抵抗胞内劳森菌的疫苗的制作方法
专利名称：抵抗胞内劳森菌的疫苗的制作方法
抵抗胞内劳森菌的疫苗本发明涉及用于抵抗胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)感染的疫苗，在这 个意义上，疫苗是至少提供胞内劳森菌感染的负面影响降低的组合物，如组织损伤和/或 临床病征(如，下降的体重增加，腹泻等)的负面影响。许多动物(特别是猪)的增生性肠炎呈现出不成熟隐窝上皮细胞粘膜增生的临床 病征和病理症状，特别是在末端回肠中。可以受到影响的小肠的其他部位包括空肠、盲肠和 结肠。断奶幼畜和仔猪主要受到体重快速减轻和脱水的典型临床表现的影响。猪的自然临 床疾病在全世界范围内发生。该疾病始终与胞内曲状细菌(目前已知为胞内劳森菌)的存 在相关。通常，对抗胞内劳森菌的口服接种疫苗已经显示出是一种在经济上有效的措施， 以控制回肠炎和更好地开发猪的遗传生长潜能(Porcine Proliferative Enteropathy Technical manual 3. 0 (猪增生性肠炎技术手册3. 0)，2006年7月；获自Boehringer Ingelheim)。此外，口服而非非肠道的疫苗接种将降低血液携带感染(如通过多次使用的 针的PRRS)的传播以及注射部位反应的减少和保留在畜体内的针。与单独的疫苗接种相 比，这将减少动物和人的应激、时间、劳动成本和精力(McOrist :"Ileitis-0ne Pathogen, Several Diseases，，，IPVS Ileitis Symposium in Hamburg, 2004 年 6 月 28 日)。通常了解减毒活疫苗方法的优势是免疫的功效通常是相对良好的，因为宿主的免 疫系统以更“自然”的方式暴露于生物体的所有抗原物质。特别地，对于胞内细菌剂，如胞 内劳森菌，由于基于完全的和合适的T细胞的免疫应答，认为活的减毒疫苗方法给接种疫 苗的动物给予了最好利用的保护。这与用于胞内细菌的亚基或杀灭疫苗类型相关的不定的 差的免疫性相反。这对于专性胞内细菌(如，胞内劳森菌或衣原体(Chlamydia))也特别如 此，这些胞内细菌在粘膜内引起致病的感染。研究表明目标胞内细菌完整的活减毒形式最 好递送至靶粘膜，它们需要作为完整的活细菌形式，以在靶粘膜中产生完全保护性的免疫 应答，而且与使用部分细菌成分相比，它们在免疫上也是较好的。一般的理解是需要口服给予对抗胞内劳森菌的疫苗(参见上文中提到的 Technical Manual 3.0)。这是基于如下的事实身体抵抗回肠炎的基础是小肠中的局部 免疫力，这是细胞介导的免疫力和通过抗体(尤其是IgA)的局部防御的结果。根据目前 的知识，血清抗体(IgG)不能给予任何保护，只是因为它们没有到达肠腔。已经在研究中 证明了口服疫苗接种产生细胞介导的免疫力，以及在肠道中局部产生IgA(Murtaugh，见 Agrar-und Veter inar -Akademie, Nutztierpraxis Aktuel 1, Ausgabe 9, Juni 2004 ；禾口 Hyland 等，见 Veterinary Immunology and Immunopathology 102 (2004) 329-338)。相反， 肌内给药没有产生保护。此外，紧次于对抗胞内细菌的成功疫苗必须诱导细胞介导的免疫 力以及局部抗体的产生的一般了解，本领域技术人员知道实际上仅有非常低百分比的口服 摄入的抗原被肠上皮细胞吸收，并且胞内劳森菌掺入细胞中是通过细菌启动的活性过程。 因此，灭活的疫苗将给肠提供具有不充足的免疫原性抗原(Haesebrouck等，见Veterinary Microbiology 100 (2004) 255-268)。这是为什么认为只有减毒的活疫苗在肠细胞中诱导足 够的细胞介导的保护(参见上文中提到的Technical Manual 3.0)。目前，市场上只有一种抵抗胞内劳森菌的疫苗，由Boehringer Ingelheim销售的viz. Enter i SO1 Ileitis。 这种疫苗是真正的用于口服给药的活疫苗。本发明的目的是提供抵抗胞内劳森菌感染的可替换疫苗。为此，发明了使用非活 性的含有碳水化合物的组合物，这些碳水化合物在活的胞内劳森菌细胞中也能找到，与这 些细胞的外细胞膜相连，将组合物用于制造抵抗胞内劳森菌感染的疫苗，该疫苗是适于全 身给药的形式。令人惊讶地，与长久以来对怎样对抗胞内劳森菌的一般了解相反，发现使用 含有碳水化合物的非活性组合物，例如，从胞内劳森菌的外细胞膜提取的，作为疫苗中的抗 原，可以诱导对抗胞内劳森菌的保护，当将抗原全身给药时，即，以到达身体循环系统的方 式(包括心血管和淋巴系统)，这种保护与使用活疫苗Enteri so 1 ileitis(根据相应 的说明书来给药)提供的保护相当或甚至有提高，因此影响作为整体的身体，而不是特定 部位，如胃肠道。例如，可以通过将抗原给予肌肉组织中(肌内)、真皮中(皮内)、皮肤下 (皮下)、粘膜下(膜下)、静脉中(静脉内)等来进行全身给药。除了可获得的非常好的保 护以外，本发明非活性疫苗的重要优点在于当与活疫苗比较时固有的安全性。通常，可以通过使用本领域已知的方法将含有碳水化合物的组合物用于制造疫 苗，这些方法基本上包括将含有抗原性碳水化合物的组合物(或从其衍生的组合物，如原 始组合物或提取物的稀释物或浓缩物，一种或多种纯化成分等)与药物学上可接受的载体 混合，所述载体例如为液体载体，如(任选缓冲的)水，或固体载体，如通常用于获得冷冻干 燥疫苗的那些。因此，可以在工业环境中进行制造，也可以就地(即，在兽医处、农场等)将 抗原与其他疫苗混合，例如，在实际给药于动物之前(立即)混合。在疫苗中，抗原应当以 免疫有效量存在，即，能够刺激目标动物的免疫系统足以至少降低用野生型生物体的接种 后激发的负效应的含量。任选地，可以加入其他物质，如佐剂、稳定剂、粘度调节剂或其他成 分，这取决于预期的用途或所需的疫苗特性。对于全身性疫苗接种，许多形式是合适的，特 别是液体制剂(含有溶解的、乳化的或悬浮的抗原)，以及固体制剂，如植入物或介质形式， 如用于抗原悬浮于液体中的固体载体。全身性疫苗接种，特别是非肠道疫苗接种(即，不通 过消化道)，和用于全身性疫苗接种的合适疫苗(物理)形式已经知道有200多年了。注意到已经报道了胞内劳森菌细菌的亚基作为疫苗中的抗原，用于保护以对抗这 种细菌。然而，这些主要是重组蛋白，并且迄今为止没有一个证明了能够提供良好的保护。 也提出了将杀灭的细菌(其固有地含有也能在活的胞内劳森菌细胞中找到的与外细胞膜 相连的碳水化合物)作为对抗胞内劳森菌的疫苗中的抗原，但实际上尚未测试和报道基于 杀灭的全细胞的疫苗能提供良好的保护。除此之外，由于通常的理解是对全身性给药抗原 来局部(即，在肠中)对抗胞内劳森菌不存在合理的期望，因此没有结合这些杀灭的细菌来 使用全身性给药。在这点上，注意到W097/20050 (Daratech PTY Ltd)提及了使用杀灭的胞内劳森菌 细菌来使猪免疫。然而，没有提及全身性给药。基于目前的支持，只在口服给药时，疫苗接 种才是有效的，通常理解口服途径是为Daratech申请中所述的实验选择的给药途径。另 一个提及杀灭细菌的专利申请是W02005/011731 (Boehringer Ingelheim)。然而，实际上 公开的只是使用了 口服给药的活疫苗。没有显示杀灭疫苗是有效的，也没有公开可以全身 性给药杀灭的疫苗。EP843818 (Boehringer Ingelheim)描述了肌内给药杀灭的疫苗(段 落
，结合段落
)，在段落W115]中，描述了通过在标准大气条件下储存在4°C下来杀灭细菌。然而，如通常所知的，在这样的条件下，胞内劳森菌细菌能够存活。因此， 这篇文献没有教导本发明的主题。还注意到含有碳水化合物的组合物从Kroll等是已知的 (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2005 年 6 月，693—699)，其中i亥碳水 化合物在活的胞内劳森菌中也能找到，与这些细胞的外细胞膜相连。然而，这种组合物是用 于诊断的。出于如上所述的原因，尚未测得其为保护性抗原。在一个实施方案中，含有碳水化合物的组合物是由胞内劳森菌细菌的杀灭产生的 材料。已经发现了非常方便的提供用于根据本发明使用的碳水化合物的方式是简单地杀灭 胞内劳森菌细胞并使用获自作为碳水化合物来源的材料。从活细胞提取碳水化合物在理 论上也是可行的(类似于通过除去细胞壁形成活的形骸细胞)，但需要更精密复杂的并因 此更昂贵的技术。该材料可以作为整体使用，例如，胞内劳森菌细胞的全细胞悬浮液或裂解 物，或可以从该材料中纯化或甚至分离出碳水化合物。可以通过使用相对简单的本领域已 知的技术来进行这种方法。在优选的实施方案中，含有碳水化合物的组合物含有杀灭的胞内劳森菌细菌的完 整细胞。已经证明了这是最方便用于提供碳水化合物作为疫苗中的抗原的方式。此外，甚 至可进一步提高疫苗的功效，可能是因为这种将抗原给予目标动物的免疫系统的方式可更 好地模拟碳水化合物的天然环境。在一个实施方案中，疫苗包含水包油型佐剂，其含有亚微米大小的油滴。通常，佐 剂是非特异性的免疫刺激剂。原则上，可以将在免疫事件的级联中能够促进或扩大特定的 过程并最终导致更好免疫应答(即，对抗原的综合身体应答，特别是通过淋巴细胞介导的 应答，并且通常涉及特定抗体或之前敏化的淋巴细胞对抗原的识别)的每种物质定义为佐 剂。已经显示出使用含有亚微米大小油滴的水包油型佐剂可提供非常好的对抗胞内劳森菌 的保护。实际上，水包油型佐剂这样结合非活性抗原的应用是常见的。然而，通常知道当油 滴直径大时获得最好的免疫刺激特性。特别是，当认为安全性是重要问题时，特别地使用具 有1微米以下直径的油滴。在这种情况下，可以使用小的液滴，因为已知这些引起较少的组 织损伤、临床病征等。然而，对于通过全身性疫苗接种获得肠道相关疾病保护(如本发明中 的情况)来说，可以选择大的液滴，因为期望免疫应答必须得到明显加强。相反，我们发现 了对于对抗胞内劳森菌的保护，在组合物中使用小的油滴可提供非常好的结果。在更优选的实施方案中，佐剂包含生物可降解油的液滴和矿物油的液滴，生物可 降解油的液滴的平均大小不同于矿物油的液滴的平均大小。已经显示出使用生物可降解油 和矿物油的混合物对于功效和安全性提供了非常好的结果。除此之外，组合物的稳定性非 常高，这是重要的经济优势。已经证明了稳定性是非常好的，特别是当生物可降解油液滴或 矿物油液滴的平均(容重)大小小于500nm(优选400nm)时。在一个实施方案中，疫苗进一步包含猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae) 和猪圆环病毒的抗原。迄今为止，现有技术中已经提出了胞内劳森菌的组合疫苗。然而，实 际上这些组合中没有多少的功效得到了测试。这种情况的原因在于通常理解为抗原与胞内 劳森菌抗原的组合只有当劳森菌抗原作为活(减毒)细胞提供时才能获得成功的保护。在 这点上，我们参考W02005/011731，其也提出了基于胞内劳森菌的所有种类的组合疫苗。然 而，关于该专利申请的说明书和权利要求结构，受让人(Boehringer Ingelheim)似乎确信 只有当劳森菌抗原以活细胞形式存在时才能期望组合疫苗具有合理的成功机会。这对于W02006/099561同样如此，受让人也是Boehringer Ingelheim)。实际上，基于普通常识，这 是显而易见的想法。使用以下实施例来进一步解释本发明。实施例1描述了获得基本上无蛋白质的含碳水化合物的组合物的方法以及使用 该组合物制得的疫苗。实施例2描述了一个实验，其中将根据本发明的第二种疫苗与目前市场上的疫苗 和含有胞内劳森菌亚基蛋白的实验疫苗进行比较。实施例3描述了一个实验，其中将根据本发明的两种不同的疫苗与目前市场上的 疫苗进行比较。实施例4描述了一个实验，其中确定了根据本发明的疫苗的剂量影响。实施例1在这个实施例中，描述了获得基本上无蛋白质的与胞内劳森菌细胞的外细胞膜相 连的碳水化合物组合物的方法以及可以使用这种组合物制得的疫苗。通常，碳水化合物是 含有碳、氢和氧的有机化合物，碳、氢和氧的比例通常为1 2 1。碳水化合物的实例是糖 (糖类)、淀粉、纤维素和树胶。通常，它们作为动物膳食中的主要能源。胞内劳森菌是革兰 氏阴性细菌，因此其含有不完全是由磷脂和蛋白质构成的外膜，而是外膜还含有碳水化合 物，特别是多糖(通常是如脂多糖、脂寡糖或甚至非脂多糖这样的多糖)。用于疫苗制备的碳水化合物级分取二十微升含有浓度为3.7E8( = 3. 7X IO8)细胞/ml的胞内劳森菌的缓冲水 (0. 04M PBS，磷酸盐缓冲的盐水)。通过将它们在100°C下保持10分钟来裂解细胞。将0. 04M PBS中的蛋白酶K(10mg/ml)加入，至1. 7mg/ml的终浓度。将该混合物在60°C下培养60分 钟，以降解所有蛋白质并保持碳水化合物完整。随后，将混合物在100°C下培养10分钟，以 灭活蛋白酶K。将所得到的材料在2-8°C下储存，直至进一步使用，所得到的材料是含有碳 水化合物的组合物，特别是含有存在于活的胞内劳森菌细菌中的与其外细胞膜相连的碳水 化合物(参见以下的段落)。将组合物配制于Diluvac forte佐剂中。这种佐剂(参阅EP 0382271)包括7. 5%重量的具有大约400nm的平均容重大小的醋酸维生素E液滴，液滴悬 浮于水中，并用0.5%重量的吐温80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)稳定。每微菌升疫苗含 有从1. 2E8胞内劳森菌提取的材料。劳森菌碳水化合物抗原的免疫沉淀根据标准程序，在室温下，用饱和的Na2SO4,将两批对抗胞内劳森菌完整细胞产生 的单克隆抗体(MoAb’s)进行沉淀。通过离心(10.000g，10分钟)将沉淀物沉淀。用20% Na2SO4洗涤沉淀物，并重悬浮于0. 04M PBS中。根据制造商的手册，用0. IM NaPO4(pH 7. 4) 预先洗涤酪氨酰(Tylosyl)激活的Dynal珠粒(DynaBeads，DK)。从每批MoAb，s取出 140 μ g，并加入到2E8预先洗涤过的珠粒中，并在37°C下培养过夜。通过离心沉淀珠粒并通 过抽吸上清液来除去未结合的MoAb’ s。分光光度计测量显示出20至35%加入的MoAb，s 已经与珠粒结合。将0. 04M PBS中的两批Iml胞内劳森菌细胞(3. 7E8/ml)超声波处理1分钟。将 所得到的细胞裂解物加入到酪氨酰激活的珠粒-单克隆复合物中，并在4°C下培养过夜。用 0. IM NaPO4(pH 7. 4)将酪氨酰激活的珠粒-单克隆复合物洗涤三次。以连续的方式，将珠粒在 0. 5ml 的 0. 04M PBS 中的 8M 脲(El) ；0. 5ml IOmM 甘氨酸 pH2. 5 (E2)；和 0. 5ml 50mM HCl (E3)中洗涤来洗脱结合的化合物。洗脱后，用100 μ 1和200 μ 1 IM Tris/HCl (pH 8. 0) 中禾口 E2禾口 E3。从每个步骤取样并装载于SDS-PAGE凝胶上。使用考马斯亮蓝(CBB)和银染将凝胶 染色或弄污。使用如上所述的相同MoAb’s来产生斑点。凝胶和斑点的观察显示出MoAb’s 识别具有21和24kDa表观分子量的条带，这些条带在CBB凝胶上未看到，但在银染的凝胶 上看到了。此外，确定了结合MoAb’s的细胞级分是蛋白酶K抗性的。因此，基于这些结果， 可以推断出该级分含有碳水化合物(即，所有蛋白被裂解了，并且超声波处理的DNA级分在 银染中没有作为清晰的条带显示出来)，并且碳水化合物与胞内劳森菌的外细胞膜(即对 抗这种级分产生的MoAb’s也识别完整的胞内劳森菌细胞)相连(即，形成其的一部分或与 其结合)。已知胞内劳森菌是革兰氏阴性细菌的事实，因此认为碳水化合物组合物包括多 糖。实施例2进行该实施例来测试在疫苗中配制碳水化合物抗原的方便方法，S卩，通过杀灭的 完整细胞(也称为菌苗)。作为对照，使用了可购得的疫苗Enterisol iieitis和包含 蛋白质亚基的实验亚基疫苗。接着，将未接种疫苗的动物用作对照。实施例2的实验设计如下制得灭活的完整细胞疫苗。收集源自患有PPE的猪的肠的活胞内劳森菌细 胞。用0.01%BPL(i3-丙内酯)将细胞灭活。所得到的材料，在本发明的意义上固有地是 非活性的含有碳水化合物的组合物(特别是因为它含有存在于活胞内劳森菌细菌中的与 外细胞膜相连的碳水化合物)，将其以大约2. 8 X IO8细胞/ml疫苗的浓度配制于Diluvac forte佐剂中(参见实施例1)。亚基疫苗含有重组Ρ1Λ和P4，如从EP1219711中所知的(分别为19/21和37kDa 蛋白)，并且该重组蛋白通过基因5074、4320和5464来表达，如W02005/070958中所述。将 蛋白质配制于Diluvac forte佐剂中。疫苗含有大约50 μ g每种蛋白/微升。使用了四十六周大的SPF猪。将猪分成4组，每组十头猪。根据制造商的说明，组 1 口服接种一次(T = (m)2ml “Enter i sol ileitis”(Boehringer Ingelheim)。组 2和组3肌内接种两次(在T = O和T = 4周时)，分别接种2ml如上所述的灭活劳森菌完 整细胞疫苗和重组亚基组合疫苗。组4留着作为未接种的对照。在T = 6周时，所有的猪 用均质的胞内劳森菌感染的粘膜口服激发。随后，每日观察所有猪的猪增生性肠病(PPE) 的临床病征。在激发之前和之后，以规则的时间，从猪取样血清血液(用于血清学)和粪便 (用于PCR)。在T = 9周时，将所有猪安乐死并进行尸检。获取回肠的组织学样品并通过 显微镜进行检查。从感染的粘膜制备激发接种物将500克感染的粘膜(从感染的肠刮下来的)与 500ml生理盐水混合。将该混合物在通用勻浆器中在冰上全速均质一分钟。在T = 6周时， 用20ml激发接种物口服激发所有猪。在T = 0、4、6、7、8和9w时，获取每只猪的粪便样品(克含量)和血清血样并冷冻 储存直至测试。在定量PCR(Q-PCR)中测试粪便样品并表示为以皮克(pg)计的量的对数。 在常用的IFT测试(检测对抗血清中完整胞内劳森菌细菌的抗体的免疫荧光抗体测试)中测试血清样品。对于组织学评分，获取回肠的相关样品，在4%缓冲的福尔马林中固定，常规 包埋并切片。用苏木精-曙红(HE染色)和使用抗胞内劳森菌单克隆抗体的免疫组织化学 染色(IHC染色)将这些切片染色。通过显微镜检查这些切片。组织学评分如下HE染色
未检测到异常分:=0
可疑损伤分:=1/2
轻微损伤分:=1
中度损伤分:=2
严重损伤分:=3
IHC染色
无明显的胞内劳森菌细菌分:=0
可疑的细菌存在分:=1/2
切片中存在单个/少量细菌分·改=1
切片中存在中等数量的细菌分:=2
切片中存在大量细菌分:=3
单独记录每只猪的所有数据。按照激发后不同参数的阳性动物的平均值来计算每
组的分数。使用非参数Marm-Whitney U测试来评价统计学显著性(双侧检验的并将显著 性水平设定为0. 05)。实施例2的结果血清学在第一次接种之前，测试IFT抗体滴度时，所有猪是血清反应阴性的。用完整细 胞菌苗(组2)接种疫苗后，猪产生了高IFT抗体滴度，而对照和接种亚基疫苗的猪仍然是 阴性的，直至激发(表1)。接种Enterisol 的猪(组1)中的两只产生了中等的ift滴 度，而该组中的所有其他猪保持血清反应阴性。激发后，所有猪产生了高ift抗体滴度。表 1中描述了平均结果(使用所用的稀释度，1.0是下侧的检测水平)。表1.接种和激发后猪血清的平均IFT抗体滴度(21og)
组T = O周T = 4周Τ = 6周Τ = 9周1< 1. 01. 11. 7> 11. 42< 1. 03. 7> 11. 8> 12. 03< 1. 0< 1. 0< 1. 0> 11. 64< 1. 0< 1. 0< 1. 0> 12. 0粪便样品的实时PCR在激发之前，所有粪便样品是阴性的。激发后，在所有组中发现了阳性反应。组 1 (P = 0. 02)、组2 (ρ = 0. 01)和组3 (ρ = 0. 03)与对照相比较，具有明显较低的泄出水平。 表2中给出了激发后的概述。
表2.接种和激发后粪便样品的PCR平均结果(log pg)
权利要求
1.非活性的含有碳水化合物的组合物的用途，该碳水化合物在活的胞内劳森菌细胞中 也能找到，与这些细胞的外细胞膜相连，该组合物用于制造抵抗胞内劳森菌感染的疫苗，该 疫苗是适于全身给药的形式。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于含有碳水化合物的组合物是从杀灭胞内劳森菌 细菌获得的材料。
3.根据权利要求2的用途，其特征在于含有碳水化合物的组合物含有杀灭的胞内劳森 菌细菌的完整细胞。
4.根据在前任一项权利要求的用途，其特征在于所述疫苗包含水包油型佐剂，该佐剂 含有亚微米大小的油滴。
5.根据权利要求4的用途，其特征在于所述佐剂包含生物可降解油的液滴和矿物油的 液滴，生物可降解油的液滴的平均大小不同于矿物油的液滴的平均大小。
6.根据在前任一项权利要求的用途，其特征在于所述疫苗进一步包含猪肺炎支原体和 猪圆环病毒的抗原。
7.非活性的含有碳水化合物的组合物，该碳水化合物在活的胞内劳森菌细胞中也能找 到，与这些细胞的外细胞膜相连，该组合物用于制造抵抗胞内劳森菌感染的疫苗，该疫苗是 适于全身给药的形式。
全文摘要
本发明涉及非活性的含有碳水化合物的组合物的用途，该碳水化合物在活的胞内劳森菌细胞中也能找到，与这些细胞的外细胞膜相连，该组合物用于制造抵抗胞内劳森菌感染的疫苗，该疫苗是适于全身给药的形式。
文档编号A61K39/106GK102006883SQ200980113679
公开日2011年4月6日 申请日期2009年4月16日 优先权日2008年4月18日
发明者A·A·C·雅各布斯, C·C·施里尔, P·维尔梅吉, R·P·A·M·塞吉尔斯 申请人:英特威国际有限公司
抵抗胞内劳森菌的疫苗本发明涉及用于抵抗胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)感染的疫苗，在这 个意义上，疫苗是至少提供胞内劳森菌感染的负面影响降低的组合物，如组织损伤和/或 临床病征(如，下降的体重增加，腹泻等)的负面影响。许多动物(特别是猪)的增生性肠炎呈现出不成熟隐窝上皮细胞粘膜增生的临床 病征和病理症状，特别是在末端回肠中。可以受到影响的小肠的其他部位包括空肠、盲肠和 结肠。断奶幼畜和仔猪主要受到体重快速减轻和脱水的典型临床表现的影响。猪的自然临 床疾病在全世界范围内发生。该疾病始终与胞内曲状细菌(目前已知为胞内劳森菌)的存 在相关。通常，对抗胞内劳森菌的口服接种疫苗已经显示出是一种在经济上有效的措施， 以控制回肠炎和更好地开发猪的遗传生长潜能(Porcine Proliferative Enteropathy Technical manual 3. 0 (猪增生性肠炎技术手册3. 0)，2006年7月；获自Boehringer Ingelheim)。此外，口服而非非肠道的疫苗接种将降低血液携带感染(如通过多次使用的 针的PRRS)的传播以及注射部位反应的减少和保留在畜体内的针。与单独的疫苗接种相 比，这将减少动物和人的应激、时间、劳动成本和精力(McOrist :"Ileitis-0ne Pathogen, Several Diseases，，，IPVS Ileitis Symposium in Hamburg, 2004 年 6 月 28 日)。通常了解减毒活疫苗方法的优势是免疫的功效通常是相对良好的，因为宿主的免 疫系统以更“自然”的方式暴露于生物体的所有抗原物质。特别地，对于胞内细菌剂，如胞 内劳森菌，由于基于完全的和合适的T细胞的免疫应答，认为活的减毒疫苗方法给接种疫 苗的动物给予了最好利用的保护。这与用于胞内细菌的亚基或杀灭疫苗类型相关的不定的 差的免疫性相反。这对于专性胞内细菌(如，胞内劳森菌或衣原体(Chlamydia))也特别如 此，这些胞内细菌在粘膜内引起致病的感染。研究表明目标胞内细菌完整的活减毒形式最 好递送至靶粘膜，它们需要作为完整的活细菌形式，以在靶粘膜中产生完全保护性的免疫 应答，而且与使用部分细菌成分相比，它们在免疫上也是较好的。一般的理解是需要口服给予对抗胞内劳森菌的疫苗(参见上文中提到的 Technical Manual 3.0)。这是基于如下的事实身体抵抗回肠炎的基础是小肠中的局部 免疫力，这是细胞介导的免疫力和通过抗体(尤其是IgA)的局部防御的结果。根据目前 的知识，血清抗体(IgG)不能给予任何保护，只是因为它们没有到达肠腔。已经在研究中 证明了口服疫苗接种产生细胞介导的免疫力，以及在肠道中局部产生IgA(Murtaugh，见 Agrar-und Veter inar -Akademie, Nutztierpraxis Aktuel 1, Ausgabe 9, Juni 2004 ；禾口 Hyland 等，见 Veterinary Immunology and Immunopathology 102 (2004) 329-338)。相反， 肌内给药没有产生保护。此外，紧次于对抗胞内细菌的成功疫苗必须诱导细胞介导的免疫 力以及局部抗体的产生的一般了解，本领域技术人员知道实际上仅有非常低百分比的口服 摄入的抗原被肠上皮细胞吸收，并且胞内劳森菌掺入细胞中是通过细菌启动的活性过程。 因此，灭活的疫苗将给肠提供具有不充足的免疫原性抗原(Haesebrouck等，见Veterinary Microbiology 100 (2004) 255-268)。这是为什么认为只有减毒的活疫苗在肠细胞中诱导足 够的细胞介导的保护(参见上文中提到的Technical Manual 3.0)。目前，市场上只有一种抵抗胞内劳森菌的疫苗，由Boehringer Ingelheim销售的viz. Enter i SO1 Ileitis。 这种疫苗是真正的用于口服给药的活疫苗。本发明的目的是提供抵抗胞内劳森菌感染的可替换疫苗。为此，发明了使用非活 性的含有碳水化合物的组合物，这些碳水化合物在活的胞内劳森菌细胞中也能找到，与这 些细胞的外细胞膜相连，将组合物用于制造抵抗胞内劳森菌感染的疫苗，该疫苗是适于全 身给药的形式。令人惊讶地，与长久以来对怎样对抗胞内劳森菌的一般了解相反，发现使用 含有碳水化合物的非活性组合物，例如，从胞内劳森菌的外细胞膜提取的，作为疫苗中的抗 原，可以诱导对抗胞内劳森菌的保护，当将抗原全身给药时，即，以到达身体循环系统的方 式(包括心血管和淋巴系统)，这种保护与使用活疫苗Enteri so 1 ileitis(根据相应 的说明书来给药)提供的保护相当或甚至有提高，因此影响作为整体的身体，而不是特定 部位，如胃肠道。例如，可以通过将抗原给予肌肉组织中(肌内)、真皮中(皮内)、皮肤下 (皮下)、粘膜下(膜下)、静脉中(静脉内)等来进行全身给药。除了可获得的非常好的保 护以外，本发明非活性疫苗的重要优点在于当与活疫苗比较时固有的安全性。通常，可以通过使用本领域已知的方法将含有碳水化合物的组合物用于制造疫 苗，这些方法基本上包括将含有抗原性碳水化合物的组合物(或从其衍生的组合物，如原 始组合物或提取物的稀释物或浓缩物，一种或多种纯化成分等)与药物学上可接受的载体 混合，所述载体例如为液体载体，如(任选缓冲的)水，或固体载体，如通常用于获得冷冻干 燥疫苗的那些。因此，可以在工业环境中进行制造，也可以就地(即，在兽医处、农场等)将 抗原与其他疫苗混合，例如，在实际给药于动物之前(立即)混合。在疫苗中，抗原应当以 免疫有效量存在，即，能够刺激目标动物的免疫系统足以至少降低用野生型生物体的接种 后激发的负效应的含量。任选地，可以加入其他物质，如佐剂、稳定剂、粘度调节剂或其他成 分，这取决于预期的用途或所需的疫苗特性。对于全身性疫苗接种，许多形式是合适的，特 别是液体制剂(含有溶解的、乳化的或悬浮的抗原)，以及固体制剂，如植入物或介质形式， 如用于抗原悬浮于液体中的固体载体。全身性疫苗接种，特别是非肠道疫苗接种(即，不通 过消化道)，和用于全身性疫苗接种的合适疫苗(物理)形式已经知道有200多年了。注意到已经报道了胞内劳森菌细菌的亚基作为疫苗中的抗原，用于保护以对抗这 种细菌。然而，这些主要是重组蛋白，并且迄今为止没有一个证明了能够提供良好的保护。 也提出了将杀灭的细菌(其固有地含有也能在活的胞内劳森菌细胞中找到的与外细胞膜 相连的碳水化合物)作为对抗胞内劳森菌的疫苗中的抗原，但实际上尚未测试和报道基于 杀灭的全细胞的疫苗能提供良好的保护。除此之外，由于通常的理解是对全身性给药抗原 来局部(即，在肠中)对抗胞内劳森菌不存在合理的期望，因此没有结合这些杀灭的细菌来 使用全身性给药。在这点上，注意到W097/20050 (Daratech PTY Ltd)提及了使用杀灭的胞内劳森菌 细菌来使猪免疫。然而，没有提及全身性给药。基于目前的支持，只在口服给药时，疫苗接 种才是有效的，通常理解口服途径是为Daratech申请中所述的实验选择的给药途径。另 一个提及杀灭细菌的专利申请是W02005/011731 (Boehringer Ingelheim)。然而，实际上 公开的只是使用了 口服给药的活疫苗。没有显示杀灭疫苗是有效的，也没有公开可以全身 性给药杀灭的疫苗。EP843818 (Boehringer Ingelheim)描述了肌内给药杀灭的疫苗(段 落
，结合段落
)，在段落W115]中，描述了通过在标准大气条件下储存在4°C下来杀灭细菌。然而，如通常所知的，在这样的条件下，胞内劳森菌细菌能够存活。因此， 这篇文献没有教导本发明的主题。还注意到含有碳水化合物的组合物从Kroll等是已知的 (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2005 年 6 月，693—699)，其中i亥碳水 化合物在活的胞内劳森菌中也能找到，与这些细胞的外细胞膜相连。然而，这种组合物是用 于诊断的。出于如上所述的原因，尚未测得其为保护性抗原。在一个实施方案中，含有碳水化合物的组合物是由胞内劳森菌细菌的杀灭产生的 材料。已经发现了非常方便的提供用于根据本发明使用的碳水化合物的方式是简单地杀灭 胞内劳森菌细胞并使用获自作为碳水化合物来源的材料。从活细胞提取碳水化合物在理 论上也是可行的(类似于通过除去细胞壁形成活的形骸细胞)，但需要更精密复杂的并因 此更昂贵的技术。该材料可以作为整体使用，例如，胞内劳森菌细胞的全细胞悬浮液或裂解 物，或可以从该材料中纯化或甚至分离出碳水化合物。可以通过使用相对简单的本领域已 知的技术来进行这种方法。在优选的实施方案中，含有碳水化合物的组合物含有杀灭的胞内劳森菌细菌的完 整细胞。已经证明了这是最方便用于提供碳水化合物作为疫苗中的抗原的方式。此外，甚 至可进一步提高疫苗的功效，可能是因为这种将抗原给予目标动物的免疫系统的方式可更 好地模拟碳水化合物的天然环境。在一个实施方案中，疫苗包含水包油型佐剂，其含有亚微米大小的油滴。通常，佐 剂是非特异性的免疫刺激剂。原则上，可以将在免疫事件的级联中能够促进或扩大特定的 过程并最终导致更好免疫应答(即，对抗原的综合身体应答，特别是通过淋巴细胞介导的 应答，并且通常涉及特定抗体或之前敏化的淋巴细胞对抗原的识别)的每种物质定义为佐 剂。已经显示出使用含有亚微米大小油滴的水包油型佐剂可提供非常好的对抗胞内劳森菌 的保护。实际上，水包油型佐剂这样结合非活性抗原的应用是常见的。然而，通常知道当油 滴直径大时获得最好的免疫刺激特性。特别是，当认为安全性是重要问题时，特别地使用具 有1微米以下直径的油滴。在这种情况下，可以使用小的液滴，因为已知这些引起较少的组 织损伤、临床病征等。然而，对于通过全身性疫苗接种获得肠道相关疾病保护(如本发明中 的情况)来说，可以选择大的液滴，因为期望免疫应答必须得到明显加强。相反，我们发现 了对于对抗胞内劳森菌的保护，在组合物中使用小的油滴可提供非常好的结果。在更优选的实施方案中，佐剂包含生物可降解油的液滴和矿物油的液滴，生物可 降解油的液滴的平均大小不同于矿物油的液滴的平均大小。已经显示出使用生物可降解油 和矿物油的混合物对于功效和安全性提供了非常好的结果。除此之外，组合物的稳定性非 常高，这是重要的经济优势。已经证明了稳定性是非常好的，特别是当生物可降解油液滴或 矿物油液滴的平均(容重)大小小于500nm(优选400nm)时。在一个实施方案中，疫苗进一步包含猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae) 和猪圆环病毒的抗原。迄今为止，现有技术中已经提出了胞内劳森菌的组合疫苗。然而，实 际上这些组合中没有多少的功效得到了测试。这种情况的原因在于通常理解为抗原与胞内 劳森菌抗原的组合只有当劳森菌抗原作为活(减毒)细胞提供时才能获得成功的保护。在 这点上，我们参考W02005/011731，其也提出了基于胞内劳森菌的所有种类的组合疫苗。然 而，关于该专利申请的说明书和权利要求结构，受让人(Boehringer Ingelheim)似乎确信 只有当劳森菌抗原以活细胞形式存在时才能期望组合疫苗具有合理的成功机会。这对于W02006/099561同样如此，受让人也是Boehringer Ingelheim)。实际上，基于普通常识，这 是显而易见的想法。使用以下实施例来进一步解释本发明。实施例1描述了获得基本上无蛋白质的含碳水化合物的组合物的方法以及使用 该组合物制得的疫苗。实施例2描述了一个实验，其中将根据本发明的第二种疫苗与目前市场上的疫苗 和含有胞内劳森菌亚基蛋白的实验疫苗进行比较。实施例3描述了一个实验，其中将根据本发明的两种不同的疫苗与目前市场上的 疫苗进行比较。实施例4描述了一个实验，其中确定了根据本发明的疫苗的剂量影响。实施例1在这个实施例中，描述了获得基本上无蛋白质的与胞内劳森菌细胞的外细胞膜相 连的碳水化合物组合物的方法以及可以使用这种组合物制得的疫苗。通常，碳水化合物是 含有碳、氢和氧的有机化合物，碳、氢和氧的比例通常为1 2 1。碳水化合物的实例是糖 (糖类)、淀粉、纤维素和树胶。通常，它们作为动物膳食中的主要能源。胞内劳森菌是革兰 氏阴性细菌，因此其含有不完全是由磷脂和蛋白质构成的外膜，而是外膜还含有碳水化合 物，特别是多糖(通常是如脂多糖、脂寡糖或甚至非脂多糖这样的多糖)。用于疫苗制备的碳水化合物级分取二十微升含有浓度为3.7E8( = 3. 7X IO8)细胞/ml的胞内劳森菌的缓冲水 (0. 04M PBS，磷酸盐缓冲的盐水)。通过将它们在100°C下保持10分钟来裂解细胞。将0. 04M PBS中的蛋白酶K(10mg/ml)加入，至1. 7mg/ml的终浓度。将该混合物在60°C下培养60分 钟，以降解所有蛋白质并保持碳水化合物完整。随后，将混合物在100°C下培养10分钟，以 灭活蛋白酶K。将所得到的材料在2-8°C下储存，直至进一步使用，所得到的材料是含有碳 水化合物的组合物，特别是含有存在于活的胞内劳森菌细菌中的与其外细胞膜相连的碳水 化合物(参见以下的段落)。将组合物配制于Diluvac forte佐剂中。这种佐剂(参阅EP 0382271)包括7. 5%重量的具有大约400nm的平均容重大小的醋酸维生素E液滴，液滴悬 浮于水中，并用0.5%重量的吐温80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)稳定。每微菌升疫苗含 有从1. 2E8胞内劳森菌提取的材料。劳森菌碳水化合物抗原的免疫沉淀根据标准程序，在室温下，用饱和的Na2SO4,将两批对抗胞内劳森菌完整细胞产生 的单克隆抗体(MoAb’s)进行沉淀。通过离心(10.000g，10分钟)将沉淀物沉淀。用20% Na2SO4洗涤沉淀物，并重悬浮于0. 04M PBS中。根据制造商的手册，用0. IM NaPO4(pH 7. 4) 预先洗涤酪氨酰(Tylosyl)激活的Dynal珠粒(DynaBeads，DK)。从每批MoAb，s取出 140 μ g，并加入到2E8预先洗涤过的珠粒中，并在37°C下培养过夜。通过离心沉淀珠粒并通 过抽吸上清液来除去未结合的MoAb’ s。分光光度计测量显示出20至35%加入的MoAb，s 已经与珠粒结合。将0. 04M PBS中的两批Iml胞内劳森菌细胞(3. 7E8/ml)超声波处理1分钟。将 所得到的细胞裂解物加入到酪氨酰激活的珠粒-单克隆复合物中，并在4°C下培养过夜。用 0. IM NaPO4(pH 7. 4)将酪氨酰激活的珠粒-单克隆复合物洗涤三次。以连续的方式，将珠粒在 0. 5ml 的 0. 04M PBS 中的 8M 脲(El) ；0. 5ml IOmM 甘氨酸 pH2. 5 (E2)；和 0. 5ml 50mM HCl (E3)中洗涤来洗脱结合的化合物。洗脱后，用100 μ 1和200 μ 1 IM Tris/HCl (pH 8. 0) 中禾口 E2禾口 E3。从每个步骤取样并装载于SDS-PAGE凝胶上。使用考马斯亮蓝(CBB)和银染将凝胶 染色或弄污。使用如上所述的相同MoAb’s来产生斑点。凝胶和斑点的观察显示出MoAb’s 识别具有21和24kDa表观分子量的条带，这些条带在CBB凝胶上未看到，但在银染的凝胶 上看到了。此外，确定了结合MoAb’s的细胞级分是蛋白酶K抗性的。因此，基于这些结果， 可以推断出该级分含有碳水化合物(即，所有蛋白被裂解了，并且超声波处理的DNA级分在 银染中没有作为清晰的条带显示出来)，并且碳水化合物与胞内劳森菌的外细胞膜(即对 抗这种级分产生的MoAb’s也识别完整的胞内劳森菌细胞)相连(即，形成其的一部分或与 其结合)。已知胞内劳森菌是革兰氏阴性细菌的事实，因此认为碳水化合物组合物包括多 糖。实施例2进行该实施例来测试在疫苗中配制碳水化合物抗原的方便方法，S卩，通过杀灭的 完整细胞(也称为菌苗)。作为对照，使用了可购得的疫苗Enterisol iieitis和包含 蛋白质亚基的实验亚基疫苗。接着，将未接种疫苗的动物用作对照。实施例2的实验设计如下制得灭活的完整细胞疫苗。收集源自患有PPE的猪的肠的活胞内劳森菌细 胞。用0.01%BPL(i3-丙内酯)将细胞灭活。所得到的材料，在本发明的意义上固有地是 非活性的含有碳水化合物的组合物(特别是因为它含有存在于活胞内劳森菌细菌中的与 外细胞膜相连的碳水化合物)，将其以大约2. 8 X IO8细胞/ml疫苗的浓度配制于Diluvac forte佐剂中(参见实施例1)。亚基疫苗含有重组Ρ1Λ和P4，如从EP1219711中所知的(分别为19/21和37kDa 蛋白)，并且该重组蛋白通过基因5074、4320和5464来表达，如W02005/070958中所述。将 蛋白质配制于Diluvac forte佐剂中。疫苗含有大约50 μ g每种蛋白/微升。使用了四十六周大的SPF猪。将猪分成4组，每组十头猪。根据制造商的说明，组 1 口服接种一次(T = (m)2ml “Enter i sol ileitis”(Boehringer Ingelheim)。组 2和组3肌内接种两次(在T = O和T = 4周时)，分别接种2ml如上所述的灭活劳森菌完 整细胞疫苗和重组亚基组合疫苗。组4留着作为未接种的对照。在T = 6周时，所有的猪 用均质的胞内劳森菌感染的粘膜口服激发。随后，每日观察所有猪的猪增生性肠病(PPE) 的临床病征。在激发之前和之后，以规则的时间，从猪取样血清血液(用于血清学)和粪便 (用于PCR)。在T = 9周时，将所有猪安乐死并进行尸检。获取回肠的组织学样品并通过 显微镜进行检查。从感染的粘膜制备激发接种物将500克感染的粘膜(从感染的肠刮下来的)与 500ml生理盐水混合。将该混合物在通用勻浆器中在冰上全速均质一分钟。在T = 6周时， 用20ml激发接种物口服激发所有猪。在T = 0、4、6、7、8和9w时，获取每只猪的粪便样品(克含量)和血清血样并冷冻 储存直至测试。在定量PCR(Q-PCR)中测试粪便样品并表示为以皮克(pg)计的量的对数。 在常用的IFT测试(检测对抗血清中完整胞内劳森菌细菌的抗体的免疫荧光抗体测试)中测试血清样品。对于组织学评分，获取回肠的相关样品，在4%缓冲的福尔马林中固定，常规 包埋并切片。用苏木精-曙红(HE染色)和使用抗胞内劳森菌单克隆抗体的免疫组织化学 染色(IHC染色)将这些切片染色。通过显微镜检查这些切片。组织学评分如下HE染色
未检测到异常分:=0
可疑损伤分:=1/2
轻微损伤分:=1
中度损伤分:=2
严重损伤分:=3
IHC染色
无明显的胞内劳森菌细菌分:=0
可疑的细菌存在分:=1/2
切片中存在单个/少量细菌分·改=1
切片中存在中等数量的细菌分:=2
切片中存在大量细菌分:=3
单独记录每只猪的所有数据。按照激发后不同参数的阳性动物的平均值来计算每
组的分数。使用非参数Marm-Whitney U测试来评价统计学显著性(双侧检验的并将显著 性水平设定为0. 05)。实施例2的结果血清学在第一次接种之前，测试IFT抗体滴度时，所有猪是血清反应阴性的。用完整细 胞菌苗(组2)接种疫苗后，猪产生了高IFT抗体滴度，而对照和接种亚基疫苗的猪仍然是 阴性的，直至激发(表1)。接种Enterisol 的猪(组1)中的两只产生了中等的ift滴 度，而该组中的所有其他猪保持血清反应阴性。激发后，所有猪产生了高ift抗体滴度。表 1中描述了平均结果(使用所用的稀释度，1.0是下侧的检测水平)。表1.接种和激发后猪血清的平均IFT抗体滴度(21og)
组T = O周T = 4周Τ = 6周Τ = 9周1< 1. 01. 11. 7> 11. 42< 1. 03. 7> 11. 8> 12. 03< 1. 0< 1. 0< 1. 0> 11. 64< 1. 0< 1. 0< 1. 0> 12. 0粪便样品的实时PCR在激发之前，所有粪便样品是阴性的。激发后，在所有组中发现了阳性反应。组 1 (P = 0. 02)、组2 (ρ = 0. 01)和组3 (ρ = 0. 03)与对照相比较，具有明显较低的泄出水平。 表2中给出了激发后的概述。
表2.接种和激发后粪便样品的PCR平均结果(log pg)
权利要求
1.非活性的含有碳水化合物的组合物的用途，该碳水化合物在活的胞内劳森菌细胞中 也能找到，与这些细胞的外细胞膜相连，该组合物用于制造抵抗胞内劳森菌感染的疫苗，该 疫苗是适于全身给药的形式。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于含有碳水化合物的组合物是从杀灭胞内劳森菌 细菌获得的材料。
3.根据权利要求2的用途，其特征在于含有碳水化合物的组合物含有杀灭的胞内劳森 菌细菌的完整细胞。
4.根据在前任一项权利要求的用途，其特征在于所述疫苗包含水包油型佐剂，该佐剂 含有亚微米大小的油滴。
5.根据权利要求4的用途，其特征在于所述佐剂包含生物可降解油的液滴和矿物油的 液滴，生物可降解油的液滴的平均大小不同于矿物油的液滴的平均大小。
6.根据在前任一项权利要求的用途，其特征在于所述疫苗进一步包含猪肺炎支原体和 猪圆环病毒的抗原。
7.非活性的含有碳水化合物的组合物，该碳水化合物在活的胞内劳森菌细胞中也能找 到，与这些细胞的外细胞膜相连，该组合物用于制造抵抗胞内劳森菌感染的疫苗，该疫苗是 适于全身给药的形式。
全文摘要
本发明涉及非活性的含有碳水化合物的组合物的用途，该碳水化合物在活的胞内劳森菌细胞中也能找到，与这些细胞的外细胞膜相连，该组合物用于制造抵抗胞内劳森菌感染的疫苗，该疫苗是适于全身给药的形式。
文档编号A61K39/106GK102006883SQ200980113679
公开日2011年4月6日 申请日期2009年4月16日 优先权日2008年4月18日
发明者A·A·C·雅各布斯, C·C·施里尔, P·维尔梅吉, R·P·A·M·塞吉尔斯 申请人:英特威国际有限公司
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