一种人3d结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用
一种人3d结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用人自体表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞为种子细胞，培养具有3D复层结构表皮细胞膜片的技术及其在临床中的应用。表皮干细胞是一类异质性细胞，具有不同的亚类，其分子特征、分化能力及细胞巢(resident sites)都不相同。表皮干细胞主要包括:毛囊干细胞(HFSCs)、毛囊外根鞘干细胞、表达keratin-15的毛囊多潜能干细胞(follicle pluripotent stem cells，fPSCs)、皮脂腺干细胞(SGSCs)、汗腺干细胞(sweat stem cell)和黑色素干细胞(melancyte stem cell, EP1-NCSCs)和滤泡表皮干细胞(IFESCs)等。
[0002]主要技术包括WBB细胞培养基的应用，Wbbase混合酶分离表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞，细胞的单层扩增培养，细胞的诱导分化，3D结构表皮细胞膜片培养技术以及临床治疗技术。
【背景技术】
[0003]皮肤由表皮、真皮和皮下组织组成，是人体最大最复杂的器官，具有保护、分泌、感知和代谢功能。皮肤缺损、色素脱失和烧伤等是临床上的常见疾病，其最主要的治疗方法是自体皮肤移植或采用临时皮肤替代物覆盖。此外，白癜风也是一种常见性皮肤色素脱失性疾病，发病机制目前还不清楚，治疗方法有激光照射等物理治疗法、药物治疗法和自体表皮移植法等方法。表皮移植法需要自体皮肤，然而，由于人体皮肤有限，人们一直在寻找一种永久性皮肤替代物，但永久性皮肤替代物仍依赖于有活性的自体多种皮肤种子细胞，主要包括各种表皮干细胞等。
表皮干细胞具有终身、无限的自我更新能力。它是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞。从发生机制来看，干细胞并不直接分化产生终末分化细胞，而是先分化成短暂扩充细胞，短暂扩充细胞有产生定向分化成某种终末分化细胞的能力，因而是定向祖细胞。短暂扩充细胞再经过几次到十几次不等的分裂后定向分化，进一步可分化为有丝分裂后细胞及终末分化细胞。短暂扩充细胞的存在说明组织靠较少量的干细胞分裂为很多的子代分化细胞。干细胞自我更新和分化的方式通常有两种，一种是不对称方式分裂，即I个干细胞分裂成I个干细胞和一个定向祖细胞，常见于单细胞生物和无脊椎动物；另一种是具有高度调控机制的分裂方式，干细胞按一定的概率分裂成干细胞或定向祖细胞，BP干细胞按一定的概率分裂为两个干细胞或两个定向祖细胞，或按不对称方式分裂。一般认为哺乳类动物即以此种方式进行自我组织更新。细胞的更新具有准确无误性，干细胞在整个增殖过程中处于相对静止状态，而由短暂扩充细胞完成DNA合成和细胞扩充的任务，干细胞在分裂后仍保留其原有的遗传信息，短暂扩充细胞拥有新复制DNA序列，以保证差错仅停留在短暂扩充细胞水平。通常干细胞等数分裂干细胞和定向祖细胞，当受到损伤等情况时，干细胞的分裂方式会发生改变以适应机体的需要。
[0004]皮肤上皮层是一层保护机体免受外界环境损伤的重要屏障。该层主要为角质细胞类型，包含了大约85%的活表皮细胞。角质层是复扁平上皮细胞。在表皮基底层，角质细胞分化、增殖，随着角质细胞产生角蛋白并上移至表皮表面后，发生程序性死亡。角蛋白细胞增殖、分化及凋亡是复杂且严格控制的过程。角蛋白细胞可产生很多细胞因子和生长因子，包括 IL-1, IL-3, IL-6, IL-8,集落刺激因子，TNF-alpha, TGF-alpha and beta,成纤维细胞生长因子，双调蛋白和PDGF。除了保护功能之外，角蛋白细胞在组织稳态、伤口恢复、癌症以及皮肤基因治疗上有着重要的作用。人角蛋白细胞能表达粘附分子和细胞因子，能参与皮肤免疫和动态平衡。
[0005]黑色素细胞起源于外胚层的神经嵴，位于表皮的基底层，与表皮细胞共同组成表皮黑色素单位，其主要功能是产生黑色素小体保护皮肤免受损害。I960年Cruickshank首次报道体外培养黑色素细胞以来，由于培养技术未突破，一直未得到大量纯化的黑色素细胞。1982年，美国Eisinger和Marco用一种含有致癌因子TPA的培养基培养出大量人黑色素细胞，但仅能存活几个月。
[0006]近年来，对表皮细胞、表皮干细胞和黑色素细胞等单独培养方法的报导很多，但目前还未见到将三种细胞共培养形成具有三维复层结构表皮的报道。因此，建立一种表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞形成三维复层结构表皮的制备方法与移植新技术具有重要的经济和社会意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种人表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞形成3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其在皮肤缺失、烧伤和皮肤色素脱失性疾病中的应用。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方法来实现的:一种人表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞形成3D结构表皮细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
1)用Wbbase混合酶一次性分离人皮肤干细胞、基底角质细胞和黑色素细胞等；
2)3D结构表皮细胞膜片的两步培养法，第一步，三种细胞无血清混合单层扩增培养，第二步，细胞的诱导分化共培养，形成3D结构表皮细胞膜片；
3)3D结构细胞膜片的剥离方法，该方法不需用酶消化黏附在培养皿上的表皮，可完整保护细胞的活性；
4)3D结构细胞膜片的临床移植方法，用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将复层结构表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎。
[0009]本发明的技术优势在于:
(I)Wbbase混合酶同时分离三种不同细胞方法，其分离有效时间窗口为5_10小时，比传统的胰酶分离有效时间窗口 2分钟提高了 150-300倍，且分离后不需中和酶的活性，分离细胞表面的膜受体和膜蛋白保存完整，细胞活性大于95%，细胞总收率大于1-5 XlOVg皮肤。
[0010](2)3D结构细胞膜片的两步共培养方法；WBB培养基可同时扩增三种细胞，扩增倍数在100-120倍之间，是传统方法的5倍。
[0011](3)该技术制备的3D结构表皮细胞膜片中黑色素细胞和表皮细胞的比例接近正常人表皮结构。
[0012](4)该3D结构表皮细胞膜片可用于白癜风、烧伤后色素减退等皮肤色素脱失性皮肤病及各种创伤的治疗，移植后皮肤复色效果接近或与本人肤色一致。
【附图说明】
[0013]图1和图2是培养的3D结构表皮细胞膜片照片；
图3是白癒风患者治疗如照片；
图4是白癜风患者移植3D结构表皮细胞膜片后一个月照片。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
1、人表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞的共分离
在无菌条件下将无菌2X 2cm2正常全层皮置于盛有20ml WBB无血清培养基的培养皿中，用WBB细胞分离器将皮肤制备成直径为0.1mmX0.1mm2组织颗粒，将组织颗粒置于含有Wbbase混合酶的WBB培养基中酶解，4°C酶解10-12小时，过滤，离心分离，得到多种高活性种子细胞，包括基底层角质细胞、黑色素干细胞、短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞(Interfollicle Epidermal Stem Cell，IFESCs)皮脂腺干细胞等。基底层角质细胞、黑色素干细胞、短暂扩充细胞三种细胞活性分别达到95%以上，细胞总收率大于1-5X107/克皮肤。
[0015]2、三种细胞无血清混合单层扩增培养
将三种种子细胞接种到细胞培养皿上，细胞密度为1-2 X 16个细胞/直径60mm培养皿，加5mlWBB单层细胞培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，4_7天细胞达到80-90%的汇合。
[0016]3、3D结构表皮细胞膜片的共培养
当单层培养的细胞达到80-90%的汇合后，吸出培养皿中的单层细胞培养基，另加入5mlffBB无血清细胞分化培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，经7_10天 培养，细胞分化向3D复层结构生长，厚度为3-10层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片。
[0017]4、3D结构表皮细胞膜片的剥离方法
将Wbbase酶加入到培养皿，混匀，37°C，5%C02培养30分钟，慢慢将表皮细胞膜片从培养皿底部轻轻剥离，置于无菌尼龙网上，用无菌PBS清洗3遍，置于密封瓶保存备用。
[0018]5、3D结构表皮细胞膜片的临床应用
用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎，3-6个月后皮损处可完全复色，无任何瘢痕。
[0019]实施例2
1、丝蛋白膜的制备
将无菌丝素蛋白膜置于60mm培养皿底部并用专用不锈钢固定装置固定丝蛋白膜备用。
[0020]2、人表皮干细胞、黑色素细胞和角质形成细胞的共分离
在无菌条件下将无菌2X 2cm2正常全层皮置于盛有20ml WBB无血清培养基的培养皿中，用WBB细胞分离器将皮肤制备成0.1mmX 0.1mm2组织颗粒，将组织颗粒置于含有Wbbase混合酶的WBB培养基中酶解，4°C酶解10-12小时，过滤，离心分离，得到表皮干细胞、基底层角质形成细胞、黑色素细胞等三种高活性种子细胞，包括黑色素干细胞、短暂扩充细胞等，三种细胞活性分别达到95%以上，细胞总收率大于1-6X 17/克皮肤。
[0021 ] 3、三种细胞无血清混合单层扩增培养
将三种种子细胞接种到丝蛋白包被的培养皿上，细胞密度为1.8-2.5 X 16个细胞/直径60mm培养皿，加5mlWBB单层细胞培养基，37°C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，6-10天细胞达到80-90%的汇合。
[0022]4、3D结构表皮细胞膜片的共培养
当单层培养的细胞达到80-90%的汇合后，吸出培养皿中的单层细胞培养基，另加入5mlffBB无血清细胞分化培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，经7_10天培养，细胞分化向3D复层结构生长，厚度为3-10层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片。
[0023]5、丝蛋白膜为支架材料细胞膜片的剥离
用无菌吸管将培养基吸干，用生理盐水漂洗3遍，用无菌镊子从培养皿边缘轻轻将丝蛋白膜支架材料剥离，将剥离下来的细胞膜片置于带保存液的运输瓶，2-8°C保存或运输。
[0024]6、3D结构表皮细胞膜片的临床应用
用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎，十天后丝蛋白膜会慢慢脱落，3-6个月后皮损处可完全复色，无任何瘢痕。
[0025]实施例3
1、人表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞的共分离
在无菌条件下将无菌4X2cm2正常全层皮置于盛有20mlWBB无血清培养基的培养皿中，用WBB细胞分离器将皮肤制备成直径为0.1mmX0.1mm2组织颗粒，将组织颗粒置于含有Wbbase混合酶的WBB培养基中酶解，4°C酶解10小时，过滤，离心分离，得到多种高活性种子细胞，包括基底层角质细胞、黑色素干细胞、短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞(Interfollicle Epidermal Stem Cell，IFESCs)皮脂腺干细胞等。基底层角质细胞、黑色素干细胞、短暂扩充细胞三种细胞活性分别达到95%以上，细胞总收率大于1-4X 17/克皮肤。
[0026]2、三种细胞无血清混合单层扩增培养
将三种种子细胞接种到细胞培养皿上，细胞密度为1.5 X 16个细胞/60mm培养皿内，加5mlWBB单层细胞培养基，37°C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，5_9天细胞达到80-90%的汇合。
[0027]3、3D结构表皮细胞膜片的共培养
当单层培养的细胞达到90%以上汇合后，吸出培养皿中的单层细胞培养基，另加入5mlwbb无血清细胞分化培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，经7_10天培养，细胞分化向3D复层结构生长，厚度为4-11层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片。
[0028]4、3D结构表皮细胞膜片的剥离方法
将3mlWbbase酶加入到培养皿，混匀，37°C，5%0)2培养35分钟，慢慢将表皮细胞膜片从培养皿底部轻轻剥离，置于无菌尼龙网上，用无菌PBS清洗3遍，置于密封瓶保存备用。
[0029]5、3D结构表皮细胞膜片的临床应用
用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎，3-6个月后皮损处可完全复色，无任何瘢痕。
【主权项】
1.一种人3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用，其特征在于，包括以下步骤: (1)人表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞的共分离 将无菌2X2cm2正常全层皮置于盛有20ml WBB无血清培养基的培养皿中，用WBB细胞分离器将皮肤制备成0.1mmX0.1mm2组织颗粒，将组织颗粒置于含Wbbase混合酶的WBB培养基中酶解，4°C酶解10-12小时，过滤、离心分离，得到三种高活性的种子细胞，包括短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞(Interfollicle Epidermal Stem Cell，IFESCs)皮脂腺干细胞等，三种细胞活性分别达到95%以上，细胞总收率大于1-5 X 17/克皮肤； (2)三种细胞无血清混合单层扩增培养 将三种种子细胞接种到培养皿上，细胞密度为1-2 X 16个细胞/直径60mm培养皿，加5mlWBB单层细胞培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，4_7天细胞达到80-90%的汇合； (3)3D结构表皮细胞膜片的诱导分化共培养 当单层培养的细胞达到80-90%的汇合后，吸出培养皿中的单层细胞培养基，另加入5mlffBB无血清细胞分化培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，经7_10天诱导分化培养，细胞向3D复层结构生长，厚度为3-10层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片; (4)3D结构表皮细胞膜片的剥离方法 将带弯针头的微量注射器吸满无菌生理盐水，将弯针头轻轻插入培养皿和细胞膜片间，边插边注射生理盐水，慢慢将3D结构细胞膜片从培养皿底部轻轻剥离，用无菌PBS清洗3遍，置于密封瓶保存备用。2.根据权利要求1所述的人3D结构表皮细胞膜片，其临床应用:用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将复层结构表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎；3D结构表皮细胞膜片中含表皮干细胞、黑色素细胞、基底层角质细胞与人体正常皮肤的比例相近，可用于白癜风、烧伤后色素减退等皮肤色素脱失性皮肤病的治疗，具有无免疫排斥反应、皮肤复色均匀，复色快和无疤痕等优点，也可用于创伤和烧伤等的修复。
【专利摘要】本发明公开了一种人3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）用Wbbase混合酶一次性分离人表皮干细胞、基底层角质细胞和黑色素干细胞等；（2）两步培养法：a)三种细胞无血清混合单层培养；b)细胞的诱导分化及3D结构表皮细胞膜片的培养；（3）细胞膜片的剥离。（4）治疗白癜风、烧伤等皮肤色素脱失性疾病的临床应用。本发明的创造性：（1）同时分离三种细胞，有效时间比传统的胰蛋白酶分离提高150-300倍，不需中和酶的活性，分离的细胞活性大于95%，总收率大于1-5×107/克皮肤；（2）两步培养法同时扩增三种细胞，扩增倍数提升5倍；（3）黑色素形成单位与正常人接近；（4）移植后皮肤复色效果接近或与本人肤色一致。
【IPC分类】C12N5/074, C12N5/071, A61L27/60, A61L27/38
【公开号】CN104906634
【申请号】CN201510298389
【发明人】杨国成, 邓勇, 杜佳静
【申请人】武汉北度生物科技有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月3日
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用人自体表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞为种子细胞，培养具有3D复层结构表皮细胞膜片的技术及其在临床中的应用。表皮干细胞是一类异质性细胞，具有不同的亚类，其分子特征、分化能力及细胞巢(resident sites)都不相同。表皮干细胞主要包括:毛囊干细胞(HFSCs)、毛囊外根鞘干细胞、表达keratin-15的毛囊多潜能干细胞(follicle pluripotent stem cells，fPSCs)、皮脂腺干细胞(SGSCs)、汗腺干细胞(sweat stem cell)和黑色素干细胞(melancyte stem cell, EP1-NCSCs)和滤泡表皮干细胞(IFESCs)等。
[0002]主要技术包括WBB细胞培养基的应用，Wbbase混合酶分离表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞，细胞的单层扩增培养，细胞的诱导分化，3D结构表皮细胞膜片培养技术以及临床治疗技术。
【背景技术】
[0003]皮肤由表皮、真皮和皮下组织组成，是人体最大最复杂的器官，具有保护、分泌、感知和代谢功能。皮肤缺损、色素脱失和烧伤等是临床上的常见疾病，其最主要的治疗方法是自体皮肤移植或采用临时皮肤替代物覆盖。此外，白癜风也是一种常见性皮肤色素脱失性疾病，发病机制目前还不清楚，治疗方法有激光照射等物理治疗法、药物治疗法和自体表皮移植法等方法。表皮移植法需要自体皮肤，然而，由于人体皮肤有限，人们一直在寻找一种永久性皮肤替代物，但永久性皮肤替代物仍依赖于有活性的自体多种皮肤种子细胞，主要包括各种表皮干细胞等。
表皮干细胞具有终身、无限的自我更新能力。它是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞。从发生机制来看，干细胞并不直接分化产生终末分化细胞，而是先分化成短暂扩充细胞，短暂扩充细胞有产生定向分化成某种终末分化细胞的能力，因而是定向祖细胞。短暂扩充细胞再经过几次到十几次不等的分裂后定向分化，进一步可分化为有丝分裂后细胞及终末分化细胞。短暂扩充细胞的存在说明组织靠较少量的干细胞分裂为很多的子代分化细胞。干细胞自我更新和分化的方式通常有两种，一种是不对称方式分裂，即I个干细胞分裂成I个干细胞和一个定向祖细胞，常见于单细胞生物和无脊椎动物；另一种是具有高度调控机制的分裂方式，干细胞按一定的概率分裂成干细胞或定向祖细胞，BP干细胞按一定的概率分裂为两个干细胞或两个定向祖细胞，或按不对称方式分裂。一般认为哺乳类动物即以此种方式进行自我组织更新。细胞的更新具有准确无误性，干细胞在整个增殖过程中处于相对静止状态，而由短暂扩充细胞完成DNA合成和细胞扩充的任务，干细胞在分裂后仍保留其原有的遗传信息，短暂扩充细胞拥有新复制DNA序列，以保证差错仅停留在短暂扩充细胞水平。通常干细胞等数分裂干细胞和定向祖细胞，当受到损伤等情况时，干细胞的分裂方式会发生改变以适应机体的需要。
[0004]皮肤上皮层是一层保护机体免受外界环境损伤的重要屏障。该层主要为角质细胞类型，包含了大约85%的活表皮细胞。角质层是复扁平上皮细胞。在表皮基底层，角质细胞分化、增殖，随着角质细胞产生角蛋白并上移至表皮表面后，发生程序性死亡。角蛋白细胞增殖、分化及凋亡是复杂且严格控制的过程。角蛋白细胞可产生很多细胞因子和生长因子，包括 IL-1, IL-3, IL-6, IL-8,集落刺激因子，TNF-alpha, TGF-alpha and beta,成纤维细胞生长因子，双调蛋白和PDGF。除了保护功能之外，角蛋白细胞在组织稳态、伤口恢复、癌症以及皮肤基因治疗上有着重要的作用。人角蛋白细胞能表达粘附分子和细胞因子，能参与皮肤免疫和动态平衡。
[0005]黑色素细胞起源于外胚层的神经嵴，位于表皮的基底层，与表皮细胞共同组成表皮黑色素单位，其主要功能是产生黑色素小体保护皮肤免受损害。I960年Cruickshank首次报道体外培养黑色素细胞以来，由于培养技术未突破，一直未得到大量纯化的黑色素细胞。1982年，美国Eisinger和Marco用一种含有致癌因子TPA的培养基培养出大量人黑色素细胞，但仅能存活几个月。
[0006]近年来，对表皮细胞、表皮干细胞和黑色素细胞等单独培养方法的报导很多，但目前还未见到将三种细胞共培养形成具有三维复层结构表皮的报道。因此，建立一种表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞形成三维复层结构表皮的制备方法与移植新技术具有重要的经济和社会意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种人表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞形成3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其在皮肤缺失、烧伤和皮肤色素脱失性疾病中的应用。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方法来实现的:一种人表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞形成3D结构表皮细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
1)用Wbbase混合酶一次性分离人皮肤干细胞、基底角质细胞和黑色素细胞等；
2)3D结构表皮细胞膜片的两步培养法，第一步，三种细胞无血清混合单层扩增培养，第二步，细胞的诱导分化共培养，形成3D结构表皮细胞膜片；
3)3D结构细胞膜片的剥离方法，该方法不需用酶消化黏附在培养皿上的表皮，可完整保护细胞的活性；
4)3D结构细胞膜片的临床移植方法，用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将复层结构表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎。
[0009]本发明的技术优势在于:
(I)Wbbase混合酶同时分离三种不同细胞方法，其分离有效时间窗口为5_10小时，比传统的胰酶分离有效时间窗口 2分钟提高了 150-300倍，且分离后不需中和酶的活性，分离细胞表面的膜受体和膜蛋白保存完整，细胞活性大于95%，细胞总收率大于1-5 XlOVg皮肤。
[0010](2)3D结构细胞膜片的两步共培养方法；WBB培养基可同时扩增三种细胞，扩增倍数在100-120倍之间，是传统方法的5倍。
[0011](3)该技术制备的3D结构表皮细胞膜片中黑色素细胞和表皮细胞的比例接近正常人表皮结构。
[0012](4)该3D结构表皮细胞膜片可用于白癜风、烧伤后色素减退等皮肤色素脱失性皮肤病及各种创伤的治疗，移植后皮肤复色效果接近或与本人肤色一致。
【附图说明】
[0013]图1和图2是培养的3D结构表皮细胞膜片照片；
图3是白癒风患者治疗如照片；
图4是白癜风患者移植3D结构表皮细胞膜片后一个月照片。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
1、人表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞的共分离
在无菌条件下将无菌2X 2cm2正常全层皮置于盛有20ml WBB无血清培养基的培养皿中，用WBB细胞分离器将皮肤制备成直径为0.1mmX0.1mm2组织颗粒，将组织颗粒置于含有Wbbase混合酶的WBB培养基中酶解，4°C酶解10-12小时，过滤，离心分离，得到多种高活性种子细胞，包括基底层角质细胞、黑色素干细胞、短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞(Interfollicle Epidermal Stem Cell，IFESCs)皮脂腺干细胞等。基底层角质细胞、黑色素干细胞、短暂扩充细胞三种细胞活性分别达到95%以上，细胞总收率大于1-5X107/克皮肤。
[0015]2、三种细胞无血清混合单层扩增培养
将三种种子细胞接种到细胞培养皿上，细胞密度为1-2 X 16个细胞/直径60mm培养皿，加5mlWBB单层细胞培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，4_7天细胞达到80-90%的汇合。
[0016]3、3D结构表皮细胞膜片的共培养
当单层培养的细胞达到80-90%的汇合后，吸出培养皿中的单层细胞培养基，另加入5mlffBB无血清细胞分化培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，经7_10天 培养，细胞分化向3D复层结构生长，厚度为3-10层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片。
[0017]4、3D结构表皮细胞膜片的剥离方法
将Wbbase酶加入到培养皿，混匀，37°C，5%C02培养30分钟，慢慢将表皮细胞膜片从培养皿底部轻轻剥离，置于无菌尼龙网上，用无菌PBS清洗3遍，置于密封瓶保存备用。
[0018]5、3D结构表皮细胞膜片的临床应用
用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎，3-6个月后皮损处可完全复色，无任何瘢痕。
[0019]实施例2
1、丝蛋白膜的制备
将无菌丝素蛋白膜置于60mm培养皿底部并用专用不锈钢固定装置固定丝蛋白膜备用。
[0020]2、人表皮干细胞、黑色素细胞和角质形成细胞的共分离
在无菌条件下将无菌2X 2cm2正常全层皮置于盛有20ml WBB无血清培养基的培养皿中，用WBB细胞分离器将皮肤制备成0.1mmX 0.1mm2组织颗粒，将组织颗粒置于含有Wbbase混合酶的WBB培养基中酶解，4°C酶解10-12小时，过滤，离心分离，得到表皮干细胞、基底层角质形成细胞、黑色素细胞等三种高活性种子细胞，包括黑色素干细胞、短暂扩充细胞等，三种细胞活性分别达到95%以上，细胞总收率大于1-6X 17/克皮肤。
[0021 ] 3、三种细胞无血清混合单层扩增培养
将三种种子细胞接种到丝蛋白包被的培养皿上，细胞密度为1.8-2.5 X 16个细胞/直径60mm培养皿，加5mlWBB单层细胞培养基，37°C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，6-10天细胞达到80-90%的汇合。
[0022]4、3D结构表皮细胞膜片的共培养
当单层培养的细胞达到80-90%的汇合后，吸出培养皿中的单层细胞培养基，另加入5mlffBB无血清细胞分化培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，经7_10天培养，细胞分化向3D复层结构生长，厚度为3-10层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片。
[0023]5、丝蛋白膜为支架材料细胞膜片的剥离
用无菌吸管将培养基吸干，用生理盐水漂洗3遍，用无菌镊子从培养皿边缘轻轻将丝蛋白膜支架材料剥离，将剥离下来的细胞膜片置于带保存液的运输瓶，2-8°C保存或运输。
[0024]6、3D结构表皮细胞膜片的临床应用
用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎，十天后丝蛋白膜会慢慢脱落，3-6个月后皮损处可完全复色，无任何瘢痕。
[0025]实施例3
1、人表皮干细胞、黑色素细胞和角质细胞的共分离
在无菌条件下将无菌4X2cm2正常全层皮置于盛有20mlWBB无血清培养基的培养皿中，用WBB细胞分离器将皮肤制备成直径为0.1mmX0.1mm2组织颗粒，将组织颗粒置于含有Wbbase混合酶的WBB培养基中酶解，4°C酶解10小时，过滤，离心分离，得到多种高活性种子细胞，包括基底层角质细胞、黑色素干细胞、短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞(Interfollicle Epidermal Stem Cell，IFESCs)皮脂腺干细胞等。基底层角质细胞、黑色素干细胞、短暂扩充细胞三种细胞活性分别达到95%以上，细胞总收率大于1-4X 17/克皮肤。
[0026]2、三种细胞无血清混合单层扩增培养
将三种种子细胞接种到细胞培养皿上，细胞密度为1.5 X 16个细胞/60mm培养皿内，加5mlWBB单层细胞培养基，37°C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，5_9天细胞达到80-90%的汇合。
[0027]3、3D结构表皮细胞膜片的共培养
当单层培养的细胞达到90%以上汇合后，吸出培养皿中的单层细胞培养基，另加入5mlwbb无血清细胞分化培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，经7_10天培养，细胞分化向3D复层结构生长，厚度为4-11层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片。
[0028]4、3D结构表皮细胞膜片的剥离方法
将3mlWbbase酶加入到培养皿，混匀，37°C，5%0)2培养35分钟，慢慢将表皮细胞膜片从培养皿底部轻轻剥离，置于无菌尼龙网上，用无菌PBS清洗3遍，置于密封瓶保存备用。
[0029]5、3D结构表皮细胞膜片的临床应用
用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎，3-6个月后皮损处可完全复色，无任何瘢痕。
【主权项】
1.一种人3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用，其特征在于，包括以下步骤: (1)人表皮干细胞、黑色素细胞和基底层角质细胞的共分离 将无菌2X2cm2正常全层皮置于盛有20ml WBB无血清培养基的培养皿中，用WBB细胞分离器将皮肤制备成0.1mmX0.1mm2组织颗粒，将组织颗粒置于含Wbbase混合酶的WBB培养基中酶解，4°C酶解10-12小时，过滤、离心分离，得到三种高活性的种子细胞，包括短暂扩充细胞、毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞(Interfollicle Epidermal Stem Cell，IFESCs)皮脂腺干细胞等，三种细胞活性分别达到95%以上，细胞总收率大于1-5 X 17/克皮肤； (2)三种细胞无血清混合单层扩增培养 将三种种子细胞接种到培养皿上，细胞密度为1-2 X 16个细胞/直径60mm培养皿，加5mlWBB单层细胞培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，4_7天细胞达到80-90%的汇合； (3)3D结构表皮细胞膜片的诱导分化共培养 当单层培养的细胞达到80-90%的汇合后，吸出培养皿中的单层细胞培养基，另加入5mlffBB无血清细胞分化培养基，370C，5%C02培养，每48小时更换一次培养基，经7_10天诱导分化培养，细胞向3D复层结构生长，厚度为3-10层，形成具有三维结构的表皮细胞膜片; (4)3D结构表皮细胞膜片的剥离方法 将带弯针头的微量注射器吸满无菌生理盐水，将弯针头轻轻插入培养皿和细胞膜片间，边插边注射生理盐水，慢慢将3D结构细胞膜片从培养皿底部轻轻剥离，用无菌PBS清洗3遍，置于密封瓶保存备用。2.根据权利要求1所述的人3D结构表皮细胞膜片，其临床应用:用皮肤打磨机将白癜风皮损处磨至点状渗血，将复层结构表皮细胞膜片贴在打磨处，用敷料包扎；3D结构表皮细胞膜片中含表皮干细胞、黑色素细胞、基底层角质细胞与人体正常皮肤的比例相近，可用于白癜风、烧伤后色素减退等皮肤色素脱失性皮肤病的治疗，具有无免疫排斥反应、皮肤复色均匀，复色快和无疤痕等优点，也可用于创伤和烧伤等的修复。
【专利摘要】本发明公开了一种人3D结构表皮细胞膜片的制备方法及其临床应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）用Wbbase混合酶一次性分离人表皮干细胞、基底层角质细胞和黑色素干细胞等；（2）两步培养法：a)三种细胞无血清混合单层培养；b)细胞的诱导分化及3D结构表皮细胞膜片的培养；（3）细胞膜片的剥离。（4）治疗白癜风、烧伤等皮肤色素脱失性疾病的临床应用。本发明的创造性：（1）同时分离三种细胞，有效时间比传统的胰蛋白酶分离提高150-300倍，不需中和酶的活性，分离的细胞活性大于95%，总收率大于1-5×107/克皮肤；（2）两步培养法同时扩增三种细胞，扩增倍数提升5倍；（3）黑色素形成单位与正常人接近；（4）移植后皮肤复色效果接近或与本人肤色一致。
【IPC分类】C12N5/074, C12N5/071, A61L27/60, A61L27/38
【公开号】CN104906634
【申请号】CN201510298389
【发明人】杨国成, 邓勇, 杜佳静
【申请人】武汉北度生物科技有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月3日
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