一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料及其制备方法
一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料及其制备方法【专利说明】一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料及其制备方法[0001]
技术领域：
[0002]本发明属于有机功能材料制备领域，具体涉及一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料及其制备方法。【
背景技术：
】[0003]骨移植术一直致力于修复由于创伤、肿瘤、感染等所造成的大范围骨缺损，以恢复机体功能、美观，是最常见的移植手术之一。骨移植按移植物来源分为自体骨移植、异体骨移植和人工骨替代材料移植。自体骨移植是骨修复和骨重建的金标准，然而由于来源有限，会造成二次创伤，不能提供初始稳定等缺点，其临床应用受到很大的限制。异体骨移植费用高，数量有限。同时，异体骨具有抗原性，特别是在种植体较大时，常因免疫排斥反应或外病毒传播导致植入失败。因此，人造骨替代材料的研宄是近年来的热点。其中，可注射骨替代材料(injectablebonesubstitutes,IBSs)由于其微创的手术通路以及对复杂不规则缺损区的有效充填等优点，使其在临床应用中可以有效的缓解患者的不适，缩短痊愈时间，减小治疗代价，因此IBSs在骨组织工程领域获得了越来越多的关注。[0004]聚甲基丙稀酸甲醋(Polymethylmethacrylate,PMMA)作为一种IBS，其价格低廉，具有一定的机械强度，室温下能快速成型，且与机体的排斥反应小，自20世纪60年代以来便被广泛用于骨缺损修复。然而，在长期的临床实践过程中，PMMA的一些弊端逐渐暴露，如机械性能与天然骨不匹配、骨整合性差、聚合反应温度较高、感染等，使得PMMA植入体在受体骨的不断改建过程中出现逐渐地松动，脱落以及周围组织坏死，并可能最终造成移植失败。因此，对PMMA进行自身改性或加入新的生物材料势在必行。[0005]多孔三维立体结构是近来年骨组织工程中理想的支架模型，可提供宽大的表面积和空间，利于细胞粘附生长、细胞外基质沉积、营养和氧气进入及代谢产物排出，也有利于血管和神经长入和药物缓释，从而使受体与支架材料更健康、稳固的结合。基于此，将PMMA制成多孔载体，相互连通的多孔结构将会使PMMA得到与骨相似的机械特性，便于骨长入。另外，将具有骨引导功能的材料作为填料，将改善多孔PMMA的骨引导功能。除此之外，局部的药物缓释系统的介入可以有效的发挥所载入药物的功效，达到抗菌、抗炎或抗肿瘤等作用，提高骨移植成功率。[0006]壳聚糖(CS)是是甲壳素的部分脱乙酰基产物，是目前自然界唯一大量存在的碱性多糖，无生物毒性，具有良好的组织相容性、生物可降解性和抗菌性，在医学、生物学领域得到了深入的研宄和广泛的应用。近年来研宄发现，通过加入碱性盐(如甘油磷酸钠:GP)、含羟基聚合物(如壳聚糖季铵盐:HTCC)，对壳聚糖进行衍生化(如羟丁基壳聚糖:HBC)和接枝反应(如聚乙二醇接枝壳聚糖:PEG-g-CS)或与高分子化合物(如聚乙烯醇:PVA;甲基纤维素:MC)共混等，可得到具有温度敏感性的壳聚糖基物理凝胶，由于其可注射性、生物相容性、可降解性和人工细胞外支架功能等，已获得越来越多的关注。这种复合物溶液可以在室温或低于室温时长时间保持液态，而当温度升高到生理体温(37°C)时立即凝胶化。另外，壳聚糖基温敏凝胶可作为骨引导材料和药物的载体，实现局部的药物缓释。【
发明内容】[0007]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷与不足，提供一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料及其制备方法。[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，为聚甲基丙烯酸甲酯与负载骨引导材料和药物的壳聚糖基温敏凝胶混合得到的新型的可注射的多孔三维结构的骨水泥复合物。[0009]所述的聚甲基丙烯酸甲酯为自凝树脂，优选将聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂按质量比1:1的比例搅拌混合得到，其为均一的面团状可塑物。[0010]所述的壳聚糖基温敏凝胶包括:含l_5wt%碱性盐(如甘油磷酸钠:GP;碳酸氢钠；磷酸钠)的壳聚糖凝胶，含l_10wt%羟基聚合物(如壳聚糖季铵盐:HTCC)的壳聚糖凝胶，对壳聚糖进行衍生化(如羟丁基壳聚糖:HBC)、接枝反应(如聚乙二醇接枝壳聚糖:PEG-g-CS；聚异丙基丙烯酰胺；泊洛沙姆接枝壳聚糖)或与浓度为l_10wt%的高分子化合物(如聚乙烯醇:PVA;甲基纤维素:MC)共混等得到的壳聚糖凝胶中的一种。[0011]所述的骨引导材料包括磷酸钙陶瓷(如羟基磷灰石)、磷酸钙骨水泥(如β-磷酸三钙)、钙硅材料(如生物玻璃)等其中一种或几种的组合物。所述的壳聚糖基温敏凝胶负载骨引导材料的量优选为5-100mg/mL。[0012]所述的药物包括各类抗菌药物、抗炎药物、抗肿瘤药、多肽和蛋白质类药物等化学合成药物中的一种或几种的组合物。所述的抗菌药物包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物中的一种或几种的组合物；所述的抗炎药物包括各类甾体抗炎药和非留体抗炎药(如阿司匹林、保泰松、塞来昔布)等化学合成药物中的一种或几种的组合物，载药量为；所述的抗肿瘤药包括烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素类、植物药类、激素及杂类等化学合成药物中的一种或几种的组合物，载药量为。所述的多肽和蛋白质类药物包括牛血清白蛋白、胰岛素、生长因子、促红细胞生成素、干扰素、治疗性单克隆抗体等化学合成药物中的一种或几种的组合物。所述的壳聚糖基温敏凝胶负载药物的量优选为l-150mg/mL。更优选的，所述的药物为抗菌药物时，壳聚糖基温敏凝胶的载药量为l_50mg/mL;药物为抗炎药物时，壳聚糖基温敏凝胶的载药量为1-lOOmg/mL;药物为抗肿瘤药时，壳聚糖基温敏凝胶的载药量为10-150mg/mL;药物为多肽或蛋白质类药物时，壳聚糖基温敏凝胶的载药量为l_85mg/mL。[0013]所述的复合支架骨移植材料中，聚甲基丙烯酸甲酯与负载骨引导材料和药物的壳聚糖基温敏凝胶的体积比优选为3-12:10。[0014]上述可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，包括以下步骤:Cl)制备如下壳聚糖基复合溶液中的一种:含l-5wt%碱性盐(如甘油磷酸钠:GP;碳酸氢钠；磷酸钠)的壳聚糖基复合溶液、含l_10wt%含羟基聚合物(如壳聚糖季铵盐:HTCC)的壳聚糖基复合溶液，对壳聚糖进行衍生化(如羟丁基壳聚糖:HBC)和接枝反应(如聚乙二醇接枝壳聚糖:PEG-g-CS;聚异丙基丙烯酰胺；泊洛沙姆接枝壳聚糖)或与浓度为l_10wt%的高分子化合物(如聚乙烯醇:PVA;甲基纤维素:MC)共混等得到壳聚糖基复合溶液。[0015](2)往混合均匀的壳聚糖基复合溶液中加入骨引导材料和药物，并超声处理使其混合均匀。[0016](3)将复合溶液置于温箱中使其形成凝胶。[0017](4)将聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂搅拌混合形成均一的面团状可塑物。[0018](5)将(4)所得面团状可塑物与(3)所得凝胶混合均匀，将其注入模具内，经固化、脱模、干燥得到可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料。[0019]步骤(2)加入骨引导材料和药物的混合溶液中骨引导材料、药物的终浓度分别优选为5-lOOmg/mL、l_150mg/mLo[0020]步骤(3)中形成凝胶的温度优选为30_60°C。[0021]步骤(4)中聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂的质量比优选为1:1。[0022]步骤(5)中当前第1页1 2 3 4 面团状可塑物与凝胶的体积比优选为3-12:10。
[0023]本发明提供的可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料以PMMA作为提供机械支撑的支架，壳聚糖基温敏凝胶作为成孔剂及骨引导材料和药物的载体，两者相互混合构成新型的可注射的多孔骨水泥复合物。该复合支架骨移植材料具有以下几个特点:(I)作为IBS，由于其微创的手术通路以及对复杂不规则缺损区的有效充填等优点，使其在临床应用中可以有效的缓解患者的不适，缩短痊愈时间，减小治疗代价。(2)对已有传统致密、实心的PMMA进行改性，形成具有多重优势的三维多孔支架，便于细胞粘附生长、细胞外基质沉积、营养和氧气进入及代谢产物排出，也有利于血管和神经长入和药物缓释。(3)找到多孔复合支架材料机械特性的平衡点，接近人体松质骨特性。(4)骨引导材料的填入，便于进一步引导矿物沉积，加强材料-骨界面的结合力。(5)局部的药物缓释系统的介入可以有效的发挥所载入药物的功效，达到抗菌、抗炎或抗肿瘤等作用，提高骨移植成功率。该材料制备方法简单，生物相容性好，机械特性匹配，还具有良好的生物矿化功能和抗菌、抗炎或抗肿瘤能力，在未来的骨组织重建的临床应用方面有着广阔的前景。
[0024]本发明相对于现有技术具有以下显著效果:
1、此复合支架骨移植材料制备方法简单，时间短，成本低。
[0025]2、由于本材料的可注射性，采用微创的手术通路，可以在临床应用中有效的缓解患者的不适，缩短痊愈时间，减小治疗代价。
[0026]3、与传统的PMMA比较，在未来的临床使用过程中，由于成孔剂CS-GP凝胶的加入降低了 PMMA的聚合反应，减少放热，降低周围组织坏死的风险。另外，从注射入体内到材料硬化之间的工作时间适宜，便于材料充分填充骨缺损区，并且手术者在术中有充足的时间操作。
[0027]4、与传统的PMMA比较，此多孔三维立体支架材料具有与骨相似的机械特性、良好骨引导性和生物相容性，从而造福广大骨缺损患者并产生深远的社会影响。
【附图说明】
[0028]图1是实施例1得到的抑菌环实验(ZOI)结果图。
[0029]图2是实施例2得到的抑菌环实验(ZOI)结果图。
[0030]图3是实施例3得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料的显微CT(μ-CT)结果图，数据由由瑞士 Scanco Medical公司的μ-CT 50微型CT米集。
[0031]图4是实施例3得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料横断面的SEM图(X250)，扫描电镜的照片由德国卡尔蔡司公司的sigma场发射透射电镜拍摄得到。
[0032]图5是实施例3得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料于SBF内浸泡28d其横断面的SEM图(X20000)，扫描电镜的照片由德国卡尔蔡司公司的sigma场发射透射电镜拍摄得到。
[0033]图6是实施例3得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料于SBF内浸泡28d的机械特性结果图，数据由美国MTS系统公司的MTS810陶瓷试验系统采集。
[0034]图7是实施例4得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料于SBF内浸泡28d的机械特性结果图，数据由美国MTS系统公司的MTS810陶瓷试验系统采集。
[0035]图8是实施例5得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料于SBF内浸泡28d的机械特性结果图，数据由美国MTS系统公司的MTS810陶瓷试验系统采集。
[0036]图9是实施例6得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料对MC3T3细胞的毒性结果图。
[0037]图10是实施例7得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料对BMSC细胞的毒性结果图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，并阐明本发明的突出特点和显著进步。下述实施例仅在于说明本发明而不限制本发明的保护范围，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0039]实施例1
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0040](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0041](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0042](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg羟基磷灰石(HA)于混合均匀的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0043](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0044](6) CS-GP/Nano-HA/GM凝胶冷冻干燥后压片，直径为13mm，置于涂有浓度为Img/mL的大肠杆菌悬浊液的LB琼脂培养基的中心，在37°C温箱内培养24h后观察，并测量抑菌环直径。
[0045]结果见图1，在凝胶片周围有一圈直径为4.39cm的透明抑菌环，证实了本实施例得到的CS-GP/Nano-HA/GM凝胶的良好抑菌性。
[0046]实施例2
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0047](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0048](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0049](4)先后加入25mg万古霉素(VM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/VM混合溶液。
[0050](5 )将CS-GP/Nano-HA/VM混合溶液置于37°C的恒温箱中，5min后形成凝胶。
[0051](6) CS-GP/Nano-HA/VM凝胶冷冻干燥后压片，直径为13mm，置于涂有浓度为Img/mL的金黄色葡萄球菌悬浊液的MH琼脂培养基的中心，在37°C温箱内培养24h后观察，并测量抑菌环直径。
[0052]结果见图2，在凝胶片周围有一圈直径为4.53cm的透明抑菌环，证实了本实施例得到的CS-GP/Nano-HA/VM凝胶的良好抑菌性。
[0053]实施例3
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0054](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0055](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0 056](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0057](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0058](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0059](7)将此面团状可塑物按照3:4的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0060](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0061]用μ-CT 50微型CT (瑞士 Scanco Medical公司)采集所得复合支架骨移植材料的显微CT结果，结果见图3，从三维重建结果可以看到材料表面有很多不规则的孔隙，并镶嵌有白色的纳米HA颗粒；横断面扫描结果则显示了不规则孔径相互连通，纳米HA颗粒分布于材料支架内。
[0062]用sigma场发射透射电镜(德国卡尔蔡司公司)观察所得复合支架骨移植材料形貌，结果见图4，从图中可以看到材料表面有很多不规则的孔隙，孔隙内和PMMA表面镶嵌有针状的纳米HA颗粒。
[0063]图3、4结果表明所得到材料的结构为骨长入提供了理想的支架。
[0064]将所得PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料置于配好的人工体液SBF溶液中浸泡，每隔一周更换一次SBF溶液，28d后取出冷冻干燥，用sigma场发射透射电镜观察其形貌，用MTS810陶瓷试验系统采集其机械特性数据，结果见图5和图6。
[0065]图5是经过浸泡后的复合支架骨移植材料横断面的SEM图，通过图5可以看到材料于SBF内浸泡28d后，在PMMA和针状纳米HA表面有一层丰富的、体积较大的块状沉积物，证实所制备的复合物支架具有促进矿化和潜在的骨引导作用。
[0066]图6是经过浸泡后的材料的机械特性结果，结果表明该材料在SBF内浸泡28d前后，其弹性模量和抗压强度无统计学差异，并且处于人体松质骨的机械特性值范围内，具有模拟人体松质骨的潜质。
[0067]实施例4
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0068](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0069](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0070](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0071](5)将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0072](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0073](7)将此面团状可塑物按照3:10的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0074](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0075]将所得PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料置于配好的人工体液SBF溶液中浸泡，每隔一周更换一次SBF溶液，28d后取出冷冻干燥，用MTS810陶瓷试验系统采集其机械特性数据，结果见图7。结果表明该材料在SBF内浸泡28d前后，其弹性模量和抗压强度无统计学差异，并且处于人体松质骨的机械特性值范围内，具有模拟人体松质骨的潜质。
[0076]实施例5
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0077](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0078](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0079](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg羟基磷灰石(HA)于混合均匀的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0080](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0081](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0082](7)将此面团状可塑物按照6:5的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0083](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0084]将所得PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料置于配好的人工体液SBF溶液中浸泡，每隔一周更换一次SBF溶液，28d后取出冷冻干燥，用MTS810陶瓷试验系统采集其机械特性数据，结果见图8。结果表明该材料在SBF内浸泡28d前后，其弹性模量和抗压强度无统计学差异，并且处于人体松质骨的机械特性值范围内，具有模拟人体松质骨的潜质。
[0085]实施例6
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0086](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0087](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0088](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0089](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0090](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0091](7)将此面团状可塑物按照3:4的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0092](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0093](9)将用高压蒸汽消毒过的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料浸泡于含10%胎牛血清和1% 双抗(青霉素和硫酸链霉素)的a-MEM培养基内，置于37°C培养箱培养24h制得浸提液。同时用此a-MEM培养基复苏传代MC3T3细胞。
[0094](10)将150-200 μ L MC3T3细胞按照I X 14/孔的密度接种进96孔板内，培养24h后待细胞贴壁，将培养基吸出，替换为上述步骤(9)的浸提液(实验组)，含10%胎牛血清和1%双抗的的a-MEM培养基作为对照组，继续培养，每组设6个副孔。
[0095](11)在第I和第3天时，每孔加入20 μ L 5mg/mL的MTT溶液，培养4h后吸出，替换为200 μ L DMSO溶液，室温下避光混匀15min，测量490nm处的分光光度值，并计算相对生长比率(RGR)，即0D_^fi /OD5irtya,以检测本实施例得到的复合支架骨移植材料是否有细胞毒性。
[0096]结果见图9，从图中可以看到，第I天和第3天的MC3T3细胞的RGR均大于100，并且随着时间增长，OD值也会随之增长，证实此复合支架骨移植材料对MC3T3细胞无毒性，有良好的生物相容性。
[0097]实施例7
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0098](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0099](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0100](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0101](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0102](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0103](7)将此面团状可塑物按照3:4的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0104](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0105](9)将用高压蒸汽消毒过的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料浸泡于含10%牛血清和1%双抗(青霉素和硫酸链霉素)的a-MEM培养基内，置于37°C培养箱培养24h制得浸提液。同时用此a-MEM培养基复苏传代骨髓间充质干细胞(BMSC)细胞；
(10)将150-200 μ L BMSC细胞按照I X 14/孔的密度接种进96孔板内，培养24h后待细胞贴壁，将培养基吸出，替换为上述步骤(9)的浸提液(实验组)，含10%胎牛血清和1%双抗的a-MEM培养基作为对照组，继续培养。每组设6个副孔。
[0106](11)在第I和第3天时，每孔加入20 yL 5mg/mL的MTT溶液，培养4h后吸出，替换为200 μ L DMSO溶液，室温下避光混匀15min，测量490nm处的分光光度值，并计算相对生长比率(RGR)，即0D_^fi /OD5irtya,以检测本实施例得到的复合支架骨移植材料是否有细胞毒性。
[0107]结果见图10，从图中可以看到，第I天和第3天的BMSC细胞的RGR均大于100，并且随着时间增长，OD值也会随之增长，证实此复合支架骨移植材料对BMSC细胞无毒性，有良好的生物相容性。
【主权项】
1.一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:为聚甲基丙烯酸甲酯与负载骨引导材料和药物的壳聚糖基温敏凝胶混合得到的可注射的多孔三维结构的骨水泥复合物。2.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:所述的聚甲基丙烯酸甲酯为将聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂按质量比1:1的比例搅拌混合得到。3.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:所述的壳聚糖基温敏凝胶为如下壳聚糖凝胶中的一种:含l_5wt%碱性盐的壳聚糖凝胶，含l-10wt%轻基聚合物的壳聚糖凝胶，对壳聚糖进行衍生化、接枝反应或与浓度为l-10wt%的高分子化合物共混得到的壳聚糖凝胶。4.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:所述的骨引导材料为磷酸钙陶瓷、磷酸钙骨水泥和钙硅材料中的一种或几种；所述的药物为抗菌药物、抗炎药物、抗肿瘤药、多肽和蛋白质类药物中的一种或几种。5.根据权利要求4所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:所述的壳聚糖基温敏凝胶负载骨引导材料的量为5-100mg/mL，负载药物的量为l_150mg/mL。6.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于??聚甲基丙烯酸甲酯与负载骨引导材料和药物的壳聚糖基温敏凝胶的体积比为3-12:10。7.权利要求1-6任一项所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (O制备如下壳聚糖基复合溶液中的一种:含l_5wt%碱性盐的壳聚糖基复合溶液、含l-10wt%含羟基聚合物的壳聚糖基复合溶液，对壳聚糖进行衍生化、接枝反应或与浓度为l-10wt%的高分子化合物共混得到壳聚糖基复合溶液； (2)往混合均匀的壳聚糖基复合溶液中加入骨引导材料和药物，并超声处理使其混合均匀； (3)将复合溶液置于温箱中使其形成凝胶； (4)将聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂搅拌混合形成均一的面团状可塑物； (5)将(4)所得面团状可塑物与(3)所得凝胶混合均匀，将其注入模具内，经固化、脱模、干燥得到可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料。8.根据权利要求7所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，其特征在于:步骤(2)加入骨引导材料和药物的混合溶液中骨引导材料、药物的终浓度分别为5-lOOmg/mL、l_150mg/mLo9.根据权利要求7所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，其特征在于:步骤(4)中聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂的质量比为1:1。10.根据权利要求7所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，其特征在于:步骤(5)中面团状可塑物与凝胶的体积比为3-12:10。
【专利摘要】本发明公开了一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料及其制备方法，属于有机功能材料制备领域。本发明的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）作为提供机械支撑的支架，壳聚糖基温敏凝胶作为成孔剂及骨引导材料和药物的载体，两者相互混合可构成新型的可注射的多孔三维结构的骨水泥复合物。此支架骨移植材料的制备方法简单，反应温度适宜，生物相容性好，机械特性匹配，具有良好的生物矿化功能和相应的抗菌、抗炎或抗肿瘤等能力，在未来的骨组织重建的临床应用方面有着广阔的前景。
【IPC分类】A61L27/50, A61L27/10, A61L27/54, A61L27/12, A61L27/16, A61L27/20, A61L27/56
【公开号】CN104906637
【申请号】CN201510252453
【发明人】撒悦, 蒋滔, 王曼
【申请人】武汉大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月15日
技术领域：
[0002]本发明属于有机功能材料制备领域，具体涉及一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料及其制备方法。【
背景技术：
】[0003]骨移植术一直致力于修复由于创伤、肿瘤、感染等所造成的大范围骨缺损，以恢复机体功能、美观，是最常见的移植手术之一。骨移植按移植物来源分为自体骨移植、异体骨移植和人工骨替代材料移植。自体骨移植是骨修复和骨重建的金标准，然而由于来源有限，会造成二次创伤，不能提供初始稳定等缺点，其临床应用受到很大的限制。异体骨移植费用高，数量有限。同时，异体骨具有抗原性，特别是在种植体较大时，常因免疫排斥反应或外病毒传播导致植入失败。因此，人造骨替代材料的研宄是近年来的热点。其中，可注射骨替代材料(injectablebonesubstitutes,IBSs)由于其微创的手术通路以及对复杂不规则缺损区的有效充填等优点，使其在临床应用中可以有效的缓解患者的不适，缩短痊愈时间，减小治疗代价，因此IBSs在骨组织工程领域获得了越来越多的关注。[0004]聚甲基丙稀酸甲醋(Polymethylmethacrylate,PMMA)作为一种IBS，其价格低廉，具有一定的机械强度，室温下能快速成型，且与机体的排斥反应小，自20世纪60年代以来便被广泛用于骨缺损修复。然而，在长期的临床实践过程中，PMMA的一些弊端逐渐暴露，如机械性能与天然骨不匹配、骨整合性差、聚合反应温度较高、感染等，使得PMMA植入体在受体骨的不断改建过程中出现逐渐地松动，脱落以及周围组织坏死，并可能最终造成移植失败。因此，对PMMA进行自身改性或加入新的生物材料势在必行。[0005]多孔三维立体结构是近来年骨组织工程中理想的支架模型，可提供宽大的表面积和空间，利于细胞粘附生长、细胞外基质沉积、营养和氧气进入及代谢产物排出，也有利于血管和神经长入和药物缓释，从而使受体与支架材料更健康、稳固的结合。基于此，将PMMA制成多孔载体，相互连通的多孔结构将会使PMMA得到与骨相似的机械特性，便于骨长入。另外，将具有骨引导功能的材料作为填料，将改善多孔PMMA的骨引导功能。除此之外，局部的药物缓释系统的介入可以有效的发挥所载入药物的功效，达到抗菌、抗炎或抗肿瘤等作用，提高骨移植成功率。[0006]壳聚糖(CS)是是甲壳素的部分脱乙酰基产物，是目前自然界唯一大量存在的碱性多糖，无生物毒性，具有良好的组织相容性、生物可降解性和抗菌性，在医学、生物学领域得到了深入的研宄和广泛的应用。近年来研宄发现，通过加入碱性盐(如甘油磷酸钠:GP)、含羟基聚合物(如壳聚糖季铵盐:HTCC)，对壳聚糖进行衍生化(如羟丁基壳聚糖:HBC)和接枝反应(如聚乙二醇接枝壳聚糖:PEG-g-CS)或与高分子化合物(如聚乙烯醇:PVA;甲基纤维素:MC)共混等，可得到具有温度敏感性的壳聚糖基物理凝胶，由于其可注射性、生物相容性、可降解性和人工细胞外支架功能等，已获得越来越多的关注。这种复合物溶液可以在室温或低于室温时长时间保持液态，而当温度升高到生理体温(37°C)时立即凝胶化。另外，壳聚糖基温敏凝胶可作为骨引导材料和药物的载体，实现局部的药物缓释。【
发明内容】[0007]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷与不足，提供一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料及其制备方法。[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，为聚甲基丙烯酸甲酯与负载骨引导材料和药物的壳聚糖基温敏凝胶混合得到的新型的可注射的多孔三维结构的骨水泥复合物。[0009]所述的聚甲基丙烯酸甲酯为自凝树脂，优选将聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂按质量比1:1的比例搅拌混合得到，其为均一的面团状可塑物。[0010]所述的壳聚糖基温敏凝胶包括:含l_5wt%碱性盐(如甘油磷酸钠:GP;碳酸氢钠；磷酸钠)的壳聚糖凝胶，含l_10wt%羟基聚合物(如壳聚糖季铵盐:HTCC)的壳聚糖凝胶，对壳聚糖进行衍生化(如羟丁基壳聚糖:HBC)、接枝反应(如聚乙二醇接枝壳聚糖:PEG-g-CS；聚异丙基丙烯酰胺；泊洛沙姆接枝壳聚糖)或与浓度为l_10wt%的高分子化合物(如聚乙烯醇:PVA;甲基纤维素:MC)共混等得到的壳聚糖凝胶中的一种。[0011]所述的骨引导材料包括磷酸钙陶瓷(如羟基磷灰石)、磷酸钙骨水泥(如β-磷酸三钙)、钙硅材料(如生物玻璃)等其中一种或几种的组合物。所述的壳聚糖基温敏凝胶负载骨引导材料的量优选为5-100mg/mL。[0012]所述的药物包括各类抗菌药物、抗炎药物、抗肿瘤药、多肽和蛋白质类药物等化学合成药物中的一种或几种的组合物。所述的抗菌药物包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物中的一种或几种的组合物；所述的抗炎药物包括各类甾体抗炎药和非留体抗炎药(如阿司匹林、保泰松、塞来昔布)等化学合成药物中的一种或几种的组合物，载药量为；所述的抗肿瘤药包括烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素类、植物药类、激素及杂类等化学合成药物中的一种或几种的组合物，载药量为。所述的多肽和蛋白质类药物包括牛血清白蛋白、胰岛素、生长因子、促红细胞生成素、干扰素、治疗性单克隆抗体等化学合成药物中的一种或几种的组合物。所述的壳聚糖基温敏凝胶负载药物的量优选为l-150mg/mL。更优选的，所述的药物为抗菌药物时，壳聚糖基温敏凝胶的载药量为l_50mg/mL;药物为抗炎药物时，壳聚糖基温敏凝胶的载药量为1-lOOmg/mL;药物为抗肿瘤药时，壳聚糖基温敏凝胶的载药量为10-150mg/mL;药物为多肽或蛋白质类药物时，壳聚糖基温敏凝胶的载药量为l_85mg/mL。[0013]所述的复合支架骨移植材料中，聚甲基丙烯酸甲酯与负载骨引导材料和药物的壳聚糖基温敏凝胶的体积比优选为3-12:10。[0014]上述可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，包括以下步骤:Cl)制备如下壳聚糖基复合溶液中的一种:含l-5wt%碱性盐(如甘油磷酸钠:GP;碳酸氢钠；磷酸钠)的壳聚糖基复合溶液、含l_10wt%含羟基聚合物(如壳聚糖季铵盐:HTCC)的壳聚糖基复合溶液，对壳聚糖进行衍生化(如羟丁基壳聚糖:HBC)和接枝反应(如聚乙二醇接枝壳聚糖:PEG-g-CS;聚异丙基丙烯酰胺；泊洛沙姆接枝壳聚糖)或与浓度为l_10wt%的高分子化合物(如聚乙烯醇:PVA;甲基纤维素:MC)共混等得到壳聚糖基复合溶液。[0015](2)往混合均匀的壳聚糖基复合溶液中加入骨引导材料和药物，并超声处理使其混合均匀。[0016](3)将复合溶液置于温箱中使其形成凝胶。[0017](4)将聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂搅拌混合形成均一的面团状可塑物。[0018](5)将(4)所得面团状可塑物与(3)所得凝胶混合均匀，将其注入模具内，经固化、脱模、干燥得到可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料。[0019]步骤(2)加入骨引导材料和药物的混合溶液中骨引导材料、药物的终浓度分别优选为5-lOOmg/mL、l_150mg/mLo[0020]步骤(3)中形成凝胶的温度优选为30_60°C。[0021]步骤(4)中聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂的质量比优选为1:1。[0022]步骤(5)中当前第1页1 2 3 4 面团状可塑物与凝胶的体积比优选为3-12:10。
[0023]本发明提供的可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料以PMMA作为提供机械支撑的支架，壳聚糖基温敏凝胶作为成孔剂及骨引导材料和药物的载体，两者相互混合构成新型的可注射的多孔骨水泥复合物。该复合支架骨移植材料具有以下几个特点:(I)作为IBS，由于其微创的手术通路以及对复杂不规则缺损区的有效充填等优点，使其在临床应用中可以有效的缓解患者的不适，缩短痊愈时间，减小治疗代价。(2)对已有传统致密、实心的PMMA进行改性，形成具有多重优势的三维多孔支架，便于细胞粘附生长、细胞外基质沉积、营养和氧气进入及代谢产物排出，也有利于血管和神经长入和药物缓释。(3)找到多孔复合支架材料机械特性的平衡点，接近人体松质骨特性。(4)骨引导材料的填入，便于进一步引导矿物沉积，加强材料-骨界面的结合力。(5)局部的药物缓释系统的介入可以有效的发挥所载入药物的功效，达到抗菌、抗炎或抗肿瘤等作用，提高骨移植成功率。该材料制备方法简单，生物相容性好，机械特性匹配，还具有良好的生物矿化功能和抗菌、抗炎或抗肿瘤能力，在未来的骨组织重建的临床应用方面有着广阔的前景。
[0024]本发明相对于现有技术具有以下显著效果:
1、此复合支架骨移植材料制备方法简单，时间短，成本低。
[0025]2、由于本材料的可注射性，采用微创的手术通路，可以在临床应用中有效的缓解患者的不适，缩短痊愈时间，减小治疗代价。
[0026]3、与传统的PMMA比较，在未来的临床使用过程中，由于成孔剂CS-GP凝胶的加入降低了 PMMA的聚合反应，减少放热，降低周围组织坏死的风险。另外，从注射入体内到材料硬化之间的工作时间适宜，便于材料充分填充骨缺损区，并且手术者在术中有充足的时间操作。
[0027]4、与传统的PMMA比较，此多孔三维立体支架材料具有与骨相似的机械特性、良好骨引导性和生物相容性，从而造福广大骨缺损患者并产生深远的社会影响。
【附图说明】
[0028]图1是实施例1得到的抑菌环实验(ZOI)结果图。
[0029]图2是实施例2得到的抑菌环实验(ZOI)结果图。
[0030]图3是实施例3得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料的显微CT(μ-CT)结果图，数据由由瑞士 Scanco Medical公司的μ-CT 50微型CT米集。
[0031]图4是实施例3得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料横断面的SEM图(X250)，扫描电镜的照片由德国卡尔蔡司公司的sigma场发射透射电镜拍摄得到。
[0032]图5是实施例3得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料于SBF内浸泡28d其横断面的SEM图(X20000)，扫描电镜的照片由德国卡尔蔡司公司的sigma场发射透射电镜拍摄得到。
[0033]图6是实施例3得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料于SBF内浸泡28d的机械特性结果图，数据由美国MTS系统公司的MTS810陶瓷试验系统采集。
[0034]图7是实施例4得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料于SBF内浸泡28d的机械特性结果图，数据由美国MTS系统公司的MTS810陶瓷试验系统采集。
[0035]图8是实施例5得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料于SBF内浸泡28d的机械特性结果图，数据由美国MTS系统公司的MTS810陶瓷试验系统采集。
[0036]图9是实施例6得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料对MC3T3细胞的毒性结果图。
[0037]图10是实施例7得到的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料对BMSC细胞的毒性结果图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，并阐明本发明的突出特点和显著进步。下述实施例仅在于说明本发明而不限制本发明的保护范围，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0039]实施例1
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0040](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0041](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0042](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg羟基磷灰石(HA)于混合均匀的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0043](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0044](6) CS-GP/Nano-HA/GM凝胶冷冻干燥后压片，直径为13mm，置于涂有浓度为Img/mL的大肠杆菌悬浊液的LB琼脂培养基的中心，在37°C温箱内培养24h后观察，并测量抑菌环直径。
[0045]结果见图1，在凝胶片周围有一圈直径为4.39cm的透明抑菌环，证实了本实施例得到的CS-GP/Nano-HA/GM凝胶的良好抑菌性。
[0046]实施例2
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0047](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0048](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0049](4)先后加入25mg万古霉素(VM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/VM混合溶液。
[0050](5 )将CS-GP/Nano-HA/VM混合溶液置于37°C的恒温箱中，5min后形成凝胶。
[0051](6) CS-GP/Nano-HA/VM凝胶冷冻干燥后压片，直径为13mm，置于涂有浓度为Img/mL的金黄色葡萄球菌悬浊液的MH琼脂培养基的中心，在37°C温箱内培养24h后观察，并测量抑菌环直径。
[0052]结果见图2，在凝胶片周围有一圈直径为4.53cm的透明抑菌环，证实了本实施例得到的CS-GP/Nano-HA/VM凝胶的良好抑菌性。
[0053]实施例3
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0054](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0055](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0 056](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0057](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0058](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0059](7)将此面团状可塑物按照3:4的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0060](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0061]用μ-CT 50微型CT (瑞士 Scanco Medical公司)采集所得复合支架骨移植材料的显微CT结果，结果见图3，从三维重建结果可以看到材料表面有很多不规则的孔隙，并镶嵌有白色的纳米HA颗粒；横断面扫描结果则显示了不规则孔径相互连通，纳米HA颗粒分布于材料支架内。
[0062]用sigma场发射透射电镜(德国卡尔蔡司公司)观察所得复合支架骨移植材料形貌，结果见图4，从图中可以看到材料表面有很多不规则的孔隙，孔隙内和PMMA表面镶嵌有针状的纳米HA颗粒。
[0063]图3、4结果表明所得到材料的结构为骨长入提供了理想的支架。
[0064]将所得PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料置于配好的人工体液SBF溶液中浸泡，每隔一周更换一次SBF溶液，28d后取出冷冻干燥，用sigma场发射透射电镜观察其形貌，用MTS810陶瓷试验系统采集其机械特性数据，结果见图5和图6。
[0065]图5是经过浸泡后的复合支架骨移植材料横断面的SEM图，通过图5可以看到材料于SBF内浸泡28d后，在PMMA和针状纳米HA表面有一层丰富的、体积较大的块状沉积物，证实所制备的复合物支架具有促进矿化和潜在的骨引导作用。
[0066]图6是经过浸泡后的材料的机械特性结果，结果表明该材料在SBF内浸泡28d前后，其弹性模量和抗压强度无统计学差异，并且处于人体松质骨的机械特性值范围内，具有模拟人体松质骨的潜质。
[0067]实施例4
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0068](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0069](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0070](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0071](5)将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0072](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0073](7)将此面团状可塑物按照3:10的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0074](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0075]将所得PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料置于配好的人工体液SBF溶液中浸泡，每隔一周更换一次SBF溶液，28d后取出冷冻干燥，用MTS810陶瓷试验系统采集其机械特性数据，结果见图7。结果表明该材料在SBF内浸泡28d前后，其弹性模量和抗压强度无统计学差异，并且处于人体松质骨的机械特性值范围内，具有模拟人体松质骨的潜质。
[0076]实施例5
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0077](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0078](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0079](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg羟基磷灰石(HA)于混合均匀的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0080](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0081](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0082](7)将此面团状可塑物按照6:5的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0083](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0084]将所得PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料置于配好的人工体液SBF溶液中浸泡，每隔一周更换一次SBF溶液，28d后取出冷冻干燥，用MTS810陶瓷试验系统采集其机械特性数据，结果见图8。结果表明该材料在SBF内浸泡28d前后，其弹性模量和抗压强度无统计学差异，并且处于人体松质骨的机械特性值范围内，具有模拟人体松质骨的潜质。
[0085]实施例6
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0086](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0087](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0088](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0089](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0090](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0091](7)将此面团状可塑物按照3:4的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0092](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0093](9)将用高压蒸汽消毒过的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料浸泡于含10%胎牛血清和1% 双抗(青霉素和硫酸链霉素)的a-MEM培养基内，置于37°C培养箱培养24h制得浸提液。同时用此a-MEM培养基复苏传代MC3T3细胞。
[0094](10)将150-200 μ L MC3T3细胞按照I X 14/孔的密度接种进96孔板内，培养24h后待细胞贴壁，将培养基吸出，替换为上述步骤(9)的浸提液(实验组)，含10%胎牛血清和1%双抗的的a-MEM培养基作为对照组，继续培养，每组设6个副孔。
[0095](11)在第I和第3天时，每孔加入20 μ L 5mg/mL的MTT溶液，培养4h后吸出，替换为200 μ L DMSO溶液，室温下避光混匀15min，测量490nm处的分光光度值，并计算相对生长比率(RGR)，即0D_^fi /OD5irtya,以检测本实施例得到的复合支架骨移植材料是否有细胞毒性。
[0096]结果见图9，从图中可以看到，第I天和第3天的MC3T3细胞的RGR均大于100，并且随着时间增长，OD值也会随之增长，证实此复合支架骨移植材料对MC3T3细胞无毒性，有良好的生物相容性。
[0097]实施例7
Cl)室温下将壳聚糖(CS)溶解于0.lmol/L盐酸溶液中配制质量浓度为2%的CS盐酸溶液，溶解完全后，于冰浴中搅拌15min。
[0098](2)与此同时，将甘油磷酸钠(GP)溶解在蒸馏水配制质量浓度为50%的GP溶液，同样在冰浴中放置15min。
[0099](3)在不断搅拌下，将0.5mL GP溶液缓慢滴入4.5mL CS盐酸溶液中，保持溶液无混浊，搅拌20min得到混合均匀的CS-GP溶液。
[0100](4)先后加入25mg硫酸庆大霉素(GM)和300mg轻基磷灰石(HA)于混合均勾的CS-GP溶液中，并超声处理使其混合均匀得到CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液。
[0101](5 )将CS-GP/Nano-HA/GM混合溶液置于37 °C的恒温箱中，5min后形成CS-GP/Nano-HA/GM 凝胶。
[0102](6)将PMMA的粉剂和液剂按照质量比1:1的比例搅拌混合，形成均一的面团状可塑物。
[0103](7)将此面团状可塑物按照3:4的体积比与上述CS-GP/Nano-HA/GM凝胶充分混合均勾，随后注入聚四氟乙烯的圆柱体模具(内径6臟，高12mm)内，以便塑形。
[0104](8)过夜固化后，脱模，干燥得到PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料。
[0105](9)将用高压蒸汽消毒过的PMMA/CS-GP/Nano-HA/GM复合支架骨移植材料浸泡于含10%牛血清和1%双抗(青霉素和硫酸链霉素)的a-MEM培养基内，置于37°C培养箱培养24h制得浸提液。同时用此a-MEM培养基复苏传代骨髓间充质干细胞(BMSC)细胞；
(10)将150-200 μ L BMSC细胞按照I X 14/孔的密度接种进96孔板内，培养24h后待细胞贴壁，将培养基吸出，替换为上述步骤(9)的浸提液(实验组)，含10%胎牛血清和1%双抗的a-MEM培养基作为对照组，继续培养。每组设6个副孔。
[0106](11)在第I和第3天时，每孔加入20 yL 5mg/mL的MTT溶液，培养4h后吸出，替换为200 μ L DMSO溶液，室温下避光混匀15min，测量490nm处的分光光度值，并计算相对生长比率(RGR)，即0D_^fi /OD5irtya,以检测本实施例得到的复合支架骨移植材料是否有细胞毒性。
[0107]结果见图10，从图中可以看到，第I天和第3天的BMSC细胞的RGR均大于100，并且随着时间增长，OD值也会随之增长，证实此复合支架骨移植材料对BMSC细胞无毒性，有良好的生物相容性。
【主权项】
1.一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:为聚甲基丙烯酸甲酯与负载骨引导材料和药物的壳聚糖基温敏凝胶混合得到的可注射的多孔三维结构的骨水泥复合物。2.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:所述的聚甲基丙烯酸甲酯为将聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂按质量比1:1的比例搅拌混合得到。3.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:所述的壳聚糖基温敏凝胶为如下壳聚糖凝胶中的一种:含l_5wt%碱性盐的壳聚糖凝胶，含l-10wt%轻基聚合物的壳聚糖凝胶，对壳聚糖进行衍生化、接枝反应或与浓度为l-10wt%的高分子化合物共混得到的壳聚糖凝胶。4.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:所述的骨引导材料为磷酸钙陶瓷、磷酸钙骨水泥和钙硅材料中的一种或几种；所述的药物为抗菌药物、抗炎药物、抗肿瘤药、多肽和蛋白质类药物中的一种或几种。5.根据权利要求4所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于:所述的壳聚糖基温敏凝胶负载骨引导材料的量为5-100mg/mL，负载药物的量为l_150mg/mL。6.根据权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料，其特征在于??聚甲基丙烯酸甲酯与负载骨引导材料和药物的壳聚糖基温敏凝胶的体积比为3-12:10。7.权利要求1-6任一项所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (O制备如下壳聚糖基复合溶液中的一种:含l_5wt%碱性盐的壳聚糖基复合溶液、含l-10wt%含羟基聚合物的壳聚糖基复合溶液，对壳聚糖进行衍生化、接枝反应或与浓度为l-10wt%的高分子化合物共混得到壳聚糖基复合溶液； (2)往混合均匀的壳聚糖基复合溶液中加入骨引导材料和药物，并超声处理使其混合均匀； (3)将复合溶液置于温箱中使其形成凝胶； (4)将聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂搅拌混合形成均一的面团状可塑物； (5)将(4)所得面团状可塑物与(3)所得凝胶混合均匀，将其注入模具内，经固化、脱模、干燥得到可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料。8.根据权利要求7所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，其特征在于:步骤(2)加入骨引导材料和药物的混合溶液中骨引导材料、药物的终浓度分别为5-lOOmg/mL、l_150mg/mLo9.根据权利要求7所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，其特征在于:步骤(4)中聚甲基丙烯酸甲酯的粉剂和液剂的质量比为1:1。10.根据权利要求7所述的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料的制备方法，其特征在于:步骤(5)中面团状可塑物与凝胶的体积比为3-12:10。
【专利摘要】本发明公开了一种可注射-多孔-载药的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料及其制备方法，属于有机功能材料制备领域。本发明的聚甲基丙烯酸甲酯基复合支架骨移植材料采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）作为提供机械支撑的支架，壳聚糖基温敏凝胶作为成孔剂及骨引导材料和药物的载体，两者相互混合可构成新型的可注射的多孔三维结构的骨水泥复合物。此支架骨移植材料的制备方法简单，反应温度适宜，生物相容性好，机械特性匹配，具有良好的生物矿化功能和相应的抗菌、抗炎或抗肿瘤等能力，在未来的骨组织重建的临床应用方面有着广阔的前景。
【IPC分类】A61L27/50, A61L27/10, A61L27/54, A61L27/12, A61L27/16, A61L27/20, A61L27/56
【公开号】CN104906637
【申请号】CN201510252453
【发明人】撒悦, 蒋滔, 王曼
【申请人】武汉大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月15日
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