参照Xu,J.等（XuJ,LiX,YangH,etal.SINlpromotes invasionandmetastasisofhepatocellularcarcinomabyfacilitating epithelial-mesenchymaltransition.Cancer, 2013, 119:2247-2257.)的实验方法进行， 简要步骤如下；（1)将Matrigel胶炬D，RranklinLakes，NJ)放于冰上缓慢融化，Matrigel 胶和PBS溶液按1:4混合，将20y1稀释后的Matrigel胶加入到Transwell板（Corning， NY，USA)的上室中，轻轻摇匀后放到细胞培养箱中培养24小时。（2)在下室中加入600 的完全培养基，并把Transwell小室放于其中，然后将培养板放于细胞培养箱中水化15分 钟。（3)在Transwell小室中加入2X105个细胞并添加200y1不含胎牛血清的细胞培养 基，在细胞培养箱中放置24小时。（4) 24小时后用棉团把上室内部的细胞和培养基擦掉，然 后放在冰甲醇中浸没10分钟。（5)将Tranwell小室倒扣在桌面上并在上面滴一滴结晶紫 溶液，染色15分钟。（6)15分钟后用蒸馈水洗掉结晶紫溶液，干燥后放于倒置显微镜下观 察。（7)在100倍显微镜下计数各组穿过的细胞数目，进行统计分析。7.裸鼠体内成瘤实 验
[0062] 7. 1裸鼠肝癌细胞皮下成瘤实验
[0063] BALB/c免疫缺陷鼠购买自长沙景达实验动物公司，并在中南大学动物学部SPF级 动物实验室中喂养。参照Yang, H.等（Yang H, Fang F, Qiang R, Yang L. MicroRNA-14〇-5p suppresses tumor growth and metastasis by targeting transforming growth factor beta receptor land fibroblast growth factor 9in hepatocellular carcinoma. 舶patology，2013, 58:205-217.)等的试验方法进行如下操作：将状态良好的细胞用膜酶 消化下来后用生理盐水制成悬浮液，并将细胞的浓度调整至SXloVml。裸鼠皮下瘤采取 皮下注射肿瘤细胞方法成瘤，注射部位选取左腹股沟，注射量为0. 1ml(约5 X 106细胞）， 接种时由裸鼠体侧腰部稍靠下的部位进针，要保证与接种点的距离小于针头的长度，向尾 部方穿行，绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层，当针头到达接种位点时注射，可看到鼓起的 小包，退出针头。从第二天开始通过每天测量皮下瘤的长径和短径来比较两组皮下瘤生长 速度的差异；一个月后待皮下瘤长到一定体积，将裸鼠用颈椎脱位法处死，取出皮下瘤并拍 照，用游标卡尺测量皮下瘤的长径和短径。皮下瘤体积的计算公式为：体积（皿3)=(长径 (mm) X短径（mm)2)/2。
[0064] 7. 2裸鼠肝癌细胞肝脏原位成瘤实验
[0065]原位成瘤实验方法参照Yang,H.等（YangH,FangF,ChangR,Yang L.MicroRNA-14〇-5psuppressestumorgrowthandmetastasisbytargeting transforminggrowthfactorbetareceptorlandfibroblastgrowthfactor9in hepatocellularcarcinoma.化patology, 2013, 58:205-217.的方法。将 7. 1 的皮下瘤分组 取出后生理盐水浸泡，用手术刀片切割成约1mm3的小块。采用10%水合氯醒腹腔注射麻醉， 每只裸鼠约注射60y1。麻醉后，用舰伏棉球擦拭消毒裸鼠胸腹部3次，切开剑突左侧皮肤， 再横向剪开腹壁肌层及腹膜层，显露肝脏，眼科剪将左肝被膜剪开，将皮下瘤小块塞入肝被 膜下，并用明胶海绵压迫止血，缝线关闭腹腔。种植2个月后，将裸鼠用颈椎脱位法处死，完 整取出裸鼠的肝脏和肺脏，将裸鼠的肝脏分组观察并拍照，并观察有无肉眼可见转移灶。然 后采用4%甲醒浸泡所取下来的肝脏和肺脏。将裸鼠肝脏和肺脏石蜡包埋后，用切片机切成 厚度约4ym的切片，肥染色后显微镜下观察裸鼠肝脏和肺脏内的有无转移灶。
[0066] 上述各实验的实验结果及其分析如下：
[0067] 1.ACTL6A信使RNA和蛋白在肝癌细胞和肝癌组织中呈显著高表达，且与侵袭转移 潜能密切相关。
[0068] 首先采用实时定量PCR方法检测ACTL6A在肥C细胞系中ACTL6A信使RNA的表达， 结果发现ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系中表达较L02细胞中表达明显增高；且其在高侵袭 转移能力的肝癌细胞系HCXLM3、M肥C97-H等中的表达水平也明显高于低侵袭转移能力的 肝癌细胞系SMMC772UPLC/PRF5等，RT-PCR检测也得到了一致的结果，由此可见ACTL6A与 肝癌细胞系的侵袭转移能力关系密切。同时，我们采用Western-bolt方法检测ACTL6A蛋白 在肝癌细胞系中的表达，与实时定量PCR结果完全一致，详见图1A1，A2，D1。图1中的A1: 实时定量PCR(实时定量巧光PCR，简称实时定量PCR)显示ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系 (PLC/PRF5,SMMC7721，HepG2,Hep3B，Huh7,M肥C97-L]fflCC97-H，肥化M3)中较L02 细胞相 对高表达。参见图1中的A2，RT-PCR同样显示ACTL6A信使RNA在肝癌细胞系中表达较L02 中的表达增高，且在高转移潜能的细胞系化p3B，M肥C97-H，肥化M3中表达较低转移潜能细 胞系化C/PRF5，SMMC7721，化pG2中的高；图1中的DlWestern-blot(蛋白质印记法）显示 ACTL6A基因的蛋白表达在各肝癌细胞系中的表达较L02细胞中的高。
[0069] 接着我们检测ACTL6A在新鲜冰冻的肝癌组织（T)及配对的邻近非肿瘤正常肝组 织（ANLT)中的表达，实时定量PCR检测发现ACTL6A信使RNA在肝癌组织中较邻近非肿瘤 正常肝组织中表达明显增高，Western-bolt检测发现ACTL6A蛋白表达在肝癌组织中亦明 显较邻近非肿瘤正常肝组织中表达增高，详见图1B1，B2，D2。图1中的B1 ;实时定量PCR显 示ACTL6A信使RNA在30对肝癌组织（T)中的表达较配对的邻近非肿瘤肝组织（ANLT)中 表达明显增高；图1中的B2 ;RT-PCR检测结果显示肝血管瘤肝组织（L495)与4对肝癌组织 (T)和与T配对的邻近非肿瘤肝组织（ANLT)中ACTL6A信使RNA在肝癌组织中的表达较肝 组织及配对的ANLT中的表达明显增高；图1中的D2显示肝癌组织中ACTL6A基因的蛋白表 达较肝组织及与肝组织配对的ANLT中的表达明显增高。
[0070] 同时，根据不同临床类型的肝癌进行ACTL6A的检测，发现结节性肝癌中ACTL6A信 使RNA的表达水平明显高于孤立性大肝癌和小肝癌，详见图1C。图1中C;实时定量PCR显 示ACTL6A信使RNA的表达在结节性肝癌中较该基因在孤立性大肝癌和小肝癌中的表达均 明显增高。
[0071] 2.ACTL6A高表达与不良临床病理特征及预后密切相关
[007引进一步采用免疫组化法检测肥C组织中ACTL6A蛋白的表达，结果显示，ACTL6A蛋 白在肥C组织中高表达，而癌旁肝组织中则未见明显表达，详见图2A1。参见图2A1可见免 疫组化染色显示ACTL6A信使RNA在肝癌组织中表达明显高于相应癌旁肝组织。
[007引进一步分层研究我们发现小肝癌组和孤立性大肝癌组ACTL6A的高表达率相近， 但二者均显著低于结节性肝癌组，详见图2A2。图2A2 ;免疫组化染色显示ACTL6A在邻近非 肿瘤肝组织、无转移肝癌组织和有转移肝癌组织中表达呈现逐渐增高趋势。
[0074] 统计分析ACTL6A的高低表达与肥C患者临床病理特征的关系发现其与患者血清 甲胎蛋白水平，肿瘤结节数目，肿瘤包膜，Edmondson-Steiner分级，静脉浸润，TOM分期和 复发明显相关，详见表1。
[007引表1.ACTL6A表达水平与肝癌临床病理特征的相关性 [0076]
[0078] 注：不包括肝功能分级为化ild-化曲C级的患者。P< 0. 05结果有显著性差异。 ACTL6A低表达定义为：免疫组化评分为0-1 ;ACTL6A高表达定义为：免疫组化评分为2~ 4。
[0079] 生存分析发现ACTL6A高表达肥C患者的总生存时间及无瘤生存时间均明显短于 ACTL6A低表达者（详见图2BLB2)，且根据不同临床类型的肝癌分层分析发现ACTL6A高表 达小肝癌、孤立性大肝癌和结节性肝癌患者的总生存时间及无瘤生存时间均分别明显短于 ACTL6A低表达者（详见图 2(：1，〔2,01，02,61，62)。图281;1(3口1311-1116161'法绘制的1(-111曲 线生存分析显示ACTL6A高表达肝癌患者的总生存时间明显短于低表达的患者，图2B2显示 ACTL6A高表达肝癌患者的无瘤生存时间也明显短于低表达患者。参见图2中的C1和C2 ; 根据肝癌临床类型分层分析显示ACTL6A高表达的小肝癌患者总生存时间（C1)和无瘤生存 时间（C2)明显短于低表达患者。图2中D 1和D2图；ACTL6A高表达的孤立性大肝癌患者 总生存时间值1)和无瘤生存时间值2)明显短于低表达患者；图2中E1和E2 ;ACTL6A高表 达的结节性肝癌患者总生存时间巧1)和无瘤生存时间巧2)亦明显短于低表达患者。
[0080] 单多因素Cox比例风险回归模型分析发现ACTL6A的高表达是肥C总生存时间和 无瘤生存时间的独立危险预后因素，详见表2,表3。
[0081] 表2.肝癌总生存率的单因素及多因素COX回归分析
[0082]
[0084]P< 0. 05结果有显著性差异。皿，风险比；CI，可信区间。
[0085] 表3.肝癌无瘤生存率的单因素及多因素COX回归分析
[0086]
[0088] P< 0. 05结果有显著性差异。
[0089] 综合免疫组化与临床病理特征及预后的研究，提示ACTL6A高表达是肝细胞癌不 良临床类型及不良预后的重要标志，其可能促进肝癌袭转移及复发。
[0090] 3.体外实验中ACTL6A过表达可促进肝癌细胞侵袭转移，敲除ACTL6A可抑制肝癌 细胞侵袭转移
[0091] 为研究ACTL6A如何调控肝癌侵袭转移，首先根据ACTL6A表达水平不同，选择 ACTL6A低表达的化C/PR巧细胞系进行ACTL6A质粒过表达慢病毒转染，构建ACTL6A过表达 的化C/PR巧细胞株；选择ACTL6A高表达的化p3B细胞系进行ACTL6A短发夹RNA敲除质粒 慢病毒转染，构建ACTL6A低表达的化p3B细胞株；同时分别构建相应的空质粒病毒转染株 做为对照组，详见图3。图3中可见巧光显微镜拍照可见ACTL6A过表达和ACTL6A敲除的3 个序列（ACTL6A-敲除-1、ACTL6A-敲除-2和ACTL6A-敲除-3)相比肝癌细胞转染效率均 高于70%。
[0092] 转染效率经实时定量PCR和Western-blot验证发现化C/PRF5过表达ACTL6A细 胞较化C/PR巧对照组细胞的ACTL6A信使RNA和ACTL6A蛋白表达增高2倍W上；而敲除序 列经实时定量PCR和Western-blot验证发现SMCTL6A-3的效率最高，因此选择该序列进 行下一步实验，详见图4。参见图4中的A图为实时定量PCR证实化C/PRF5过表达ACTL6A 细胞的ACTL6A信使RNA表达量较对照组化C/PR巧对照组细胞超出2倍W上。参见图4中 的B图实时定量PCR验证各敲除序列的化p3B敲除ACTL6A细胞与对照组化p3B对照组细 胞中ACTL6A信使RNA表达量的差异，其中Hep3B敲除ACTL6A-3细胞敲除效率最高。参见 图4中的C图通过Western-blot验证ACTL6A蛋白在各不同转染处理的细胞中表达情况，结 果与实时定量PCR-致，后续体内外功能学实验选取化C/PR巧过表达ACTL6A细胞和化p3B 敲除ACTL6A-3细胞及相应对照组进行研究。
[0093]构建的细胞株分别进行细胞骨架免疫巧光实验、划痕愈合实验和transwell侵袭 小室实验W检测ACTL6A过表达/敲除对细胞运动、迁移和侵袭能力的影响。
[0094]采用了罗丹明鬼笔环肤标记肝癌细胞的肌动蛋白W此观察细胞骨架形态，对比PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞和化C/PR巧对照组细胞骨架形态的差异。在400倍巧光正置 显微镜下看W清楚地观察到相较于化C/PR巧对照组细胞，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞骨 架亮度更强，细胞的形态舒展呈狭长型，并伸出更多的伪足，说明细胞运动性增强。而对比 Ifep3B敲除ACTL6A细胞和化p3B对照组细胞，发现化p3B敲除ACTL6A细胞形态较化p3B对 照组细胞呈卵圆形，伪足等明显减少，说明细胞运动性可能降低，详见图5A1，A2。参见图5 中的A1和A2 ;细胞骨架免疫巧光实验显示过表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A 细胞形态较对照组化C/PR巧对照组明显变得舒展、细长，并有小伪足（A1);敲除ACTL6A的 Ifep3B敲除ACTL6A细胞形态较对照组化p3B对照组细胞明显呈鶴卵石样改变，细胞纤维丝 减少、密度降低，突触减少（A2)。 细胞划痕愈合实验则显示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于化C/PR巧对照组细胞 的愈合能力明显增强，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显增加，提示转染后细胞运 动、迁移能力明显增加，详见图5B1，B2。参见图5中的图B1和图B2 ;划痕愈合实验显示过 表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞迁移能力较化C/PR巧对照组细胞明显增 强。而化p3B敲除ACTL6A细胞的愈合能力较化p3B对照组细胞明显减弱，24小时及48小 时划痕的愈合面积均明显减少，提示提示敲除ACTL6A后细胞运动、迁移能力明显减弱，详 见图5CLC2。参见图5中的图C1和图C2;敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞迁移能 力较化p3B对照组细胞明显减弱。
[0095]细胞划痕愈合实验则显示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于化C/PR巧对照组 细胞的愈合能力明显增强，24小时及48小时划痕的愈合面积均明显增加，提示转染后细胞 运动、迁移能力明显增加，详见图5B1，B2。参见图5中的图B1和图B2 ;划痕愈合实验显示 过表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞迁移能力较化C/PR巧对照组细胞明显 增强。而化p3B敲除ACTL6A细胞的愈合能力较化p3B对照组细胞明显减弱，24小时及48 小时划痕的愈合面积均明显减少，提不提不献除ACTL6A后细胞运动、迁移能力明显减弱， 详见图5CLC2。参见图5中的图C1和图C2 ;敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞迁移 能力较化p3B对照组细胞明显减弱。
[0096]Transwell侵袭小室实验表明化C/PRF5过表达ACTL6A细胞相较于化C/PR巧对照 组细胞的侵袭能力明显增加，结果如图5D1-D2所示。参见图5中的D1和D2 ;Transwell侵 袭小室实验显示过表达ACTL6A质粒的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞侵袭能力较化C/PRF5 对照组细胞明显增强；敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞侵袭能力较化p3B对照组细 胞明显减弱。说明24小时化C/PRF5过表达ACTL6A细胞穿过小室的数目要明显多于化C/ PR巧对照组细胞，提示转染ACTL6A后细胞的侵袭能力明显增强。而化p3B敲除ACTL6A细 胞的侵袭能力较化p3B对照组细胞明显减弱，如图抓1-D2所示，24小时化p3B敲除ACTL6A 细胞穿过小室的数目要明显少于化p3B对照组细胞，提示敲除ACTL6A后细胞的侵袭能力明 显减弱。
[0097] 综合细胞骨架免疫巧光、划痕愈合和Transwell侵袭小室实验结果，说明ACTL6A过表达能明显促进肝癌细胞的运动、迁移和侵袭能力，而敲除ACTL6A能减弱肝癌细胞的运 动、迁移和侵袭能力。
[0098] 4.裸鼠体内实验ACTL6A过表达可促进肝癌细胞生长和转移
[0099] 将化C/PRF5过表达ACTL6A细胞和化C/PR巧对照组细胞分别注射到裸鼠左腹股 沟皮下，每组各6只，一个月后将裸鼠处死，取出皮下瘤拍照并测量皮下瘤体积，结果列于 图6中的A1~A3中。参见图6中的A1图~A3图；裸鼠皮下成瘤实验显示化C/PRF5过表 达ACTL6A细胞皮下瘤明显较对照组化C/PR巧对照组细胞皮下瘤体积大（A1图，A2图）； 皮下瘤生长曲线亦提示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞皮下瘤形成速度快于化C/PR巧对照 组细胞（A3图）。如图6A1~A2显示，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞组所行成的皮下瘤体 积明显大于化C/PR巧对照组细胞所形成的皮下瘤体积。如图6A3所示，PLC/PR巧过表达 ACTL6A细胞组皮下瘤的生长曲线也明显快于LC/PRF5K°ntMi细胞组。
[0100] 进一步的肝脏原位种植成瘤实验中将各组皮下瘤切成约1皿3的小块后种植于裸 鼠肝被膜下，1个月后分别比较各组原位肝肿瘤体积的差异，结果列于图6中的B1~B3中。 参见图6中的B1~B3图：裸鼠肝脏原位成瘤实验显示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞肝脏 原位成瘤体积明显较对照组化C/PR巧对照组细胞原位瘤体积大，且差异有统计学意义；肝 脏原位瘤免疫组织化学提示化C/PRF5过表达ACTL6A细胞原位瘤内ACTL6A呈细胞核内高 表达，而对照组化C/PR巧对照组内低表达炬3)。如图她1-B3,结果显示化C/PRF5过表达 ACTL6A细胞组所行成的肝脏肿瘤体积明显大于化C/PR巧对照组细胞所形成的肝脏肿瘤。 皮下成瘤及原位成瘤的实验结果充分证明，在肝癌细胞中过表达ACTL6A在体内同样可W 明显提高肝癌的生长能力。在获取肝脏原位肿瘤标本的同时，我们也检测了肿瘤的肝内转 移和肺转移情况，结果列于图6中的C1和C2 W及D1和D2中。参见图6中的C1和C2 ;肝 脏原位成瘤照片显示ACTL6A高表达的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞构建的原位瘤较化C/ PR巧对照组细胞易发生肝内转移；参见图6中的D1和D2;肺切片肥染色显示ACTL6A高表 达的化C/PRF5过表达ACTL6A细胞较化C/PR巧对照组细胞构建的肝癌原位瘤容易发生肺 转移。如图6C1-C2，D1-D2所示，PLC/PRF5过表达ACTL6A细胞的肝内转移和肺转移明显高 于化C/PR巧对照组细胞组，提示过表达ACTL6A能在体内促进肝癌的侵袭和转移，该一研究 结果进一步提示ACTL6A可能成为治疗肝癌侵袭转移的重要生物祀点。
[010。 由W上实验结果及其分析可知ACTL6A在肝癌细胞系和肝癌组织中的高表达情况 及与侵袭转移潜能相关；临床病理特征及生存分析发现ACTL6A高表达患者具有不良临床 病理因素及不良生存时间和预后；细胞功能学实验亦提示了ACTL6A高表达可促进肝癌细 胞运动、迁移、侵袭和转移潜能，抑制ACTL6A可抑制肝癌细胞运动、侵袭和转移潜能。体内 实验亦证实过表达ACTL6A能促进肝癌生长。因此，ACTL6A可作为肝癌生物祀向治疗的一 个重要祀点。我们设计不同祀向给药系统进行实验，W了解祀向抑制ACTL6A治疗肝癌的潜 能。可将该基因通过基因给药的方式，调节该基因控制的蛋白在细胞核内的表达量，从而控 制患者的预后情况，防止肝癌细胞发生EMT-MET过程导致转移。显然此处的给药方式可W 为各种可W控制细胞核中相关蛋白表达量的给药方式。举例来说可W为祀向敲除ACTL6A 质粒可W经慢病毒载体包装后进行静脉注射给药，或经电荷翻转型药物载体将药物 输送到 细胞核中。优选采用上述两种方法给药。采用上述两种方法给药可W提高受体对药物的敏 感性，保证疗效。尤其优选为经电荷翻转型药物载体将药物输送到细胞核中。由于该给药方 法为将该基因直接携带至细胞核中ACTL6A基因处给药，药效持久可W避免耐药性的发生。
[0102] 本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该药物组合物主要作用为通过向癌细 胞核给药，从而抑制由ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式并不限于 W下两种，也可W为其他能实现输送作用的给药方式。优选该药物组合物中包含敲除了表 达ACTL6A基因的慢病毒载体。
[0103] 具体给药方式说明如下：
[0104] 1.慢病毒shRNA敲除ACTL6A质粒载体尾静脉注射给药。
[0105]载体；GV248,元件顺序；hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，敲除序列 5'-GGGATAGTTTCCAAGCTAT-3'。SMCTL6A质粒经慢病毒转染后进入宿主细胞，在宿主细胞内 经转录翻译，抑制ACTL6A蛋白的表达，从而在体内发挥作用。该方法在最近如Ambrogio, C. 等（Lentiviral-based approach for the validation of cancer therapeutic targets in vivo. Biotechniques，2014, 57(4):179, 181-187)的研究中被采用静脉注射法进行体 内实验，获得了良好的体内治疗效果。慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒，经改造的慢 病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。慢病毒载体可W将外源基因或外源的 ShRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方 面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、屯、肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的 细胞。使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的ShRNA的转导效率，且目的基因或目的 ShRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的 ShRNA的长期、稳定表达，从而达到良好的基因治疗效果。因慢病毒作用时间长且滴度稳定， 裸鼠成瘤一般在1-2个月W内，因此可在成瘤周期的第一周内仅注射一次即可。
[0106] 给药方法；裸鼠尾静脉注射方法；1.使用尾静脉注射架将裸鼠固定好，将尾己拉 直，綱紧；2.用酒精棉球擦拭尾己，使血管扩张，有利于注射，注射状态为尾己发白，紧靠白 色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉；3.用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾 己固定；4.注射时左手化尾，使尾己紧贴桌面，一般选择距裸鼠尾尖1/4或1/3处进针，使 用1ml膜岛素注射器注射，进针时针头与桌面平行，针尖稍稍朝下，从中指及无名指与拇指 接触处稍上方进针点针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，推 注时无阻力则成功。
[0107] 由上可见，采用上述敲除质粒方法给药时ACTL6A基因序列为序列表中SEQ ID NO. 3所不的基因序列疗效最优。其他a)序列表中SEQ ID NO. 1所不的基因序列；b)序列 表中SEQ ID NO. 2所示的基因序列；虽然也对肝癌有疗效，但效果相较该基因序列稍微差一 些。
[010引本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该药物组合物主要作用为通过向癌细 胞核给药，从而抑制由ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式并不限于W下两种，也可W为其他能实现输送作用的给药方式。优选该药物组合物中所述SMCTL6A 与递送载体相连接后用于所述药物组合物中。
[0109] 2.经电荷翻转型药物载体给药
[0110] 阳离子聚合物如聚己締亚胺（polyet的leneimine，阳I)和聚L赖氨酸 (pol^ysine，化L)W及聚酷胺胺（PAMAM)树枝状大分子等被广泛地用来作为基因载体。实 验表明它们能够进入细胞核内，也能够将生物活性物质输送到细胞核中。然而，该些带正电 荷的聚合物会被网状内皮系统（reticuloendothelialsystem,RE巧识别而很快被清除出 血液循环系统，因此，理想的方法是对该些阳离子聚合物进行可逆修饰，使其在血液中带负 电荷，W抑制它们与正常细胞和组织的作用，而到达肿瘤组织或癌细胞内后去掉该些修饰 而再生原来的阳离子聚合物，重新获得细胞核定位的能力。实体瘤组织间液和细胞的溶酶 体呈酸性，因此可W应用肿瘤组织和细胞中的酸性环境作为信号来触发阳离子保护基团的 离去。根据癌组织内容易产生代谢性酸中毒导致肿瘤细胞内PH低于7. 4,因此有关利用 pH响应的载体输送抗癌药物已有大量的报道。该些高分子载体能够在细胞间质和溶酶体的 酸性抑刺激下将药物释放在细胞间隙或溶酶体中，但是无法将药物输送至细胞核中。駿基 酷胺基团具有在酸性条件下自催化水解的性质。因此申有青（电荷翻转型药物载体用于肿 瘤细胞核祀向药物输送的研究。高分子通报，2010,（12):22-29。）等设计了对胺基进行可 逆保护，用1，2环己二酸酢与聚己内醋-聚己締亚胺的嵌段共聚物（P化bPEI)的阳I段反 应，将阳I的胺基酷胺化为駿基酷胺，得到带负电荷的酷胺化PEI(PEI/amide)。根据该一理 论将祀向敲除SMCTL6A治疗进一步引入到阳I/amide上。在正常生理条件下，双亲性的 P化阳I/amide-sMCTL6A自组装成为带负电的纳米颗粒；在抑小于6时，駿基酷胺基团自 催化水解，重新生成胺基，使得载体带正电荷。而在肿瘤组织、内涵体或溶酶体中显正电性， 使纳米颗粒在细胞内能够成功地实现电荷翻转。根据该一研究得到了得到不同结构的駿基 酷胺化的化L使原来阳离子聚合物化L呈负电性，避免了伯胺基团带来的系统生物毒性。
[0111] 因此，DNA毒化物类抗癌药物可经静脉注射或口服吸收入血被直接输送到它们在 细胞核中的祀点周围，避开了癌细胞在细胞膜和细胞浆中多种药耐药机制，大大提高了药 物的利用度及疗效。因此，可W利用电荷翻转载体进行肿瘤细胞核祀向SMCTL6A给药。W ACTL6A-RNAi(26884-1)为祀序列，按照短发夹RNA设计原理，构建得到的ACTL6A短发夹 RNA质粒。
[0112] 实施例 [011引实施例1
[0114]将化區病毒为载体，敲除质粒中的ACTL6A后进行动物体给药过程及结果如下；
[01巧]将Ifep3B敲除ACTL6A细胞和H巧3B对照组细胞分别约5X106个/只注射到裸鼠 左腹股沟皮下组织后，所得结果列于图7A中。参见图7中的A图：裸鼠皮下成瘤实验显示 敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞皮下瘤明显较对照组化p3B对照组细胞皮下成瘤体 积小。而如图7A显示，化p3B敲除ACTL6A细胞组所行成的皮下瘤体积明显小于化p3B对 照组细胞所形成的皮下瘤体积，进行体积的测量后成组比较亦得出类似结果，所得结果列 于图7B中。参见图7中的B图；统计分析两组皮下瘤大小可见化p3B敲除ACTL6A细胞皮 下瘤明显较对照组化p3B对照组细胞皮下成瘤体积小有统计学差异。
[011引实施例2
[0117]将经电荷翻转型药物载体P化阳I/amide作为载体携带SMCTL6A后进行动物体 给药后，实验过程及所得结果如下：
[0118]肝脏原位种植成瘤实验所得结果如图8中的A图和B图所示，参见图8中的A图； 肝脏原位成瘤图片显示化p3B敲除ACTL6A细胞肝脏原位成瘤体积明显较对照组化p3B对 照组细胞原位瘤体积小。参见图8中的B;两组体积差异有统计学意义。如图8A，B显示， Ifep3B敲除ACTL6A细胞组所行成的肝脏肿瘤体积明显小于化p3B对照组细胞所形成的肝脏 肿瘤。检测肝脏原位成瘤的肝内转移灶及肺转移灶情况发现，Hep3B敲除ACTL6A细胞组的 肝转移及肺转移率明显低于相应的化p3B对照组细胞组，结果参见图8中的C和D。参见 图8中的C;敲除ACTL6A的化p3B对照组细胞构建的原位瘤较化p3B敲除ACTL6A细胞易 发生肝内转移。参见图8中的D;敲除ACTL6A的化p3B对照组细胞构建的原位瘤较化p3B 敲除ACTL6A细胞易发生肺转移。
[0119] 由实施例1~2可知，通过上述两种给药方式给药后，小鼠体内的癌细胞转移受到 有效抑制，抑制肝癌原位瘤生长和转移。
[0120] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌细胞侵袭转移的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括在慢病毒载体中敲除带有 所述ACTL6A基因质粒的给药方式。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以电荷翻转载体为载体对 所述肝癌肿瘤细胞核靶向给药的应用。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的应用，其特征在于，所述ACTL6A基因序列为序 列表中a)~c)中的一种基因： a) 序列表中SEQIDNO. 1所示的基因序列； b) 序列表中SEQIDNO. 2所示的基因序列； c) 序列表中SEQIDNO. 3所示的基因序列。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述ACTL6A基因序列为序列表中SEQID NO. 3所不的基因序列。6. -种药物组合物，其特征在于，包含敲除了表达ACTL6A基因的慢病毒载体。7. -种药物组合物，其特征在于，ACTL6A基因与递送载体相连接后用于所述药物组合 物中。8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为电荷翻转型药物载体。
【专利摘要】本发明提供了一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用，本发明提供通过实验发现ACTL6A基因编码的相应蛋白，在细胞核内存在高表达时，患者术后癌症复发几率增高。通过已知各种给药方式，实现对ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达抑制，从而达到有效防止肝癌细胞在人体内的EMT作用，降低肝癌细胞在体内的转移机会，从而提高患者术后的生存时间和减少转移复发。
【IPC分类】A61P35/00, A61K48/00
【公开号】CN104906598
【申请号】CN201510290964
【发明人】杨连粤, 肖帅
【申请人】中南大学湘雅医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月1日
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