一种基于树状大分子的具有rgd靶向功能的ct成像纳米造影剂的制备方法
一种基于树状大分子的具有rgd靶向功能的ct成像纳米造影剂的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于CT成像造影剂领域，特别涉及一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]RGD多肽因其能和整合素α νβ 3特异结合，在调节肿瘤生长、血管生成及转移方面起到重要作用。近几十年来，随着纳米技术的不断发展，各种纳米颗粒应运而生，尤其是连接RGD的纳米颗粒，因为其本身的肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞的双重靶向性能及与肿瘤相关的整合素的高亲和力，使其在靶向整合素的配体中有着广泛的应用。另外，金纳米颗粒由于其无细胞毒性、具有很好的化学稳定性、催化活性、生物相容性以及特殊的光学特性，使其可以很好的应用于蛋白质检测、光热治疗和体内疾病诊断等领域。然而单一的纳米颗粒有自身的缺点和局限性，因此寻找合适的方法合成多功能的复合纳米颗粒成为了当今纳米颗粒领域研宄的重点。
[0003]Au DENPs复合纳米颗粒作为多功能复合纳米颗粒中的一种，已被验证了可以成功应用于细胞分离、抗菌和体内双模态成像等方面。在之前的研宄中，公开了一种用于CT成像的增强生物相容性的用PEG修饰的Au DENPsO G5.NH2事先用mPEG_COOH和通过PEG连接的配体RGD修饰，G5.NH2-(PEG-RGD) 7-mPEG8用作包裹Au纳米颗粒。将剩余的树状大分子终端乙酰化，可以获得靶向整合蛋白α ν β 3的{(Au °) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_mPEG8}DENPs (PEGylatedAu DENPs-RGD)。PEGylatedAu DENPs-R⑶靶向探针通过分别通过 UV-Vis光谱、ICP-AES和TEM测定。在体外和体内分别通过乳腺癌细胞株(MDA-MB-435)和异种移植肿瘤模型评估靶向CT成像性能。PEGylatedAu DENPs-RGD探针的体内肿瘤摄入的组织学研宄和MDA-MB-435的移植瘤的α νβ 3整合素的表达确定了其为肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的双重靶向纳米颗粒。在体内实验中，生物分布显示该靶向纳米探针可以在96h内被清除，这是第一个报道PEGylated Au DENPs连接整合素作为肿瘤靶向CT成像的探针。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，该方法不仅提高了纳米颗粒的稳定性和生物相容性，而且对整合素高表达癌细胞及肿瘤血管内皮细胞具有特异性的双重靶向作用；制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
[0005]本发明的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，包括:
[0006](I)取RGD-PEG-COOH，加入二甲基亚砜DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反应2?4h，再加入树状大分子G5.NH2磁力搅拌反应2?4h，得到RGD-PEG修饰的树状大分子G5.NH2;然后取mPEG-COOH，加入DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反应2?4h ;再加入RGD-PEG修饰的树状大分子G5.NH2磁力搅拌反应2?4d，透析除去副产物和杂质，得到G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8;
[0007](2)在磁力震荡下将HAuCl4溶液加入G5.NH 2_ (PEG-RGD) 7_mPEG8，得到树状大分子/金盐混合物；20?40min后，将冰浴处理的NaBH4溶液加入树状大分子/金盐混合物中，继续搅拌I?3h，得到{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs ;在持续的磁力震荡下，将三乙胺加入{(Au0) 30Q-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs的水溶液中，20?40min后加入无水醋酸并持续搅拌，混合物持续反应20?28h，透析，得到{(Au°) 3(I(1-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs。
[0008]所述步骤(I)中的RGD-PEG-COOH、G5.順2和 mPEG-COOH 的质量比为 46.32mg:40.16mg:30.88mg。
[0009]所述步骤(I)中的EDC和NHS分别与RGD-PEG-COOH、mPEG-COOH的摩尔比均为5:5:1ο
[0010]所述步骤(I)中的RGD-PEG-C00H与DMSO的质量体积比为40.16mg: 10mL。
[0011]所述步骤(2)中的G5.NH2-(PEG-RGD)7IiPEGi^ 的 G5.NH 2与 HAuCl 4的摩尔比为300:1ο
[0012]所述步骤⑵中的三乙胺和无水醋酸的加入量分别为6.16 X 1^mmol,
6.16 X 10 3mmol ο
[0013]所述步骤(I)和⑵中的透析具体为采用PBS缓冲液和蒸馏水透析三天，每天3次，每次4L。
[0014]有益效果
[0015](I)本发明采用简单的复合纳米颗粒方法，然后进行乙酰化修饰；该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低；
[0016](2)本发明制备的{(Au°) 3QQ-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7-PEG8} DENPs 复合纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水溶液中，没有出现团聚现象。所用的修饰剂RGD成本低，具有产业化实施的前景。表面连接的甲氧基聚乙二醇(mPEG)又进一步提高了纳米颗粒的稳定性、亲水性和生物相容性。合成的纳米颗粒具有很好的CT成像效应，在体内CT成像诊断中有潜在的应用价值。
【附图说明】
[0017]图1 为{(Au0) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_PEG8} DENPs 的制备过程。
[0018]图2 为在室温 25 0C 下 G5.NH2-(PEG-RGD)7-PEGjP {(Au °) 300-G5.NHAc-(PEG-RGD)7_PEG8}DENPs溶解在水中的紫外可见光谱。
[0019]图3为高分辨率TEM图像(a)和PEGylatedAu DENPs-RGD的分布直方图(b)。
[0020]图4 为 PEGylatedAu DENPs-RGD 的 CT 值(a)和 Omnipaque (Au 和碘)作为放射性元素的分子聚集浓度(b)。
[0021]图5为不同浓度的PEGylated Au DENPs-R⑶治疗MDA-MB-435乳腺癌细胞4h的稳定性MTT测试。
[0022]图 6 为靶向 PEGylatedAu DENPs-RGD，非靶向 PEGylated Au DENPs-RGD，西仑吉肽(一种整合素α ν β 3抑制剂)阻滞的靶向NPs治疗MDA-MB-435乳腺癌细胞4h的细胞摄入Au的量。
[0023]图7为不同浓度的Au非靶向PEGylated Au DENPs-RGD,西仑吉肽阻滞的靶向NPs和靶向PEGylatedAu DENPs-RGD治疗细胞团块的CT值。
[0024]图8为将靶向Au DENPs (a)，西仑吉肽阻滞的靶向PEGylated Au DENPs-RGD (b)和靶向PEGylatedAu DENPs-RGD (c)静脉注射入负荷MDA-MB-435乳腺癌细胞的小鼠体内后0，2，6以及24h后的轴位CT图像，白色箭头指向肿瘤。
[0025]图9为将靶向Au DENPs,西仑吉肽阻滞的靶向PEGylatedAu DENPs-RGD和靶向PEGylated Au DENPs-RGD静脉注射入负荷MDA-MB-435乳腺癌细胞的小鼠体内后0，2，6以及24h后的CT值。
[0026]图10为银染色光学显微镜MDA-MB-435异种移植小鼠模型的图像:(a)静脉注射革巴向 PEGylated Au DENPs-RGD (200 μ L, [Au] = 0.1 Μ) ； (b)静脉注射非革巴向 PEGylatedAu DENPs-RGD(200 μ L, [Au] = 0.1Μ) ； (c)静脉注射靶向西仑吉肽阻滞的 PEGylated AuDENPs-RGD (200 μ L, [Au] = 0.1Μ) ； (d)阴性未做治疗的对照组。原始放大倍数为200。
[0027]图11为Au在小鼠主要器官中心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的Au生物分布。记录在不同时间点注射 PEGylated Au DENPs-RGD 探针(200 μ L, [Au] = 0.1Μ)后的数据。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0029]实施例1
[0030](I)取46.32mg RGD-PEG-COOH于一反应瓶中，加入二甲基亚砜(DMSO)使其溶解，然后加入EDC/NHS(69.48mg)反应3h。再加入40.16mg树状大分子G5.順2于1mlDMSO磁力搅拌反应3h。然后，取30.88mg mPEG-COOH于一反应瓶中，加入1ml 二甲亚砜(DMSO)使其溶解，然后加入EDC/NHS(69.48mg)反应3h。再加入40.16mg RGD-PEG修饰的树状大分子G5.順2于1ml DMSO磁力搅拌反应3d，接着溶液会逐渐变成浅黄色。将反应混合液用PBS缓冲液和蒸馏水透析三天(3次，4L/次)，除去副产物和杂质，获得产物G5.NH2- (PEG-RGD) 7-mPEG8冷冻干燥后备用。
[0031](2)在磁力震荡下将HAuCl4溶液加入G5.NH2-(PEG-RGD) 7-mPEG8 (G5.順2与金盐的摩尔比为300:1)。30min后，冰浴处理的5mol过剩的NaBH4溶液加入树状大分子/金盐混合物中，继续搅拌。几秒后，反应混合物变成深红色，完成整个反应需要2h的持续搅拌。最终标记的产物是{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs。将剩余的树状大分子终端氨基{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs乙酰化。简而言之，在持续的磁力震荡下，三乙胺(6.16 X 10_3mmol)加入{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs 的水溶液中。3Omin 后，无水醋酸(6.16 X 1^mmol)加入三乙胺/DENP的混合物中，并持续搅拌，混合物持续反应24h。最终将反应混合液用PBS缓冲液和蒸馏水透析三天(3次，4L/次)，获得产物{(Au0) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7-mPEG8} DENPs (PEGylatedAu DENPs-RGD)冷冻干燥后备用。
[0032](3)稀释的悬浮物PEGylated Au DENPs-RGD (lmg/mL，5 μ L)沉积在碳涂层铜网格，然后在风干之前进行测量。在获取数字图像后，每个样本的300个纳米颗粒随机选择并用ImageJ软件测量，并画出PEGylatedAu DENPs-RGD的分布直方图。在分析PEGylated AuDENPs-RGD样本时，将其放入水中溶解。ICP-AES (Leeman Prodigy，USA)用来分析PEGylatedAu DENPs-RGD 中 Au 的量。使用 64排螺旋 CT (Discovery CT750HD，GE healthcare)在 80kV、10mA下进行扫描。不同浓度的PEGylated Au DENPs-RGD的Au溶液0.2ml放入1.5ml的微量离心管中，计算出每个样本的CT值(HU)。
[0033](4)细胞培养:MDA-MB-435细胞在37°C，5% CO2的培养基中培养，其中的培养液为10%灭火的牛胎血清(FBS)，100U/mL青霉素以及100U/mL链霉素。本发明反应条件温和，合成步骤简单。制备的 PEGylatedAu DENPs-RGD复合纳米颗粒具有良好的胶体稳定性、生物相容性和X射线衰减特性，在CT成像诊断领域具有潜在的应用价值。
[0034](5)体外细胞的靶向CT成像:为了探测体外PEGylated Au DENPs-RGD探针的肿瘤细胞的CT靶向成像，将MDA-MB-435细胞分成3组，大约5X 106MDA-MB_435置入5ml的培养瓶中培养一整夜可以使细胞融合80%。然后，第一组培养基中加入含有5ml含有PEGylated Au DENPs-RGD ([Au] = 0，10，20，40，80，100 μ Μ)的培养液；第二组培养基中在加入 PEGylated Au DENPs-RGD ([Au] = 0，10，20，40，80，100 μ M，respectively)之前2h加入新鲜的整合素α νβ 3的抑制物RGD ;第三组的培养基加入非靶向的PEGylatedAuDENPs ([Au] = 0，10，20，40，80，100 μ M，respectively)。在培养 4h 后，培养液加入 1.5ml微量离心管中。所有内容物在64排螺旋CT(Discovery CT750HD，GE healthcare)在80kV、100mA下进行扫描，在工作站上测定CT值。
[0035](6)体内异种肿瘤细胞移植的靶向CT成像:24只4_6周的雌性BALB/c裸小鼠腋下注射IX 106MDA-MB-435，注射3周后，当肿瘤体积达到0.5-lcm3时，裸小鼠用戊巴比妥金星腹腔麻醉(40mg/kg)，然后随机分成三组，一组8只尾静脉注射200 μ L ofPEGylatedAuDENPs-RGD ([Au] =0.1M);第二组8 只在注射 200 μ L ofPEGylatedAu DENPs-RGD([Au]=
0.1M)之前腹腔注入200 μ L整合素ανβ3抑制剂(Cilengitide，EMD 121974);最后一组8只注入类似剂量的非靶向PEGylatedAu DENPs ([Au] = 0.1M)。在注射后2h，6h，24h用微型CT扫描，参数为80kV，450 μ Α,层厚45 μ m。在工作站上重建图像并测得CT值。
[0036](7)银增强染色与整合素α νβ 3免疫组化:从小鼠切除的肿瘤治疗不同的方法用PBS洗两次，并无菌嵌入在石蜡中进行组织学分析。按照制造商的指示，对整合素ανβ3进行免疫组化分析:将先把组织与兔子抗体murine在4°C培育一整夜，然后与多克隆二级抗体在室温下培育2小时。将组织部分在PBS洗三次，然后用3’-Diaminobenzidine (DAB)进行免疫组织化学分析。将组织放在复合显微镜下放大200倍进行拍照。
[0037](8)体内生物分布的研宄:六只雌性的BALB/c负荷肿瘤裸小鼠(22_25g)被用于体内PEGylatedAu DENPs-RGD的生物分布研宄。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后(40mg/kg)，小鼠在不同时间点(6、24和96h分别注入)尾静脉注射注射PEGylated Au DENPs-RGD (溶于
200μ L PBS中，(Au) = 0.1Μ)。然后，将小鼠安乐死，取出器官(包括心脏，肝，脾，肺和肾)和肿瘤并称重。将器官和肿瘤溶于硝基盐酸中。不同的器官和肿瘤吸收情况由ICP-AES测量。
[0038]测试结果:
[0039](I)PEGylated Au DENPs-R⑶的合成与表征:包含 PEG 的部分(RGD-PEG-COOH andmPEG-COOH)的PEG基团通过EDC耦合化学方法顺序共轭于G5.NH2。附着在聚合物表面的RGD肽有望通过向心配体-受体交互使粒子专门针对癌症细胞过度表达整合素。PEGylatedAu DENPs-RGD的光学性质通过紫外可见光谱进行表征。可以观察到的粒子有两个特征吸收峰:一个在520nm，这是由于Au NPs的典型的表面等离子体共振(SPR)，而另一个在280nm，由于共轭RGD基团的靶向成像。
[0040] (2) PEGylated Au DENPs-RGD 的靶向 X 射线衰减属性结果:将 PEGylatedAuDENPs-RGD靶向X射线衰减属性与Omnipaque进行对比(图4)，很显然，随着Au浓度的增加，CT图像的亮度增加。材料的衰减强度的增加存在剂量依赖。然而，PEGylated AuDENPs-RGD的革El向衰减特性比同样浓度下的Au或者I的Omnipaque大。综上，PEGylatedAuDENPs-RGD探针有助于增强CT对比度。
[0041 ] (3) PEGylated Au DENPs-RGD探针的体外细胞摄取结果:Au摄取靶向的PEGylated Au DENPs-R⑶治疗MDA-MB-435细胞的浓度显著高于非靶向的PEGylated AuDENPs-RGD (p〈0.01)，Au摄取靶向的 PEGylated Au DENPs-R⑶治疗MDA-MB-435细胞的浓度显著高于靶向NPs抑制的整合素ανβ3ο (ρ<0.01)ο此外，靶向NPs治疗整合素ανβ3-抑制的MDA-MB-435的Au摄入量与非靶向PEGylated Au DENPs探针无明显差异(p>0.05)。PEGylatedAu DENPs-RGD探针对于过度表达的肿瘤细胞，可以有效靶向整合素ανβ3。
[0042](4)肿瘤细胞的体外革巴向CT成像:靶向PEGylatedAu DENPs-RGD和非革巴向PEGylated Au DENPs治疗MDA-MB-435细胞的CT值比PBS缓冲液治疗的CT值要高很多，并且随着Au浓度的增加而增加(p〈0.01)。在相同Au的浓度下，靶向PEGylated Au DENPs-RGD培养的MDA-MB-435细胞CT值要高于非靶向PEGylated Au DENPs培养的MDA-MB-435细胞CT值(p〈0.01)。靶向PEGylatedAu DENPs-R⑶治疗的MDA-MB-435细胞CT值与西仑吉肽抑制的 PEGylatedAu DENPs-RGD 以及非靶向 PEGylated Au DENPs 治疗的 MDA-MB-435 细胞CT值无明显差异(p>0.05)。
[0043](5)肿瘤模型的体内靶向微CT成像:数据显示在注入探针后，肿瘤局部的CT值有明显增加(图9)。然而，在每一个时间点，肿瘤组织注入PEGylated Au DENPs-RGD探针比非靶向PEGylatedAu DENPs的CT值要高，这突出了 GRD基团在特定靶向中的功能。此外，数据显示PEGylated Au DENPs-R⑶特定靶向整合素ανβ3。通过R⑶调节靶向策略，这些纳米探针在肿瘤组织中有一个相对延长的保留时间，能够延长肿瘤CT成像的时间。另外，整合素α νβ 3抑制剂西仑吉肽的有效性随着时间延长而降低，靶向PEGylatedAu DENPs-RGD可以连接整合素ανβ3。
[0044](6)PEGylated Au DENPs-RGD探针的体内肿瘤摄入结果以及整合素ανβ3在MDA-MB-435移植瘤的表达:结果显示肿瘤组织摄入的PEGylatedAu DENPs-RGD是通过整合素ανβ3调节途径实现的，MDA-MB-435移植瘤能够表达整合素α νβ3，这可以促使PEGylatedAu DENPs-RGD 靶向 CT 成像。
[0045](7) PEGylatedAu DENPs-RGD探针的体内生物分布:数据显示在肝和脾中，肝Au的摄取量为 446 yg/g(6h)以及 564yg/g(24h)，脾 Au 的摄取量为 415yg/g(6h)以及 681 μ g/g(24h)，在肝和脾中，NPs的PEGylat1n可以避开网状内皮组织的识别，在其他主要器官中(比如心，肺和肾)，Au可以在肿瘤中聚集。PEGylated Au DENPs-RGD可以在肿瘤组织中聚积，Au的摄入量为18.5 μ g/g(6h)和28.8 μ g/g(24h)，能够促使有效的CT靶向成像。在主要器官中，Au的摄入量在注入96h和注射前的浓度为同样的水平，这意味着NPs可以在体内清除，这对临床生物医学成像应用非常重要。
【主权项】
1.一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，包括: (1)取RGD-PEG-COOH，加入二甲基亚砜DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反应2?4h，再加入树状大分子G5.NH2磁力搅拌反应2?4h，得到RGD-PEG修饰的树状大分子G5.NH2;然后取mPEG-COOH，加入DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反应2?4h ;再加入RGD-PEG修饰的树状大分子G5.NH2磁力搅拌反应2?4d，透析除去副产物和杂质，得到G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8; (2)在磁力震荡下将HAuCl4溶液加入G5.NH 2- (PEG-RGD) 7_mPEG8，得到树状大分子/金盐混合物；20?40min后，将冰浴处理的NaBH4溶液加入树状大分子/金盐混合物中，继续搅拌I?3h，得到{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs ;在持续的磁力震荡下，将三乙胺加入{(Au0) 30Q-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs的水溶液中，20?40min后加入无水醋酸并持续搅拌，混合物持续反应20?28h，透析，得到{(Au0) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_mPEG8}DENPs ο2.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的RGD-PEG-C00H、G5.順2和mPEG-COOH的质量比为 46.32mg: 40.16mg: 30.88mg。3.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的EDC和NHS分别与RGD-PEG-C00H、mPEG-COOH的摩尔比均为5:5:1。4.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的RGD-PEG-C00H与DMSO的质量体积比为40.16mg:10mL。5.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的G5.NH2-(PEG-RGD) 7-mPEG8中的G5.NH 2与HAuCl4的摩尔比为300:1。6.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的三乙胺和无水醋酸的加入量分别为6.16 X 10 3mmol、6.16 X 10 3mmol。7.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤⑴和⑵中的透析具体为采用PBS缓冲液和蒸馏水透析三天，每天3次，每次4L。
【专利摘要】本发明涉及一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，包括：(1)用RGD-PEG-COOH、mPEG-COOH修饰第5代端基为氨基的聚酰胺胺树状大分子，得到RGD修饰的聚乙二醇化树状大分子；(2)在上述功能化树状大分子溶液中加入氯金酸溶液，搅拌均匀后加入NaBH4溶液，再加入三乙胺、乙酸酐，反应结束后，将反应产物透析，冷冻干燥即得。本发明不仅提高了纳米颗粒的稳定性和生物相容性，而且对整合素高表达癌细胞及肿瘤血管内皮细胞均具有特异性的靶向作用；制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
【IPC分类】A61K49/12, A61K49/18
【公开号】CN104906601
【申请号】CN201510299214
【发明人】李康安, 张贵祥, 彭琛, 史向阳, 张承中
【申请人】上海市第一人民医院, 东华大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月3日
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于CT成像造影剂领域，特别涉及一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]RGD多肽因其能和整合素α νβ 3特异结合，在调节肿瘤生长、血管生成及转移方面起到重要作用。近几十年来，随着纳米技术的不断发展，各种纳米颗粒应运而生，尤其是连接RGD的纳米颗粒，因为其本身的肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞的双重靶向性能及与肿瘤相关的整合素的高亲和力，使其在靶向整合素的配体中有着广泛的应用。另外，金纳米颗粒由于其无细胞毒性、具有很好的化学稳定性、催化活性、生物相容性以及特殊的光学特性，使其可以很好的应用于蛋白质检测、光热治疗和体内疾病诊断等领域。然而单一的纳米颗粒有自身的缺点和局限性，因此寻找合适的方法合成多功能的复合纳米颗粒成为了当今纳米颗粒领域研宄的重点。
[0003]Au DENPs复合纳米颗粒作为多功能复合纳米颗粒中的一种，已被验证了可以成功应用于细胞分离、抗菌和体内双模态成像等方面。在之前的研宄中，公开了一种用于CT成像的增强生物相容性的用PEG修饰的Au DENPsO G5.NH2事先用mPEG_COOH和通过PEG连接的配体RGD修饰，G5.NH2-(PEG-RGD) 7-mPEG8用作包裹Au纳米颗粒。将剩余的树状大分子终端乙酰化，可以获得靶向整合蛋白α ν β 3的{(Au °) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_mPEG8}DENPs (PEGylatedAu DENPs-RGD)。PEGylatedAu DENPs-R⑶靶向探针通过分别通过 UV-Vis光谱、ICP-AES和TEM测定。在体外和体内分别通过乳腺癌细胞株(MDA-MB-435)和异种移植肿瘤模型评估靶向CT成像性能。PEGylatedAu DENPs-RGD探针的体内肿瘤摄入的组织学研宄和MDA-MB-435的移植瘤的α νβ 3整合素的表达确定了其为肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的双重靶向纳米颗粒。在体内实验中，生物分布显示该靶向纳米探针可以在96h内被清除，这是第一个报道PEGylated Au DENPs连接整合素作为肿瘤靶向CT成像的探针。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，该方法不仅提高了纳米颗粒的稳定性和生物相容性，而且对整合素高表达癌细胞及肿瘤血管内皮细胞具有特异性的双重靶向作用；制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
[0005]本发明的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，包括:
[0006](I)取RGD-PEG-COOH，加入二甲基亚砜DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反应2?4h，再加入树状大分子G5.NH2磁力搅拌反应2?4h，得到RGD-PEG修饰的树状大分子G5.NH2;然后取mPEG-COOH，加入DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反应2?4h ;再加入RGD-PEG修饰的树状大分子G5.NH2磁力搅拌反应2?4d，透析除去副产物和杂质，得到G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8;
[0007](2)在磁力震荡下将HAuCl4溶液加入G5.NH 2_ (PEG-RGD) 7_mPEG8，得到树状大分子/金盐混合物；20?40min后，将冰浴处理的NaBH4溶液加入树状大分子/金盐混合物中，继续搅拌I?3h，得到{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs ;在持续的磁力震荡下，将三乙胺加入{(Au0) 30Q-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs的水溶液中，20?40min后加入无水醋酸并持续搅拌，混合物持续反应20?28h，透析，得到{(Au°) 3(I(1-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs。
[0008]所述步骤(I)中的RGD-PEG-COOH、G5.順2和 mPEG-COOH 的质量比为 46.32mg:40.16mg:30.88mg。
[0009]所述步骤(I)中的EDC和NHS分别与RGD-PEG-COOH、mPEG-COOH的摩尔比均为5:5:1ο
[0010]所述步骤(I)中的RGD-PEG-C00H与DMSO的质量体积比为40.16mg: 10mL。
[0011]所述步骤(2)中的G5.NH2-(PEG-RGD)7IiPEGi^ 的 G5.NH 2与 HAuCl 4的摩尔比为300:1ο
[0012]所述步骤⑵中的三乙胺和无水醋酸的加入量分别为6.16 X 1^mmol,
6.16 X 10 3mmol ο
[0013]所述步骤(I)和⑵中的透析具体为采用PBS缓冲液和蒸馏水透析三天，每天3次，每次4L。
[0014]有益效果
[0015](I)本发明采用简单的复合纳米颗粒方法，然后进行乙酰化修饰；该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低；
[0016](2)本发明制备的{(Au°) 3QQ-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7-PEG8} DENPs 复合纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水溶液中，没有出现团聚现象。所用的修饰剂RGD成本低，具有产业化实施的前景。表面连接的甲氧基聚乙二醇(mPEG)又进一步提高了纳米颗粒的稳定性、亲水性和生物相容性。合成的纳米颗粒具有很好的CT成像效应，在体内CT成像诊断中有潜在的应用价值。
【附图说明】
[0017]图1 为{(Au0) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_PEG8} DENPs 的制备过程。
[0018]图2 为在室温 25 0C 下 G5.NH2-(PEG-RGD)7-PEGjP {(Au °) 300-G5.NHAc-(PEG-RGD)7_PEG8}DENPs溶解在水中的紫外可见光谱。
[0019]图3为高分辨率TEM图像(a)和PEGylatedAu DENPs-RGD的分布直方图(b)。
[0020]图4 为 PEGylatedAu DENPs-RGD 的 CT 值(a)和 Omnipaque (Au 和碘)作为放射性元素的分子聚集浓度(b)。
[0021]图5为不同浓度的PEGylated Au DENPs-R⑶治疗MDA-MB-435乳腺癌细胞4h的稳定性MTT测试。
[0022]图 6 为靶向 PEGylatedAu DENPs-RGD，非靶向 PEGylated Au DENPs-RGD，西仑吉肽(一种整合素α ν β 3抑制剂)阻滞的靶向NPs治疗MDA-MB-435乳腺癌细胞4h的细胞摄入Au的量。
[0023]图7为不同浓度的Au非靶向PEGylated Au DENPs-RGD,西仑吉肽阻滞的靶向NPs和靶向PEGylatedAu DENPs-RGD治疗细胞团块的CT值。
[0024]图8为将靶向Au DENPs (a)，西仑吉肽阻滞的靶向PEGylated Au DENPs-RGD (b)和靶向PEGylatedAu DENPs-RGD (c)静脉注射入负荷MDA-MB-435乳腺癌细胞的小鼠体内后0，2，6以及24h后的轴位CT图像，白色箭头指向肿瘤。
[0025]图9为将靶向Au DENPs,西仑吉肽阻滞的靶向PEGylatedAu DENPs-RGD和靶向PEGylated Au DENPs-RGD静脉注射入负荷MDA-MB-435乳腺癌细胞的小鼠体内后0，2，6以及24h后的CT值。
[0026]图10为银染色光学显微镜MDA-MB-435异种移植小鼠模型的图像:(a)静脉注射革巴向 PEGylated Au DENPs-RGD (200 μ L, [Au] = 0.1 Μ) ； (b)静脉注射非革巴向 PEGylatedAu DENPs-RGD(200 μ L, [Au] = 0.1Μ) ； (c)静脉注射靶向西仑吉肽阻滞的 PEGylated AuDENPs-RGD (200 μ L, [Au] = 0.1Μ) ； (d)阴性未做治疗的对照组。原始放大倍数为200。
[0027]图11为Au在小鼠主要器官中心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的Au生物分布。记录在不同时间点注射 PEGylated Au DENPs-RGD 探针(200 μ L, [Au] = 0.1Μ)后的数据。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0029]实施例1
[0030](I)取46.32mg RGD-PEG-COOH于一反应瓶中，加入二甲基亚砜(DMSO)使其溶解，然后加入EDC/NHS(69.48mg)反应3h。再加入40.16mg树状大分子G5.順2于1mlDMSO磁力搅拌反应3h。然后，取30.88mg mPEG-COOH于一反应瓶中，加入1ml 二甲亚砜(DMSO)使其溶解，然后加入EDC/NHS(69.48mg)反应3h。再加入40.16mg RGD-PEG修饰的树状大分子G5.順2于1ml DMSO磁力搅拌反应3d，接着溶液会逐渐变成浅黄色。将反应混合液用PBS缓冲液和蒸馏水透析三天(3次，4L/次)，除去副产物和杂质，获得产物G5.NH2- (PEG-RGD) 7-mPEG8冷冻干燥后备用。
[0031](2)在磁力震荡下将HAuCl4溶液加入G5.NH2-(PEG-RGD) 7-mPEG8 (G5.順2与金盐的摩尔比为300:1)。30min后，冰浴处理的5mol过剩的NaBH4溶液加入树状大分子/金盐混合物中，继续搅拌。几秒后，反应混合物变成深红色，完成整个反应需要2h的持续搅拌。最终标记的产物是{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs。将剩余的树状大分子终端氨基{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs乙酰化。简而言之，在持续的磁力震荡下，三乙胺(6.16 X 10_3mmol)加入{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs 的水溶液中。3Omin 后，无水醋酸(6.16 X 1^mmol)加入三乙胺/DENP的混合物中，并持续搅拌，混合物持续反应24h。最终将反应混合液用PBS缓冲液和蒸馏水透析三天(3次，4L/次)，获得产物{(Au0) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7-mPEG8} DENPs (PEGylatedAu DENPs-RGD)冷冻干燥后备用。
[0032](3)稀释的悬浮物PEGylated Au DENPs-RGD (lmg/mL，5 μ L)沉积在碳涂层铜网格，然后在风干之前进行测量。在获取数字图像后，每个样本的300个纳米颗粒随机选择并用ImageJ软件测量，并画出PEGylatedAu DENPs-RGD的分布直方图。在分析PEGylated AuDENPs-RGD样本时，将其放入水中溶解。ICP-AES (Leeman Prodigy，USA)用来分析PEGylatedAu DENPs-RGD 中 Au 的量。使用 64排螺旋 CT (Discovery CT750HD，GE healthcare)在 80kV、10mA下进行扫描。不同浓度的PEGylated Au DENPs-RGD的Au溶液0.2ml放入1.5ml的微量离心管中，计算出每个样本的CT值(HU)。
[0033](4)细胞培养:MDA-MB-435细胞在37°C，5% CO2的培养基中培养，其中的培养液为10%灭火的牛胎血清(FBS)，100U/mL青霉素以及100U/mL链霉素。本发明反应条件温和，合成步骤简单。制备的 PEGylatedAu DENPs-RGD复合纳米颗粒具有良好的胶体稳定性、生物相容性和X射线衰减特性，在CT成像诊断领域具有潜在的应用价值。
[0034](5)体外细胞的靶向CT成像:为了探测体外PEGylated Au DENPs-RGD探针的肿瘤细胞的CT靶向成像，将MDA-MB-435细胞分成3组，大约5X 106MDA-MB_435置入5ml的培养瓶中培养一整夜可以使细胞融合80%。然后，第一组培养基中加入含有5ml含有PEGylated Au DENPs-RGD ([Au] = 0，10，20，40，80，100 μ Μ)的培养液；第二组培养基中在加入 PEGylated Au DENPs-RGD ([Au] = 0，10，20，40，80，100 μ M，respectively)之前2h加入新鲜的整合素α νβ 3的抑制物RGD ;第三组的培养基加入非靶向的PEGylatedAuDENPs ([Au] = 0，10，20，40，80，100 μ M，respectively)。在培养 4h 后，培养液加入 1.5ml微量离心管中。所有内容物在64排螺旋CT(Discovery CT750HD，GE healthcare)在80kV、100mA下进行扫描，在工作站上测定CT值。
[0035](6)体内异种肿瘤细胞移植的靶向CT成像:24只4_6周的雌性BALB/c裸小鼠腋下注射IX 106MDA-MB-435，注射3周后，当肿瘤体积达到0.5-lcm3时，裸小鼠用戊巴比妥金星腹腔麻醉(40mg/kg)，然后随机分成三组，一组8只尾静脉注射200 μ L ofPEGylatedAuDENPs-RGD ([Au] =0.1M);第二组8 只在注射 200 μ L ofPEGylatedAu DENPs-RGD([Au]=
0.1M)之前腹腔注入200 μ L整合素ανβ3抑制剂(Cilengitide，EMD 121974);最后一组8只注入类似剂量的非靶向PEGylatedAu DENPs ([Au] = 0.1M)。在注射后2h，6h，24h用微型CT扫描，参数为80kV，450 μ Α,层厚45 μ m。在工作站上重建图像并测得CT值。
[0036](7)银增强染色与整合素α νβ 3免疫组化:从小鼠切除的肿瘤治疗不同的方法用PBS洗两次，并无菌嵌入在石蜡中进行组织学分析。按照制造商的指示，对整合素ανβ3进行免疫组化分析:将先把组织与兔子抗体murine在4°C培育一整夜，然后与多克隆二级抗体在室温下培育2小时。将组织部分在PBS洗三次，然后用3’-Diaminobenzidine (DAB)进行免疫组织化学分析。将组织放在复合显微镜下放大200倍进行拍照。
[0037](8)体内生物分布的研宄:六只雌性的BALB/c负荷肿瘤裸小鼠(22_25g)被用于体内PEGylatedAu DENPs-RGD的生物分布研宄。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后(40mg/kg)，小鼠在不同时间点(6、24和96h分别注入)尾静脉注射注射PEGylated Au DENPs-RGD (溶于
200μ L PBS中，(Au) = 0.1Μ)。然后，将小鼠安乐死，取出器官(包括心脏，肝，脾，肺和肾)和肿瘤并称重。将器官和肿瘤溶于硝基盐酸中。不同的器官和肿瘤吸收情况由ICP-AES测量。
[0038]测试结果:
[0039](I)PEGylated Au DENPs-R⑶的合成与表征:包含 PEG 的部分(RGD-PEG-COOH andmPEG-COOH)的PEG基团通过EDC耦合化学方法顺序共轭于G5.NH2。附着在聚合物表面的RGD肽有望通过向心配体-受体交互使粒子专门针对癌症细胞过度表达整合素。PEGylatedAu DENPs-RGD的光学性质通过紫外可见光谱进行表征。可以观察到的粒子有两个特征吸收峰:一个在520nm，这是由于Au NPs的典型的表面等离子体共振(SPR)，而另一个在280nm，由于共轭RGD基团的靶向成像。
[0040] (2) PEGylated Au DENPs-RGD 的靶向 X 射线衰减属性结果:将 PEGylatedAuDENPs-RGD靶向X射线衰减属性与Omnipaque进行对比(图4)，很显然，随着Au浓度的增加，CT图像的亮度增加。材料的衰减强度的增加存在剂量依赖。然而，PEGylated AuDENPs-RGD的革El向衰减特性比同样浓度下的Au或者I的Omnipaque大。综上，PEGylatedAuDENPs-RGD探针有助于增强CT对比度。
[0041 ] (3) PEGylated Au DENPs-RGD探针的体外细胞摄取结果:Au摄取靶向的PEGylated Au DENPs-R⑶治疗MDA-MB-435细胞的浓度显著高于非靶向的PEGylated AuDENPs-RGD (p〈0.01)，Au摄取靶向的 PEGylated Au DENPs-R⑶治疗MDA-MB-435细胞的浓度显著高于靶向NPs抑制的整合素ανβ3ο (ρ<0.01)ο此外，靶向NPs治疗整合素ανβ3-抑制的MDA-MB-435的Au摄入量与非靶向PEGylated Au DENPs探针无明显差异(p>0.05)。PEGylatedAu DENPs-RGD探针对于过度表达的肿瘤细胞，可以有效靶向整合素ανβ3。
[0042](4)肿瘤细胞的体外革巴向CT成像:靶向PEGylatedAu DENPs-RGD和非革巴向PEGylated Au DENPs治疗MDA-MB-435细胞的CT值比PBS缓冲液治疗的CT值要高很多，并且随着Au浓度的增加而增加(p〈0.01)。在相同Au的浓度下，靶向PEGylated Au DENPs-RGD培养的MDA-MB-435细胞CT值要高于非靶向PEGylated Au DENPs培养的MDA-MB-435细胞CT值(p〈0.01)。靶向PEGylatedAu DENPs-R⑶治疗的MDA-MB-435细胞CT值与西仑吉肽抑制的 PEGylatedAu DENPs-RGD 以及非靶向 PEGylated Au DENPs 治疗的 MDA-MB-435 细胞CT值无明显差异(p>0.05)。
[0043](5)肿瘤模型的体内靶向微CT成像:数据显示在注入探针后，肿瘤局部的CT值有明显增加(图9)。然而，在每一个时间点，肿瘤组织注入PEGylated Au DENPs-RGD探针比非靶向PEGylatedAu DENPs的CT值要高，这突出了 GRD基团在特定靶向中的功能。此外，数据显示PEGylated Au DENPs-R⑶特定靶向整合素ανβ3。通过R⑶调节靶向策略，这些纳米探针在肿瘤组织中有一个相对延长的保留时间，能够延长肿瘤CT成像的时间。另外，整合素α νβ 3抑制剂西仑吉肽的有效性随着时间延长而降低，靶向PEGylatedAu DENPs-RGD可以连接整合素ανβ3。
[0044](6)PEGylated Au DENPs-RGD探针的体内肿瘤摄入结果以及整合素ανβ3在MDA-MB-435移植瘤的表达:结果显示肿瘤组织摄入的PEGylatedAu DENPs-RGD是通过整合素ανβ3调节途径实现的，MDA-MB-435移植瘤能够表达整合素α νβ3，这可以促使PEGylatedAu DENPs-RGD 靶向 CT 成像。
[0045](7) PEGylatedAu DENPs-RGD探针的体内生物分布:数据显示在肝和脾中，肝Au的摄取量为 446 yg/g(6h)以及 564yg/g(24h)，脾 Au 的摄取量为 415yg/g(6h)以及 681 μ g/g(24h)，在肝和脾中，NPs的PEGylat1n可以避开网状内皮组织的识别，在其他主要器官中(比如心，肺和肾)，Au可以在肿瘤中聚集。PEGylated Au DENPs-RGD可以在肿瘤组织中聚积，Au的摄入量为18.5 μ g/g(6h)和28.8 μ g/g(24h)，能够促使有效的CT靶向成像。在主要器官中，Au的摄入量在注入96h和注射前的浓度为同样的水平，这意味着NPs可以在体内清除，这对临床生物医学成像应用非常重要。
【主权项】
1.一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，包括: (1)取RGD-PEG-COOH，加入二甲基亚砜DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反应2?4h，再加入树状大分子G5.NH2磁力搅拌反应2?4h，得到RGD-PEG修饰的树状大分子G5.NH2;然后取mPEG-COOH，加入DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反应2?4h ;再加入RGD-PEG修饰的树状大分子G5.NH2磁力搅拌反应2?4d，透析除去副产物和杂质，得到G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8; (2)在磁力震荡下将HAuCl4溶液加入G5.NH 2- (PEG-RGD) 7_mPEG8，得到树状大分子/金盐混合物；20?40min后，将冰浴处理的NaBH4溶液加入树状大分子/金盐混合物中，继续搅拌I?3h，得到{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs ;在持续的磁力震荡下，将三乙胺加入{(Au0) 30Q-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs的水溶液中，20?40min后加入无水醋酸并持续搅拌，混合物持续反应20?28h，透析，得到{(Au0) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_mPEG8}DENPs ο2.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的RGD-PEG-C00H、G5.順2和mPEG-COOH的质量比为 46.32mg: 40.16mg: 30.88mg。3.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的EDC和NHS分别与RGD-PEG-C00H、mPEG-COOH的摩尔比均为5:5:1。4.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的RGD-PEG-C00H与DMSO的质量体积比为40.16mg:10mL。5.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的G5.NH2-(PEG-RGD) 7-mPEG8中的G5.NH 2与HAuCl4的摩尔比为300:1。6.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的三乙胺和无水醋酸的加入量分别为6.16 X 10 3mmol、6.16 X 10 3mmol。7.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于:所述步骤⑴和⑵中的透析具体为采用PBS缓冲液和蒸馏水透析三天，每天3次，每次4L。
【专利摘要】本发明涉及一种基于树状大分子的具有RGD靶向功能的CT成像纳米造影剂的制备方法，包括：(1)用RGD-PEG-COOH、mPEG-COOH修饰第5代端基为氨基的聚酰胺胺树状大分子，得到RGD修饰的聚乙二醇化树状大分子；(2)在上述功能化树状大分子溶液中加入氯金酸溶液，搅拌均匀后加入NaBH4溶液，再加入三乙胺、乙酸酐，反应结束后，将反应产物透析，冷冻干燥即得。本发明不仅提高了纳米颗粒的稳定性和生物相容性，而且对整合素高表达癌细胞及肿瘤血管内皮细胞均具有特异性的靶向作用；制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
【IPC分类】A61K49/12, A61K49/18
【公开号】CN104906601
【申请号】CN201510299214
【发明人】李康安, 张贵祥, 彭琛, 史向阳, 张承中
【申请人】上海市第一人民医院, 东华大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月3日
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