一种超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和应用
一种超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米技术领域，涉及一种超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)是利用原子核在磁场内共振所产生信号经重建成像的一种成像技术。磁共振成像(MRI)作为一项新的医学影像诊断技术，近年来发展十分迅速。MRI所提供的信息量不但多于其他许多成像技术，而且以它所提供的特有信息对诊断疾病具有很大的潜在优越性，其具有分辨率高、成像参数多、使用安全等突出优点，因而更好的显示体内组织器官的结构和病变的性质及功能状态，能够大大提高诊断的准确性和早期性。但是当正常组织与病变组织的磁共振信号差异不明显时，会造成MRI诊断困难，这时就需要引入磁共振成像造影剂，提高组织对比度从而显示体内器官的功能与状态。因此可以使用磁共振成像造影剂来提高MRI诊断的敏感性和特异性。
[0003]MRI造影剂主要有顺磁性造影剂和超顺磁性造影剂两大类。目前常用的顺磁性造影剂是钆离子的配合物，如二乙二胺醋酸钆(Gd-DTPA)。但这种造影剂静脉注射后会迅速进入细胞间隙，导致成像时间缩短，为保持足够的对比度，需注射较大剂量。另外，小分子的Gd系造影剂特异性差。在静脉注射之后，Gd-DTPA会快速弥散。除了病变部位，在正常关节中也会富集一定量的Gd系分子，因而降低了 Gd分子造影的特异性，同时也减弱了病变部位的对比度，而且小分子造影剂会很快被肾脏所清除，对MRI和实时监测都造成了不便。超顺磁性造影剂主要由四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒构成。相对于顺磁性造影剂，超顺磁性造影剂的磁矩大，弛豫效能高，而且可以通过尺寸选择或特异性表面分子修饰实现对特定组织的靶向，并有独特的跨膜机理，可实现细胞内分子靶向。同时超顺磁性氧化铁纳米颗粒的血液半衰期、体内分布状态与其粒子的大小和表面状态有直接的关系。另外，粒径较小的超顺磁性氧化铁纳米颗粒具有较长的血液半衰期，并且具有穿过血管壁、细胞间隙、细胞膜、血脑屏障等各种生理屏障的能力。
[0004]超顺磁性造影剂的合成方法分为两类，一种是共沉淀法:即将一定量的葡聚糖高聚物、铁盐和亚铁盐溶于水，搅拌下滴加一定量的氨水，在一定温度下反应一段时间，可获得粒径约为25?40纳米的超顺磁性氧化铁纳米颗粒。目前合成已经许可上市和正在临床实验的超顺磁性造影剂方法主要是用共沉淀法获得，但是这类造影剂粒径较大、结晶度低、饱和磁化强度小、MRI成像效果差，表面包覆层的厚度不均；而另一类高温热分解合成的超顺磁性氧化铁纳米颗粒，虽然粒径较小且更加均一，氧化铁磁性能优越，但其水溶性和生理稳定性差的缺陷严重阻碍了其应用于体内成像，因而需要通过表面再修饰提高水溶性和生理稳定性及其靶向性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提供一种超顺磁性纳米颗粒，所述超顺磁性纳米颗粒包含位于核心的四氧化三铁纳米粒子、包覆在其表面的PEG修饰的脂质分子以及与PEG连接的靶向分子。所述超顺磁性纳米颗粒通过最外层包覆PEG修饰的脂质分子提高体内稳定性和生物相容性，从而获得了尺寸均一，生理稳定性优良且具备良好磁响应能力的超顺磁性氧化铁颗粒，同时连接靶向分子，能使纳米颗粒之间产生静电排斥，进一步提高纳米颗粒的分散性，减小了粒径，得到了更窄的粒径分布，同时实现了可以靶向病变组织的功能。
[0006]本发明采用以下技术方案，可以更好的达到和实现本发明的目的和有益效果。但是以下技术方案仅为优选技术方案，并非旨在限制本发明。
[0007]本发明提供了一种超顺磁性纳米颗粒，所述超顺磁性纳米颗粒包含位于核心的油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子、包覆在油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子表面的PEG修饰的脂质分子，以及与PEG连接的靶向分子。
[0008]在本发明提供的技术方案的基础上，所述靶向分子为硫磺素S、硫磺素T、刚果红、二乙烯苯或其衍生物中的一种或至少两种的组合。
[0009]在本发明提供的技术方案的基础上，所述四氧化三铁纳米粒子为油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子。
[0010]优选地，所述四氧化三铁纳米粒子的粒径为I?lOOnm。
[0011]在本发明提供的技术方案的基础上，所述PEG修饰的脂质分子为DSPE-PEG5000-NHS, DSPE-PEG2000-NHS或它们的衍生物中的任意一种或至少两种的组合。
[0012]本发明的目的之二在于提供一种超顺磁性纳米颗粒的制备方法，所述方法以PEG修饰的脂质分子为修饰剂，热分解含铁化合物，而后将靶向分子连接在PEG上，得到所述超顺磁性纳米颗粒。
[0013]利用本发明的方法采用高温热分解所获得氧化铁磁响应优越，通过由油酸包覆四氧化三铁纳米粒子，最外层又包覆PEG修饰的脂质分子提高磁性纳米粒子在体内的稳定性和生物相容性，同时修饰靶向分子，实现了可以靶向病变组织的功能，此外连接靶向分子之后可以进一步使产物的纳米粒径变小，从而更增加了产物的稳定性。
[0014]作为本发明的优选技术方案，本发明所述超顺磁性纳米颗粒的制备方法包括以下步骤:
[0015](I)将含铁化合物溶解在水和醇中，形成溶液a ;
[0016](2)将油酸盐溶解于烷烃中形成溶液b ;
[0017](3)将溶液a与b混合，加热到50?90°C，回流，得到溶液C，水洗，干燥得固体d ；
[0018](4)固体d与油酸溶于沸点高于200°C的烯烃中，在保护性气体下，加热到280?350°C得到溶液e，冷却至室温，絮凝沉淀，分离沉淀物，溶解在有机溶剂中得到溶液f ;
[0019](5)将PEG修饰的脂质分子溶解于溶液f中，除去有机溶剂，加水分散得到分散体系g ;
[0020](6)在分散体系g中加入靶向分子，室温反应24_72h，透析，得到所述超顺磁性纳米颗粒。
[0021]本发明利用含铁化合物与油酸盐反应生成固体d油酸铁，而后在沸点高于200°C的烯烃中将油酸铁加热分解生成磁性四氧化三铁粒子，同时与油酸作用，使四氧化三铁表面形成油酸包覆层，得到油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子(即步骤(4)所述分离得到的沉淀物)，从而提高四氧化三铁粒子的稳定性并使得其表面具有亲脂性，使得其容易溶于有机溶剂中，并与PEG修饰的脂质分子反应，使得油酸包覆的四氧化三铁粒子表面包覆上PEG修饰的脂质分子，而后通过PEG与靶向分子连接，而使得磁性纳米粒子表面连接有靶向分子从而具有靶向治疗效果。
[0022]在本发明技术方案中，在本发明提供的技术方案的基础上，所述含铁化合物为三乙酰丙酮铁、五羰基铁、辛酸铁、草酸铁、乙酸铁、氯化铁、氯化亚铁、氢氧化铁或氢氧化亚铁中的任意一种或者至少两种的混合物。
[0023]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述靶向分子为硫磺素S、硫磺素T、刚果红、二乙烯苯或其衍生物中的任意一种或至少两种的组合。
[0024]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述PEG修饰的脂质分子为DSPE-PEG5000-NHS, DSPE-PEG2000-NHS或它们的衍生物中的任意一种或至少两种的组合。
[0025]在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(I)所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇或丙三醇中的任意一种或至少两种的混合物；
[0026]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(I)所述溶液a的浓度为10?50mg/mL ;即每mL溶液a中含有10?50mg的含铁化合物，例如溶液a的浓度可以为12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、24mg/mL、28mg/mL、32mg/mL、36mg/mL、40mg/mL、44mg/mL 或 48mg/mL。
[0027]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(I)所述水和醇的体积比为1:1-1:3，例如可以为 1:1、1:2 或 1:3。
[0028]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上 ，步骤(2)所述油酸盐为油酸钾、油酸钠或油酸铵中的任意一种或至少两种的混合物。
[0029]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(2)所述油酸盐与步骤(I)所述含铁化合物中铁元素的摩尔比彡3:1，例如可以为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1等。
[0030]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(2)所述油酸盐的质量占溶液b质量的 8 ?25wt%，例如 9wt%、10wt%、12wt%、14wt%、16wt%、18wt%、20wt%、22wt%、23wt %、24wt % 或 25wt %。
[0031]步骤(2)中油酸盐的作用是其可以和含铁化合物反应形成油酸铁，油酸铁与油酸混合，在高温下发生热分解后形成的四氧化三铁，同时其外面会形成油酸包覆层，这一方面有利于控制四氧化三铁纳米粒子的尺寸，另一方面也便于溶解于四氧化三铁可溶于有机溶剂，进而可与PEG修饰的脂质分子一同溶解在有机溶剂中，进而可以与PEG修饰的脂质分子进行作用，实现对四氧化三铁表面的进一步修饰。
[0032]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(3)所述反应时间为2_4h，例如2h、2.5h、3h、3.5h 或 4h。
[0033]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(3)所述回流在搅拌下进行，所述干燥为真空干燥；
[0034]在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)所述沸点高于200°C的烯烃为碳链长度为12-18个碳的烯烃，优选为十二烯、十四烯、十六烯或十八烯中的任意一种或者至少两种的混合物。
[0035]本发明所述沸点高于200°C的烯烃除了作为溶剂，也有少部分起到还原剂的作用，即利用烯烃中含有的双键的还原性，从而可以使得油酸铁热分解过程中部分三价铁还原为二价铁，从而实现生成四氧化三铁纳米粒子的目的。
[0036]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每Ig固体d，步骤(4)所述油酸的用量为 0.5 ?1.5mL，例如 0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.lmL、1.2mL、1.3mL 或1.4mL。
[0037]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每Ig固体d，步骤(4)所述沸点高于200°C的烯烃的用量为10?20mL，例如10mL、12mL、14mL、16mL、18mL或20mL。
[0038]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)所述絮凝沉淀利用絮凝剂来实现，所述絮凝剂优选乙醇；
[0039]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述絮凝剂的加入量为溶液e体积的2?10倍，例如2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍或9.5倍。
[0040]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)利用磁铁分离沉淀物。
[0041]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，利用磁铁分离沉淀物过程重复3?10次，例如4次、5次、6次、7次、8次或9次。
[0042]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、甲苯或正己烷中的任意一种或者至少两种的混合物。
[0043]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每1mg沉淀物，步骤(4)所述有机溶剂的用量为5?10mL，例如5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或I OmL。
[0044]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)所述保护性气体为氮气。
[0045]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每1mg沉淀物，步骤(5)所述PEG修饰的脂质分子的用量为10?80mg，例如10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg或80mgo
[0046]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每1mg沉淀物，步骤(5)所述水的加入量为5?10mL，例如5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
[0047]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每1mg沉淀物，步骤(6)所述革巴向分子的加入量为I?5mg，例如lmg、2mg、3mg、4mg或5mg。
[0048]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(6)所述室温反应在搅拌下进行。
[0049]在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(6)所述透析采用现有技术实现，例如将室温反应后的溶液用截留分子量为3，500的渗析袋在水中进行渗析。
[0050]本发明的目的之三在于提供一种超顺磁性造影剂，所述超顺磁性造影剂包含本发明所述的超顺磁性纳米颗粒。
[0051]本发明的目的之四在于提供一种所述超顺磁性造影剂的制备方法，所述方法为:将本发明所述的超顺磁性纳米颗粒分散于水中形成稳定的分散体系，而后过膜除菌(例如所述过膜可以利用0.22微米滤膜来实现)，得到所述超顺磁性造影剂。
[0052]作为优选技术方案，本发明所述超顺磁性造影剂的制备方法，具体包括以下步骤:
[0053](I)将含铁化合物溶解在水和醇中，形成溶液a ;
[0054](2)将油酸盐溶解于烷烃中形成溶液b ;
[0055](3)将溶液a与b混合，加热到50?90°C，回流，得到溶液C，水洗，干燥得固体d ；
[0056](4)固体d与油酸溶于沸点高于200°C的烯烃中，在惰性气体保护下，加热到280?350°C得到溶液e，冷却至室温，絮凝沉淀，分离沉淀物，溶解在有机溶剂中得到溶液f ;
[0057](5)将PEG修饰的脂质分子溶解于溶液f中，除去有机溶剂，加水分散得到分散体系g ;
[0058](6)在分散体系g中加入靶向分子，室温反应24_72h，透析，得到所述超顺磁性纳米颗粒；
[0059](7)将步骤(6)所得超顺磁性纳米颗粒分散于水中形成稳定的分散体系，而后用0.22微米滤膜过滤除菌，得到所述超顺磁性造影剂。
[0060]本发明所述的超顺磁性造影剂可以用于阿尔茨海默病核磁共振成像。
[0061]与现有技术相比，本发明及优选的技术方案具有如下有益效果:
[0062]本发明通过由油酸包覆四氧化三铁纳米粒子，最外层又包覆PEG修饰的脂质分子，提高了磁性纳米粒子在体内的稳定性和生物相容性，使产物可在生理环境中长时间稳定存在，有利于在体内保持长循环，解决了现有商品化造影剂结晶度低、饱和磁化强度小、MRI成像效果差的问题，且具有很好的生物相容性，将靶向分子连接在PEG上，使得产物的纳米粒径进一步减小，粒径分布范围变窄，进一步提高了产物的稳定性，同时提高了产物的靶向性，可用于开发具有靶向性的核磁共振成像造影剂。本发明通过连接靶向分子实现了超顺磁性氧化铁造影剂能够靶向阿尔茨海默病的病变组织，解决了现有商品化氧化铁造影剂难以跨过血脑屏障，在脑部聚集性差的问题。
【附图说明】
[0063]图1是本发明实施例1制备的超顺磁性纳米颗粒造影剂的透射电镜图；
[0064]图2是本发明实施例1制备的连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)和未连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(MNPs)的水力学直径的对比图；
[0065]图3是本发明实施例1制备的连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)和未连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(MNPs)的弛豫率测试结果图；
[0066]图4是本发明实施例1制备的连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs，B图)和未连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(MNPs，A图)用于阿尔茨海默病核磁共振成像的效果图。
【具体实施方式】
[0067]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本 发明的具体限制。
[0068]实施例1
[0069]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0070](I)称取3g三氯化铁溶于40mL蒸馏水和40mL乙醇的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为37.5mg/mL)；
[0071](2)称取17g油酸钠分散于SOmL正己烷中，形成溶液b(即其中油酸盐的质量分数为 23.5wt% )；
[0072](3)将溶液a*b混合后，加热到60°C，搅拌回流4h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0073](4)将Ig固体d溶于20mL十八稀中，加入0.5mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到3000C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入41mL乙醇絮凝，磁铁分离3次后，将1mg沉淀物分散到5mL 二氯甲烷中，得到溶液f ;
[0074](5)向溶液f中加入1mg DSPE-PEG2000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入5mL超纯水超声得到分散体系g ；
[0075](6)向分散体系g中加入4mg刚果红，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)。
[0076]利用透射电镜(JEOL 2100F)对实施例1制备得到的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂进行表征，结果如图1所示，所得产物粒径为15-30nm，为合成的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂粒径尺寸。
[0077]利用动态光散射仪(Malvern)测定实施例1制备的连接革E向分子超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)和未连接靶向分子(即直接将溶液g用0.22微米滤膜过滤除菌得到的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，用MNPs表示)的水力学直径，结果如图2所示，由图2可知，连接靶向分子刚果红后，纳米粒径的分布范围从20-90nm变为20_55nm，小粒径占有的数量百分比增大，平均粒径变小，从而得到了尺寸更加均一，粒径分布范围更窄的纳米颗粒。
[0078]对实施例1 (刚果红-MNPs)和对比例I (MNPs)制备的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂的弛豫率进行表征，方法如下，将样品配制成5个不同铁离子浓度的样品，各取200 UL于测试管中，室温下使用MQ60磁共振测试仪，设定Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列测定样品的自旋-自旋弛豫时间T2，以铁离子浓度和弛豫率民(1/%)做线性回归曲线，经计算得到的斜率即为弛豫效率。
[0079]结果如图3所示，实施例1制备的刚果红修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)和对比例I制备的不连接靶向分子的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂(MNPs)的弛豫率呈现很好的线性关系，民分别为166??'-1和168??''即在用PEG修饰的脂质分子包覆的四氧化三铁纳米粒子外连接上革G向分子，仍能够使超顺磁性纳米颗粒造影剂具有很好的弛豫性能。
[0080]通过尾静脉注射向阿尔茨海默病模型小鼠体内注射300 μ L实施例1制备的造影剂的生理缓冲溶液，以对比例制备的造影剂作为对照，24h后使用7T核磁共振成像在合适的序列下成像，结果如图4所示，与未连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂相比，连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂在淀粉样蛋白斑处灰度值降低，能看到明显的淀粉样蛋白斑成像效果，实现了对淀粉样蛋白斑的核磁共振成像。
[0081]实施例2
[0082]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0083](I)称取0.8g草酸铁溶于20mL蒸馏水和60mL乙醇的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为10mg/mL)；
[0084](2)称取5.17g油酸钠分散于80mL正己烷中，形成溶液b (即其中油酸盐的质量分数为 8.5wt% )；
[0085](3)将溶液a*b混合后，加热到50°C，搅拌回流2h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0086](4)将Ig固体d溶于1mL十八烯中，加入1.0mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到2800C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入44mL乙醇絮凝，磁铁分离3次后，将1mg沉淀物分散到1mL三氯甲烷中，得到溶液f ;
[0087](5)向溶液f中加入30mg DSPE-PEG2000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入SmL超纯水超声分散，得到分散体系g ;
[0088](6)向分散体系g中加入Img刚果红，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂。
[0089]经电镜表征粒径为5_50nm，动态光散射对连接革E向分子前后的纳米粒子表征，发现在连接靶向分子刚果红后，粒径分布从5-100nm变为5_50nm，粒径分布范围变窄，小粒径占有的数量百分比增大，而且弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0090]实施例3
[0091]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0092](I)称取4g三乙酰丙酮铁溶于40mL蒸馏水和40mL正丙醇的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为50mg/mL)；
[0093](2)称取18.45g油酸钠分散于80mL正己烷中，形成溶液b (即其中油酸盐的质量分数为25Wt % )；
[0094](3)将溶液a和b混合后，加热到90°C，搅拌回流3h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0095](4)将Ig固体d溶于15mL十八稀中，加入1.5mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到3500C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入160mL乙醇絮凝，磁铁分离5次后，将1mg沉淀物分散到1mL 二氯甲烷中，得到溶液f ;
[0096](5)向溶液f中加入80mg DSPE-PEG2000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入1mL超纯水超声分散，得到分散体系g ;
[0097](6)向分散体系g中加入5mg硫磺素T，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂。
[0098]经电镜表征粒径为l_30nm，动态光散射对连接革E向分子前后的纳米粒子表征，发现在连接革E向分子硫磺素T后，粒径分布从l-70nm变为l_30nm，粒径分布范围变窄，小粒径占有的数量百分比增大，而且弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0099]实施例4
[0100]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0101 ] (I)称取0.8g三氯化铁和0.8g辛酸铁溶于40mL蒸馏水和40mL乙醇的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为20mg/mL)；
[0102](2)称取11.07g油酸钠分散于80mL正己烷中，形成溶液b(即其中油酸盐的质量分数为2Owt % )；
[0103](3)将溶液a*b混合后，加热到70°C，搅拌回流4h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0104](4)将Ig固体d溶于20mL十六稀中，加入1.5mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到300°C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入IlOmL乙醇絮凝，磁铁分离10次后，将1mg沉淀物分散到1mL四氢呋喃中，得到溶液f ；
[0105](5)向溶液f中加入40mg DSPE-PEG5000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入1mL超纯水超声分散，得到分散体系g ;
[0106](6)向分散体系g中加入3mg硫磺素S，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂。
[0107]经电镜表征粒径为5_30nm，动态光散 射对连接革E向分子前后的纳米粒子表征，发现在连接革E向分子硫磺素S后，粒径分布从5-80nm变为5_30nm，粒径分布范围变窄，小粒径占有的数量百分比增大，而且弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0108]经表征粒径为l_30nm，弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0109]实施例5
[0110]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0111](I)称取0.8g草酸铁溶于20mL蒸馏水和30mL乙醇和30丙三醇mL的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为10mg/mL)；
[0112](2)称取6.15g油酸钠分散于SOmL正己烷中，形成溶液b (即其中油酸盐的质量分数为 8.5wt% )；
[0113](3)将溶液a*b混合后，加热到50°C，搅拌回流2h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0114](4)将Ig固体d溶于15mL十八稀中，加入1.0mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到2800C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入32mL乙醇絮凝，磁铁分离3次后，将1mg沉淀物分散到1mL正己烷中，得到溶液f ;
[0115](5)向溶液f中加入30mg DSPE-PEG2000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入SmL超纯水超声分散，得到分散体系g ;
[0116](6)向分散体系g中加入Img刚果红，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂。
[0117]经电镜表征粒径为5_30nm，动态光散射对连接革E向分子前后的纳米粒子表征，发现在连接靶向分子刚果红后，粒径分布从5-70nm变为5_30nm，粒径分布范围变窄，小粒径占有的数量百分比增大，而且弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0118]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种超顺磁性纳米颗粒，其特征在于，所述超顺磁性纳米颗粒包含位于核心的油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子、包覆在油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子表面的PEG修饰的脂质分子，以及与PEG连接的靶向分子。2.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米颗粒，其特征在于，所述靶向分子为硫磺素S、硫磺素T、刚果红、二乙烯苯或所述分子的衍生物中的一种或至少两种的组合。3.根据权利要求1或2所述的超顺磁性纳米颗粒，其特征在于，所述四氧化三铁纳米粒子的粒径为I?10nm ； 优选地，所述PEG修饰的脂质分子为DSPE-PEG5000-NHS、DSPE-PEG2000-NHS或它们的衍生物中的任意一种或至少两种的组合。4.根据权利要求1-3中任一项所述的超顺磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法以PEG修饰的脂质分子为修饰剂，热分解含铁化合物，而后将靶向分子连接在PEG上，得到所述超顺磁性纳米颗粒。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将含铁化合物溶解在水和醇中，形成溶液a; (2)将油酸盐溶解于烷烃中形成溶液b; (3)将溶液a与b混合，加热到50?90°C，回流反应，得到溶液C，水洗，干燥得固体d； (4)固体d与油酸溶于沸点高于200°C的烯烃中，在保护性气体下，加热到280?350°C得到溶液e，冷却至室温，絮凝沉淀，分离沉淀物，溶解在有机溶剂中得到溶液f ; (5)将PEG修饰的脂质分子溶解于溶液f中，除去有机溶剂，加水分散得到分散体系g; (6)在分散体系g中加入靶向分子，室温反应24-72h，透析，得到所述超顺磁性纳米颗粒。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述含铁化合物为三乙酰丙酮铁、五羰基铁、辛酸铁、草酸铁、乙酸铁、氯化铁、氯化亚铁、氢氧化铁或氢氧化亚铁中的任意一种或者至少两种的混合物； 优选地，所述靶向分子为硫磺素S、硫磺素T、刚果红、二乙烯苯或其衍生物中的任意一种或至少两种的组合； 优选地，所述PEG修饰的脂质分子为DSPE-PEG5000-NHS、DSPE-PEG2000-NHS或它们的衍生物中的任意一种或至少两种的组合。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇或丙三醇中的任意一种或至少两种的混合物； 优选地，步骤⑴所述溶液a的浓度为10?50mg/mL ； 优选地，步骤(I)所述水和醇的体积比为1:1-1:3 ; 优选地，步骤(2)所述油酸盐为油酸钾、油酸钠或油酸铵中的任意一种或至少两种的混合物； 优选地，步骤(2)所述油酸盐与步骤(I)所述含铁化合物中铁元素的摩尔比多3:1 ； 优选地，步骤⑵所述油酸盐的质量占溶液b质量的8?25wt% ； 优选地，步骤(3)所述反应时间为2-4h ; 优选地，步骤(3)所述回流在搅拌下进行，所述干燥为真空干燥。8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述沸点高于200°C的烯烃为碳链长度为12-18个碳的烯烃，优选为十二烯、十四烯、十六烯或十八烯中的任意一种或者至少两种的混合物； 优选地，相对于每Ig固体d，步骤(4)所述油酸的用量为0.5?1.5mL ； 优选地，相对于每Ig固体d，步骤(4)所述沸点高于200°C的稀径的用量为10?20mL ； 优选地，步骤(4)所述絮凝沉淀利用絮凝剂来实现，所述絮凝剂优选乙醇； 优选地，所述絮凝剂的加入量为溶液e体积的2?10倍； 优选地，步骤(4)利用磁铁分离沉淀物； 优选地，利用磁铁分离沉淀物过程重复3?10次； 优选地，步骤(4)所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、甲苯或正己烷中的任意一种或者至少两种的混合物； 优选地，相对于每1mg沉淀物，步骤⑷所述有机溶剂的用量为5?1mL ； 优选地，步骤(4)所述保护性气体为氮气； 优选地，相对于每1mg沉淀物，步骤(5)所述PEG修饰的脂质分子的用量为10?80mg ； 优选地，相对于每1mg沉淀物，步骤(5)所述水的加入量为5?1mL ； 优选地，相对于每1mg沉淀物，步骤(6)所述革E向分子的加入量为I?5mg ； 优选地，步骤(6)所述室温反应在搅拌下进行。9.一种超顺磁性造影剂，其特征在于，所述超顺磁性造影剂包含根据权利要求1-3中任一项所述的超顺磁性纳米颗粒。10.根据权利要求9所述的超顺磁性造影剂的制备方法，其特征在于，所述方法为:将根据权利要求1-3中任一项所述的超顺磁性纳米颗粒分散于水中形成稳定的分散体系，而后过膜除菌，得到所述超顺磁性造影剂。
【专利摘要】本发明提供了一种超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和应用，所述超顺磁性纳米颗粒包含位于核心的油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子、包覆在油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子表面的PEG修饰的脂质分子，以及与PEG连接的靶向分子。本发明以PEG修饰的脂质分子为修饰剂，热分解含铁化合物，而后将靶向分子连接在PEG上，得到超顺磁性纳米颗粒。本发明超顺磁性纳米颗粒提高了磁性纳米粒子在体内的稳定性和生物相容性，连接靶向分子使得产物的纳米粒径进一步减小，粒径分布范围变窄，进一步提高了产物的稳定性，同时提高了产物的靶向性，改善了形成的超顺磁性造影剂在阿尔茨海默病的病变组织的成像效果。
【IPC分类】A61K49/12, A61K49/18
【公开号】CN104906600
【申请号】CN201510242805
【发明人】张欣, 代凤英, 胡冰冰
【申请人】中国科学院过程工程研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月13日
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米技术领域，涉及一种超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)是利用原子核在磁场内共振所产生信号经重建成像的一种成像技术。磁共振成像(MRI)作为一项新的医学影像诊断技术，近年来发展十分迅速。MRI所提供的信息量不但多于其他许多成像技术，而且以它所提供的特有信息对诊断疾病具有很大的潜在优越性，其具有分辨率高、成像参数多、使用安全等突出优点，因而更好的显示体内组织器官的结构和病变的性质及功能状态，能够大大提高诊断的准确性和早期性。但是当正常组织与病变组织的磁共振信号差异不明显时，会造成MRI诊断困难，这时就需要引入磁共振成像造影剂，提高组织对比度从而显示体内器官的功能与状态。因此可以使用磁共振成像造影剂来提高MRI诊断的敏感性和特异性。
[0003]MRI造影剂主要有顺磁性造影剂和超顺磁性造影剂两大类。目前常用的顺磁性造影剂是钆离子的配合物，如二乙二胺醋酸钆(Gd-DTPA)。但这种造影剂静脉注射后会迅速进入细胞间隙，导致成像时间缩短，为保持足够的对比度，需注射较大剂量。另外，小分子的Gd系造影剂特异性差。在静脉注射之后，Gd-DTPA会快速弥散。除了病变部位，在正常关节中也会富集一定量的Gd系分子，因而降低了 Gd分子造影的特异性，同时也减弱了病变部位的对比度，而且小分子造影剂会很快被肾脏所清除，对MRI和实时监测都造成了不便。超顺磁性造影剂主要由四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒构成。相对于顺磁性造影剂，超顺磁性造影剂的磁矩大，弛豫效能高，而且可以通过尺寸选择或特异性表面分子修饰实现对特定组织的靶向，并有独特的跨膜机理，可实现细胞内分子靶向。同时超顺磁性氧化铁纳米颗粒的血液半衰期、体内分布状态与其粒子的大小和表面状态有直接的关系。另外，粒径较小的超顺磁性氧化铁纳米颗粒具有较长的血液半衰期，并且具有穿过血管壁、细胞间隙、细胞膜、血脑屏障等各种生理屏障的能力。
[0004]超顺磁性造影剂的合成方法分为两类，一种是共沉淀法:即将一定量的葡聚糖高聚物、铁盐和亚铁盐溶于水，搅拌下滴加一定量的氨水，在一定温度下反应一段时间，可获得粒径约为25?40纳米的超顺磁性氧化铁纳米颗粒。目前合成已经许可上市和正在临床实验的超顺磁性造影剂方法主要是用共沉淀法获得，但是这类造影剂粒径较大、结晶度低、饱和磁化强度小、MRI成像效果差，表面包覆层的厚度不均；而另一类高温热分解合成的超顺磁性氧化铁纳米颗粒，虽然粒径较小且更加均一，氧化铁磁性能优越，但其水溶性和生理稳定性差的缺陷严重阻碍了其应用于体内成像，因而需要通过表面再修饰提高水溶性和生理稳定性及其靶向性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提供一种超顺磁性纳米颗粒，所述超顺磁性纳米颗粒包含位于核心的四氧化三铁纳米粒子、包覆在其表面的PEG修饰的脂质分子以及与PEG连接的靶向分子。所述超顺磁性纳米颗粒通过最外层包覆PEG修饰的脂质分子提高体内稳定性和生物相容性，从而获得了尺寸均一，生理稳定性优良且具备良好磁响应能力的超顺磁性氧化铁颗粒，同时连接靶向分子，能使纳米颗粒之间产生静电排斥，进一步提高纳米颗粒的分散性，减小了粒径，得到了更窄的粒径分布，同时实现了可以靶向病变组织的功能。
[0006]本发明采用以下技术方案，可以更好的达到和实现本发明的目的和有益效果。但是以下技术方案仅为优选技术方案，并非旨在限制本发明。
[0007]本发明提供了一种超顺磁性纳米颗粒，所述超顺磁性纳米颗粒包含位于核心的油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子、包覆在油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子表面的PEG修饰的脂质分子，以及与PEG连接的靶向分子。
[0008]在本发明提供的技术方案的基础上，所述靶向分子为硫磺素S、硫磺素T、刚果红、二乙烯苯或其衍生物中的一种或至少两种的组合。
[0009]在本发明提供的技术方案的基础上，所述四氧化三铁纳米粒子为油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子。
[0010]优选地，所述四氧化三铁纳米粒子的粒径为I?lOOnm。
[0011]在本发明提供的技术方案的基础上，所述PEG修饰的脂质分子为DSPE-PEG5000-NHS, DSPE-PEG2000-NHS或它们的衍生物中的任意一种或至少两种的组合。
[0012]本发明的目的之二在于提供一种超顺磁性纳米颗粒的制备方法，所述方法以PEG修饰的脂质分子为修饰剂，热分解含铁化合物，而后将靶向分子连接在PEG上，得到所述超顺磁性纳米颗粒。
[0013]利用本发明的方法采用高温热分解所获得氧化铁磁响应优越，通过由油酸包覆四氧化三铁纳米粒子，最外层又包覆PEG修饰的脂质分子提高磁性纳米粒子在体内的稳定性和生物相容性，同时修饰靶向分子，实现了可以靶向病变组织的功能，此外连接靶向分子之后可以进一步使产物的纳米粒径变小，从而更增加了产物的稳定性。
[0014]作为本发明的优选技术方案，本发明所述超顺磁性纳米颗粒的制备方法包括以下步骤:
[0015](I)将含铁化合物溶解在水和醇中，形成溶液a ;
[0016](2)将油酸盐溶解于烷烃中形成溶液b ;
[0017](3)将溶液a与b混合，加热到50?90°C，回流，得到溶液C，水洗，干燥得固体d ；
[0018](4)固体d与油酸溶于沸点高于200°C的烯烃中，在保护性气体下，加热到280?350°C得到溶液e，冷却至室温，絮凝沉淀，分离沉淀物，溶解在有机溶剂中得到溶液f ;
[0019](5)将PEG修饰的脂质分子溶解于溶液f中，除去有机溶剂，加水分散得到分散体系g ;
[0020](6)在分散体系g中加入靶向分子，室温反应24_72h，透析，得到所述超顺磁性纳米颗粒。
[0021]本发明利用含铁化合物与油酸盐反应生成固体d油酸铁，而后在沸点高于200°C的烯烃中将油酸铁加热分解生成磁性四氧化三铁粒子，同时与油酸作用，使四氧化三铁表面形成油酸包覆层，得到油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子(即步骤(4)所述分离得到的沉淀物)，从而提高四氧化三铁粒子的稳定性并使得其表面具有亲脂性，使得其容易溶于有机溶剂中，并与PEG修饰的脂质分子反应，使得油酸包覆的四氧化三铁粒子表面包覆上PEG修饰的脂质分子，而后通过PEG与靶向分子连接，而使得磁性纳米粒子表面连接有靶向分子从而具有靶向治疗效果。
[0022]在本发明技术方案中，在本发明提供的技术方案的基础上，所述含铁化合物为三乙酰丙酮铁、五羰基铁、辛酸铁、草酸铁、乙酸铁、氯化铁、氯化亚铁、氢氧化铁或氢氧化亚铁中的任意一种或者至少两种的混合物。
[0023]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述靶向分子为硫磺素S、硫磺素T、刚果红、二乙烯苯或其衍生物中的任意一种或至少两种的组合。
[0024]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述PEG修饰的脂质分子为DSPE-PEG5000-NHS, DSPE-PEG2000-NHS或它们的衍生物中的任意一种或至少两种的组合。
[0025]在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(I)所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇或丙三醇中的任意一种或至少两种的混合物；
[0026]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(I)所述溶液a的浓度为10?50mg/mL ;即每mL溶液a中含有10?50mg的含铁化合物，例如溶液a的浓度可以为12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、24mg/mL、28mg/mL、32mg/mL、36mg/mL、40mg/mL、44mg/mL 或 48mg/mL。
[0027]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(I)所述水和醇的体积比为1:1-1:3，例如可以为 1:1、1:2 或 1:3。
[0028]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上 ，步骤(2)所述油酸盐为油酸钾、油酸钠或油酸铵中的任意一种或至少两种的混合物。
[0029]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(2)所述油酸盐与步骤(I)所述含铁化合物中铁元素的摩尔比彡3:1，例如可以为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1等。
[0030]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(2)所述油酸盐的质量占溶液b质量的 8 ?25wt%，例如 9wt%、10wt%、12wt%、14wt%、16wt%、18wt%、20wt%、22wt%、23wt %、24wt % 或 25wt %。
[0031]步骤(2)中油酸盐的作用是其可以和含铁化合物反应形成油酸铁，油酸铁与油酸混合，在高温下发生热分解后形成的四氧化三铁，同时其外面会形成油酸包覆层，这一方面有利于控制四氧化三铁纳米粒子的尺寸，另一方面也便于溶解于四氧化三铁可溶于有机溶剂，进而可与PEG修饰的脂质分子一同溶解在有机溶剂中，进而可以与PEG修饰的脂质分子进行作用，实现对四氧化三铁表面的进一步修饰。
[0032]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(3)所述反应时间为2_4h，例如2h、2.5h、3h、3.5h 或 4h。
[0033]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(3)所述回流在搅拌下进行，所述干燥为真空干燥；
[0034]在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)所述沸点高于200°C的烯烃为碳链长度为12-18个碳的烯烃，优选为十二烯、十四烯、十六烯或十八烯中的任意一种或者至少两种的混合物。
[0035]本发明所述沸点高于200°C的烯烃除了作为溶剂，也有少部分起到还原剂的作用，即利用烯烃中含有的双键的还原性，从而可以使得油酸铁热分解过程中部分三价铁还原为二价铁，从而实现生成四氧化三铁纳米粒子的目的。
[0036]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每Ig固体d，步骤(4)所述油酸的用量为 0.5 ?1.5mL，例如 0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.lmL、1.2mL、1.3mL 或1.4mL。
[0037]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每Ig固体d，步骤(4)所述沸点高于200°C的烯烃的用量为10?20mL，例如10mL、12mL、14mL、16mL、18mL或20mL。
[0038]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)所述絮凝沉淀利用絮凝剂来实现，所述絮凝剂优选乙醇；
[0039]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述絮凝剂的加入量为溶液e体积的2?10倍，例如2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍或9.5倍。
[0040]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)利用磁铁分离沉淀物。
[0041]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，利用磁铁分离沉淀物过程重复3?10次，例如4次、5次、6次、7次、8次或9次。
[0042]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、甲苯或正己烷中的任意一种或者至少两种的混合物。
[0043]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每1mg沉淀物，步骤(4)所述有机溶剂的用量为5?10mL，例如5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或I OmL。
[0044]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)所述保护性气体为氮气。
[0045]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每1mg沉淀物，步骤(5)所述PEG修饰的脂质分子的用量为10?80mg，例如10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg或80mgo
[0046]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每1mg沉淀物，步骤(5)所述水的加入量为5?10mL，例如5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
[0047]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，相对于每1mg沉淀物，步骤(6)所述革巴向分子的加入量为I?5mg，例如lmg、2mg、3mg、4mg或5mg。
[0048]优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(6)所述室温反应在搅拌下进行。
[0049]在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(6)所述透析采用现有技术实现，例如将室温反应后的溶液用截留分子量为3，500的渗析袋在水中进行渗析。
[0050]本发明的目的之三在于提供一种超顺磁性造影剂，所述超顺磁性造影剂包含本发明所述的超顺磁性纳米颗粒。
[0051]本发明的目的之四在于提供一种所述超顺磁性造影剂的制备方法，所述方法为:将本发明所述的超顺磁性纳米颗粒分散于水中形成稳定的分散体系，而后过膜除菌(例如所述过膜可以利用0.22微米滤膜来实现)，得到所述超顺磁性造影剂。
[0052]作为优选技术方案，本发明所述超顺磁性造影剂的制备方法，具体包括以下步骤:
[0053](I)将含铁化合物溶解在水和醇中，形成溶液a ;
[0054](2)将油酸盐溶解于烷烃中形成溶液b ;
[0055](3)将溶液a与b混合，加热到50?90°C，回流，得到溶液C，水洗，干燥得固体d ；
[0056](4)固体d与油酸溶于沸点高于200°C的烯烃中，在惰性气体保护下，加热到280?350°C得到溶液e，冷却至室温，絮凝沉淀，分离沉淀物，溶解在有机溶剂中得到溶液f ;
[0057](5)将PEG修饰的脂质分子溶解于溶液f中，除去有机溶剂，加水分散得到分散体系g ;
[0058](6)在分散体系g中加入靶向分子，室温反应24_72h，透析，得到所述超顺磁性纳米颗粒；
[0059](7)将步骤(6)所得超顺磁性纳米颗粒分散于水中形成稳定的分散体系，而后用0.22微米滤膜过滤除菌，得到所述超顺磁性造影剂。
[0060]本发明所述的超顺磁性造影剂可以用于阿尔茨海默病核磁共振成像。
[0061]与现有技术相比，本发明及优选的技术方案具有如下有益效果:
[0062]本发明通过由油酸包覆四氧化三铁纳米粒子，最外层又包覆PEG修饰的脂质分子，提高了磁性纳米粒子在体内的稳定性和生物相容性，使产物可在生理环境中长时间稳定存在，有利于在体内保持长循环，解决了现有商品化造影剂结晶度低、饱和磁化强度小、MRI成像效果差的问题，且具有很好的生物相容性，将靶向分子连接在PEG上，使得产物的纳米粒径进一步减小，粒径分布范围变窄，进一步提高了产物的稳定性，同时提高了产物的靶向性，可用于开发具有靶向性的核磁共振成像造影剂。本发明通过连接靶向分子实现了超顺磁性氧化铁造影剂能够靶向阿尔茨海默病的病变组织，解决了现有商品化氧化铁造影剂难以跨过血脑屏障，在脑部聚集性差的问题。
【附图说明】
[0063]图1是本发明实施例1制备的超顺磁性纳米颗粒造影剂的透射电镜图；
[0064]图2是本发明实施例1制备的连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)和未连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(MNPs)的水力学直径的对比图；
[0065]图3是本发明实施例1制备的连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)和未连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(MNPs)的弛豫率测试结果图；
[0066]图4是本发明实施例1制备的连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs，B图)和未连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂(MNPs，A图)用于阿尔茨海默病核磁共振成像的效果图。
【具体实施方式】
[0067]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本 发明的具体限制。
[0068]实施例1
[0069]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0070](I)称取3g三氯化铁溶于40mL蒸馏水和40mL乙醇的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为37.5mg/mL)；
[0071](2)称取17g油酸钠分散于SOmL正己烷中，形成溶液b(即其中油酸盐的质量分数为 23.5wt% )；
[0072](3)将溶液a*b混合后，加热到60°C，搅拌回流4h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0073](4)将Ig固体d溶于20mL十八稀中，加入0.5mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到3000C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入41mL乙醇絮凝，磁铁分离3次后，将1mg沉淀物分散到5mL 二氯甲烷中，得到溶液f ;
[0074](5)向溶液f中加入1mg DSPE-PEG2000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入5mL超纯水超声得到分散体系g ；
[0075](6)向分散体系g中加入4mg刚果红，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)。
[0076]利用透射电镜(JEOL 2100F)对实施例1制备得到的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂进行表征，结果如图1所示，所得产物粒径为15-30nm，为合成的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂粒径尺寸。
[0077]利用动态光散射仪(Malvern)测定实施例1制备的连接革E向分子超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)和未连接靶向分子(即直接将溶液g用0.22微米滤膜过滤除菌得到的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，用MNPs表示)的水力学直径，结果如图2所示，由图2可知，连接靶向分子刚果红后，纳米粒径的分布范围从20-90nm变为20_55nm，小粒径占有的数量百分比增大，平均粒径变小，从而得到了尺寸更加均一，粒径分布范围更窄的纳米颗粒。
[0078]对实施例1 (刚果红-MNPs)和对比例I (MNPs)制备的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂的弛豫率进行表征，方法如下，将样品配制成5个不同铁离子浓度的样品，各取200 UL于测试管中，室温下使用MQ60磁共振测试仪，设定Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列测定样品的自旋-自旋弛豫时间T2，以铁离子浓度和弛豫率民(1/%)做线性回归曲线，经计算得到的斜率即为弛豫效率。
[0079]结果如图3所示，实施例1制备的刚果红修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂(刚果红-MNPs)和对比例I制备的不连接靶向分子的超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂(MNPs)的弛豫率呈现很好的线性关系，民分别为166??'-1和168??''即在用PEG修饰的脂质分子包覆的四氧化三铁纳米粒子外连接上革G向分子，仍能够使超顺磁性纳米颗粒造影剂具有很好的弛豫性能。
[0080]通过尾静脉注射向阿尔茨海默病模型小鼠体内注射300 μ L实施例1制备的造影剂的生理缓冲溶液，以对比例制备的造影剂作为对照，24h后使用7T核磁共振成像在合适的序列下成像，结果如图4所示，与未连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂相比，连接靶向分子的超顺磁性纳米颗粒造影剂在淀粉样蛋白斑处灰度值降低，能看到明显的淀粉样蛋白斑成像效果，实现了对淀粉样蛋白斑的核磁共振成像。
[0081]实施例2
[0082]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0083](I)称取0.8g草酸铁溶于20mL蒸馏水和60mL乙醇的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为10mg/mL)；
[0084](2)称取5.17g油酸钠分散于80mL正己烷中，形成溶液b (即其中油酸盐的质量分数为 8.5wt% )；
[0085](3)将溶液a*b混合后，加热到50°C，搅拌回流2h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0086](4)将Ig固体d溶于1mL十八烯中，加入1.0mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到2800C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入44mL乙醇絮凝，磁铁分离3次后，将1mg沉淀物分散到1mL三氯甲烷中，得到溶液f ;
[0087](5)向溶液f中加入30mg DSPE-PEG2000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入SmL超纯水超声分散，得到分散体系g ;
[0088](6)向分散体系g中加入Img刚果红，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂。
[0089]经电镜表征粒径为5_50nm，动态光散射对连接革E向分子前后的纳米粒子表征，发现在连接靶向分子刚果红后，粒径分布从5-100nm变为5_50nm，粒径分布范围变窄，小粒径占有的数量百分比增大，而且弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0090]实施例3
[0091]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0092](I)称取4g三乙酰丙酮铁溶于40mL蒸馏水和40mL正丙醇的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为50mg/mL)；
[0093](2)称取18.45g油酸钠分散于80mL正己烷中，形成溶液b (即其中油酸盐的质量分数为25Wt % )；
[0094](3)将溶液a和b混合后，加热到90°C，搅拌回流3h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0095](4)将Ig固体d溶于15mL十八稀中，加入1.5mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到3500C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入160mL乙醇絮凝，磁铁分离5次后，将1mg沉淀物分散到1mL 二氯甲烷中，得到溶液f ;
[0096](5)向溶液f中加入80mg DSPE-PEG2000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入1mL超纯水超声分散，得到分散体系g ;
[0097](6)向分散体系g中加入5mg硫磺素T，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂。
[0098]经电镜表征粒径为l_30nm，动态光散射对连接革E向分子前后的纳米粒子表征，发现在连接革E向分子硫磺素T后，粒径分布从l-70nm变为l_30nm，粒径分布范围变窄，小粒径占有的数量百分比增大，而且弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0099]实施例4
[0100]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0101 ] (I)称取0.8g三氯化铁和0.8g辛酸铁溶于40mL蒸馏水和40mL乙醇的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为20mg/mL)；
[0102](2)称取11.07g油酸钠分散于80mL正己烷中，形成溶液b(即其中油酸盐的质量分数为2Owt % )；
[0103](3)将溶液a*b混合后，加热到70°C，搅拌回流4h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0104](4)将Ig固体d溶于20mL十六稀中，加入1.5mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到300°C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入IlOmL乙醇絮凝，磁铁分离10次后，将1mg沉淀物分散到1mL四氢呋喃中，得到溶液f ；
[0105](5)向溶液f中加入40mg DSPE-PEG5000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入1mL超纯水超声分散，得到分散体系g ;
[0106](6)向分散体系g中加入3mg硫磺素S，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂。
[0107]经电镜表征粒径为5_30nm，动态光散 射对连接革E向分子前后的纳米粒子表征，发现在连接革E向分子硫磺素S后，粒径分布从5-80nm变为5_30nm，粒径分布范围变窄，小粒径占有的数量百分比增大，而且弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0108]经表征粒径为l_30nm，弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0109]实施例5
[0110]在本实施例中，通过以下方法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂，具体包括以下步骤:
[0111](I)称取0.8g草酸铁溶于20mL蒸馏水和30mL乙醇和30丙三醇mL的混合溶剂中，形成溶液a (溶液a浓度为10mg/mL)；
[0112](2)称取6.15g油酸钠分散于SOmL正己烷中，形成溶液b (即其中油酸盐的质量分数为 8.5wt% )；
[0113](3)将溶液a*b混合后，加热到50°C，搅拌回流2h。水洗后，真空干燥得到固体d ;
[0114](4)将Ig固体d溶于15mL十八稀中，加入1.0mL油酸，氮气环境下，搅拌加热到2800C，保持lh，得到溶液e，冷却至室温，加入32mL乙醇絮凝，磁铁分离3次后，将1mg沉淀物分散到1mL正己烷中，得到溶液f ;
[0115](5)向溶液f中加入30mg DSPE-PEG2000-NHS，完全溶解后，除去有机溶剂，加入SmL超纯水超声分散，得到分散体系g ;
[0116](6)向分散体系g中加入Img刚果红，搅拌过夜，3，500分子量透析袋透析72h，用0.22微米滤膜过滤除菌，得到超顺磁性氧化铁纳米颗粒造影剂。
[0117]经电镜表征粒径为5_30nm，动态光散射对连接革E向分子前后的纳米粒子表征，发现在连接靶向分子刚果红后，粒径分布从5-70nm变为5_30nm，粒径分布范围变窄，小粒径占有的数量百分比增大，而且弛豫性能良好，可以在阿尔茨海默病模型小鼠体内核磁共振成像。
[0118]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种超顺磁性纳米颗粒，其特征在于，所述超顺磁性纳米颗粒包含位于核心的油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子、包覆在油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子表面的PEG修饰的脂质分子，以及与PEG连接的靶向分子。2.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米颗粒，其特征在于，所述靶向分子为硫磺素S、硫磺素T、刚果红、二乙烯苯或所述分子的衍生物中的一种或至少两种的组合。3.根据权利要求1或2所述的超顺磁性纳米颗粒，其特征在于，所述四氧化三铁纳米粒子的粒径为I?10nm ； 优选地，所述PEG修饰的脂质分子为DSPE-PEG5000-NHS、DSPE-PEG2000-NHS或它们的衍生物中的任意一种或至少两种的组合。4.根据权利要求1-3中任一项所述的超顺磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法以PEG修饰的脂质分子为修饰剂，热分解含铁化合物，而后将靶向分子连接在PEG上，得到所述超顺磁性纳米颗粒。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将含铁化合物溶解在水和醇中，形成溶液a; (2)将油酸盐溶解于烷烃中形成溶液b; (3)将溶液a与b混合，加热到50?90°C，回流反应，得到溶液C，水洗，干燥得固体d； (4)固体d与油酸溶于沸点高于200°C的烯烃中，在保护性气体下，加热到280?350°C得到溶液e，冷却至室温，絮凝沉淀，分离沉淀物，溶解在有机溶剂中得到溶液f ; (5)将PEG修饰的脂质分子溶解于溶液f中，除去有机溶剂，加水分散得到分散体系g; (6)在分散体系g中加入靶向分子，室温反应24-72h，透析，得到所述超顺磁性纳米颗粒。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述含铁化合物为三乙酰丙酮铁、五羰基铁、辛酸铁、草酸铁、乙酸铁、氯化铁、氯化亚铁、氢氧化铁或氢氧化亚铁中的任意一种或者至少两种的混合物； 优选地，所述靶向分子为硫磺素S、硫磺素T、刚果红、二乙烯苯或其衍生物中的任意一种或至少两种的组合； 优选地，所述PEG修饰的脂质分子为DSPE-PEG5000-NHS、DSPE-PEG2000-NHS或它们的衍生物中的任意一种或至少两种的组合。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇或丙三醇中的任意一种或至少两种的混合物； 优选地，步骤⑴所述溶液a的浓度为10?50mg/mL ； 优选地，步骤(I)所述水和醇的体积比为1:1-1:3 ; 优选地，步骤(2)所述油酸盐为油酸钾、油酸钠或油酸铵中的任意一种或至少两种的混合物； 优选地，步骤(2)所述油酸盐与步骤(I)所述含铁化合物中铁元素的摩尔比多3:1 ； 优选地，步骤⑵所述油酸盐的质量占溶液b质量的8?25wt% ； 优选地，步骤(3)所述反应时间为2-4h ; 优选地，步骤(3)所述回流在搅拌下进行，所述干燥为真空干燥。8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述沸点高于200°C的烯烃为碳链长度为12-18个碳的烯烃，优选为十二烯、十四烯、十六烯或十八烯中的任意一种或者至少两种的混合物； 优选地，相对于每Ig固体d，步骤(4)所述油酸的用量为0.5?1.5mL ； 优选地，相对于每Ig固体d，步骤(4)所述沸点高于200°C的稀径的用量为10?20mL ； 优选地，步骤(4)所述絮凝沉淀利用絮凝剂来实现，所述絮凝剂优选乙醇； 优选地，所述絮凝剂的加入量为溶液e体积的2?10倍； 优选地，步骤(4)利用磁铁分离沉淀物； 优选地，利用磁铁分离沉淀物过程重复3?10次； 优选地，步骤(4)所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、甲苯或正己烷中的任意一种或者至少两种的混合物； 优选地，相对于每1mg沉淀物，步骤⑷所述有机溶剂的用量为5?1mL ； 优选地，步骤(4)所述保护性气体为氮气； 优选地，相对于每1mg沉淀物，步骤(5)所述PEG修饰的脂质分子的用量为10?80mg ； 优选地，相对于每1mg沉淀物，步骤(5)所述水的加入量为5?1mL ； 优选地，相对于每1mg沉淀物，步骤(6)所述革E向分子的加入量为I?5mg ； 优选地，步骤(6)所述室温反应在搅拌下进行。9.一种超顺磁性造影剂，其特征在于，所述超顺磁性造影剂包含根据权利要求1-3中任一项所述的超顺磁性纳米颗粒。10.根据权利要求9所述的超顺磁性造影剂的制备方法，其特征在于，所述方法为:将根据权利要求1-3中任一项所述的超顺磁性纳米颗粒分散于水中形成稳定的分散体系，而后过膜除菌，得到所述超顺磁性造影剂。
【专利摘要】本发明提供了一种超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和应用，所述超顺磁性纳米颗粒包含位于核心的油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子、包覆在油酸包覆的四氧化三铁纳米粒子表面的PEG修饰的脂质分子，以及与PEG连接的靶向分子。本发明以PEG修饰的脂质分子为修饰剂，热分解含铁化合物，而后将靶向分子连接在PEG上，得到超顺磁性纳米颗粒。本发明超顺磁性纳米颗粒提高了磁性纳米粒子在体内的稳定性和生物相容性，连接靶向分子使得产物的纳米粒径进一步减小，粒径分布范围变窄，进一步提高了产物的稳定性，同时提高了产物的靶向性，改善了形成的超顺磁性造影剂在阿尔茨海默病的病变组织的成像效果。
【IPC分类】A61K49/12, A61K49/18
【公开号】CN104906600
【申请号】CN201510242805
【发明人】张欣, 代凤英, 胡冰冰
【申请人】中国科学院过程工程研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月13日
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