有效抗肿瘤的副粘病毒的制作方法
专利名称：有效抗肿瘤的副粘病毒的制作方法
有效抗肿瘤的副粘病毒本发明涉及通过给予活动物副粘病毒来治疗肿瘤。所述病毒具有杀死人肿瘤细胞 但在相同剂量下不杀死人正常分化细胞和人正常增殖细胞的选择性。通过基因改造，该病 毒得以修饰从而一或多个基因被相关副粘病毒的同源基因取代。任选这些同源基因作为其 他转基因插入病毒基因组。通过所述方法，产生的嵌合病毒的抗肿瘤活性与亲代病毒相比 是提高的。基因工程的方法也允许修饰肿瘤细胞中表达的酶识别的F蛋白裂解位点。本领域已知，溶瘤病毒可用作癌症治疗剂。常用于治疗肿瘤的溶瘤病毒在 Chiocca, 2002 中描述。溶瘤病毒列表见于 Vaha-Koskela，Heikkila，and Hinkkanen，2007。 这些病毒属于各种病毒种类和科。已经作为溶瘤药剂检测过的副粘病毒科的病毒包括麻疹病毒(例如(Peng et al.，2001)，新城疫病毒(例如 Sinkovics and Horvath，2000)，Tupaia 畐 Ij 粘病毒 (Springfeld et al.，2005)，腮腺炎病毒(例如 Myers et al.，2005)，猿猴病毒 5 (例如 Parks et al.，2002)和仙台病毒(例如 Kinoh et al. ,2004)。在Stojdl et al.，2003中描述了所有检测的肿瘤细胞系中有80%中在水泡性口 炎病毒(VSV)感染之后的干扰素反应中存在缺陷。推定相似百分比的肿瘤细胞系将对NDV 感染敏感，这是由于VSV和NDV都是单负病毒目的成员。还显示NDV在肿瘤细胞中选择性 复制的机制基于抗病毒细胞干扰素反应的缺陷(见例如WO 99/18799)。在EP-A-0702085中，描述了涉及重组副粘病毒的内容基因操纵的感染性复制 型非分节负链RNA病毒突变体，包含位于开放读框内的插入和/或缺失，病毒基因组的 pseudogen 区或基因间(intergenic)区域。另外，在W099/66045中描述了基因修饰的NDV病毒，其得自病毒基因组的全长 cDNA分子。WO 00/62735中描述了肿瘤治疗方法，包括给予干扰素敏感型有复制能力的克隆 RNA病毒，诸如NDV。此外还描述了禽副粘病毒2的用途。此外，没有关于APMV2具有溶瘤 活性的支持性数据。WO 01/20989 (PCT/US00/26116)中描述了利用重组溶瘤副粘病毒治疗肿瘤患者的 方法。所述肿瘤通过给予有复制能力的副粘病毒而减小。描述了多种可用于改造病毒基因 组以改善溶瘤性质的方法。此外，WO 03/005964中描述了包含编码细胞因子的核酸的重组VSV。US 6，699，479中描述了 NDV突变体，其表达降低水平的V蛋白并包含位于编辑基 因座中的核苷酸取代。US 2004/0170607中描述了通过给予并非常见人病原体的病毒治疗黑素瘤。W02006/50984中描述了重组NDV病毒，其具有编码抗肿瘤蛋白的基因。具体是重 组RNA病毒，优选副粘病毒，优选新城疫病毒(NDV)，用于治疗疾病，尤其是用于溶瘤性肿瘤 治疗。还描述了产生这样的重组病毒，其编码结合蛋白(抗体，锚蛋白重复分子，肽等)，前 药转化酶和/或蛋白酶，并导致病毒感染的肿瘤细胞中这些分子的选择性表达。这些结合
3蛋白、前药转化酶和/或蛋白酶的活性增加病毒的抗肿瘤效果。在W02006/50984中，描述 了所述修饰的病毒的制备以及治疗癌症的用途。NDV可利用反向遗传技术如EP-A-O 702 085所述进行遗传操作。例如，已知可 制备重组NDV构建体，其包含另外的核酸，所述核酸编码分泌的碱性磷酸酶(Zhao and Peeters，2003)，绿色荧光蛋白(Engel-Herbert et al.，2003)，传染性法氏囊病病毒的VP2 蛋白(Huang et al.，2004)，流感病毒血凝素(Nakaya et al.，2001)和氯霉素乙酰转移酶 (Huang et al. ,2001) (Krishnamurthy, Huang, and Samal，2000)o 这些重组 NDV 均没有被 构建为用于治疗人疾病。重组NDV用于研究NDV的基本病毒学或用于开发禽类的疫苗株。 亲代病毒株作为NDV的缓发型毒株。这些菌株没有明显的溶瘤性质。即使对于已知的病毒系统和方法，仍亟需可选择性用于治疗癌症尤其是肿瘤并且 优于已知病毒种类的那些病毒。此外，目前没有已知数据显示APMV3-9可用于制备治疗癌症具体是肿瘤的药物。目前吃惊地发现本发明的选择性病毒种类(衍生自副粘病毒科，衍生自APMV3-9 亚种类)可用于肿瘤治疗中，并且与现有技术中的种类相比具有令人吃惊的有效活性。现有技术中没有关于本发明的副粘病毒具有抗肿瘤效果的描述。选自副粘病毒科的肿瘤是例如禽副粘病毒3 (APMV3)，禽副粘病毒4 (APMV4)，禽副 粘病毒5 (APMV5)，禽副粘病毒6 (APMV6)，禽副粘病毒7 (APMV7)，禽副粘病毒8 (APMV8)和禽 副粘病毒9 (APMV9,以及Mapuera病毒禾口 Fer-de-Lance病毒。病毒APMV3-9 描述于(Alexander，2003)。本发明还包括通过分子生物学组合不同病毒的遗传元件制备嵌合病毒的方法。具 体地，本发明包括选自 APMV3，APMV4, APMV5, APMV6, APMV7, APMV8, APMV9, Mapuera 病毒和 Fer-de-Lance病毒的组的副粘病毒在制备用于治疗癌症具体是肿瘤的药物中的用途。癌症和肿瘤的治疗指抑制肿瘤生长，优选杀死肿瘤细胞或阻断感染期间的增长。 所述副粘病毒在肿瘤细胞中选择性复制。具体地，所述用途包括制备用于治疗增生性疾病具体是增生过度性疾病的药物。 优选新生物可用所述病毒治疗，优选选自肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和脑癌的组的癌 症可被治疗。更优选本发明涉及本发明的病毒在制备用于治疗实体瘤和转移瘤的药物中的用 途。更优选可治疗具有低增生率的肿瘤。具有低增生率的肿瘤的实例是前列腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，黑素瘤，宫颈癌， 膀胱癌，胶质母细胞瘤和纤维肉瘤。另一选择的方面，本发明涉及所述病毒在制备用于治疗脑肿瘤和胶质母细胞瘤的 药物中的用途。本发明的另一方面是在RNA水平具有超过80%序列相同性的紧密相关的副粘病 毒。所述病毒可为新发现的副粘病毒。本发明的病毒还可为重组的并被进一步修饰以表达一或多个源自APMV1-9的其 他基因，优选其被修饰以表达一或多个源自APMVl (新城疫病毒)的其他基因。本发明的病毒还可被修饰以包含编码结合蛋白的基因(见W02006/050984)。
其他基因可编码酶，具体是前药转化酶，编码抗体或含有具有抗体可变区的至少 一个免疫球蛋白结构域的融合蛋白(见W02006/050984)。所述修饰导致当给予携带肿瘤的人或动物例如裸鼠时，通过抗肿瘤效果测定的更 高的溶瘤能力。本发明的病毒还编码另一副粘病毒的F和/或HN蛋白的基因，由此F蛋白可具有 多碱基裂解位点，所述病毒经修饰从而一个基因被来自APMV1-9的组的病毒的同源基因取 代。基因修饰还可导致禽类中病毒病原性减弱。本发明还包括利用所述病毒制备用于治疗上述疾病的药物，所述药物具有药学可 接受的载体和稀释剂。所述载体和稀释剂描述于Remington' s Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company,Easton Pennsylvania(1980)。所用病毒效价根据治疗 指征在如下范围内:109-1012pfu 每剂，IO8-IO11Pfu, IO7-IO10Pfu 或 106_109pfu。所述药学载体和稀释剂可包含本发明病毒的乳剂，并可通过吸入、静脉内输注、皮 下注射、腹腔内注射或肿瘤注射给药。本发明的另一方面是预防和/或治疗增生性疾病具体是癌症的方法，包括给予需 要的对象药物有效量的本发明的药物组合物。药物有效量是本发明病毒的效价，具体是治 愈或抑制疾病的本发明的病毒。对于治疗效果而言，可接受的剂量是不同的，有赖于例如构建体、患者，给药途径 和癌症种类。本发明还包括本发明的病毒与化疗剂的组合应用。本发明的病毒可与任何抗肿瘤剂，烷基化剂，抗代谢药物，植物源性抗肿瘤剂，激 素治疗剂，拓扑异构酶抑制剂，喜树碱衍生物，激酶抑制剂，靶向药物，抗体，干扰素和/或 生物反应调节剂和其他抗肿瘤药物一起使用。在这方面，以下是可与该发明的病毒一起使 用的第二种药剂的非限制性列表 烷化剂包括但不限于氮芥氮氧化物，环磷酰胺(cyclophophamide)，异环磷 酰胺，噻替哌，雷莫司汀(ranimustine)，尼莫司汀(nimustine)，替莫唑胺，六甲蜜胺 (altretamine),阿扎丙宗(apaziquone), brostallicin,苯达莫司汀，卡莫司汀，雌莫司 汀，福莫司汀，葡磷酰胺，异环磷酰胺，马磷酰胺，苯达莫司汀和二溴卫矛醇；钼配位的烷基 化合物包括但不限于，顺钼，卡钼，依他钼，乐钼，奈达钼，奥沙利钼或沙钼(satrplatin)； 抗代谢药物包括但不限于，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤核苷，巯基嘌呤，5-氟尿嘧啶单独或 与甲酰四氢叶酸，替加氟，去氧氟尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，cytarabine ocfosfate，依诺 他滨，吉西他滨，氟达拉滨，5-阿扎胞苷，卡培他滨，克拉屈滨，氯法拉滨，地西他滨，依氟 鸟胺酸，乙炔基胞苷(ethynylcytidine)，阿糖胞苷，羟基脲，马法兰，奈拉滨，洛拉曲克， ocfosfite，disodium premetrexed，喷司他丁，pelitrexol，雷替曲塞，triapine，三甲曲 沙，阿糖腺苷，长春新碱，长春瑞滨；激素治疗剂，如依西美坦，Lupron，阿那曲唑，度骨化醇 (doxercalciferol)，法倔唑(fadrozole)，福美司坦，11 β -羟脱氢酶1抑制剂，17-α羟化 酶/17，20裂解酶抑制剂，如醋酸阿比特龙，5- α还原酶抑制剂如Bearfina (非那雄胺)和 爱普列特，抗雌激素，如柠檬酸他莫昔芬和氟维司群，Trelstar,托瑞米芬，雷洛昔芬，拉索 昔芬，来曲唑，或抗雄性激素，如比卡鲁胺，氟他胺，米非司酮，尼鲁米特，康士得(Casodex)，或抗孕酮及其组合；植物源性抗肿瘤活性物质，例如包括从有丝分裂抑制剂选出的那些，包 括例如埃博霉素类(印othilone)诸如sagopilone，Ixab印ilone或埃博霉素B，长春碱，长 春氟宁，多烯紫杉醇，紫杉醇，细胞毒性拓扑异构酶抑制剂包括一个或多个选自下组的药剂阿克拉霉素， 氨萘非特，belotecan,喜树碱，10-羟基喜树碱，9_氨基喜树碱，diflomotecan,伊立替 康(Camptosar)，edotecarin, epimbicin (Ellence)，依托泊昔，依沙替康，gimatecan, lurtotecan,米托惠酉昆，pirambicin, pixantrone,鲁比牛寺康，索布佐生，tafluposide,与托 泊替康及其组合；免疫学上(Immunologicals)包括干扰素和许多其它免疫促进剂。干扰素包括干 扰素α，干扰素a-2a，干扰素a_2b，干扰素β，干扰素Y-Ia或干扰素Y_nl。其他药剂 包括L19-IL2和其他L19衍生物，非格司亭，香菇多糖，sizofilan, TheraCys,乌苯美司，阿 地白介素，阿仑珠单抗，BAM-002，达卡巴嗪，赛尼哌，地尼白介素，emtuzumab ozogamicin, ibritumomab，咪喹莫特(imiquimod)，来格司亭，香菇多糖，黑素瘤疫苗(Corixa)，莫拉司 亭，沙格司亭，他索那敏，tecleukin，thymalasin，托西莫单抗，Vimlizin，依帕珠单抗，米妥 莫单抗，oregovomab, pemtumomab, Provenge,生物反应调节剂是调节有生命的生物体的防御机制或生物反应的药剂，所述生物 反应如生存，生长，或组织细胞分化，以引导其具有抗肿瘤活性。这些药剂包括云芝多糖 (krestin)，香菇多糖，西左非兰(sizof iran)，溶链菌制剂(picibanil)，ProMune或乌苯美司。促凋亡剂YM155，AMG 的 655，AP02L/TRAIL, CHR-2797。抗血管生成化合物包括，阿维A，Aflibercept,血管抑素，aplidine，asentar, Axitinib, Recentin,贝伐珠单抗，brivanib alaninat, cilengtide,考布他汀，达斯特， 内皮抑素，芬维 A 铵，商夫酮，pazopanib,兰尼单抗，rebimastat, removab, Revlimid, Sorafenib, Vatalanib，角鲨胺，舒尼替尼，Telatinib，沙利度胺，ukrain, Vitaxin ；钼配位的化合物包括但不限于，顺钼，卡钼，奈达钼，沙钼或奥沙利钼；喜树碱衍生物包括但不限于喜树碱，10-羟基喜树碱，9-氨基喜树碱，依立替康， edotecarin,与托泊替康；抗体包括曲妥珠单抗，西妥昔单抗贝伐珠单抗或利妥昔单抗，ticilimumab, lpilimumab，lumiliximab，catumaxomab, atacicept ；oregovomab，阿仓珠单抗。VEGF抑制剂也可与本发明的病毒组合。VEGF抑制剂例如索拉非尼，达斯特，贝伐 珠单抗，舒尼替尼，Recentin, Axitinib, Aflibercept, Telatinib, brivanib alaninate, Vatalanib, pazopanib 禾口 Ranibizumab。EGFR(HERl)抑制剂也可与本发明的病毒组合。EGFR抑制剂例如西妥昔单抗， Panitumumab, Vectibix, Gefitinib, Erlotinib, Zactima0HER2抑制剂也可与本发明的病毒组合。HER2抑制剂例如Lapatinib，Tratuzumab， Pertuzumab0mTOR抑制剂也可与本发明的病毒组合。mTOR抑制剂例如Temsirolimus，西罗莫司
/雷帕霉素，依维莫司。cMet抑制剂也可与本发明的病毒组合。
PI3K-和AKT抑制剂也可与本发明的病毒组合。CDK抑制剂也可与本发明的病毒组合。CDK抑制剂的实例是细胞周期蛋白依赖激 酶(roscovitine)禾口 flavopiridol。纺锤体组装检控点(Spindle assembly checkpoint)抑制剂和靶向的抗有丝分 裂剂可与本发明的病毒组合。靶向的抗有丝分裂药物例如PLK抑制剂，Aurora抑制剂诸如 Hesperadin,检控点激酶抑制剂和KSP抑制剂。HDAC抑制剂可与本发明的病毒组合。HDAC抑制剂例如panobinostat， vorinostat, MS275,belinostat 禾口 LBH589。HSP90抑制剂和HSP70抑制剂可与本发明的病毒组合。蛋白酶体抑制剂可与本发明的病毒组合。蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米和 carfilzomib。丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂可与本发明的病毒组合。 丝氨酸激酶抑制剂包括MEK抑制剂和Raf抑制剂诸如Sorafenib。本发明的病毒可与法呢基转移酶抑制剂例如tipifarnib —起使用。本发明的病毒可与酪氨酸激酶抑制剂一起使用，所述酪氨酸激酶抑制剂包括 Dasatinib, Nilotibib, DAST, Bosutinib, Sorafenib,贝伐珠单抗，舒尼替尼，AZD2171, Axitinib, Aflibercept, Telatinib,伊马替尼敏使朗(mesylate), brivanib alaninate, pazopanib, Ranibizumab, Vatalanib, Cetuximab, Panitumumab, Vectibix, Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Tratuzumab, Pertuzumab 禾口 c_Kit 抑制剂。维生素D受体激动剂可与本发明的病毒组合。Bcl-2蛋白抑制剂可与本发明的病毒组合。Bcl-2蛋白抑制剂是obatoclax， oblimersen sodium 禾口 gossypol。分化 20 受体簇拮抗剂(Cluster of Differentiation 20 receptor antagonists)可与本发明的病毒组合。分化20受体簇拮抗剂例如利妥昔单抗。核糖核苷 酸还原酶抑制剂可与本发明的病毒组合。核糖核苷酸还原酶抑制剂例如吉西他滨。拓扑异 构酶I和Il抑制剂可与本发明的病毒组合。拓扑异构酶I和Il抑制剂例如Camptosar (伊 立替康)和多柔比星。肿瘤坏死凋亡诱导配体受体1激动剂可与本发明的病毒组合。肿瘤坏死凋亡诱导 配体受体1激动剂例如mapatumumab。5-羟色胺受体拮抗剂可与本发明的病毒组合。5-羟色胺受体拮抗剂例如rEV598， Xaliprode，帕洛诺司琼盐酸盐，格兰塞隆，Zindol，帕洛诺司琼盐酸盐或AB-1001。整联蛋白抑制剂可与本发明的病毒组合。整联蛋白抑制剂例如α 5β 1整联蛋白 抑制剂诸如Ε7820，JSM 6425，volociximab或内皮抑素。雄激素受体拮抗剂可与本发明的病毒组合。雄激素受体拮抗剂例如癸酸苯丙酸诺 龙，氟甲睾酮，氟甲睾酮，Android, Prost-aid，Andromustine，比卡鲁胺，氟他胺，Apo-环丙 孕酮，Apo-氟他胺，醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)，比卡鲁胺，色普龙，Tabi，醋酸 环丙孕酮，环丙孕酮片，尼鲁米特。芳香酶抑制剂可与本发明的病毒组合。芳香化酶抑制剂的例子有阿那曲唑，来曲 唑，睾内酯，依西美坦，福美司坦和氨鲁米特。基质金属蛋白酶抑制剂可与病毒的发明。其他抗癌药物包括阿利维A酸，聚肌胞，阿曲生坦，蓓萨罗丁，硼替佐米，波生坦，骨化三醇，exisulind，非那雄胺，福莫司汀，伊班膦 酸，米替福新，米托蒽醌，L-门冬酰胺，丙卡巴胼，达卡巴嗪，羟基脲，羟基脲，培门冬酶，喷司 itT, tazarotne, VELCADE M^iMU, Canfosfamide darinaparsin $会H￥@|。
实施例肿瘤选择性复制当与人肿瘤细胞诸如HT29结肠癌细胞或HT1080纤维肉瘤细胞一起保温时，该病 毒能复制并产生子代病毒。在肿瘤细胞中获得的效价比在人原代正常细胞中获得的效价高 至少100倍。当检验病毒的细胞杀死效应时，杀死原代正常细胞必需的MOI比足以杀死人肿瘤 细胞的MOI高至少100倍，更优选1000倍。病毒的产生病毒在具胚禽卵(优选鸡卵)或人肿瘤细胞系或人肿瘤细胞系衍生物中生长。从卵的尿囊液或从所述细胞上清或从细胞碎片收获病毒(细胞结合的病毒)。所述病毒利用非连续蔗糖密度梯度超速离心浓缩并纯化。任选，所述病毒利用切 向流过滤浓缩和纯化。抗肿瘤效果病毒的抗肿瘤效果显示在小鼠肿瘤模型中。当肿瘤内或静脉内给药时，所述病毒 导致裸鼠中建立的人异种移植肿瘤的退化。病毒的有效剂量是IO5-IO9Pfu/注射。一些肿 瘤模型中。在2-14天(优选7天)中重复给药是非常有效所需的。病毒的基因改造反向遗传系统已经对于许多副粘病毒公开。其类似地经改造适应本发明的副粘病对病毒基因组进行测序。基于该序列，设计用于克隆的引物，使得其跨病毒基因 组中的独特限制酶识别位点。通过RT-PCR，病毒基因组的多个片段作为DNA在质粒载体如 ρΧ8δΤ中被克隆。利用基因组质粒，在DNA水平进行突变、基因交换以及其他类型的基因改造。通过利用辅助质粒将基因组质粒DNA转染进入表达Τ7-聚合酶的细胞，可拯救重 组病毒。还可使用拯救病毒的其他方法。例如，Τ7聚合酶的表达可通过细胞与编码Τ7聚 合酶的表达质粒的共转染来实现。对于相关病毒NDV，还描述了其他转基因在病毒中的表达(Punier et al. ,2008)。其他转基因优选插入M-F或F-HN之间的基因间区域。F和HN转基因可源自任何APMV，优选来自自身具有强溶瘤能力的病毒。F和H/HN 转基因可衍生自除外APMV的其他副粘病毒。为了增加病毒的溶瘤能力，仅表达单独的F或HN蛋白即可。嵌合病毒为了组合两种不同病毒的阳性特征或为了去除阴性特征，可用其他病毒的同源片 段替代基因组的片段。所述病毒可为任何相关副粘病毒并且不限于APMV。APMV的F和HN蛋白的内源性基因可被来自相关副粘病毒的异源基因取代以改变病毒特异性和肿瘤选择性。为了允许病毒粒子的正确装配，所有三个蛋白M，F和HN可用相关病毒的同源基因 片段取代。为了降低禽类的病原性，P/V蛋白的基因被突变或用来自相关病毒的基因取代。相 同的方法也可增加病毒特异性(与正常细胞相比)以杀死人肿瘤细胞。内源性L，P和NP蛋白可被交换。这三种蛋白的交换将对病毒的复制特性产生影 响。转基因为了降低病毒的病原性，禽类干扰素的基因被插入病毒基因组。为了增加病毒的肿瘤穿透力，将编码细胞外基质降解酶诸如松弛素，胶原蛋白酶， MMP等的转基因插入病毒。为了增加治疗能力，将编码具有抗肿瘤活性的蛋白的转基因插入所述病毒，所述 蛋白诸如毒素，前药转化酶，蛋白酶，抗体等。例如TRAIL及其突变体，MDA-7，IL2，TNF-a， IGF-BP-7。为了显像目的以及作为生物标记，将编码报道基因诸如GFP、萤光素酶、NIS或标 记肽如PSA、胰岛素C-肽、共同病毒抗原(肽)等的转基因插入病毒。对比文件Alexander,D. J. (2003). Newcastle Disease,Other Avian Paramyxoviruses,and Pneumovirus Infections. ISBN 081380423X ed. In" Diseases of Poultry" (Y. M. Saif, Ed.), pp. 63-99. Blackwell Publishing.Chiocca, E.A. (2002). Oncolytic viruses. Nat Rev Cancer 2(12)，938-50.EngeI-Herbert, I. , Werner, 0. , Teifke, J.P., Mebatsion, Τ. , Mettenleiter, T. C. , and Romer-Oberdorfer,A. (2003). Characterization of a recombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein. J Virol Methods 108(1), 19-28.Huang, Ζ. , Elankumaran, S. , Yunus, A. S. , and Samal, S. K. (2004). A recombinant Newcastle disease virus (NDV) expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus (IBDV) protects against NDV and IBDV. J Virol 78(18)，10054-63·Huang, Ζ. , Krishnamurthy, S. , Panda, A. , and Samal, S. K. (2001). High-level expression of a foreign gene from the most 3' -proximal locus of a recombinant Newcastle disease virus. J Gen Virol 82 (Pt 7),1729-36.Kinoh, H. , Inoue, M. , Washizawa, K. , Yamamoto, Τ. , Fujikawa, S. , Tokusumi, Y. , lida, A. , Nagai, Y. , and Hasegawa, M. (2004). Generation of a recombinant Sendai virus that is selectively activated and lyses human tumor cells expressing matrixmetalloproteinases. Gene Ther 11 (14),1137-45.Krishnamurthy, S. , Huang,Ζ. ,and Samal,S. K. (2000). Recovery of a virulent strain of newcastle disease virus from cloned cDNA !expression of a foreign gene results in growth retardation and attenuation. Virology 278(1),168-82.Myers,R. ,Greiner,S. ,Harvey,Μ. ,Soeffker,D. ,Frenzke,Μ. ,Abraham,K. ,Shaw,
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权利要求
选自APMV3，APMV4，APMV5，APMV6，APMV7，APMV8，APMV9，Mapuera病毒和Fer de Lance病毒的组的副粘病毒在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述病毒是在RNA水平具有超过80%序列相同性的紧密相 关的副粘病毒。
3.权利要求1的用途，其中所述病毒是重组的。
4.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达源自APMV1-9的一个其他基因。
5.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达源自APMV1-9的两个或更多个其他基因。
6.权利要求4-5任一项的用途，其中所述基因编码另一种副粘病毒的F和/或HN蛋白。
7.权利要求6的用途，其中所述F蛋白具有多碱基(multibasic)裂解位点。
8.权利要求3的用途，其中所述病毒经修饰从而一个基因被选自APMV1-9的组的病毒 的同源基因取代。
9.权利要求3的用途，其中所述基因修饰导致在禽类中的病原性减弱。
10.权利要求3的用途，其中所述基因修饰导致病毒感染肿瘤细胞与非转化的正常细 胞相比更高的选择性。
11.权利要求3的用途，其中所述基因修饰导致给药携带肿瘤的裸鼠时通过抗肿瘤效 果测定的更高的溶瘤能力。
12.权利要求1的用途，其中所述病毒是肿瘤内给药的。
13.权利要求1的用途，其中所述病毒是腹腔内给药的。
14.权利要求1的用途，其中所述病毒通过吸入给药。
15.权利要求1的用途，其中所述病毒是静脉内给药的。
16.权利要求1的用途，其中所述病毒通过密度梯度超速离心来纯化。
17.权利要求1的用途，其中所述病毒通过切向流过滤纯化。
18.权利要求1的用途，其中所述肿瘤选自结肠癌，乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，黑 素瘤，宫颈癌，膀胱癌，胶质母细胞瘤和纤维肉瘤组成的组。
19.权利要求1的用途，其中所述药物组合物还包含化疗剂。
20.权利要求1的用途，其中所述药物组合物还包含重组治疗抗体。
21.权利要求1的用途，其中所述药物组合物还包含重组治疗蛋白。
22.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码结合蛋白的其他基因。
23.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码酶的其他基因。
24.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码前药转化酶的其他基因。
25.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码抗体的其他基因。
26.权利要求3的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码融合蛋白的其他基因， 所述融合蛋白包含具有抗体可变区的至少一个免疫球蛋白结构域。
27.权利要求1的用途，其中所述肿瘤是转移瘤。
28.权利要求8的用途，其中2-5个基因被取代，产生具有仅1-4个来源病毒的保留基 因的嵌合病毒。
全文摘要
本发明涉及选自下组的副粘病毒APMV3，APMV4，APMV5，APMV6，APMV7，APMV8，APMV9，Mapuera病毒和Fer-de-Lance病毒，其可用于制备用于治疗肿瘤的病毒。所述病毒具有杀死人肿瘤细胞但在相同剂量不杀死人正常分化细胞和人正常增殖细胞的选择性。通过基因改造，所述病毒可被修饰从而一或多个基因被加入或由相关副粘病毒的同源基因取代。通过所述方法，产生的嵌合病毒的抗肿瘤活性与亲代病毒相比提高。
文档编号A61K35/76GK101945660SQ200980105182
公开日2011年1月12日 申请日期2009年2月12日 优先权日2008年2月14日
发明者F·普赫勒尔, R·拜尔 申请人:拜耳先灵医药股份有限公司
有效抗肿瘤的副粘病毒本发明涉及通过给予活动物副粘病毒来治疗肿瘤。所述病毒具有杀死人肿瘤细胞 但在相同剂量下不杀死人正常分化细胞和人正常增殖细胞的选择性。通过基因改造，该病 毒得以修饰从而一或多个基因被相关副粘病毒的同源基因取代。任选这些同源基因作为其 他转基因插入病毒基因组。通过所述方法，产生的嵌合病毒的抗肿瘤活性与亲代病毒相比 是提高的。基因工程的方法也允许修饰肿瘤细胞中表达的酶识别的F蛋白裂解位点。本领域已知，溶瘤病毒可用作癌症治疗剂。常用于治疗肿瘤的溶瘤病毒在 Chiocca, 2002 中描述。溶瘤病毒列表见于 Vaha-Koskela，Heikkila，and Hinkkanen，2007。 这些病毒属于各种病毒种类和科。已经作为溶瘤药剂检测过的副粘病毒科的病毒包括麻疹病毒(例如(Peng et al.，2001)，新城疫病毒(例如 Sinkovics and Horvath，2000)，Tupaia 畐 Ij 粘病毒 (Springfeld et al.，2005)，腮腺炎病毒(例如 Myers et al.，2005)，猿猴病毒 5 (例如 Parks et al.，2002)和仙台病毒(例如 Kinoh et al. ,2004)。在Stojdl et al.，2003中描述了所有检测的肿瘤细胞系中有80%中在水泡性口 炎病毒(VSV)感染之后的干扰素反应中存在缺陷。推定相似百分比的肿瘤细胞系将对NDV 感染敏感，这是由于VSV和NDV都是单负病毒目的成员。还显示NDV在肿瘤细胞中选择性 复制的机制基于抗病毒细胞干扰素反应的缺陷(见例如WO 99/18799)。在EP-A-0702085中，描述了涉及重组副粘病毒的内容基因操纵的感染性复制 型非分节负链RNA病毒突变体，包含位于开放读框内的插入和/或缺失，病毒基因组的 pseudogen 区或基因间(intergenic)区域。另外，在W099/66045中描述了基因修饰的NDV病毒，其得自病毒基因组的全长 cDNA分子。WO 00/62735中描述了肿瘤治疗方法，包括给予干扰素敏感型有复制能力的克隆 RNA病毒，诸如NDV。此外还描述了禽副粘病毒2的用途。此外，没有关于APMV2具有溶瘤 活性的支持性数据。WO 01/20989 (PCT/US00/26116)中描述了利用重组溶瘤副粘病毒治疗肿瘤患者的 方法。所述肿瘤通过给予有复制能力的副粘病毒而减小。描述了多种可用于改造病毒基因 组以改善溶瘤性质的方法。此外，WO 03/005964中描述了包含编码细胞因子的核酸的重组VSV。US 6，699，479中描述了 NDV突变体，其表达降低水平的V蛋白并包含位于编辑基 因座中的核苷酸取代。US 2004/0170607中描述了通过给予并非常见人病原体的病毒治疗黑素瘤。W02006/50984中描述了重组NDV病毒，其具有编码抗肿瘤蛋白的基因。具体是重 组RNA病毒，优选副粘病毒，优选新城疫病毒(NDV)，用于治疗疾病，尤其是用于溶瘤性肿瘤 治疗。还描述了产生这样的重组病毒，其编码结合蛋白(抗体，锚蛋白重复分子，肽等)，前 药转化酶和/或蛋白酶，并导致病毒感染的肿瘤细胞中这些分子的选择性表达。这些结合
3蛋白、前药转化酶和/或蛋白酶的活性增加病毒的抗肿瘤效果。在W02006/50984中，描述 了所述修饰的病毒的制备以及治疗癌症的用途。NDV可利用反向遗传技术如EP-A-O 702 085所述进行遗传操作。例如，已知可 制备重组NDV构建体，其包含另外的核酸，所述核酸编码分泌的碱性磷酸酶(Zhao and Peeters，2003)，绿色荧光蛋白(Engel-Herbert et al.，2003)，传染性法氏囊病病毒的VP2 蛋白(Huang et al.，2004)，流感病毒血凝素(Nakaya et al.，2001)和氯霉素乙酰转移酶 (Huang et al. ,2001) (Krishnamurthy, Huang, and Samal，2000)o 这些重组 NDV 均没有被 构建为用于治疗人疾病。重组NDV用于研究NDV的基本病毒学或用于开发禽类的疫苗株。 亲代病毒株作为NDV的缓发型毒株。这些菌株没有明显的溶瘤性质。即使对于已知的病毒系统和方法，仍亟需可选择性用于治疗癌症尤其是肿瘤并且 优于已知病毒种类的那些病毒。此外，目前没有已知数据显示APMV3-9可用于制备治疗癌症具体是肿瘤的药物。目前吃惊地发现本发明的选择性病毒种类(衍生自副粘病毒科，衍生自APMV3-9 亚种类)可用于肿瘤治疗中，并且与现有技术中的种类相比具有令人吃惊的有效活性。现有技术中没有关于本发明的副粘病毒具有抗肿瘤效果的描述。选自副粘病毒科的肿瘤是例如禽副粘病毒3 (APMV3)，禽副粘病毒4 (APMV4)，禽副 粘病毒5 (APMV5)，禽副粘病毒6 (APMV6)，禽副粘病毒7 (APMV7)，禽副粘病毒8 (APMV8)和禽 副粘病毒9 (APMV9,以及Mapuera病毒禾口 Fer-de-Lance病毒。病毒APMV3-9 描述于(Alexander，2003)。本发明还包括通过分子生物学组合不同病毒的遗传元件制备嵌合病毒的方法。具 体地，本发明包括选自 APMV3，APMV4, APMV5, APMV6, APMV7, APMV8, APMV9, Mapuera 病毒和 Fer-de-Lance病毒的组的副粘病毒在制备用于治疗癌症具体是肿瘤的药物中的用途。癌症和肿瘤的治疗指抑制肿瘤生长，优选杀死肿瘤细胞或阻断感染期间的增长。 所述副粘病毒在肿瘤细胞中选择性复制。具体地，所述用途包括制备用于治疗增生性疾病具体是增生过度性疾病的药物。 优选新生物可用所述病毒治疗，优选选自肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和脑癌的组的癌 症可被治疗。更优选本发明涉及本发明的病毒在制备用于治疗实体瘤和转移瘤的药物中的用 途。更优选可治疗具有低增生率的肿瘤。具有低增生率的肿瘤的实例是前列腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，黑素瘤，宫颈癌， 膀胱癌，胶质母细胞瘤和纤维肉瘤。另一选择的方面，本发明涉及所述病毒在制备用于治疗脑肿瘤和胶质母细胞瘤的 药物中的用途。本发明的另一方面是在RNA水平具有超过80%序列相同性的紧密相关的副粘病 毒。所述病毒可为新发现的副粘病毒。本发明的病毒还可为重组的并被进一步修饰以表达一或多个源自APMV1-9的其 他基因，优选其被修饰以表达一或多个源自APMVl (新城疫病毒)的其他基因。本发明的病毒还可被修饰以包含编码结合蛋白的基因(见W02006/050984)。
其他基因可编码酶，具体是前药转化酶，编码抗体或含有具有抗体可变区的至少 一个免疫球蛋白结构域的融合蛋白(见W02006/050984)。所述修饰导致当给予携带肿瘤的人或动物例如裸鼠时，通过抗肿瘤效果测定的更 高的溶瘤能力。本发明的病毒还编码另一副粘病毒的F和/或HN蛋白的基因，由此F蛋白可具有 多碱基裂解位点，所述病毒经修饰从而一个基因被来自APMV1-9的组的病毒的同源基因取 代。基因修饰还可导致禽类中病毒病原性减弱。本发明还包括利用所述病毒制备用于治疗上述疾病的药物，所述药物具有药学可 接受的载体和稀释剂。所述载体和稀释剂描述于Remington' s Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company,Easton Pennsylvania(1980)。所用病毒效价根据治疗 指征在如下范围内:109-1012pfu 每剂，IO8-IO11Pfu, IO7-IO10Pfu 或 106_109pfu。所述药学载体和稀释剂可包含本发明病毒的乳剂，并可通过吸入、静脉内输注、皮 下注射、腹腔内注射或肿瘤注射给药。本发明的另一方面是预防和/或治疗增生性疾病具体是癌症的方法，包括给予需 要的对象药物有效量的本发明的药物组合物。药物有效量是本发明病毒的效价，具体是治 愈或抑制疾病的本发明的病毒。对于治疗效果而言，可接受的剂量是不同的，有赖于例如构建体、患者，给药途径 和癌症种类。本发明还包括本发明的病毒与化疗剂的组合应用。本发明的病毒可与任何抗肿瘤剂，烷基化剂，抗代谢药物，植物源性抗肿瘤剂，激 素治疗剂，拓扑异构酶抑制剂，喜树碱衍生物，激酶抑制剂，靶向药物，抗体，干扰素和/或 生物反应调节剂和其他抗肿瘤药物一起使用。在这方面，以下是可与该发明的病毒一起使 用的第二种药剂的非限制性列表 烷化剂包括但不限于氮芥氮氧化物，环磷酰胺(cyclophophamide)，异环磷 酰胺，噻替哌，雷莫司汀(ranimustine)，尼莫司汀(nimustine)，替莫唑胺，六甲蜜胺 (altretamine),阿扎丙宗(apaziquone), brostallicin,苯达莫司汀，卡莫司汀，雌莫司 汀，福莫司汀，葡磷酰胺，异环磷酰胺，马磷酰胺，苯达莫司汀和二溴卫矛醇；钼配位的烷基 化合物包括但不限于，顺钼，卡钼，依他钼，乐钼，奈达钼，奥沙利钼或沙钼(satrplatin)； 抗代谢药物包括但不限于，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤核苷，巯基嘌呤，5-氟尿嘧啶单独或 与甲酰四氢叶酸，替加氟，去氧氟尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，cytarabine ocfosfate，依诺 他滨，吉西他滨，氟达拉滨，5-阿扎胞苷，卡培他滨，克拉屈滨，氯法拉滨，地西他滨，依氟 鸟胺酸，乙炔基胞苷(ethynylcytidine)，阿糖胞苷，羟基脲，马法兰，奈拉滨，洛拉曲克， ocfosfite，disodium premetrexed，喷司他丁，pelitrexol，雷替曲塞，triapine，三甲曲 沙，阿糖腺苷，长春新碱，长春瑞滨；激素治疗剂，如依西美坦，Lupron，阿那曲唑，度骨化醇 (doxercalciferol)，法倔唑(fadrozole)，福美司坦，11 β -羟脱氢酶1抑制剂，17-α羟化 酶/17，20裂解酶抑制剂，如醋酸阿比特龙，5- α还原酶抑制剂如Bearfina (非那雄胺)和 爱普列特，抗雌激素，如柠檬酸他莫昔芬和氟维司群，Trelstar,托瑞米芬，雷洛昔芬，拉索 昔芬，来曲唑，或抗雄性激素，如比卡鲁胺，氟他胺，米非司酮，尼鲁米特，康士得(Casodex)，或抗孕酮及其组合；植物源性抗肿瘤活性物质，例如包括从有丝分裂抑制剂选出的那些，包 括例如埃博霉素类(印othilone)诸如sagopilone，Ixab印ilone或埃博霉素B，长春碱，长 春氟宁，多烯紫杉醇，紫杉醇，细胞毒性拓扑异构酶抑制剂包括一个或多个选自下组的药剂阿克拉霉素， 氨萘非特，belotecan,喜树碱，10-羟基喜树碱，9_氨基喜树碱，diflomotecan,伊立替 康(Camptosar)，edotecarin, epimbicin (Ellence)，依托泊昔，依沙替康，gimatecan, lurtotecan,米托惠酉昆，pirambicin, pixantrone,鲁比牛寺康，索布佐生，tafluposide,与托 泊替康及其组合；免疫学上(Immunologicals)包括干扰素和许多其它免疫促进剂。干扰素包括干 扰素α，干扰素a-2a，干扰素a_2b，干扰素β，干扰素Y-Ia或干扰素Y_nl。其他药剂 包括L19-IL2和其他L19衍生物，非格司亭，香菇多糖，sizofilan, TheraCys,乌苯美司，阿 地白介素，阿仑珠单抗，BAM-002，达卡巴嗪，赛尼哌，地尼白介素，emtuzumab ozogamicin, ibritumomab，咪喹莫特(imiquimod)，来格司亭，香菇多糖，黑素瘤疫苗(Corixa)，莫拉司 亭，沙格司亭，他索那敏，tecleukin，thymalasin，托西莫单抗，Vimlizin，依帕珠单抗，米妥 莫单抗，oregovomab, pemtumomab, Provenge,生物反应调节剂是调节有生命的生物体的防御机制或生物反应的药剂，所述生物 反应如生存，生长，或组织细胞分化，以引导其具有抗肿瘤活性。这些药剂包括云芝多糖 (krestin)，香菇多糖，西左非兰(sizof iran)，溶链菌制剂(picibanil)，ProMune或乌苯美司。促凋亡剂YM155，AMG 的 655，AP02L/TRAIL, CHR-2797。抗血管生成化合物包括，阿维A，Aflibercept,血管抑素，aplidine，asentar, Axitinib, Recentin,贝伐珠单抗，brivanib alaninat, cilengtide,考布他汀，达斯特， 内皮抑素，芬维 A 铵，商夫酮，pazopanib,兰尼单抗，rebimastat, removab, Revlimid, Sorafenib, Vatalanib，角鲨胺，舒尼替尼，Telatinib，沙利度胺，ukrain, Vitaxin ；钼配位的化合物包括但不限于，顺钼，卡钼，奈达钼，沙钼或奥沙利钼；喜树碱衍生物包括但不限于喜树碱，10-羟基喜树碱，9-氨基喜树碱，依立替康， edotecarin,与托泊替康；抗体包括曲妥珠单抗，西妥昔单抗贝伐珠单抗或利妥昔单抗，ticilimumab, lpilimumab，lumiliximab，catumaxomab, atacicept ；oregovomab，阿仓珠单抗。VEGF抑制剂也可与本发明的病毒组合。VEGF抑制剂例如索拉非尼，达斯特，贝伐 珠单抗，舒尼替尼，Recentin, Axitinib, Aflibercept, Telatinib, brivanib alaninate, Vatalanib, pazopanib 禾口 Ranibizumab。EGFR(HERl)抑制剂也可与本发明的病毒组合。EGFR抑制剂例如西妥昔单抗， Panitumumab, Vectibix, Gefitinib, Erlotinib, Zactima0HER2抑制剂也可与本发明的病毒组合。HER2抑制剂例如Lapatinib，Tratuzumab， Pertuzumab0mTOR抑制剂也可与本发明的病毒组合。mTOR抑制剂例如Temsirolimus，西罗莫司
/雷帕霉素，依维莫司。cMet抑制剂也可与本发明的病毒组合。
PI3K-和AKT抑制剂也可与本发明的病毒组合。CDK抑制剂也可与本发明的病毒组合。CDK抑制剂的实例是细胞周期蛋白依赖激 酶(roscovitine)禾口 flavopiridol。纺锤体组装检控点(Spindle assembly checkpoint)抑制剂和靶向的抗有丝分 裂剂可与本发明的病毒组合。靶向的抗有丝分裂药物例如PLK抑制剂，Aurora抑制剂诸如 Hesperadin,检控点激酶抑制剂和KSP抑制剂。HDAC抑制剂可与本发明的病毒组合。HDAC抑制剂例如panobinostat， vorinostat, MS275,belinostat 禾口 LBH589。HSP90抑制剂和HSP70抑制剂可与本发明的病毒组合。蛋白酶体抑制剂可与本发明的病毒组合。蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米和 carfilzomib。丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂可与本发明的病毒组合。 丝氨酸激酶抑制剂包括MEK抑制剂和Raf抑制剂诸如Sorafenib。本发明的病毒可与法呢基转移酶抑制剂例如tipifarnib —起使用。本发明的病毒可与酪氨酸激酶抑制剂一起使用，所述酪氨酸激酶抑制剂包括 Dasatinib, Nilotibib, DAST, Bosutinib, Sorafenib,贝伐珠单抗，舒尼替尼，AZD2171, Axitinib, Aflibercept, Telatinib,伊马替尼敏使朗(mesylate), brivanib alaninate, pazopanib, Ranibizumab, Vatalanib, Cetuximab, Panitumumab, Vectibix, Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Tratuzumab, Pertuzumab 禾口 c_Kit 抑制剂。维生素D受体激动剂可与本发明的病毒组合。Bcl-2蛋白抑制剂可与本发明的病毒组合。Bcl-2蛋白抑制剂是obatoclax， oblimersen sodium 禾口 gossypol。分化 20 受体簇拮抗剂(Cluster of Differentiation 20 receptor antagonists)可与本发明的病毒组合。分化20受体簇拮抗剂例如利妥昔单抗。核糖核苷 酸还原酶抑制剂可与本发明的病毒组合。核糖核苷酸还原酶抑制剂例如吉西他滨。拓扑异 构酶I和Il抑制剂可与本发明的病毒组合。拓扑异构酶I和Il抑制剂例如Camptosar (伊 立替康)和多柔比星。肿瘤坏死凋亡诱导配体受体1激动剂可与本发明的病毒组合。肿瘤坏死凋亡诱导 配体受体1激动剂例如mapatumumab。5-羟色胺受体拮抗剂可与本发明的病毒组合。5-羟色胺受体拮抗剂例如rEV598， Xaliprode，帕洛诺司琼盐酸盐，格兰塞隆，Zindol，帕洛诺司琼盐酸盐或AB-1001。整联蛋白抑制剂可与本发明的病毒组合。整联蛋白抑制剂例如α 5β 1整联蛋白 抑制剂诸如Ε7820，JSM 6425，volociximab或内皮抑素。雄激素受体拮抗剂可与本发明的病毒组合。雄激素受体拮抗剂例如癸酸苯丙酸诺 龙，氟甲睾酮，氟甲睾酮，Android, Prost-aid，Andromustine，比卡鲁胺，氟他胺，Apo-环丙 孕酮，Apo-氟他胺，醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)，比卡鲁胺，色普龙，Tabi，醋酸 环丙孕酮，环丙孕酮片，尼鲁米特。芳香酶抑制剂可与本发明的病毒组合。芳香化酶抑制剂的例子有阿那曲唑，来曲 唑，睾内酯，依西美坦，福美司坦和氨鲁米特。基质金属蛋白酶抑制剂可与病毒的发明。其他抗癌药物包括阿利维A酸，聚肌胞，阿曲生坦，蓓萨罗丁，硼替佐米，波生坦，骨化三醇，exisulind，非那雄胺，福莫司汀，伊班膦 酸，米替福新，米托蒽醌，L-门冬酰胺，丙卡巴胼，达卡巴嗪，羟基脲，羟基脲，培门冬酶，喷司 itT, tazarotne, VELCADE M^iMU, Canfosfamide darinaparsin $会H￥@|。
实施例肿瘤选择性复制当与人肿瘤细胞诸如HT29结肠癌细胞或HT1080纤维肉瘤细胞一起保温时，该病 毒能复制并产生子代病毒。在肿瘤细胞中获得的效价比在人原代正常细胞中获得的效价高 至少100倍。当检验病毒的细胞杀死效应时，杀死原代正常细胞必需的MOI比足以杀死人肿瘤 细胞的MOI高至少100倍，更优选1000倍。病毒的产生病毒在具胚禽卵(优选鸡卵)或人肿瘤细胞系或人肿瘤细胞系衍生物中生长。从卵的尿囊液或从所述细胞上清或从细胞碎片收获病毒(细胞结合的病毒)。所述病毒利用非连续蔗糖密度梯度超速离心浓缩并纯化。任选，所述病毒利用切 向流过滤浓缩和纯化。抗肿瘤效果病毒的抗肿瘤效果显示在小鼠肿瘤模型中。当肿瘤内或静脉内给药时，所述病毒 导致裸鼠中建立的人异种移植肿瘤的退化。病毒的有效剂量是IO5-IO9Pfu/注射。一些肿 瘤模型中。在2-14天(优选7天)中重复给药是非常有效所需的。病毒的基因改造反向遗传系统已经对于许多副粘病毒公开。其类似地经改造适应本发明的副粘病对病毒基因组进行测序。基于该序列，设计用于克隆的引物，使得其跨病毒基因 组中的独特限制酶识别位点。通过RT-PCR，病毒基因组的多个片段作为DNA在质粒载体如 ρΧ8δΤ中被克隆。利用基因组质粒，在DNA水平进行突变、基因交换以及其他类型的基因改造。通过利用辅助质粒将基因组质粒DNA转染进入表达Τ7-聚合酶的细胞，可拯救重 组病毒。还可使用拯救病毒的其他方法。例如，Τ7聚合酶的表达可通过细胞与编码Τ7聚 合酶的表达质粒的共转染来实现。对于相关病毒NDV，还描述了其他转基因在病毒中的表达(Punier et al. ,2008)。其他转基因优选插入M-F或F-HN之间的基因间区域。F和HN转基因可源自任何APMV，优选来自自身具有强溶瘤能力的病毒。F和H/HN 转基因可衍生自除外APMV的其他副粘病毒。为了增加病毒的溶瘤能力，仅表达单独的F或HN蛋白即可。嵌合病毒为了组合两种不同病毒的阳性特征或为了去除阴性特征，可用其他病毒的同源片 段替代基因组的片段。所述病毒可为任何相关副粘病毒并且不限于APMV。APMV的F和HN蛋白的内源性基因可被来自相关副粘病毒的异源基因取代以改变病毒特异性和肿瘤选择性。为了允许病毒粒子的正确装配，所有三个蛋白M，F和HN可用相关病毒的同源基因 片段取代。为了降低禽类的病原性，P/V蛋白的基因被突变或用来自相关病毒的基因取代。相 同的方法也可增加病毒特异性(与正常细胞相比)以杀死人肿瘤细胞。内源性L，P和NP蛋白可被交换。这三种蛋白的交换将对病毒的复制特性产生影 响。转基因为了降低病毒的病原性，禽类干扰素的基因被插入病毒基因组。为了增加病毒的肿瘤穿透力，将编码细胞外基质降解酶诸如松弛素，胶原蛋白酶， MMP等的转基因插入病毒。为了增加治疗能力，将编码具有抗肿瘤活性的蛋白的转基因插入所述病毒，所述 蛋白诸如毒素，前药转化酶，蛋白酶，抗体等。例如TRAIL及其突变体，MDA-7，IL2，TNF-a， IGF-BP-7。为了显像目的以及作为生物标记，将编码报道基因诸如GFP、萤光素酶、NIS或标 记肽如PSA、胰岛素C-肽、共同病毒抗原(肽)等的转基因插入病毒。对比文件Alexander,D. J. (2003). Newcastle Disease,Other Avian Paramyxoviruses,and Pneumovirus Infections. ISBN 081380423X ed. In" Diseases of Poultry" (Y. M. Saif, Ed.), pp. 63-99. Blackwell Publishing.Chiocca, E.A. (2002). Oncolytic viruses. Nat Rev Cancer 2(12)，938-50.EngeI-Herbert, I. , Werner, 0. , Teifke, J.P., Mebatsion, Τ. , Mettenleiter, T. C. , and Romer-Oberdorfer,A. (2003). Characterization of a recombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein. J Virol Methods 108(1), 19-28.Huang, Ζ. , Elankumaran, S. , Yunus, A. S. , and Samal, S. K. (2004). A recombinant Newcastle disease virus (NDV) expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus (IBDV) protects against NDV and IBDV. J Virol 78(18)，10054-63·Huang, Ζ. , Krishnamurthy, S. , Panda, A. , and Samal, S. K. (2001). High-level expression of a foreign gene from the most 3' -proximal locus of a recombinant Newcastle disease virus. J Gen Virol 82 (Pt 7),1729-36.Kinoh, H. , Inoue, M. , Washizawa, K. , Yamamoto, Τ. , Fujikawa, S. , Tokusumi, Y. , lida, A. , Nagai, Y. , and Hasegawa, M. (2004). Generation of a recombinant Sendai virus that is selectively activated and lyses human tumor cells expressing matrixmetalloproteinases. Gene Ther 11 (14),1137-45.Krishnamurthy, S. , Huang,Ζ. ,and Samal,S. K. (2000). Recovery of a virulent strain of newcastle disease virus from cloned cDNA !expression of a foreign gene results in growth retardation and attenuation. Virology 278(1),168-82.Myers,R. ,Greiner,S. ,Harvey,Μ. ,Soeffker,D. ,Frenzke,Μ. ,Abraham,K. ,Shaw,
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权利要求
选自APMV3，APMV4，APMV5，APMV6，APMV7，APMV8，APMV9，Mapuera病毒和Fer de Lance病毒的组的副粘病毒在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述病毒是在RNA水平具有超过80%序列相同性的紧密相 关的副粘病毒。
3.权利要求1的用途，其中所述病毒是重组的。
4.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达源自APMV1-9的一个其他基因。
5.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达源自APMV1-9的两个或更多个其他基因。
6.权利要求4-5任一项的用途，其中所述基因编码另一种副粘病毒的F和/或HN蛋白。
7.权利要求6的用途，其中所述F蛋白具有多碱基(multibasic)裂解位点。
8.权利要求3的用途，其中所述病毒经修饰从而一个基因被选自APMV1-9的组的病毒 的同源基因取代。
9.权利要求3的用途，其中所述基因修饰导致在禽类中的病原性减弱。
10.权利要求3的用途，其中所述基因修饰导致病毒感染肿瘤细胞与非转化的正常细 胞相比更高的选择性。
11.权利要求3的用途，其中所述基因修饰导致给药携带肿瘤的裸鼠时通过抗肿瘤效 果测定的更高的溶瘤能力。
12.权利要求1的用途，其中所述病毒是肿瘤内给药的。
13.权利要求1的用途，其中所述病毒是腹腔内给药的。
14.权利要求1的用途，其中所述病毒通过吸入给药。
15.权利要求1的用途，其中所述病毒是静脉内给药的。
16.权利要求1的用途，其中所述病毒通过密度梯度超速离心来纯化。
17.权利要求1的用途，其中所述病毒通过切向流过滤纯化。
18.权利要求1的用途，其中所述肿瘤选自结肠癌，乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，黑 素瘤，宫颈癌，膀胱癌，胶质母细胞瘤和纤维肉瘤组成的组。
19.权利要求1的用途，其中所述药物组合物还包含化疗剂。
20.权利要求1的用途，其中所述药物组合物还包含重组治疗抗体。
21.权利要求1的用途，其中所述药物组合物还包含重组治疗蛋白。
22.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码结合蛋白的其他基因。
23.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码酶的其他基因。
24.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码前药转化酶的其他基因。
25.权利要求1的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码抗体的其他基因。
26.权利要求3的用途，其中所述病毒经修饰表达至少一个编码融合蛋白的其他基因， 所述融合蛋白包含具有抗体可变区的至少一个免疫球蛋白结构域。
27.权利要求1的用途，其中所述肿瘤是转移瘤。
28.权利要求8的用途，其中2-5个基因被取代，产生具有仅1-4个来源病毒的保留基 因的嵌合病毒。
全文摘要
本发明涉及选自下组的副粘病毒APMV3，APMV4，APMV5，APMV6，APMV7，APMV8，APMV9，Mapuera病毒和Fer-de-Lance病毒，其可用于制备用于治疗肿瘤的病毒。所述病毒具有杀死人肿瘤细胞但在相同剂量不杀死人正常分化细胞和人正常增殖细胞的选择性。通过基因改造，所述病毒可被修饰从而一或多个基因被加入或由相关副粘病毒的同源基因取代。通过所述方法，产生的嵌合病毒的抗肿瘤活性与亲代病毒相比提高。
文档编号A61K35/76GK101945660SQ200980105182
公开日2011年1月12日 申请日期2009年2月12日 优先权日2008年2月14日
发明者F·普赫勒尔, R·拜尔 申请人:拜耳先灵医药股份有限公司
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