用遗传编码的非天然氨基酸打破免疫耐受的制作方法
专利名称：用遗传编码的非天然氨基酸打破免疫耐受的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域。更具体说，本发明提供通过给予掺入了一个或多个非天 然氨基酸的对应于靶标部分(即所述自身部分或外来部分)的免疫原，在对象产生对抗自 身抗原，如TNFa或无数其它自身抗原的免疫应答，或者产生和提高对象对抗外来(非自 身)抗原的免疫应答的组合物和方法。
背景技术：
现代医学中的一大挑战是治疗既不引起对象产生抗体(例如，由于对象对自身抗 原的免疫耐受)也不引起强大/强烈抗体应答(例如，某些细菌/病毒感染)的医学病 症。有大量医学病症属于这种类型。例如，产生自或涉及对象自身蛋白质的病症可包含如 TNFa (参与/涉及克罗恩氏病，内毒素休克，脑疟疾等)，IL 10(参与SLE)等部分。而且， 对象对于多种病毒和细菌感染难以产生强大的抗体，如病毒和细菌感染，如HIV、CMV、结核 病和葡萄球菌。可提出多种不同方案以解决此类免疫应答问题。例如，此类方案考虑改良的佐 剂/载体，在抗原中引入强T细胞表位，偶联疫苗和组合疫苗。参见例如Baldridge等， 《疫苗佐剂免疫学和临床原则》(Vaccine Adjuvants immunological and Clinical Principles.) C. J. Hackett, Harn, D. A. Jr.编·(修马纳出版公司，新泽西州托托瓦)， 235-255 ；Makela 等，Expert Rev Vaccines, 1 (3) :399_410 (2002) ；Dalum 等，Nat Biotechnol. 17 666(1999)以及 Restifo, Curr Opin Immunol 8 658(1996).。其它方案 尝试用非特异性标记的抗原(即，重氮衍生化的抗原)进行免疫。参见Weigle，T Exp Med 121 289(1965)。然而，持续需要更好更广泛应用的方法和组合物以产生或增强对象对抗特异性自 身蛋白质如TNFa的免疫学应答，和/或对抗来自多种病原体如细菌、病毒、真菌和/或朊 蛋白病原物的特异性蛋白的免疫应答。本发明提供了这些和其它益处，一旦检验就会清楚。发明概述在产生多种疾病状态的疫苗中具有显著的选择性诱导对抗自身蛋白质的能力，或增强外源抗原特定表位的免疫原性的能力，所述疾病状态包括癌症、蛋白质折叠疾病和感 染性疾病(如细菌或病毒感染)。本发明通过在蛋白质中掺入非天然氨基酸产生用于疫苗 接种的非天然免疫原，或者产生用于被动免疫的抗体。在本发明中，加入非天然氨基酸的免 疫原对应接种/免疫对象的靶标部分(如疾病相关部分)，或者对应对象体内的靶标部分 (如疾病相关部分)。在将具有非天然氨基酸的免疫原给予对象的实施方式中，非天然氨基 酸的存在引起对抗免疫原的免疫应答，所述免疫应答交叉反应对抗靶标(如疾病相关)部 分。在第一方面，本发明提供了在对象中产生或增强对抗靶标部分如多肽、糖或两者 组合的免疫应答的方法，如B-细胞介导的应答和/或T-细胞介导的应答，所述靶标部分在 对象内或能够在对象内。所述方法包括提供包含一个或多个非天然氨基酸的非天然免疫 原，并将非天然免疫原给予对象。对象(如人、猴、小鼠、大鼠、猪、奶牛、鸡、笼中鸟、鸟舍鸟、 爬行动物和/或两栖动物)产生对抗非天然免疫原的一种或多种抗体，其中所述抗体针对 靶标部分交叉反应(因此产生或增强对抗靶标的免疫原性应答)。给予对象以产生或增强免疫应答的非天然免疫原对应对象体内至少一个靶标部 分(或对应能够在对象体内的至少一个部分)。在一些实施方式中，靶标部分可包含第一个 氨基酸序列，非天然免疫原可包含与靶标序列相同的第二个氨基酸序列，除了靶标部分序 列的一个或多个天然氨基酸被替换为免疫原序列中的一个或多个非天然氨基酸。或者或此 外，靶标部分可包含第一氨基酸序列，非天然免疫原可包含与靶标部分序列相同的第二氨 基酸序列，除了免疫原序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。在各种实施方式 中，非天然免疫原可包含与其起源的靶标部分基本相似的结构，和/或可包含与其起源的 靶标基本相似的三级和/或四级结构。非天然免疫原中出现的一个或多个非天然氨基酸可任意被抗体接近。本方面方法 中产生的一种或多种交叉反应抗体可任意对靶标部分上的表位具有特异性，所述表位包含 与非天然免疫原上的对应表位的相同序列。然而，交叉反应抗体可任意对靶标部分上的表 位具有特异性，与非天然免疫原的对应表位相比，所述表位包含不同的序列，如任意包含一 个或多个非天然氨基酸的不同序列。在这方面，可通过多种途径产生起源于靶标部分的非天然免疫原。在优选实施方 式中，使用正交翻译系统产生非天然免疫原。然而，非天然免疫原可任意在体内翻译系统中 产生(如通过选择性压力掺入)；在体外翻译系统中产生(如使用非天然氨基酸化学酰基 KWtRNAs)；通过除翻译后修饰之外的工艺产生；或通过对免疫原中出现的20种天然产生 的经典氨基酸之一进行化学修饰之外的工艺产生。掺入非天然免疫原的非天然氨基酸可任意包含除20种天然产生的经典氨基酸之 外的任何非天然氨基酸。可掺入的非天然氨基酸还可包括除20种经典氨基酸之外的任一 氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含如下结构
权利要求
一种在对象中产生或增强针对靶标部分的免疫应答的方法，所述方法包括提供非天然免疫原，其中非天然免疫原包含一个或多个非天然氨基酸；以及将非天然免疫原给予对象，其中所述对象产生针对非天然免疫原的一种或多种抗体，其中所述抗体针对靶标部分产生交叉反应；从而产生或增强针对靶标部分的免疫应答。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述免疫应答包括B-细胞介导的应答和/或 T-细胞介导的应答。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述提供非天然免疫原包括在正交翻译系统 中产生非天然免疫原。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述提供非天然免疫原包括在体外翻译系统 中产生非天然免疫原。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含20种天然产生的经典 氨基酸之一以外的非天然氨基酸。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫原中20 种天然产生的经典氨基酸之一进行化学修饰的工艺产生。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫原中20 种天然产生的经典氨基酸之一进行翻译后修饰的工艺产生。
8.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述对象选自人、猴、小鼠、大鼠、猪、奶牛、 鸡、笼中鸟、鸟舍鸟、爬行动物和两栖动物。
9.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽。
10.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽和/或碳水化合物。
11.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分是对象自身部分。
12.如权利要求11所述方法，其特征在于，所述靶标部分是疾病相关部分。
13.如权利要求12所述方法，其特征在于，所述自身部分选自以下一种或多种自身免 疫病相关自身抗原，肿瘤相关抗原，阿耳茨海默病相关抗原，淀粉样蛋白β 40，淀粉样蛋白 β 42，乳腺癌相关抗原，卵巢癌相关抗原，前列腺癌相关抗原，MAGE, BAGE, RAGE, NY-ES0，谱 系特异性肿瘤相关抗原，黑色素细胞-黑色素瘤谱系抗原，MART-1/Melan-A，酪氨酸酶或酪 氨酸酶相关蛋白质，酪氨酸酶相关蛋白质2，PSMA, PSA，突变的ras，重排的bcr/abl，Her2/ neu，突变或野生型p53，细胞色素P450 IBl，N-乙酰葡糖胺基转移酶-V的异常表达的内含 子序列，CA19-9, p53, OCAA, H0XB7, Cal25, PSA, PSMA, STEAP, PCTA-I, Cal5_3，EGF, EGFR, HER-I，CXCR4, G 蛋白偶联受体(GCPR)或 CA27-29。
14.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分并非对象的自身部分。
15.如权利要求14所述方法，其特征在于，所述靶标部分来自于细菌、病毒、真菌、支原 体、原生动物、蠕虫、或朊病毒。
16.如权利要求15所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种细 菌抗原，病毒抗原，真菌抗原，支原体抗原，原生动物抗原，蠕虫抗原，朊病毒抗原，HIV抗原， HIVgpl20, HIV gp41, HIV gag, HIV pol, HIV env, HIV tat, HIV nef, HIV rev，杯状病毒衣 壳抗原，乙型肝炎核心抗原，乙型肝炎表面抗原，丁型肝炎试剂，单纯疱疹病毒糖蛋白，水痘 带状疱疹病毒糖蛋白，流感病毒血凝素，流感病毒神经氨酸酶，流感病毒核蛋白，HPV衣壳蛋白，副流感病毒血凝素/神经氨酸酶，脊髓灰质炎病毒衣壳多肽，Hep A抗原，牛痘病毒多 肽，狂犬病病毒糖蛋白G，B. burgdorferi的OspA，B型流感嗜血杆菌外膜蛋白，结核分枝杆 菌脂阿拉伯甘露糖，结核分枝杆菌mAPG，酿脓链球菌M蛋白，肺炎链球菌荚膜多糖，鼠疫耶 尔森菌F1，鼠疫耶尔森菌V抗原，恶性疟原虫环孢子体(PfCSP)，恶性疟原虫孢子体表面蛋 白2 (PfSSP2)，恶性疟原虫肝脏分级抗原1羧基末端(PfLSAl c末端)，恶性疟原虫输出蛋 白质 I(PfExp-I)，Pfs48/45，Pfs 28, Pfs 25 或 Pfs 230。
17.如权利要求15所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自下列一种或多种细菌， 病毒，真菌，支原体，原生动物，蠕虫，朊病毒，放线菌，芽孢杆菌，类杆菌，波氏杆菌，巴尔通 体，包柔氏螺旋体菌，布鲁氏菌，弯曲杆菌，二氧化碳噬纤维菌，衣原体，梭菌，棒状杆菌，考 克斯氏体，潜蚤，肠球菌，埃立克体，大肠杆菌，弗朗西斯氏菌，梭杆菌，血巴尔通氏体，嗜血 杆菌，缠绕杆菌，克雷白氏杆菌，L型细菌，钩端螺旋体，李斯特菌，分枝杆菌，支原体，奈瑟氏 菌，新立克次氏体，诺卡氏菌，巴氏杆菌，消化球菌，消化链球菌，肺炎球菌，变形杆菌，假单 胞菌，立克次氏体，罗克利马体，沙门氏菌，痢疾杆菌，金黄色葡萄球菌，链球菌，螺旋体，耶 尔森氏菌，腺病毒，甲病毒，杯状病毒，冠状病毒，巨细胞病毒，犬瘟热病毒，埃博拉病毒，肠 病毒，EB病毒，黄病毒，丙型肝炎病毒，嗜肝DNA病毒，乙型肝炎病毒，δ肝炎病毒，戊型或 己型肝炎病毒，GBV-C,疱疹病毒，单纯疱疹病毒，水痘带状疱疹病毒，免疫缺陷病毒，艾滋病 毒，传染性腹膜炎病毒，流感病毒，A型流感病毒，白血病病毒，马尔堡病毒，正粘病毒，乳头 瘤病毒，HPV，副流感病毒，副粘病毒，RSV，细小病毒，瘟病毒，小核糖核酸病毒，脊髓灰质炎 病毒，痘病毒，牛痘病毒，狂犬病病毒，呼肠病毒，逆转录病毒，轮状病毒，犁头霉，支顶孢，链 格孢，曲霉，一蛙粪霉菌，双极霉，子囊酵母，念珠菌，假丝酵母，一耳霉，隐球菌，叶枯病菌， 表皮癣菌，外瓶霉，地丝菌，组织胞浆菌，马杜拉分支菌，马拉色菌，小孢子菌，小丛梗孢，被 孢霉，毛霉，拟青霉，青霉，单胞瓶霉，瓶霉，绿藻，足肿菌，假小托菌，腐霉，鼻孢子虫，根霉， 线状担子菌，孢子丝菌，匍柄霉，毛癣菌，毛孢子菌，木丝霉，巴贝斯虫，结肠小袋纤毛虫，孢 子虫，隐孢子虫，艾美虫，脑胞内原虫，内阿米巴，贾第虫，哈蒙德虫，肝簇虫等孢子球虫，利 什曼虫，微孢子虫，新孢子虫，微孢子虫，五鞭毛虫，疟原虫，恶性疟原虫，肺囊虫，肉孢子虫， 血吸虫，泰来虫，弓形体，锥虫，棘唇虫，猫圆线虫，钩虫，管圆线虫，蛔虫，布鲁格氏丝虫，仰 口线虫，毛细线虫，夏氏线虫，古柏线虫，环体线虫，网尾线虫，膨结虫，棘唇线虫，绦虫，复孔 绦虫，恶丝虫，龙线虫，蛲虫，类丝虫，血矛线虫，兔唇蛔虫，洛阿多肽，曼森线虫，缪勒线虫， 侏形吸虫，钩虫，细颈线虫，结节线虫，盘尾虫，后睾吸虫，胃线虫，副丝虫，肺吸虫，副蛔虫， 泡翼线虫，原圆虫，腹腔丝虫，旋尾线虫，宫绦虫，冠丝虫，类圆线虫，圆线虫，吸吮线虫，弓蛔 线虫，弓首蛔虫，旋毛虫，虹膜钩虫，鞭虫属，钩虫，或吴策线虫。
18.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列，所述非 天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二序列与第一序列相同，除了第一序列中的 一个或多个天然氨基酸在第二序列中被替换为一个或多个非天然氨基酸。
19.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列，并且所 述非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相同， 除了第二氨基酸序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。
20.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于靶标部分 的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含相同的序列。
21.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于靶标部分 的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含不同的序列。
22.如权利要求21所述方法，其特征在于，所述对应的非天然免疫原表位上的序列包 含一个或多个非天然氨基酸。
23.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基酸可被抗体接近。
24.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含与靶标部分基本相似 的结构。
25.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含与靶标部分基本相似 的三级和/或四级结构。
26.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是除20种经典氨基酸以外 的氨基酸，并且所述非天然氨基酸包含如下结构 其中R是除20种经典天然氨基酸中任一种所用侧链之外的任何取代基；其中R1是20 种经典的天然氨基酸中的一种所用的取代基；其中R2是任何取代基，使R2-R1 —起组成不 同于20种经典天然氨基酸中任一种的侧链；其中Z是0H，NH2，SH，NH-R'或S-R'；其中R' 是除H之外的任何取代基；并且其中X和Y各自是S或0。
27.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然氨基酸选自对-硝基苯丙氨酸; 邻-硝基苯丙氨酸；间-硝基苯丙氨酸；对-硼羰基Phe ；邻-硼羰基Phe ；间-硼羰基Phe ； 对_氨基Phe ；邻-氨基Phe ；间-氨基Phe ；对-酰基Phe ；邻-酰基Phe ；间-酰基Phe ； 对-OMe Phe ；邻-OMe Phe ；间-OMePhe ；对-磺基 Phe ；邻-磺基 Phe ；间-磺基 Phe ； 5-硝 基His ；3-硝基Tyr ；2-硝基Tyr ；硝基取代的Leu ；硝基取代的His ；硝基取代的Ile ；硝基取代的Trp ；2-硝基Trp ；4-硝基Trp ；5-硝基Trp ；6-硝基Trp ；7-硝基Trp ；3-氨基酪氨 酸，2-氨基酪氨酸，0-磺基酪氨酸，2-硫氧基苯丙氨酸，3-硫氧基氧基苯丙氨酸或对-羧基 苯丙氨酸，邻_羧基苯丙氨酸和间_羧基苯丙氨酸。
28.如权利要求12所述方法，其特征在于，所述靶标部分是TNFa。
29.如权利要求28所述方法，其特征在于，所述对象是小鼠，所述靶标部分是mTNFα， 并且所述免疫原是非天然mTNF α。
30.如权利要求29所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFα包含pN02Phe86-mTNF α。
31.如权利要求29所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFα选自=PNO2Phe11-HiTNFa、 PNO2Phe19ITNFa、pN02Phe21_mTNF a、pN02Phe42_mTNF a、pN02Phe49_mTNF a、 pN02Phe104-mTNF α 以及 pN02Phe113_mTNF a。
32.如权利要求28所述方法，其特征在于，所述对象是人，所述靶标部分是hTNFa，并 且免疫原是hTNF a。
33.如权利要求28所述方法，其特征在于，所述非天然hTNFα选自=PNO2Phe1LhTNFa、 pN02Phe19-hTNF a、pN02Phe21_hTNF a、pN02Phe42_hTNF a、pN02Phe49_hTNF a、 pN02Phe87-hTNF a、pN02Phe105-hTNF α 以及 pN02Phe114_hTNF a。
34.一种预防性或治疗性处理对象疾病状态的方法，所述方法包括给予对象非天然免疫原，所述免疫原包含一个或多个非天然氨基酸，并且非天然免疫 原刺激对象中抗体的产生，其中所述抗体与对象中的一种或多种靶标部分交叉反应，或者 针对对象体内与疾病状态相关的一种或多种靶标部分。
35.一种预防性或治疗性处理对象中疾病状态的方法，所述方法包括产生针对一种或多种靶标部分的抗体，此类产生包括制造针对非天然免疫原的抗体， 所述非天然免疫原包含一个或多个非天然氨基酸，并且所述抗体针对靶标部分交叉反应； 并且，将抗体给予对象。
36.如权利要求34或35所述方法，其特征在于，所述预防性或治疗性处理包括在对象 中引起B-细胞介导的应答和/或T-细胞介导的应答。
37.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原在正交翻译系统中产生。
38.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原在体外翻译系统中产生。
39.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原不包含经翻译后 修饰或化学修饰的氨基酸。
40.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含20种天然产 生的经典氨基酸之一以外的非天然氨基酸。
41.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫 原中20种天然产生的经典氨基酸之一进行化学修饰之外的工艺产生。
42.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫 原中20种天然产生的经典氨基酸之一进行翻译后修饰之外的工艺产生。
43.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述疾病状态是自身免疫病、癌症、细菌感染、病毒感染、真菌感染、支原体感染、朊病毒感染、原生动物感染或放线菌感染。
44.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述对象选自人、猴、小鼠、大鼠、 猪、奶牛、鸡、笼中鸟、鸟舍鸟、爬行动物和两栖动物。
45.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽。
46.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽和/或碳水 化合物。
47.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分是对象自身部分。
48.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分是疾病相关部分。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种 自身免疫病相关自身抗原、肿瘤相关抗原、阿耳茨海默病相关抗原、淀粉样蛋白β 40、淀 粉样蛋白β 42、乳腺癌相关抗原、卵巢癌相关抗原、前列腺癌相关抗原、MAGE、BAGE、RAGE、 NY-ES0、谱系特异性肿瘤相关抗原、黑色素细胞-黑色素瘤谱系抗原、MART-1/Melan-A、酪 氨酸酶或酪氨酸酶相关蛋白质、酪氨酸酶相关蛋白质2、PSMA、PSA、突变的ras、重排的bcr/ abl、Her2/neu、突变或野生型p53、细胞色素P4501B1、N_乙酰葡糖胺基转移酶-V的异常表 达的内含子序列、CA19-9、p53、0CAA、H0XB7、Cal25、PSA、PSMA、STEAP、PCTA-I、Cal5-3、EGF、 EGFR、HER-I、CXCR4、G 蛋白偶联受体(GCPR)或 CA27-29。
50.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分不是对象自身部分。
51.如权利要求50所述方法，其特征在于，所述靶标部分来自于细菌，病毒，真菌，支原 体，原生动物，蠕虫，或朊病毒。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种细 菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、支原体抗原、原生动物抗原、蠕虫抗原、朊病毒抗原、 抗原、 HIVgpl20、HIV gp41、HIV gag、HIV pol、HIV env、HIV tat、HIV nef、HIV rev、杯状病毒 衣壳抗原、乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎表面抗原、丁型肝炎试剂、单纯疱疹病毒糖蛋白、水 痘带状疱疹病毒糖蛋白、流感病毒血凝素、流感病毒神经氨酸酶、流感病毒核蛋白、HPV衣壳 蛋白、副流感病毒血凝素/神经氨酸酶、脊髓灰质炎病毒衣壳多肽、Hep A抗原、牛痘病毒多 肽、狂犬病病毒糖蛋白G、B. burgdorgeri的OspA、B型流感嗜血杆菌外膜蛋白、结核分枝杆 菌脂阿拉伯甘露糖、结核分枝杆菌mAPG、酿脓链球菌M蛋白、肺炎链球菌荚膜多糖、鼠疫耶 尔森菌F1、鼠疫耶尔森菌V抗原、恶性疟原虫环孢子体(PfCSP)、恶性疟原虫孢子体表面蛋 白2(PfSSP2)、恶性疟原虫肝脏分级抗原1羧基末端(PfLSAl c末端)、恶性疟原虫输出蛋 白质 I(PfExp-I)、Pfs48/45、Pfs 28、Pfs 25 或 Pfs 230。
53.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述靶标部分选自下列一种或多种细 菌、病毒、真菌、支原体、原生动物、蠕虫、朊病毒、放线菌、芽孢杆菌、类杆菌、波氏杆菌、巴尔 通体、包柔氏螺旋体菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、二氧化碳噬纤维菌、衣原体、梭菌、棒状杆菌、 考克斯氏体、潜蚤、肠球菌、埃立克体、大肠杆菌、弗朗西斯氏菌、梭杆菌、血巴尔通氏体、嗜 血杆菌、缠绕杆菌、克雷白氏杆菌、L型细菌、钩端螺旋体、李斯特菌、分枝杆菌、支原体、奈瑟 氏菌、新立克次氏体、诺卡氏菌、巴氏杆菌、消化球菌、消化链球菌、肺炎球菌、变形杆菌、假 单胞菌、立克次氏体、罗克利马体、沙门氏菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、螺旋体、 耶尔森氏菌、腺病毒、甲病毒、杯状病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、犬瘟热病毒、埃博拉病毒、 肠病毒、EB病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、嗜肝DNA病毒、乙型肝炎病毒、δ肝炎病毒、戊型或己型肝炎病毒、GBV-C、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、免疫缺陷病毒、艾滋病 毒、传染性腹膜炎病毒、流感病毒、A型流感病毒、白血病病毒、马尔堡病毒、正粘病毒、乳头 瘤病毒、HPV、副流感病毒、副粘病毒、RSV、细小病毒、瘟病毒、小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎 病毒、痘病毒、牛痘病毒、狂犬病病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、轮状病毒、犁头霉、支顶孢、链 格孢、曲霉、一蛙粪霉菌、双极霉、子囊酵母、念珠菌、假丝酵母、一耳霉、隐球菌、叶枯病菌、 表皮癣菌、外瓶霉、地丝菌、组织胞浆菌、马杜拉分支菌、马拉色菌、小孢子菌、小丛梗孢、被 孢霉、毛霉、拟青霉、青霉、单胞瓶霉、瓶霉、绿藻、足肿菌、假小托菌、腐霉、鼻孢子虫、根霉、 线状担子菌、孢子丝菌、匍柄霉、毛癣菌、毛孢子菌、木丝霉、巴贝斯虫、结肠小袋纤毛虫、孢 子虫、隐孢子虫、艾美虫、脑胞内原虫、内阿米巴、贾第虫、哈蒙德虫、肝簇虫、等孢子球虫、利 什曼虫、微孢子虫、新孢子虫、微孢子虫、五鞭毛虫、疟原虫、恶性疟原虫、肺囊虫、肉孢子虫、 血吸虫、泰来虫、弓形体、锥虫、棘唇虫、猫圆线虫、钩虫、管圆线虫、蛔虫、布鲁格氏丝虫、仰 口线虫、毛细线虫、夏氏线虫、古柏线虫、环体线虫、网尾线虫、膨结虫、棘唇线虫、绦虫、复孔 绦虫、恶丝虫、龙线虫、蛲虫、类丝虫、血矛线虫、兔唇蛔虫、洛阿多肽、曼森线虫、缪勒线虫、 侏形吸虫、钩虫、细颈线虫、结节线虫、盘尾虫、后睾吸虫、胃线虫、副丝虫、肺吸虫、副蛔虫、 泡翼线虫、原圆虫、腹腔丝虫、旋尾线虫、宫绦虫、冠丝虫、类圆线虫、圆线虫、吸吮线虫、弓蛔 线虫、弓首蛔虫、旋毛虫、虹膜钩虫、鞭虫属、钩虫、或吴策线虫。
54.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列， 所述非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二序列与第一序列相同，除了第一序 列中的一个或多个天然氨基酸在第二序列中被替换为一个或多个非天然氨基酸。
55.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列， 并且所述非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二氨基酸序列与第一氨基酸序列 相同，除了第二氨基酸序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。
56.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于 靶标部分的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含相同的 序列。
57.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于 靶标部分的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含不同的 序列。
58.如权利要求57所述方法，其特征在于，所述对应的非天然免疫原表位上的序列包 含一个或多个非天然氨基酸。
59.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基酸可被 抗体接近。
60.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述免疫原包含与靶标部分基本相 似的结构。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述免疫原包含与靶标部分基本相似的 三级和/或四级结构。
62.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是除20种经典氨 基酸以外的氨基酸，并且所述非天然氨基酸包含如下结构IV/CO2H R2——Rl —<NH2 .其中R是除20种经典天然氨基酸中任一种所用侧链之外的任何取代基；其中R1是20 种经典的天然氨基酸中一种所用的取代基；其中R2是任何取代基，使R2-R1 —起组成不同 于20种经典天然氨基酸中任一种的侧链；其中Z是0H，NH2, SH，NH-R'或S-R'；其中R' 是除H之外的任何取代基；并且其中X和Y各自是S或0。
63.如权利要求所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是对-硝基苯丙氨酸。
64.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸选自对-硝基苯 丙氨酸；邻-硝基苯丙氨酸；间-硝基苯丙氨酸；对-硼羰基Phe ；邻-硼羰基Phe ；间-硼羰 基Phe ；对-氨基Phe ；邻-氨基Phe ；间-氨基Phe ；对-酰基Phe ；邻-酰基Phe ；间-酰基 Phe ；对-OMe Phe ；邻-OMe Phe ；间-OMe Phe ；对-磺基 Phe ；邻-磺基 Phe ；间-磺基 Phe ； 5-硝基His ;3_硝基Tyr ；2-硝基Tyr ；硝基取代的Leu ；硝基取代的His ；硝基取代的Ile ； 硝基取代的Trp ；2-硝基Trp ；4-硝基Trp ；5-硝基Trp ；6-硝基Trp ；7-硝基Trp ；3-氨基酪 氨酸，2-氨基酪氨酸，0-磺基酪氨酸，2-硫氧基苯丙氨酸，3-硫氧基氧基苯丙氨酸或对-羧 基苯丙氨酸，邻-羧基苯丙氨酸和间-羧基苯丙氨酸。
65.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分是TNFα。
66.如权利要求65所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种内 毒素休克、脑疟疾、自身免疫病、多器官功能衰竭、多发性硬化症、心脏功能障碍、动脉粥样 硬化、缺血再灌注损伤、胰岛素抵抗、类风湿关节炎、克罗恩病、炎性肠病、恶病质、感染性休 克、艾滋病、移植物抗宿主病、杀菌肉芽肿、成人呼吸窘迫综合症、二氧化硅致肺纤维化。
67.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述对象是小鼠，所述靶标部分是 mTNF α，并且所述免疫原是非天然mTNF α。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述非天然mTNFa包含PNO2Phe86-HiTNF α。
69.如权利要求67所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFα选自=PNO2Phe11-IiiTNFa、 PNO2Phe19ITNFa、pN02Phe21_mTNF a、pN02Phe42_mTNF a、pN02Phe49_mTNF a、 pN02Phe104-mTNF α 以及 pN02Phe113_mTNF a。
70.如权利要求65所述方法，其特征在于，所述对象是人，所述靶标部分是hTNFa，并 且免疫原是hTNF a。
71.如权利要求70所述方法，其特征在于，所述非天然hTNFα选自=PNO2Phe1LhTNFa、 pN02Phe19-hTNF a、pN02Phe21_hTNF a、pN02Phe42_hTNF a、pN02Phe49_hTNF a、 pN02Phe87-hTNF a、pN02Phe105-hTNF α 以及 pN02Phe114_hTNF a。
72.—种生产疫苗的方法，所述方法包括鉴定抗体疗法的靶标部分，其中所述靶标部分不包含非天然氨基酸；提供非天然免疫原，其中所述非天然免疫原包含一个或多个非天然氨基酸，并且所述 非天然免疫原与靶标部分结构相似，当给予对象时，对象产生针对非天然免疫原的与靶标 部分交叉反应的抗体；以及，将非天然免疫原与一种或多种药学上可接受的佐剂、载体或赋形剂混合，由此产生疫田ο
73.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述提供非天然免疫原包括在正交翻译系 统中产生非天然免疫原。
74.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述提供非天然免疫原包括在体外翻译系 统中产生非天然免疫原。
75.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含20种天然产生的经 典氨基酸之一以外的非天然氨基酸。
76.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫原中20 种天然产生的经典氨基酸之一进行化学修饰以外的工艺产生。
77.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫原中20 种天然产生的经典氨基酸之一进行翻译后修饰以外的工艺产生。
78.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述对象选自人、猴、小鼠、大鼠、猪、奶牛、 鸡、笼中鸟、鸟舍鸟、爬行动物和两栖动物。
79.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽。
80.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽和/或碳水化合物。
81.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分是对象自身部分。
82.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分是疾病相关部分。
83.如权利要求82所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种自身 免疫病相关自身抗原、肿瘤相关抗原、阿耳茨海默病相关抗原、淀粉样蛋白β 40、淀粉样蛋 白β 42、乳腺癌相关抗原、卵巢癌相关抗原、前列腺癌相关抗原、MAGE、BAGE、RAGE、NY-ESO、 谱系特异性肿瘤相关抗原、黑色素细胞-黑色素瘤谱系抗原、MART-1/Melan-A、酪氨酸酶 或酪氨酸酶相关蛋白质、酪氨酸酶相关蛋白质2、PSMA、PSA、突变的ras、重排的bcr/abl、 Her2/neu、突变或野生型p53、细胞色素P4501B1、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V的异常表达 的内含子序列、CA19-9, p53、OCAA, H0XB7、Cal25、PSA、PSMA、STEAP, PCTA-U Cal5_3、EGF,EGFR、HER-I、CXCR4、G 蛋白偶联受体(GCPR)或 CA27-29。
84.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分并非对象的自身部分。
85.如权利要求84所述方法，其特征在于，所述靶标部分来自于细菌，病毒，真菌，支原 体，原生动物，蠕虫，或朊病毒。
86.如权利要求85所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种细 菌抗原，病毒抗原，真菌抗原，支原体抗原，原生动物抗原，蠕虫抗原，朊病毒抗原，HIV抗原， HIVgpl20, HIV gp41, HIV gag, HIV pol, HIV env, HIV tat, HIV nef, HIV rev，杯状病毒衣 壳抗原，乙型肝炎核心抗原，乙型肝炎表面抗原，S肝炎病毒试剂，单纯疱疹病毒糖蛋白，水 痘带状疱疹病毒糖蛋白，流感病毒血凝素，流感病毒神经氨酸酶，流感病毒核蛋白，HPV衣壳 蛋白，副流感病毒血凝素/神经氨酸酶，脊髓灰质炎病毒衣壳多肽，Hep A抗原，牛痘病毒多 肽，狂犬病病毒糖蛋白G，B. burgdorferi的OspA，B型流感嗜血杆菌外膜蛋白，结核分枝杆 菌脂阿拉伯甘露糖，结核分枝杆菌mAPG，酿脓链球菌M蛋白，肺炎链球菌荚膜多糖，鼠疫耶 尔森菌F1，鼠疫耶尔森菌V抗原，恶性疟原虫环孢子体(PfCSP)，恶性疟原虫孢子体表面蛋 白2(PfSSP2)，恶性疟原虫肝脏分级抗原1羧基末端(PfLSAl c末端)，恶性疟原虫输出蛋 白质 I(PfExp-I)，Pfs48/45，Pfs 28, Pfs 25 或 Pfs 230。
87.如权利要求85所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自下列一种或多种细菌、 病毒、真菌、支原体、原生动物、蠕虫、朊病毒、放线菌、芽孢杆菌、类杆菌、波氏杆菌、巴尔通 体、包柔氏螺旋体菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、二氧化碳噬纤维菌、衣原体、梭菌、棒状杆菌、考 克斯氏体、潜蚤、肠球菌、埃立克体、大肠杆菌、弗朗西斯氏菌、梭杆菌、血巴尔通氏体、嗜血 杆菌、缠绕杆菌、克雷白氏杆菌、L型细菌、钩端螺旋体、李斯特菌、分枝杆菌、支原体、奈瑟氏 菌、新立克次氏体、诺卡氏菌、巴氏杆菌、消化球菌、消化链球菌、肺炎球菌、变形杆菌、假单 胞菌、立克次氏体、罗克利马体、沙门氏菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、螺旋体、耶 尔森氏菌、腺病毒、甲病毒、杯状病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、犬瘟热病毒、埃博拉病毒、肠 病毒、EB病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、嗜肝DNA病毒、乙型肝炎病毒、δ肝炎病毒、戊型或 己型肝炎病毒、GBV-C、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、免疫缺陷病毒、艾滋病 毒、传染性腹膜炎病毒、流感病毒、A型流感病毒、白血病病毒、马尔堡病毒、正粘病毒、乳头 瘤病毒、HPV、副流感病毒、副粘病毒、RSV、细小病毒、瘟病毒、小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎 病毒、痘病毒、牛痘病毒、狂犬病病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、轮状病毒、犁头霉、支顶孢、链 格孢、曲霉、一蛙粪霉菌、双极霉、子囊酵母、念珠菌、假丝酵母、一耳霉、隐球菌、叶枯病菌、 表皮癣菌、外瓶霉、地丝菌、组织胞浆菌、马杜拉分支菌、马拉色菌、小孢子菌、小丛梗孢、被 孢霉、毛霉、拟青霉、青霉、单胞瓶霉、瓶霉、绿藻、足肿菌、假小托菌、腐霉、鼻孢子虫、根霉、 线状担子菌、孢子丝菌、匍柄霉、毛癣菌、毛孢子菌、木丝霉、巴贝斯虫、结肠小袋纤毛虫、孢 子虫、隐孢子虫、艾美虫、脑胞内原虫、内阿米巴、贾第虫、哈蒙德虫、肝簇虫、等孢子球虫、利 什曼虫、微孢子虫、新孢子虫、微孢子虫、五鞭毛虫、疟原虫、恶性疟原虫、肺囊虫、肉孢子虫、 血吸虫、泰来虫、弓形体、锥虫、棘唇虫、猫圆线虫、钩虫、管圆线虫、蛔虫、布鲁格氏丝虫、仰 口线虫、毛细线虫、夏氏线虫、古柏线虫、环体线虫、网尾线虫、膨结虫、棘唇线虫、绦虫、复孔 绦虫、恶丝虫、龙线虫、蛲虫、类丝虫、血矛线虫、兔唇蛔虫、洛阿多肽、曼森线虫、缪勒线虫、 侏形吸虫、钩虫、细颈线虫、结节线虫、盘尾虫、后睾吸虫、胃线虫、副丝虫、肺吸虫、副蛔虫、 泡翼线虫、原圆虫、腹腔丝虫、旋尾线虫、宫绦虫、冠丝虫、类圆线虫、圆线虫、吸吮线虫、弓蛔线虫、弓首蛔虫、旋毛虫、虹膜钩虫、鞭虫属、钩虫、或吴策线虫。
88.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列，所述 非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二序列与第一序列相同，除了第一序列中 的一个或多个天然氨基酸在第二序列中被替换为一个或多个非天然氨基酸。
89.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列，并且所 述非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相同， 除了第二氨基酸序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。
90.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于靶标部 分的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含相同的序列。
91.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于靶标部 分的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含不同的序列。
92.如权利要求91所述方法，其特征在于，所述对应的非天然免疫原表位上的序列包 含一个或多个非天然氨基酸。
93.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基酸可被抗体接近。
94.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含与靶标部分基本相 似的结构。
95.如权利要求94所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含与靶标部分基本相 似的三级和/或四级结构。
96.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是除20种经典氨基酸以 外的氨基酸，并且所述非天然氨基酸包含如下结构
97.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然氨基酸选自对-硝基苯丙氨 酸；邻-硝基苯丙氨酸；间-硝基苯丙氨酸；对-硼羰基Phe ；邻-硼羰基Phe ；间-硼羰基 Phe ；对-氨基Phe ；邻-氨基Phe ；间-氨基Phe ；对-酰基Phe ；邻-酰基Phe ；间-酰基 Phe ；对-OMe Phe ；邻-OMe Phe ；间-OMePhe ；对-磺基 Phe ；邻-磺基 Phe ；间-磺基 Phe ； 5-硝基His ；3-硝基Tyr ；2-硝基Tyr ；硝基取代的Leu ；硝基取代的His ；硝基取代的Ile ； 硝基取代的Trp ；2-硝基Trp ；4-硝基Trp ；5-硝基Trp ；6-硝基Trp ；7-硝基Trp ；3-氨基酪 氨酸，2-氨基酪氨酸，0-磺基酪氨酸，2-硫氧基苯丙氨酸，3-硫氧基氧基苯丙氨酸或对-羧 基苯丙氨酸，邻-羧基苯丙氨酸和间-羧基苯丙氨酸。
98.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分是TNFα。
99.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述对象是小鼠，所述靶标部分是 mTNF α，并且所述非免疫原是非天然mTNF α。
100.如权利要求99所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFα包含pN02Phe86-mTNF α。
101.如权利要求99所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFa选自 PNO2Phe11ITNFa、pN02Phe19-mTNF a、pN02Phe21-mTNF a、pN02Phe42-mTNF a、 pN02Phe49-mTNF a、pN02Phe104-mTNF α 以及 pN02Phe113_mTNF a。
102.如权利要求98所述方法，其特征在于，所述对象是人，所述靶标部分包含hTNFα， 并且免疫原包含hTNF a。
103.如权利要求102所述方法，其特征在于，所述非天然hTNFa选自 PNO2Phe11-IiTNFa、pN02Phe19_hTNF a、pN02Phe21_hTNF a、pN02Phe42_hTNF a、 pN02Phe49-hTNF a、pN02Phe87_hTNF a、pN02Phe105-hTNF α 以及 pN02Phe114_hTNF a。
104.一种由权利要求72所述方法产生的疫苗。
105.一种在细胞种产生非天然TNFa的方法，其中所述非天然TNF α包含 PNO2Phe86-TNF α，所述方法包含在合适培养基中培养细胞，其中所述细胞包含在86位氨基酸含有至少一个选择性密 码子的核酸，并且所述核酸编码TNF α ；并且，提供 PNO2Phe ；其中所述细胞还包含识别选择性密码子的正交-tRNA (Ο-tRNA)；以及，优选用PNO2Phe氨酰化Ο-tRNA并在选择者密码子的作用下将pN02Phe掺入氨基酸86 位，从而产生非天然TNF α的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)。
106.一种非天然 TNF α，所述 TNF α 包含 pN02Phe86_mTNF a。
107.一种非天然TNF a，所述TNF α包含选自下组的TNF a :pN02Phen-mTNF a、 pN02Phe19-mTNF a、pN02Phe21_mTNF a、pN02Phe42_mTNF a、pN02Phe49_mTNF a、 pN02Phe104-mTNF α 禾口 pN02Phe113_mTNF a 0
108.一种非天然TNF a，所述TNF α包含选自下组的TNF a :pN02Phen-hTNF a、pN02Phe19_hTNF α、pN02Phe21_hTNF α、pN02Phe42_hTNF α、pN02Phe49_hTNF α、 pN02Phe87-hTNF α、pN02Phe105-hTNF α 和 pN02Phe114_hTNF α。
109.—种组合物，其包含权利要求106、107或108所述的非天然TNFa。
110.一种抗权利要求106、107或108所述的非天然TNFa的抗体。
111.一种抗权利要求106、107或108所述的非天然TNFa的抗体，所述抗体能与不含 非天然氨基酸的TNF α发生交叉反应。
112.—种组合物，其包含权利要求110或111所述的抗体。
113.一种非天然 RBP4，所述 RBP4 包含 pN02Phe43mRBP4。
114.一种组合物，其包含权利要求113所述的非天然RBP4。
115.一种抗权利要求113所述的非天然RBP4的抗体，所述抗体能与不含非天然氨基酸 的RBP4发生交叉反应。
116.一种包含权利要求115所述抗体的组合物。
117.如权利要求1、34、35或72所述的方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基 酸在免疫原合成期间掺入所述非天然免疫原中。
118.如权利要求1、34、35或72所述的方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基 酸通过不同于翻译后修饰或合成后化学修饰的方法掺入所述非天然免疫原中。
119.如权利要求1、34、35或72所述的方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基 酸通过以下一种或多种方法掺入所述非天然免疫原中正交翻译；体外翻译；天然化学连 接；表达蛋白质连接；或固相合成。
120.如权利要求1、34、35或72所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含经糖 基化、硝基芳基修饰、硝化、烷基化、乙酰化、氧化、硫酸化或磷酸化的20种天然产生经典氨 基酸中的一个或多个氨基酸。
121.如权利要求120所述的方法，其特征在于，所述一个或多个氨基酸是通过不同于 翻译后修饰的方法或不同于化学修饰的方法糖基化、硝基芳基修饰、硝化、烷基化、乙酰化、 氧化、硫酸化或磷酸化的。
全文摘要
本发明包括通过给予具有一个或多个非天然氨基酸的靶标部分的抗原性形式和/或通过给予具有一个或多个非天然氨基酸的靶标部分之一的抗体产生和/或增强对象对靶标部分如疾病相关部分的的免疫应答的方法和组合物，所述抗体与所述天然靶标部分发生交叉反应。
文档编号A61P35/00GK101970005SQ200980104563
公开日2011年2月9日 申请日期2009年2月7日 优先权日2008年2月8日
发明者J·格鲁瓦尔德, P·G·舒尔茨, R·A·勒纳, R·佩尔拉, V·V·斯米德尔, 曹梦麟 申请人:斯克利普斯研究院
技术领域：
本发明涉及免疫学领域。更具体说，本发明提供通过给予掺入了一个或多个非天 然氨基酸的对应于靶标部分(即所述自身部分或外来部分)的免疫原，在对象产生对抗自 身抗原，如TNFa或无数其它自身抗原的免疫应答，或者产生和提高对象对抗外来(非自 身)抗原的免疫应答的组合物和方法。
背景技术：
现代医学中的一大挑战是治疗既不引起对象产生抗体(例如，由于对象对自身抗 原的免疫耐受)也不引起强大/强烈抗体应答(例如，某些细菌/病毒感染)的医学病 症。有大量医学病症属于这种类型。例如，产生自或涉及对象自身蛋白质的病症可包含如 TNFa (参与/涉及克罗恩氏病，内毒素休克，脑疟疾等)，IL 10(参与SLE)等部分。而且， 对象对于多种病毒和细菌感染难以产生强大的抗体，如病毒和细菌感染，如HIV、CMV、结核 病和葡萄球菌。可提出多种不同方案以解决此类免疫应答问题。例如，此类方案考虑改良的佐 剂/载体，在抗原中引入强T细胞表位，偶联疫苗和组合疫苗。参见例如Baldridge等， 《疫苗佐剂免疫学和临床原则》(Vaccine Adjuvants immunological and Clinical Principles.) C. J. Hackett, Harn, D. A. Jr.编·(修马纳出版公司，新泽西州托托瓦)， 235-255 ；Makela 等，Expert Rev Vaccines, 1 (3) :399_410 (2002) ；Dalum 等，Nat Biotechnol. 17 666(1999)以及 Restifo, Curr Opin Immunol 8 658(1996).。其它方案 尝试用非特异性标记的抗原(即，重氮衍生化的抗原)进行免疫。参见Weigle，T Exp Med 121 289(1965)。然而，持续需要更好更广泛应用的方法和组合物以产生或增强对象对抗特异性自 身蛋白质如TNFa的免疫学应答，和/或对抗来自多种病原体如细菌、病毒、真菌和/或朊 蛋白病原物的特异性蛋白的免疫应答。本发明提供了这些和其它益处，一旦检验就会清楚。发明概述在产生多种疾病状态的疫苗中具有显著的选择性诱导对抗自身蛋白质的能力，或增强外源抗原特定表位的免疫原性的能力，所述疾病状态包括癌症、蛋白质折叠疾病和感 染性疾病(如细菌或病毒感染)。本发明通过在蛋白质中掺入非天然氨基酸产生用于疫苗 接种的非天然免疫原，或者产生用于被动免疫的抗体。在本发明中，加入非天然氨基酸的免 疫原对应接种/免疫对象的靶标部分(如疾病相关部分)，或者对应对象体内的靶标部分 (如疾病相关部分)。在将具有非天然氨基酸的免疫原给予对象的实施方式中，非天然氨基 酸的存在引起对抗免疫原的免疫应答，所述免疫应答交叉反应对抗靶标(如疾病相关)部 分。在第一方面，本发明提供了在对象中产生或增强对抗靶标部分如多肽、糖或两者 组合的免疫应答的方法，如B-细胞介导的应答和/或T-细胞介导的应答，所述靶标部分在 对象内或能够在对象内。所述方法包括提供包含一个或多个非天然氨基酸的非天然免疫 原，并将非天然免疫原给予对象。对象(如人、猴、小鼠、大鼠、猪、奶牛、鸡、笼中鸟、鸟舍鸟、 爬行动物和/或两栖动物)产生对抗非天然免疫原的一种或多种抗体，其中所述抗体针对 靶标部分交叉反应(因此产生或增强对抗靶标的免疫原性应答)。给予对象以产生或增强免疫应答的非天然免疫原对应对象体内至少一个靶标部 分(或对应能够在对象体内的至少一个部分)。在一些实施方式中，靶标部分可包含第一个 氨基酸序列，非天然免疫原可包含与靶标序列相同的第二个氨基酸序列，除了靶标部分序 列的一个或多个天然氨基酸被替换为免疫原序列中的一个或多个非天然氨基酸。或者或此 外，靶标部分可包含第一氨基酸序列，非天然免疫原可包含与靶标部分序列相同的第二氨 基酸序列，除了免疫原序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。在各种实施方式 中，非天然免疫原可包含与其起源的靶标部分基本相似的结构，和/或可包含与其起源的 靶标基本相似的三级和/或四级结构。非天然免疫原中出现的一个或多个非天然氨基酸可任意被抗体接近。本方面方法 中产生的一种或多种交叉反应抗体可任意对靶标部分上的表位具有特异性，所述表位包含 与非天然免疫原上的对应表位的相同序列。然而，交叉反应抗体可任意对靶标部分上的表 位具有特异性，与非天然免疫原的对应表位相比，所述表位包含不同的序列，如任意包含一 个或多个非天然氨基酸的不同序列。在这方面，可通过多种途径产生起源于靶标部分的非天然免疫原。在优选实施方 式中，使用正交翻译系统产生非天然免疫原。然而，非天然免疫原可任意在体内翻译系统中 产生(如通过选择性压力掺入)；在体外翻译系统中产生(如使用非天然氨基酸化学酰基 KWtRNAs)；通过除翻译后修饰之外的工艺产生；或通过对免疫原中出现的20种天然产生 的经典氨基酸之一进行化学修饰之外的工艺产生。掺入非天然免疫原的非天然氨基酸可任意包含除20种天然产生的经典氨基酸之 外的任何非天然氨基酸。可掺入的非天然氨基酸还可包括除20种经典氨基酸之外的任一 氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含如下结构
权利要求
一种在对象中产生或增强针对靶标部分的免疫应答的方法，所述方法包括提供非天然免疫原，其中非天然免疫原包含一个或多个非天然氨基酸；以及将非天然免疫原给予对象，其中所述对象产生针对非天然免疫原的一种或多种抗体，其中所述抗体针对靶标部分产生交叉反应；从而产生或增强针对靶标部分的免疫应答。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述免疫应答包括B-细胞介导的应答和/或 T-细胞介导的应答。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述提供非天然免疫原包括在正交翻译系统 中产生非天然免疫原。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述提供非天然免疫原包括在体外翻译系统 中产生非天然免疫原。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含20种天然产生的经典 氨基酸之一以外的非天然氨基酸。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫原中20 种天然产生的经典氨基酸之一进行化学修饰的工艺产生。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫原中20 种天然产生的经典氨基酸之一进行翻译后修饰的工艺产生。
8.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述对象选自人、猴、小鼠、大鼠、猪、奶牛、 鸡、笼中鸟、鸟舍鸟、爬行动物和两栖动物。
9.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽。
10.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽和/或碳水化合物。
11.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分是对象自身部分。
12.如权利要求11所述方法，其特征在于，所述靶标部分是疾病相关部分。
13.如权利要求12所述方法，其特征在于，所述自身部分选自以下一种或多种自身免 疫病相关自身抗原，肿瘤相关抗原，阿耳茨海默病相关抗原，淀粉样蛋白β 40，淀粉样蛋白 β 42，乳腺癌相关抗原，卵巢癌相关抗原，前列腺癌相关抗原，MAGE, BAGE, RAGE, NY-ES0，谱 系特异性肿瘤相关抗原，黑色素细胞-黑色素瘤谱系抗原，MART-1/Melan-A，酪氨酸酶或酪 氨酸酶相关蛋白质，酪氨酸酶相关蛋白质2，PSMA, PSA，突变的ras，重排的bcr/abl，Her2/ neu，突变或野生型p53，细胞色素P450 IBl，N-乙酰葡糖胺基转移酶-V的异常表达的内含 子序列，CA19-9, p53, OCAA, H0XB7, Cal25, PSA, PSMA, STEAP, PCTA-I, Cal5_3，EGF, EGFR, HER-I，CXCR4, G 蛋白偶联受体(GCPR)或 CA27-29。
14.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分并非对象的自身部分。
15.如权利要求14所述方法，其特征在于，所述靶标部分来自于细菌、病毒、真菌、支原 体、原生动物、蠕虫、或朊病毒。
16.如权利要求15所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种细 菌抗原，病毒抗原，真菌抗原，支原体抗原，原生动物抗原，蠕虫抗原，朊病毒抗原，HIV抗原， HIVgpl20, HIV gp41, HIV gag, HIV pol, HIV env, HIV tat, HIV nef, HIV rev，杯状病毒衣 壳抗原，乙型肝炎核心抗原，乙型肝炎表面抗原，丁型肝炎试剂，单纯疱疹病毒糖蛋白，水痘 带状疱疹病毒糖蛋白，流感病毒血凝素，流感病毒神经氨酸酶，流感病毒核蛋白，HPV衣壳蛋白，副流感病毒血凝素/神经氨酸酶，脊髓灰质炎病毒衣壳多肽，Hep A抗原，牛痘病毒多 肽，狂犬病病毒糖蛋白G，B. burgdorferi的OspA，B型流感嗜血杆菌外膜蛋白，结核分枝杆 菌脂阿拉伯甘露糖，结核分枝杆菌mAPG，酿脓链球菌M蛋白，肺炎链球菌荚膜多糖，鼠疫耶 尔森菌F1，鼠疫耶尔森菌V抗原，恶性疟原虫环孢子体(PfCSP)，恶性疟原虫孢子体表面蛋 白2 (PfSSP2)，恶性疟原虫肝脏分级抗原1羧基末端(PfLSAl c末端)，恶性疟原虫输出蛋 白质 I(PfExp-I)，Pfs48/45，Pfs 28, Pfs 25 或 Pfs 230。
17.如权利要求15所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自下列一种或多种细菌， 病毒，真菌，支原体，原生动物，蠕虫，朊病毒，放线菌，芽孢杆菌，类杆菌，波氏杆菌，巴尔通 体，包柔氏螺旋体菌，布鲁氏菌，弯曲杆菌，二氧化碳噬纤维菌，衣原体，梭菌，棒状杆菌，考 克斯氏体，潜蚤，肠球菌，埃立克体，大肠杆菌，弗朗西斯氏菌，梭杆菌，血巴尔通氏体，嗜血 杆菌，缠绕杆菌，克雷白氏杆菌，L型细菌，钩端螺旋体，李斯特菌，分枝杆菌，支原体，奈瑟氏 菌，新立克次氏体，诺卡氏菌，巴氏杆菌，消化球菌，消化链球菌，肺炎球菌，变形杆菌，假单 胞菌，立克次氏体，罗克利马体，沙门氏菌，痢疾杆菌，金黄色葡萄球菌，链球菌，螺旋体，耶 尔森氏菌，腺病毒，甲病毒，杯状病毒，冠状病毒，巨细胞病毒，犬瘟热病毒，埃博拉病毒，肠 病毒，EB病毒，黄病毒，丙型肝炎病毒，嗜肝DNA病毒，乙型肝炎病毒，δ肝炎病毒，戊型或 己型肝炎病毒，GBV-C,疱疹病毒，单纯疱疹病毒，水痘带状疱疹病毒，免疫缺陷病毒，艾滋病 毒，传染性腹膜炎病毒，流感病毒，A型流感病毒，白血病病毒，马尔堡病毒，正粘病毒，乳头 瘤病毒，HPV，副流感病毒，副粘病毒，RSV，细小病毒，瘟病毒，小核糖核酸病毒，脊髓灰质炎 病毒，痘病毒，牛痘病毒，狂犬病病毒，呼肠病毒，逆转录病毒，轮状病毒，犁头霉，支顶孢，链 格孢，曲霉，一蛙粪霉菌，双极霉，子囊酵母，念珠菌，假丝酵母，一耳霉，隐球菌，叶枯病菌， 表皮癣菌，外瓶霉，地丝菌，组织胞浆菌，马杜拉分支菌，马拉色菌，小孢子菌，小丛梗孢，被 孢霉，毛霉，拟青霉，青霉，单胞瓶霉，瓶霉，绿藻，足肿菌，假小托菌，腐霉，鼻孢子虫，根霉， 线状担子菌，孢子丝菌，匍柄霉，毛癣菌，毛孢子菌，木丝霉，巴贝斯虫，结肠小袋纤毛虫，孢 子虫，隐孢子虫，艾美虫，脑胞内原虫，内阿米巴，贾第虫，哈蒙德虫，肝簇虫等孢子球虫，利 什曼虫，微孢子虫，新孢子虫，微孢子虫，五鞭毛虫，疟原虫，恶性疟原虫，肺囊虫，肉孢子虫， 血吸虫，泰来虫，弓形体，锥虫，棘唇虫，猫圆线虫，钩虫，管圆线虫，蛔虫，布鲁格氏丝虫，仰 口线虫，毛细线虫，夏氏线虫，古柏线虫，环体线虫，网尾线虫，膨结虫，棘唇线虫，绦虫，复孔 绦虫，恶丝虫，龙线虫，蛲虫，类丝虫，血矛线虫，兔唇蛔虫，洛阿多肽，曼森线虫，缪勒线虫， 侏形吸虫，钩虫，细颈线虫，结节线虫，盘尾虫，后睾吸虫，胃线虫，副丝虫，肺吸虫，副蛔虫， 泡翼线虫，原圆虫，腹腔丝虫，旋尾线虫，宫绦虫，冠丝虫，类圆线虫，圆线虫，吸吮线虫，弓蛔 线虫，弓首蛔虫，旋毛虫，虹膜钩虫，鞭虫属，钩虫，或吴策线虫。
18.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列，所述非 天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二序列与第一序列相同，除了第一序列中的 一个或多个天然氨基酸在第二序列中被替换为一个或多个非天然氨基酸。
19.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列，并且所 述非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相同， 除了第二氨基酸序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。
20.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于靶标部分 的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含相同的序列。
21.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于靶标部分 的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含不同的序列。
22.如权利要求21所述方法，其特征在于，所述对应的非天然免疫原表位上的序列包 含一个或多个非天然氨基酸。
23.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基酸可被抗体接近。
24.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含与靶标部分基本相似 的结构。
25.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含与靶标部分基本相似 的三级和/或四级结构。
26.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是除20种经典氨基酸以外 的氨基酸，并且所述非天然氨基酸包含如下结构 其中R是除20种经典天然氨基酸中任一种所用侧链之外的任何取代基；其中R1是20 种经典的天然氨基酸中的一种所用的取代基；其中R2是任何取代基，使R2-R1 —起组成不 同于20种经典天然氨基酸中任一种的侧链；其中Z是0H，NH2，SH，NH-R'或S-R'；其中R' 是除H之外的任何取代基；并且其中X和Y各自是S或0。
27.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述非天然氨基酸选自对-硝基苯丙氨酸; 邻-硝基苯丙氨酸；间-硝基苯丙氨酸；对-硼羰基Phe ；邻-硼羰基Phe ；间-硼羰基Phe ； 对_氨基Phe ；邻-氨基Phe ；间-氨基Phe ；对-酰基Phe ；邻-酰基Phe ；间-酰基Phe ； 对-OMe Phe ；邻-OMe Phe ；间-OMePhe ；对-磺基 Phe ；邻-磺基 Phe ；间-磺基 Phe ； 5-硝 基His ；3-硝基Tyr ；2-硝基Tyr ；硝基取代的Leu ；硝基取代的His ；硝基取代的Ile ；硝基取代的Trp ；2-硝基Trp ；4-硝基Trp ；5-硝基Trp ；6-硝基Trp ；7-硝基Trp ；3-氨基酪氨 酸，2-氨基酪氨酸，0-磺基酪氨酸，2-硫氧基苯丙氨酸，3-硫氧基氧基苯丙氨酸或对-羧基 苯丙氨酸，邻_羧基苯丙氨酸和间_羧基苯丙氨酸。
28.如权利要求12所述方法，其特征在于，所述靶标部分是TNFa。
29.如权利要求28所述方法，其特征在于，所述对象是小鼠，所述靶标部分是mTNFα， 并且所述免疫原是非天然mTNF α。
30.如权利要求29所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFα包含pN02Phe86-mTNF α。
31.如权利要求29所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFα选自=PNO2Phe11-HiTNFa、 PNO2Phe19ITNFa、pN02Phe21_mTNF a、pN02Phe42_mTNF a、pN02Phe49_mTNF a、 pN02Phe104-mTNF α 以及 pN02Phe113_mTNF a。
32.如权利要求28所述方法，其特征在于，所述对象是人，所述靶标部分是hTNFa，并 且免疫原是hTNF a。
33.如权利要求28所述方法，其特征在于，所述非天然hTNFα选自=PNO2Phe1LhTNFa、 pN02Phe19-hTNF a、pN02Phe21_hTNF a、pN02Phe42_hTNF a、pN02Phe49_hTNF a、 pN02Phe87-hTNF a、pN02Phe105-hTNF α 以及 pN02Phe114_hTNF a。
34.一种预防性或治疗性处理对象疾病状态的方法，所述方法包括给予对象非天然免疫原，所述免疫原包含一个或多个非天然氨基酸，并且非天然免疫 原刺激对象中抗体的产生，其中所述抗体与对象中的一种或多种靶标部分交叉反应，或者 针对对象体内与疾病状态相关的一种或多种靶标部分。
35.一种预防性或治疗性处理对象中疾病状态的方法，所述方法包括产生针对一种或多种靶标部分的抗体，此类产生包括制造针对非天然免疫原的抗体， 所述非天然免疫原包含一个或多个非天然氨基酸，并且所述抗体针对靶标部分交叉反应； 并且，将抗体给予对象。
36.如权利要求34或35所述方法，其特征在于，所述预防性或治疗性处理包括在对象 中引起B-细胞介导的应答和/或T-细胞介导的应答。
37.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原在正交翻译系统中产生。
38.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原在体外翻译系统中产生。
39.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原不包含经翻译后 修饰或化学修饰的氨基酸。
40.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含20种天然产 生的经典氨基酸之一以外的非天然氨基酸。
41.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫 原中20种天然产生的经典氨基酸之一进行化学修饰之外的工艺产生。
42.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫 原中20种天然产生的经典氨基酸之一进行翻译后修饰之外的工艺产生。
43.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述疾病状态是自身免疫病、癌症、细菌感染、病毒感染、真菌感染、支原体感染、朊病毒感染、原生动物感染或放线菌感染。
44.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述对象选自人、猴、小鼠、大鼠、 猪、奶牛、鸡、笼中鸟、鸟舍鸟、爬行动物和两栖动物。
45.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽。
46.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽和/或碳水 化合物。
47.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分是对象自身部分。
48.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分是疾病相关部分。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种 自身免疫病相关自身抗原、肿瘤相关抗原、阿耳茨海默病相关抗原、淀粉样蛋白β 40、淀 粉样蛋白β 42、乳腺癌相关抗原、卵巢癌相关抗原、前列腺癌相关抗原、MAGE、BAGE、RAGE、 NY-ES0、谱系特异性肿瘤相关抗原、黑色素细胞-黑色素瘤谱系抗原、MART-1/Melan-A、酪 氨酸酶或酪氨酸酶相关蛋白质、酪氨酸酶相关蛋白质2、PSMA、PSA、突变的ras、重排的bcr/ abl、Her2/neu、突变或野生型p53、细胞色素P4501B1、N_乙酰葡糖胺基转移酶-V的异常表 达的内含子序列、CA19-9、p53、0CAA、H0XB7、Cal25、PSA、PSMA、STEAP、PCTA-I、Cal5-3、EGF、 EGFR、HER-I、CXCR4、G 蛋白偶联受体(GCPR)或 CA27-29。
50.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分不是对象自身部分。
51.如权利要求50所述方法，其特征在于，所述靶标部分来自于细菌，病毒，真菌，支原 体，原生动物，蠕虫，或朊病毒。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种细 菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、支原体抗原、原生动物抗原、蠕虫抗原、朊病毒抗原、 抗原、 HIVgpl20、HIV gp41、HIV gag、HIV pol、HIV env、HIV tat、HIV nef、HIV rev、杯状病毒 衣壳抗原、乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎表面抗原、丁型肝炎试剂、单纯疱疹病毒糖蛋白、水 痘带状疱疹病毒糖蛋白、流感病毒血凝素、流感病毒神经氨酸酶、流感病毒核蛋白、HPV衣壳 蛋白、副流感病毒血凝素/神经氨酸酶、脊髓灰质炎病毒衣壳多肽、Hep A抗原、牛痘病毒多 肽、狂犬病病毒糖蛋白G、B. burgdorgeri的OspA、B型流感嗜血杆菌外膜蛋白、结核分枝杆 菌脂阿拉伯甘露糖、结核分枝杆菌mAPG、酿脓链球菌M蛋白、肺炎链球菌荚膜多糖、鼠疫耶 尔森菌F1、鼠疫耶尔森菌V抗原、恶性疟原虫环孢子体(PfCSP)、恶性疟原虫孢子体表面蛋 白2(PfSSP2)、恶性疟原虫肝脏分级抗原1羧基末端(PfLSAl c末端)、恶性疟原虫输出蛋 白质 I(PfExp-I)、Pfs48/45、Pfs 28、Pfs 25 或 Pfs 230。
53.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述靶标部分选自下列一种或多种细 菌、病毒、真菌、支原体、原生动物、蠕虫、朊病毒、放线菌、芽孢杆菌、类杆菌、波氏杆菌、巴尔 通体、包柔氏螺旋体菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、二氧化碳噬纤维菌、衣原体、梭菌、棒状杆菌、 考克斯氏体、潜蚤、肠球菌、埃立克体、大肠杆菌、弗朗西斯氏菌、梭杆菌、血巴尔通氏体、嗜 血杆菌、缠绕杆菌、克雷白氏杆菌、L型细菌、钩端螺旋体、李斯特菌、分枝杆菌、支原体、奈瑟 氏菌、新立克次氏体、诺卡氏菌、巴氏杆菌、消化球菌、消化链球菌、肺炎球菌、变形杆菌、假 单胞菌、立克次氏体、罗克利马体、沙门氏菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、螺旋体、 耶尔森氏菌、腺病毒、甲病毒、杯状病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、犬瘟热病毒、埃博拉病毒、 肠病毒、EB病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、嗜肝DNA病毒、乙型肝炎病毒、δ肝炎病毒、戊型或己型肝炎病毒、GBV-C、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、免疫缺陷病毒、艾滋病 毒、传染性腹膜炎病毒、流感病毒、A型流感病毒、白血病病毒、马尔堡病毒、正粘病毒、乳头 瘤病毒、HPV、副流感病毒、副粘病毒、RSV、细小病毒、瘟病毒、小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎 病毒、痘病毒、牛痘病毒、狂犬病病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、轮状病毒、犁头霉、支顶孢、链 格孢、曲霉、一蛙粪霉菌、双极霉、子囊酵母、念珠菌、假丝酵母、一耳霉、隐球菌、叶枯病菌、 表皮癣菌、外瓶霉、地丝菌、组织胞浆菌、马杜拉分支菌、马拉色菌、小孢子菌、小丛梗孢、被 孢霉、毛霉、拟青霉、青霉、单胞瓶霉、瓶霉、绿藻、足肿菌、假小托菌、腐霉、鼻孢子虫、根霉、 线状担子菌、孢子丝菌、匍柄霉、毛癣菌、毛孢子菌、木丝霉、巴贝斯虫、结肠小袋纤毛虫、孢 子虫、隐孢子虫、艾美虫、脑胞内原虫、内阿米巴、贾第虫、哈蒙德虫、肝簇虫、等孢子球虫、利 什曼虫、微孢子虫、新孢子虫、微孢子虫、五鞭毛虫、疟原虫、恶性疟原虫、肺囊虫、肉孢子虫、 血吸虫、泰来虫、弓形体、锥虫、棘唇虫、猫圆线虫、钩虫、管圆线虫、蛔虫、布鲁格氏丝虫、仰 口线虫、毛细线虫、夏氏线虫、古柏线虫、环体线虫、网尾线虫、膨结虫、棘唇线虫、绦虫、复孔 绦虫、恶丝虫、龙线虫、蛲虫、类丝虫、血矛线虫、兔唇蛔虫、洛阿多肽、曼森线虫、缪勒线虫、 侏形吸虫、钩虫、细颈线虫、结节线虫、盘尾虫、后睾吸虫、胃线虫、副丝虫、肺吸虫、副蛔虫、 泡翼线虫、原圆虫、腹腔丝虫、旋尾线虫、宫绦虫、冠丝虫、类圆线虫、圆线虫、吸吮线虫、弓蛔 线虫、弓首蛔虫、旋毛虫、虹膜钩虫、鞭虫属、钩虫、或吴策线虫。
54.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列， 所述非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二序列与第一序列相同，除了第一序 列中的一个或多个天然氨基酸在第二序列中被替换为一个或多个非天然氨基酸。
55.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列， 并且所述非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二氨基酸序列与第一氨基酸序列 相同，除了第二氨基酸序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。
56.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于 靶标部分的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含相同的 序列。
57.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于 靶标部分的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含不同的 序列。
58.如权利要求57所述方法，其特征在于，所述对应的非天然免疫原表位上的序列包 含一个或多个非天然氨基酸。
59.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基酸可被 抗体接近。
60.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述免疫原包含与靶标部分基本相 似的结构。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述免疫原包含与靶标部分基本相似的 三级和/或四级结构。
62.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是除20种经典氨 基酸以外的氨基酸，并且所述非天然氨基酸包含如下结构IV/CO2H R2——Rl —<NH2 .其中R是除20种经典天然氨基酸中任一种所用侧链之外的任何取代基；其中R1是20 种经典的天然氨基酸中一种所用的取代基；其中R2是任何取代基，使R2-R1 —起组成不同 于20种经典天然氨基酸中任一种的侧链；其中Z是0H，NH2, SH，NH-R'或S-R'；其中R' 是除H之外的任何取代基；并且其中X和Y各自是S或0。
63.如权利要求所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是对-硝基苯丙氨酸。
64.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸选自对-硝基苯 丙氨酸；邻-硝基苯丙氨酸；间-硝基苯丙氨酸；对-硼羰基Phe ；邻-硼羰基Phe ；间-硼羰 基Phe ；对-氨基Phe ；邻-氨基Phe ；间-氨基Phe ；对-酰基Phe ；邻-酰基Phe ；间-酰基 Phe ；对-OMe Phe ；邻-OMe Phe ；间-OMe Phe ；对-磺基 Phe ；邻-磺基 Phe ；间-磺基 Phe ； 5-硝基His ;3_硝基Tyr ；2-硝基Tyr ；硝基取代的Leu ；硝基取代的His ；硝基取代的Ile ； 硝基取代的Trp ；2-硝基Trp ；4-硝基Trp ；5-硝基Trp ；6-硝基Trp ；7-硝基Trp ；3-氨基酪 氨酸，2-氨基酪氨酸，0-磺基酪氨酸，2-硫氧基苯丙氨酸，3-硫氧基氧基苯丙氨酸或对-羧 基苯丙氨酸，邻-羧基苯丙氨酸和间-羧基苯丙氨酸。
65.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述靶标部分是TNFα。
66.如权利要求65所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种内 毒素休克、脑疟疾、自身免疫病、多器官功能衰竭、多发性硬化症、心脏功能障碍、动脉粥样 硬化、缺血再灌注损伤、胰岛素抵抗、类风湿关节炎、克罗恩病、炎性肠病、恶病质、感染性休 克、艾滋病、移植物抗宿主病、杀菌肉芽肿、成人呼吸窘迫综合症、二氧化硅致肺纤维化。
67.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述对象是小鼠，所述靶标部分是 mTNF α，并且所述免疫原是非天然mTNF α。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述非天然mTNFa包含PNO2Phe86-HiTNF α。
69.如权利要求67所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFα选自=PNO2Phe11-IiiTNFa、 PNO2Phe19ITNFa、pN02Phe21_mTNF a、pN02Phe42_mTNF a、pN02Phe49_mTNF a、 pN02Phe104-mTNF α 以及 pN02Phe113_mTNF a。
70.如权利要求65所述方法，其特征在于，所述对象是人，所述靶标部分是hTNFa，并 且免疫原是hTNF a。
71.如权利要求70所述方法，其特征在于，所述非天然hTNFα选自=PNO2Phe1LhTNFa、 pN02Phe19-hTNF a、pN02Phe21_hTNF a、pN02Phe42_hTNF a、pN02Phe49_hTNF a、 pN02Phe87-hTNF a、pN02Phe105-hTNF α 以及 pN02Phe114_hTNF a。
72.—种生产疫苗的方法，所述方法包括鉴定抗体疗法的靶标部分，其中所述靶标部分不包含非天然氨基酸；提供非天然免疫原，其中所述非天然免疫原包含一个或多个非天然氨基酸，并且所述 非天然免疫原与靶标部分结构相似，当给予对象时，对象产生针对非天然免疫原的与靶标 部分交叉反应的抗体；以及，将非天然免疫原与一种或多种药学上可接受的佐剂、载体或赋形剂混合，由此产生疫田ο
73.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述提供非天然免疫原包括在正交翻译系 统中产生非天然免疫原。
74.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述提供非天然免疫原包括在体外翻译系 统中产生非天然免疫原。
75.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含20种天然产生的经 典氨基酸之一以外的非天然氨基酸。
76.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫原中20 种天然产生的经典氨基酸之一进行化学修饰以外的工艺产生。
77.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原通过除了对免疫原中20 种天然产生的经典氨基酸之一进行翻译后修饰以外的工艺产生。
78.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述对象选自人、猴、小鼠、大鼠、猪、奶牛、 鸡、笼中鸟、鸟舍鸟、爬行动物和两栖动物。
79.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽。
80.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含多肽和/或碳水化合物。
81.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分是对象自身部分。
82.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分是疾病相关部分。
83.如权利要求82所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种自身 免疫病相关自身抗原、肿瘤相关抗原、阿耳茨海默病相关抗原、淀粉样蛋白β 40、淀粉样蛋 白β 42、乳腺癌相关抗原、卵巢癌相关抗原、前列腺癌相关抗原、MAGE、BAGE、RAGE、NY-ESO、 谱系特异性肿瘤相关抗原、黑色素细胞-黑色素瘤谱系抗原、MART-1/Melan-A、酪氨酸酶 或酪氨酸酶相关蛋白质、酪氨酸酶相关蛋白质2、PSMA、PSA、突变的ras、重排的bcr/abl、 Her2/neu、突变或野生型p53、细胞色素P4501B1、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V的异常表达 的内含子序列、CA19-9, p53、OCAA, H0XB7、Cal25、PSA、PSMA、STEAP, PCTA-U Cal5_3、EGF,EGFR、HER-I、CXCR4、G 蛋白偶联受体(GCPR)或 CA27-29。
84.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分并非对象的自身部分。
85.如权利要求84所述方法，其特征在于，所述靶标部分来自于细菌，病毒，真菌，支原 体，原生动物，蠕虫，或朊病毒。
86.如权利要求85所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自于下列一种或多种细 菌抗原，病毒抗原，真菌抗原，支原体抗原，原生动物抗原，蠕虫抗原，朊病毒抗原，HIV抗原， HIVgpl20, HIV gp41, HIV gag, HIV pol, HIV env, HIV tat, HIV nef, HIV rev，杯状病毒衣 壳抗原，乙型肝炎核心抗原，乙型肝炎表面抗原，S肝炎病毒试剂，单纯疱疹病毒糖蛋白，水 痘带状疱疹病毒糖蛋白，流感病毒血凝素，流感病毒神经氨酸酶，流感病毒核蛋白，HPV衣壳 蛋白，副流感病毒血凝素/神经氨酸酶，脊髓灰质炎病毒衣壳多肽，Hep A抗原，牛痘病毒多 肽，狂犬病病毒糖蛋白G，B. burgdorferi的OspA，B型流感嗜血杆菌外膜蛋白，结核分枝杆 菌脂阿拉伯甘露糖，结核分枝杆菌mAPG，酿脓链球菌M蛋白，肺炎链球菌荚膜多糖，鼠疫耶 尔森菌F1，鼠疫耶尔森菌V抗原，恶性疟原虫环孢子体(PfCSP)，恶性疟原虫孢子体表面蛋 白2(PfSSP2)，恶性疟原虫肝脏分级抗原1羧基末端(PfLSAl c末端)，恶性疟原虫输出蛋 白质 I(PfExp-I)，Pfs48/45，Pfs 28, Pfs 25 或 Pfs 230。
87.如权利要求85所述方法，其特征在于，所述靶标部分选自下列一种或多种细菌、 病毒、真菌、支原体、原生动物、蠕虫、朊病毒、放线菌、芽孢杆菌、类杆菌、波氏杆菌、巴尔通 体、包柔氏螺旋体菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、二氧化碳噬纤维菌、衣原体、梭菌、棒状杆菌、考 克斯氏体、潜蚤、肠球菌、埃立克体、大肠杆菌、弗朗西斯氏菌、梭杆菌、血巴尔通氏体、嗜血 杆菌、缠绕杆菌、克雷白氏杆菌、L型细菌、钩端螺旋体、李斯特菌、分枝杆菌、支原体、奈瑟氏 菌、新立克次氏体、诺卡氏菌、巴氏杆菌、消化球菌、消化链球菌、肺炎球菌、变形杆菌、假单 胞菌、立克次氏体、罗克利马体、沙门氏菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、螺旋体、耶 尔森氏菌、腺病毒、甲病毒、杯状病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、犬瘟热病毒、埃博拉病毒、肠 病毒、EB病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、嗜肝DNA病毒、乙型肝炎病毒、δ肝炎病毒、戊型或 己型肝炎病毒、GBV-C、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、免疫缺陷病毒、艾滋病 毒、传染性腹膜炎病毒、流感病毒、A型流感病毒、白血病病毒、马尔堡病毒、正粘病毒、乳头 瘤病毒、HPV、副流感病毒、副粘病毒、RSV、细小病毒、瘟病毒、小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎 病毒、痘病毒、牛痘病毒、狂犬病病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、轮状病毒、犁头霉、支顶孢、链 格孢、曲霉、一蛙粪霉菌、双极霉、子囊酵母、念珠菌、假丝酵母、一耳霉、隐球菌、叶枯病菌、 表皮癣菌、外瓶霉、地丝菌、组织胞浆菌、马杜拉分支菌、马拉色菌、小孢子菌、小丛梗孢、被 孢霉、毛霉、拟青霉、青霉、单胞瓶霉、瓶霉、绿藻、足肿菌、假小托菌、腐霉、鼻孢子虫、根霉、 线状担子菌、孢子丝菌、匍柄霉、毛癣菌、毛孢子菌、木丝霉、巴贝斯虫、结肠小袋纤毛虫、孢 子虫、隐孢子虫、艾美虫、脑胞内原虫、内阿米巴、贾第虫、哈蒙德虫、肝簇虫、等孢子球虫、利 什曼虫、微孢子虫、新孢子虫、微孢子虫、五鞭毛虫、疟原虫、恶性疟原虫、肺囊虫、肉孢子虫、 血吸虫、泰来虫、弓形体、锥虫、棘唇虫、猫圆线虫、钩虫、管圆线虫、蛔虫、布鲁格氏丝虫、仰 口线虫、毛细线虫、夏氏线虫、古柏线虫、环体线虫、网尾线虫、膨结虫、棘唇线虫、绦虫、复孔 绦虫、恶丝虫、龙线虫、蛲虫、类丝虫、血矛线虫、兔唇蛔虫、洛阿多肽、曼森线虫、缪勒线虫、 侏形吸虫、钩虫、细颈线虫、结节线虫、盘尾虫、后睾吸虫、胃线虫、副丝虫、肺吸虫、副蛔虫、 泡翼线虫、原圆虫、腹腔丝虫、旋尾线虫、宫绦虫、冠丝虫、类圆线虫、圆线虫、吸吮线虫、弓蛔线虫、弓首蛔虫、旋毛虫、虹膜钩虫、鞭虫属、钩虫、或吴策线虫。
88.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列，所述 非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二序列与第一序列相同，除了第一序列中 的一个或多个天然氨基酸在第二序列中被替换为一个或多个非天然氨基酸。
89.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分包含第一氨基酸序列，并且所 述非天然免疫原包含第二氨基酸序列，其中所述第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相同， 除了第二氨基酸序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。
90.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于靶标部 分的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含相同的序列。
91.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述一种或多种交叉反应抗体对于靶标部 分的表位具有特异性，其中所述表位与对应的非天然免疫原表位相比，包含不同的序列。
92.如权利要求91所述方法，其特征在于，所述对应的非天然免疫原表位上的序列包 含一个或多个非天然氨基酸。
93.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基酸可被抗体接近。
94.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含与靶标部分基本相 似的结构。
95.如权利要求94所述方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含与靶标部分基本相 似的三级和/或四级结构。
96.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是除20种经典氨基酸以 外的氨基酸，并且所述非天然氨基酸包含如下结构
97.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述非天然氨基酸选自对-硝基苯丙氨 酸；邻-硝基苯丙氨酸；间-硝基苯丙氨酸；对-硼羰基Phe ；邻-硼羰基Phe ；间-硼羰基 Phe ；对-氨基Phe ；邻-氨基Phe ；间-氨基Phe ；对-酰基Phe ；邻-酰基Phe ；间-酰基 Phe ；对-OMe Phe ；邻-OMe Phe ；间-OMePhe ；对-磺基 Phe ；邻-磺基 Phe ；间-磺基 Phe ； 5-硝基His ；3-硝基Tyr ；2-硝基Tyr ；硝基取代的Leu ；硝基取代的His ；硝基取代的Ile ； 硝基取代的Trp ；2-硝基Trp ；4-硝基Trp ；5-硝基Trp ；6-硝基Trp ；7-硝基Trp ；3-氨基酪 氨酸，2-氨基酪氨酸，0-磺基酪氨酸，2-硫氧基苯丙氨酸，3-硫氧基氧基苯丙氨酸或对-羧 基苯丙氨酸，邻-羧基苯丙氨酸和间-羧基苯丙氨酸。
98.如权利要求72所述方法，其特征在于，所述靶标部分是TNFα。
99.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述对象是小鼠，所述靶标部分是 mTNF α，并且所述非免疫原是非天然mTNF α。
100.如权利要求99所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFα包含pN02Phe86-mTNF α。
101.如权利要求99所述方法，其特征在于，所述非天然mTNFa选自 PNO2Phe11ITNFa、pN02Phe19-mTNF a、pN02Phe21-mTNF a、pN02Phe42-mTNF a、 pN02Phe49-mTNF a、pN02Phe104-mTNF α 以及 pN02Phe113_mTNF a。
102.如权利要求98所述方法，其特征在于，所述对象是人，所述靶标部分包含hTNFα， 并且免疫原包含hTNF a。
103.如权利要求102所述方法，其特征在于，所述非天然hTNFa选自 PNO2Phe11-IiTNFa、pN02Phe19_hTNF a、pN02Phe21_hTNF a、pN02Phe42_hTNF a、 pN02Phe49-hTNF a、pN02Phe87_hTNF a、pN02Phe105-hTNF α 以及 pN02Phe114_hTNF a。
104.一种由权利要求72所述方法产生的疫苗。
105.一种在细胞种产生非天然TNFa的方法，其中所述非天然TNF α包含 PNO2Phe86-TNF α，所述方法包含在合适培养基中培养细胞，其中所述细胞包含在86位氨基酸含有至少一个选择性密 码子的核酸，并且所述核酸编码TNF α ；并且，提供 PNO2Phe ；其中所述细胞还包含识别选择性密码子的正交-tRNA (Ο-tRNA)；以及，优选用PNO2Phe氨酰化Ο-tRNA并在选择者密码子的作用下将pN02Phe掺入氨基酸86 位，从而产生非天然TNF α的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)。
106.一种非天然 TNF α，所述 TNF α 包含 pN02Phe86_mTNF a。
107.一种非天然TNF a，所述TNF α包含选自下组的TNF a :pN02Phen-mTNF a、 pN02Phe19-mTNF a、pN02Phe21_mTNF a、pN02Phe42_mTNF a、pN02Phe49_mTNF a、 pN02Phe104-mTNF α 禾口 pN02Phe113_mTNF a 0
108.一种非天然TNF a，所述TNF α包含选自下组的TNF a :pN02Phen-hTNF a、pN02Phe19_hTNF α、pN02Phe21_hTNF α、pN02Phe42_hTNF α、pN02Phe49_hTNF α、 pN02Phe87-hTNF α、pN02Phe105-hTNF α 和 pN02Phe114_hTNF α。
109.—种组合物，其包含权利要求106、107或108所述的非天然TNFa。
110.一种抗权利要求106、107或108所述的非天然TNFa的抗体。
111.一种抗权利要求106、107或108所述的非天然TNFa的抗体，所述抗体能与不含 非天然氨基酸的TNF α发生交叉反应。
112.—种组合物，其包含权利要求110或111所述的抗体。
113.一种非天然 RBP4，所述 RBP4 包含 pN02Phe43mRBP4。
114.一种组合物，其包含权利要求113所述的非天然RBP4。
115.一种抗权利要求113所述的非天然RBP4的抗体，所述抗体能与不含非天然氨基酸 的RBP4发生交叉反应。
116.一种包含权利要求115所述抗体的组合物。
117.如权利要求1、34、35或72所述的方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基 酸在免疫原合成期间掺入所述非天然免疫原中。
118.如权利要求1、34、35或72所述的方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基 酸通过不同于翻译后修饰或合成后化学修饰的方法掺入所述非天然免疫原中。
119.如权利要求1、34、35或72所述的方法，其特征在于，所述一个或多个非天然氨基 酸通过以下一种或多种方法掺入所述非天然免疫原中正交翻译；体外翻译；天然化学连 接；表达蛋白质连接；或固相合成。
120.如权利要求1、34、35或72所述的方法，其特征在于，所述非天然免疫原包含经糖 基化、硝基芳基修饰、硝化、烷基化、乙酰化、氧化、硫酸化或磷酸化的20种天然产生经典氨 基酸中的一个或多个氨基酸。
121.如权利要求120所述的方法，其特征在于，所述一个或多个氨基酸是通过不同于 翻译后修饰的方法或不同于化学修饰的方法糖基化、硝基芳基修饰、硝化、烷基化、乙酰化、 氧化、硫酸化或磷酸化的。
全文摘要
本发明包括通过给予具有一个或多个非天然氨基酸的靶标部分的抗原性形式和/或通过给予具有一个或多个非天然氨基酸的靶标部分之一的抗体产生和/或增强对象对靶标部分如疾病相关部分的的免疫应答的方法和组合物，所述抗体与所述天然靶标部分发生交叉反应。
文档编号A61P35/00GK101970005SQ200980104563
公开日2011年2月9日 申请日期2009年2月7日 优先权日2008年2月8日
发明者J·格鲁瓦尔德, P·G·舒尔茨, R·A·勒纳, R·佩尔拉, V·V·斯米德尔, 曹梦麟 申请人:斯克利普斯研究院
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