寡肽化合物及其应用的制作方法
专利名称：寡肽化合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型试剂、药物组合物及其在治疗中的应用，特别是希望或有利于 减少或防止细胞增生或生长的任意治疗(例如在快速增生性疾病或者事实上任何需要或 响应细胞抑制治疗的病况的治疗中)。本发明基于增生性细胞核抗原(PCNA)和参与 DNA修复、维护和细胞周期调控的各种蛋白的新型相互作用的鉴定以及随后对负责所述 相互作用的新型五肽基序(称为APIM)的鉴定。因此，更具体而言，本发明涉及包含所 述基序并且能够与PCNA相互作用的肽及其模拟物、包含所述试剂的药物组合物、以及 所述试剂在治疗特别是涉及如上所述的减少或防止细胞增生的治疗中的应用。本发明还 提供治疗方法，所述方法包括包含PCNA相互作用基序的试剂的使用(优选与细胞抑制剂 (cytostatic agent)联合使用)。
背景技术：
人类和动物细胞暴露于各种导致DNA损伤的因素，例如反应性氧物质、紫外 光、X射线和内源性或外源性细胞抑制剂。细胞抑制剂是例如通过损伤DNA或通过干扰细胞复制机制来抑制或压制细胞生 长和/或增殖(增生/复制)的试剂。烷基化剂是一类细胞抑制剂，其中的一些用于临 床目的或用于研究目的。烷基化剂通过改变N或O原子的碱基来导致DNA损伤。这类损伤取决于试剂 的类型，很多试剂导致特异性DNA修饰。DNA损伤包括可能导致复制过程中编码错误 和/或复制阻断然后双链断裂或跨损伤合成的烷基化加合和链间交联。人类和动物细胞具有各种DNA修复系统，包括碱基切除修复、核苷酸切除修复 和错配修复。一个例子是人类DNA氧化性脱甲基酶hABH2，其通过氧化性脱甲基化而 将3-甲基胞嘧啶(3meC)转化为胞嘧啶和将1_甲基腺嘌呤(ImeA)转化为腺嘌呤。DNA修复和经细胞周期调控的DNA复制之间的密切配合对于基因组完整性是关 键的。重要的是，在损伤存在的情况下，DNA修复停止，直到所述损伤修复为止，否则 会产生变异并繁衍。已知同时参与DNA复制和DNA修复的一种蛋白是增生性细胞核抗 原(PCNA)。PCNA是滑动夹(sliding clamp)蛋白家族的成员，其从细菌到高级真核动物在功 能性上得到保留，并且它的主要功能是提供具有基因组复制所需的高持续合成性的复制 性聚合酶。在活的S期细胞中，以绿色荧光蛋白(GFP)标记的PCNA形成呈现出复制位 点的明确位点(foci)。因此它能够用作S期标记。参与细胞过程(例如DNA修复、染色质装配、后成重构和染色质重构、姐妹染 色单体粘连、细胞周期控制和存活)很多蛋白位于含有超过十二个复制叉的所谓复制工 厂中。这些蛋白中有很多蛋白通过保守PCNA相互作用肽序列(称为PIP盒(QxxL/1/ MxxF/DF/Y)，其中χ可以是任意氨基酸)与PCNA相互作用。使用肽展示文库确认了 一种称为KAx盒的替代性PCNA结合基序，但是该基序对体内PCNA相互作用的重要性
8还没有得到证实。各种蛋白与PCNA相互作用，并且这些蛋白中的一些蛋白包括hABH2已经显示 出与PCNA共同位于复制位点中。然而，共定位本身并没有意味着共定位蛋白之间的有 任何直接或间接的相互作用。实际上，hABH2中PCNA结合基序(例如PIP盒或KAx 盒)缺失说明hABH2不与PCNA相互作用。
发明内容
在导致本发明的工作中，本发明人惊讶地发现，各种蛋白通过一种新型PCNA 相互作用基序与PCNA相互作用。在作为这些蛋白之一的hABH2中，该基序位于N末 端。本发明人确定该基序与PCNA的相互作用是必要和充分的(参见实施例1)。如下文实施例中所更为详细的说明，为了探讨该PCNA相互作用基序在烷基 化损伤的DNA修复中的功能，将表达包含该基序的重组肽的细胞系暴露于各种剂量的 MMS (甲磺酸甲酯)中，所述MMS是导致形成3-甲基胞嘧啶和1-甲基腺嘌呤的SN2烷 基化剂。发现包含该基序的重组肽的表达使细胞对MMS导致的DNA损伤敏感，表明包 含该基序的重组肽竞争性抑制PCNA与hABH2之间的相互作用。还测试了包括导致其他类型DNA损伤的BCNU、替莫唑胺(TZM)和丝裂霉素 c(MMC)在内的其他试剂，令人非常惊讶的是，本发明人发现包含该基序的重组肽也使 细胞对由这些试剂导致的损伤敏感。这是完全没有预料到的，因为BCNU是O6-氯乙 基化剂，其主要导致链间交联以及一些单碱基环加合物(1，N(6)乙醛腺嘌呤)，据报道 TZM是O6G甲基化剂，而MMC导致通过CpG中的鸟嘌呤的N-烷基化而引起链间交联， 并且hABH2没有修复这些类型的DNA损伤。相反，存在其它修复这类损伤的酶，例如 由TZM导致的损伤直接为O6-甲基鸟嘌呤-DNA转移酶(MGMT)所修复。这些发现表 明包含该基序的重组肽并非仅抑制hABH2与PCNA之间的相互作用，而可能涉及到其他 蛋白，即其他蛋白可能通过该新型基序与PCNA相互作用。本发明人还发现，除了在来自ABH2敲除小鼠(即不具有ABH2的小鼠)的细胞 系观察到的以外，包含该基序的重组肽的表达还增加了细胞抑制剂(具有MMS特异性) 的细胞毒性效应，进一步表明包含该基序的重组肽具有更宽泛的效果，很可能抑制除了 hABH2之外的其他蛋白。这些令人惊讶的发现使得本发明人提出包含PCNA结合基序的肽的治疗应用。本发明的所述新型PCNA结合基序(称为APIM)已经得到表征并且定义如下X1X2X3X3' X1- (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3,独立选 自不带电荷的氨基酸组，优选非极性氨基酸。能够与PNCA相互作用的肽(或寡肽化合物)可能含有或包含这种肽(或序列) 基序。因此，本文公开了一种能够与PNCA相互作用并包含这种基序的寡肽化合物，该 寡肽化合物可以代表本发明的某些方面。例如，在一个实施方式中，本发明可以提供了一种寡肽化合物，所述寡肽化合 物能够与PCNA相互作用并且包含基序X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1, 独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而独立选自不带电荷的氨基酸
9组，优选非极性氨基酸，其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个⑴所述寡肽化合物包含至少11个氨基酸或等效亚基；GDx2F是苯丙氨酸；(iii)所述寡肽化合物包含至少一个D-氨基酸；(iv)所述寡肽化合物包含至少一条信号序列，S卩，将所述寡肽化合物导向特定 位置的序列，例如导向细胞中的序列(例如将所述寡肽化合物导入细胞的细胞穿透序列) 和/或导入特定细胞腔室的序列(例如将所述寡肽化合物导入核中的核定位信号)；和(iv)所述寡肽化合物包含基序[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID NO 27)。具体而言，在这个实施方式中，所述寡肽化合物包含核定位信号序列。在另一 个实施方式中，所述寡肽化合物包含细胞穿透序列(细胞穿透肽)。在另外一个实施方式 中，所述寡肽化合物包含细胞穿透序列和核定位序列。因此可见，在此类实施方式中，本发明的化合物可以采取含有(即包含)包含如 上所限定的PCNA相互作用基序和至少一个信号序列的寡肽化合物的构建体形式。因此 可见，在这个方面，本发明提供了一种构建体，所述构建体包含能够与PCNA相互作用 并且包含基序X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)以及至少一条信号序列的构建体，其中X1 和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不带电荷的氨 基酸组且优选非极性氨基酸。如上所述，已经确定本发明的新型基序介导含有所述基序的寡肽化合物(例如 肽)或蛋白与PCNA的相互作用。所述相互作用可以直接或间接地参与该基序与PCNA的直接结合，或者该基 序可以间接结合，例如结合可以由其他分子介导。因此，述及“PCNA相互作用”或
“PCNA结合”可以包括任意形式的相互作用，并且包括直接和间接结合。本文中任意述及“基序”的情况应当理解为是指此处所限定的X1X2X3X3, X1,。优选的是，XjPX1,独立选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、鸟氨酸 (Om)、甲基赖氨酸(MeK)和乙酰基赖氨酸(AcK)，更优选的是K、R和H，或者K和 R。X2优选为芳香族氨基酸，更优选的是，X2选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪 氨酸(Y)、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、叔丁基苯丙氨酸、联苯基丙氨酸和三叔丁基 色氨酸(在某些实施方式中，该列表可能排除F)，具体而言为F、W和Y，或者W和 Y，F和Y，或者F和W，或者在一些具体实施方式
中，X2可以是F、或W或Y。X3和X3,优选为脂肪族氨基酸，并且可以例如独立选自亮氨酸(L)、异亮氨酸 ⑴、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)和正亮氨酸(Nor)。优选的是，X3和X3,不同时为A，更优选的是，X3和X3,选自L、I、V和M， 进一步优选选自L、I和V。在某些实施方式中，所述基序与PCNA的结合在X2为W或Y时可以得到改善。 因此，在一个实施方式中，X2不是F。在其他一些实施方式中，如上所述，X2可以是 F。因此，本发明可以提供一种寡肽化合物，所述寡肽化合物包含基序[K/R]_[F/ Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R](SEQ ID NO 28)，其中所述寡肽化合物能够与PCNA相互作用。在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID NO 29)。在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID NO 30)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID NO 31)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID NO 32)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID NO 33)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID NO 34)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID NO 35)；在又一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID NO 36)；或在又一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-F-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID NO 37)。所述寡肽化合物优选为经分离的化合物。在一个优选的实施方式中，所述化合物具有或包含序列RFLVK(SEQ ID NO: 2)。在其他优选实施方式中，所述寡肽化合物具有或包含选自以下序列的序 列KFLLR (SEQ ID NO 3)、KYLLR (SEQ ID NO 4)、KWLLR (SEQ ID NO
5)、KYILR (SEQ ID NO 6)、KYVLR (SEQ ID NO 7)
RYLLR (SEQ ID NO RYVLR (SEQ ID NO RWLMR (SEQ ID NO RWLVK (SEQ ID NO RWIVK (SEQ ID NO RYVVK (SEQ ID NO
.RFLLR (SEQ ID NO 8)、 RYILR (SEQ ID NO 11)、 RYLVR (SEQ ID NO 14) RYVIR (SEQ ID NO 17)、 RWLIK (SEQ ID NO 20)、 RWAVK (SEQ ID NO 23)、
9)、RWLLR (SEQ ID NO 10)、 12)、RFLIR (SEQ ID NO 13). 15)、RYVLR (SEQ ID NO 16)、 18)、RYLVK (SEQ ID NO 19)、 21)、RWVVK (SEQ ID NO 22)、
24)、RYLIK (SEQ ID NO 25)或 RYLMK (SEQ ID NO 26)。这
些具体序列通过举例方式列出，但是它们并非旨在限定本发明的范围。在一个优选的实施方式中，本发明寡肽化合物还包含将所述基序靶向特定细胞 类型、有助于该化合物进入细胞、和/或将所述化合物定位于特定的胞内腔室(优选为细 胞核)的信号序列。因此，所述信号序列可以被看作是任何起到将所述寡肽化合物定位或换言之导 向、转运或运输到任何所需位置(例如，任何所需的细胞位置或亚细胞位置)的作用的序 列。在一些优选的实施方式中，所需位置是细胞(即细胞内部)和/或细胞核。因此，所述信号序列可以是起到将所述寡肽化合物运输到细胞中或者跨越细胞 膜(即进入细胞内部)的作用的序列。因此，所述信号序列可以是一条所谓的“细胞穿
11透”序列(或者更具体地称为“细胞穿透肽”)，在本领域中也称为蛋白转导域(PTD) 或蛋白转导序列。因此，如上所述，本发明的一个优选的实施方式是一种构建体，所述构建体包 含G)包含如本文所限定的APIM基序(即PCNA相互作用基序)的寡肽化合物，和(ii) 细胞穿透序列(更具体而言是细胞穿透肽)。细胞穿透肽(CPP)技术在近10年发展很快，已知有很多细胞穿透肽并且在很 多文献中有描述，实际上，许多此类肽可以商购获得。细胞穿透肽在尺寸、序列和电荷 上、实际上是在它们的作用机制(对于一些肽目前还未知，而对于其它肽目前还没有充 分阐明)上可以有很大变化，但是都具有跨越细胞质膜并将所连接或联合的部分(所谓的
“货物”)输送到细胞质中、甚至在一些情况中输送至细胞核中的共同能力。因此，CPP 是基于肽的输送载体。CPP可以衍生自天然存在的能够转运跨越细胞膜的蛋白(例如果蝇同源异型框蛋 白触足蛋白(Anteraiapedia)(—种转录因子))、病毒蛋白(例如HIV-I转录因子TAT以及 来自HSV-I的衣壳蛋白VP22)，或者它们可以源自合成，例如来自嵌合蛋白或合成多肽 (例如多精氨酸)。如上所述，负责转导效应的机制不是单一的，因此CPP的设计可以 基于不同的结构和序列。细胞穿透肽可以参阅Jarver等，2006，Biochimica et Biophysica Actal758,第260-263页，并且下表2列出了各种代表性肽。US 6,645,501进一步描述了 各种可以使用的细胞穿透肽。表2
CPP序列参考文献Antp分类穿透素RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 38)Boltoii (2000) Eur. L Neuro. 12:287
1权利要求
1.一种在治疗中使用的寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作 用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3' Xi' (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
2.—种在希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗或者涉及细胞抑制治疗的治疗中使 用的寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子 包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3' Xi' (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
3.—种寡肽化合物或核酸分子在药物制备中的应用，所述寡肽化合物包含PCNA相 互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，所述药物用于希望抑制细 胞生长的病症或病况的治疗中或者用于涉及细胞抑制治疗的治疗中，其中，所述PCNA 相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸 组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
4.一种希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗方法或涉及细胞抑制治疗的治疗方 法，所述方法包括对需要治疗的受试对象施用寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物 包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述 PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨 基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个ω所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述 PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含寡肽化合物或核酸分子和至少一种药用可 接受的载剂或赋形剂，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编 码所述寡肽化合物的序列，其中PCNA结合基序是X1X2X3X3' Xi' (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个ω所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述 PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述药物组合物以适合于以下施用方式的形 式提供口服、肠胃外、局部、直肠、生殖器、皮下、经尿道、经皮、鼻内、腹腔内、 肌内和/或静脉内施用和/或吸入施用。
7.如权利要求1 6中任一项所述的寡肽化合物、应用、方法或药物组合物，其中所 述寡肽化合物为进一步包含核定位信号序列和/或细胞穿透信号序列的构建体形式。
8.如权利要求7所述的寡肽化合物、应用、方法或药物组合物，其中所述构建体包含 核定位信号序列和细胞穿透信号序列。
9.一种检测、诊断或监测希望抑制细胞生长的病症或病况的方法，所述方法包括检 测含有PCNA相互作用基序的蛋白的表达水平和/或位置，其中所述蛋白的异常水平和/ 或位置指征所述病症或病况，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO: 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
10.一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核 酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是 X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；和(ii)细胞抑制剂。
11.一种产品，所述产品包含作为联合制剂的如下物质(i)寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核 酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是 X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；和(ii)细胞抑制剂，所述联合制剂同时、依次或分开用于希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗或涉及 细胞抑制治疗的治疗。
12.—种寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物或核酸分子与细胞抑制剂在希望抑 制细胞生长的病症或病况的治疗或涉及细胞抑制治疗的治疗中联合使用，所述寡肽化合 物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列， 其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
13.一种寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物或核酸分子在放射性治疗、优选为 希望抑制细胞生长的病症或病症的治疗或涉及放射性治疗的治疗中用作敏化剂，所述寡 肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的 序列，其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
14.一种体外分析方法，所述方法包括对细胞或细胞培养物施用寡肽化合物或核酸分 子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互 作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
15.一种脂质体，所述脂质体包含(i)寡肽化合物，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序；和/或(ii)核酸分子，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列；其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
16.如权利要求1 15中任一项所述的寡肽化合物、应用、方法、药物组合物、试剂 盒、产品或脂质体，其中所述核酸分子包含在载体中。
17.—种能够与PCNA相互作用的寡肽化合物，所述化合物包含基序 X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨 基酸，而X3和X3,独立选自不带电荷的氨基酸组，其中所述寡肽化合物的进一步特征在 于以下至少一个ω所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述 PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)，并且所述寡肽化合物包含至少11个氨基酸或等效亚基。
18.—种核酸分子，所述核酸分子编码具有或包含PCNA相互作用基序的肽，所述 PCNA相互作用基序的序列为X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；并且其中所述肽的进一步特征在于以下至少一个(i)所述肽包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
19.一种载体，所述载体包含权利要求18所述的核酸分子。
20.如权利要求1 19中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中，X2是芳香族氨 基酸和/或X3和X3,是脂肪族氨基酸。
21.如权利要求1 20中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中独立选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、鸟氨酸(Orn)、甲基赖氨 酸(MeK)和乙酰基赖氨酸(AcK)；和/或X2选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、叔 丁基苯丙氨酸、联苯基丙氨酸和三叔丁基色氨酸；和/或独立选自亮氨酸(L)、异亮氨酸⑴、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸 (M)和正亮氨酸(Nor)。
22.如权利要求1 21中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中，X2不是F。
23.如权利要求1 22中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中，所述PCNA相 互作用基序是[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID N0.28)； [K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID N0.29)； [K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A]-[L/V/A]-[K/R] (SEQ ID N0.30)； [K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID N0.31)； [K/R]-[F/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID N0.32)； [K/R]-[F/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID N0.33)； [K/R]-[F/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID N0.34)； [K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID N0.35)； [K/R]-[Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID N0.36)；或 [K/R]-F-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID N0.37)。
24.如权利要求1 23中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法或药物组合物，其中，所述PCNA相互作用基序具有如SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25 或 26所示的序列。
25.如权利要求1 6以及9 24中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、 应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物包含信号序 列。
26.如权利要求25所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、 试剂盒、产品或脂质体，其中，所述信号序列是核定位信号序列和/或细胞穿透信号序 列。
27.如权利要求7、8或26中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方 法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述细胞穿透信号序列是HIV-TAT或 穿透素或其片段或衍生物。
28.如权利要求1 27中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、 药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物和/或核酸分子与细胞抑 制剂联合、同时、分开或依次使用。
29.如权利要求1 28中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、 药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物是融合蛋白或适体的一部分。
30.如权利要求1 29中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、 药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物包含至少1、2、3、4或5 个D-氨基酸、至少1、2、3、4或5个非编码氨基酸、至少1、2、3、4或5个二氨基酸 和/或至少1、2、3、4或5个β-氨基酸。
31.如权利要求1 30中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、 药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物包含至少5个并且不超过 200个亚基。
32.如权利要求1 31中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含至少15个 核苷酸并且不超过 800、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、 150、100或50个核苷酸。
33.如权利要求10 16或20 32中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、 应用、方法、药物组合物、试剂盒或产品，其中，所述细胞抑制剂选自放线菌素D、 BCNU(卡莫司汀)、卡钼、CCNU、喜树碱(CPT)、斑蝥素、顺钼、环磷酰胺、阿糖胞 苷、达卡巴嗪、柔红霉素、多烯紫杉醇、阿霉素、DTIC、表阿霉素、依托泊苷、吉非 替尼、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、伊屋诺霉素、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素 C(MMC)、米托蒽醌、巯基嘌呤、奥沙利钼、紫杉醇(他克唑)、PARP-I抑制剂、泰 索帝、替莫唑胺(TZM)、替尼泊甙、托泊替康、曲奥舒凡、长春瑞滨、长春新碱、长春 碱、5-氮胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷和5-氟尿嘧啶。
34.如权利要求10 16或20 32中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、 应用、方法、药物组合物、试剂盒或产品，其中，所述细胞抑制剂是烷基化剂。
35.权利要求1 34中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药 物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其用于快速增生性病症的治疗或骨髓细胞清除术。
36.如权利要求35所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、 试剂盒、产品或脂质体，其中，所述快速增生性病症选自恶性、恶化前或非恶性的赘生 性疾病、炎症、自身免疫性病症、血液病、皮肤病、病毒诱导性快速增生性病症、骨髓 异变病症或骨髓增生性病症。
37.如权利要求36所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、 试剂盒、产品或脂质体，其中，所述快速增生性病症选自癌症、良性肿瘤、银屑病关节 炎、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、银屑病、瑞特综合征、毛发红糠疹、角质化病症 的快速增生性变型、再狭窄、糖尿病性肾病、甲状腺增生、格雷夫氏病、良性前列腺增 生、李-氟诺门提综合征、糖尿病性视网膜病变、周围性血管疾病、原位宫颈癌、家族 性结肠息肉病、口腔粘膜白斑病、组织细胞增多病、瘢痕疙瘩、血管瘤、快速增生性动 脉狭窄、炎性关节炎、表皮角化病、包括关节炎、疣和EBV诱导性疾病在内的丘疹鳞屑 性出疹、瘢痕形成、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE ；狼疮)、重症肌无力、非恶性 增生、肉芽肿、MGUS (重要性未知的单克隆丙种球蛋白病)、赘生性脑膜炎、真性红细 胞增多症、硬化性黏液水肿、疹性黏蛋白沉积症、淀粉样变性和韦格纳肉芽肿。
38.一种用于诊断希望抑制细胞生长的病症或病况的试剂盒，所述试剂盒包含对 PCNA相互作用基序具有特异性的抗体及其用于诊断所述病症或病况的使用说明书以及可选的检测底物，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
全文摘要
本发明提供了一种在治疗中使用的寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO1)，其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)。特别是，所述治疗可以是其中希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的治疗，或者涉及细胞抑制治疗(例如骨髓细胞清除)的治疗。在某些方面，本发明的化合物就其性质可以用作细胞抑制剂。在本发明的其他方面，包含所述基序的寡肽化合物可以与细胞抑制剂联合使用，或者与放射性治疗联合使用。
文档编号A61K38/17GK102015758SQ200980114258
公开日2011年4月13日 申请日期2009年2月20日 优先权日2008年2月22日
发明者佩尔·阿恩·阿斯, 玛丽特·奥特雷, 艾玛道丁·菲兹 申请人:Apim治疗学公司
技术领域：
本发明涉及新型试剂、药物组合物及其在治疗中的应用，特别是希望或有利于 减少或防止细胞增生或生长的任意治疗(例如在快速增生性疾病或者事实上任何需要或 响应细胞抑制治疗的病况的治疗中)。本发明基于增生性细胞核抗原(PCNA)和参与 DNA修复、维护和细胞周期调控的各种蛋白的新型相互作用的鉴定以及随后对负责所述 相互作用的新型五肽基序(称为APIM)的鉴定。因此，更具体而言，本发明涉及包含所 述基序并且能够与PCNA相互作用的肽及其模拟物、包含所述试剂的药物组合物、以及 所述试剂在治疗特别是涉及如上所述的减少或防止细胞增生的治疗中的应用。本发明还 提供治疗方法，所述方法包括包含PCNA相互作用基序的试剂的使用(优选与细胞抑制剂 (cytostatic agent)联合使用)。
背景技术：
人类和动物细胞暴露于各种导致DNA损伤的因素，例如反应性氧物质、紫外 光、X射线和内源性或外源性细胞抑制剂。细胞抑制剂是例如通过损伤DNA或通过干扰细胞复制机制来抑制或压制细胞生 长和/或增殖(增生/复制)的试剂。烷基化剂是一类细胞抑制剂，其中的一些用于临 床目的或用于研究目的。烷基化剂通过改变N或O原子的碱基来导致DNA损伤。这类损伤取决于试剂 的类型，很多试剂导致特异性DNA修饰。DNA损伤包括可能导致复制过程中编码错误 和/或复制阻断然后双链断裂或跨损伤合成的烷基化加合和链间交联。人类和动物细胞具有各种DNA修复系统，包括碱基切除修复、核苷酸切除修复 和错配修复。一个例子是人类DNA氧化性脱甲基酶hABH2，其通过氧化性脱甲基化而 将3-甲基胞嘧啶(3meC)转化为胞嘧啶和将1_甲基腺嘌呤(ImeA)转化为腺嘌呤。DNA修复和经细胞周期调控的DNA复制之间的密切配合对于基因组完整性是关 键的。重要的是，在损伤存在的情况下，DNA修复停止，直到所述损伤修复为止，否则 会产生变异并繁衍。已知同时参与DNA复制和DNA修复的一种蛋白是增生性细胞核抗 原(PCNA)。PCNA是滑动夹(sliding clamp)蛋白家族的成员，其从细菌到高级真核动物在功 能性上得到保留，并且它的主要功能是提供具有基因组复制所需的高持续合成性的复制 性聚合酶。在活的S期细胞中，以绿色荧光蛋白(GFP)标记的PCNA形成呈现出复制位 点的明确位点(foci)。因此它能够用作S期标记。参与细胞过程(例如DNA修复、染色质装配、后成重构和染色质重构、姐妹染 色单体粘连、细胞周期控制和存活)很多蛋白位于含有超过十二个复制叉的所谓复制工 厂中。这些蛋白中有很多蛋白通过保守PCNA相互作用肽序列(称为PIP盒(QxxL/1/ MxxF/DF/Y)，其中χ可以是任意氨基酸)与PCNA相互作用。使用肽展示文库确认了 一种称为KAx盒的替代性PCNA结合基序，但是该基序对体内PCNA相互作用的重要性
8还没有得到证实。各种蛋白与PCNA相互作用，并且这些蛋白中的一些蛋白包括hABH2已经显示 出与PCNA共同位于复制位点中。然而，共定位本身并没有意味着共定位蛋白之间的有 任何直接或间接的相互作用。实际上，hABH2中PCNA结合基序(例如PIP盒或KAx 盒)缺失说明hABH2不与PCNA相互作用。
发明内容
在导致本发明的工作中，本发明人惊讶地发现，各种蛋白通过一种新型PCNA 相互作用基序与PCNA相互作用。在作为这些蛋白之一的hABH2中，该基序位于N末 端。本发明人确定该基序与PCNA的相互作用是必要和充分的(参见实施例1)。如下文实施例中所更为详细的说明，为了探讨该PCNA相互作用基序在烷基 化损伤的DNA修复中的功能，将表达包含该基序的重组肽的细胞系暴露于各种剂量的 MMS (甲磺酸甲酯)中，所述MMS是导致形成3-甲基胞嘧啶和1-甲基腺嘌呤的SN2烷 基化剂。发现包含该基序的重组肽的表达使细胞对MMS导致的DNA损伤敏感，表明包 含该基序的重组肽竞争性抑制PCNA与hABH2之间的相互作用。还测试了包括导致其他类型DNA损伤的BCNU、替莫唑胺(TZM)和丝裂霉素 c(MMC)在内的其他试剂，令人非常惊讶的是，本发明人发现包含该基序的重组肽也使 细胞对由这些试剂导致的损伤敏感。这是完全没有预料到的，因为BCNU是O6-氯乙 基化剂，其主要导致链间交联以及一些单碱基环加合物(1，N(6)乙醛腺嘌呤)，据报道 TZM是O6G甲基化剂，而MMC导致通过CpG中的鸟嘌呤的N-烷基化而引起链间交联， 并且hABH2没有修复这些类型的DNA损伤。相反，存在其它修复这类损伤的酶，例如 由TZM导致的损伤直接为O6-甲基鸟嘌呤-DNA转移酶(MGMT)所修复。这些发现表 明包含该基序的重组肽并非仅抑制hABH2与PCNA之间的相互作用，而可能涉及到其他 蛋白，即其他蛋白可能通过该新型基序与PCNA相互作用。本发明人还发现，除了在来自ABH2敲除小鼠(即不具有ABH2的小鼠)的细胞 系观察到的以外，包含该基序的重组肽的表达还增加了细胞抑制剂(具有MMS特异性) 的细胞毒性效应，进一步表明包含该基序的重组肽具有更宽泛的效果，很可能抑制除了 hABH2之外的其他蛋白。这些令人惊讶的发现使得本发明人提出包含PCNA结合基序的肽的治疗应用。本发明的所述新型PCNA结合基序(称为APIM)已经得到表征并且定义如下X1X2X3X3' X1- (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3,独立选 自不带电荷的氨基酸组，优选非极性氨基酸。能够与PNCA相互作用的肽(或寡肽化合物)可能含有或包含这种肽(或序列) 基序。因此，本文公开了一种能够与PNCA相互作用并包含这种基序的寡肽化合物，该 寡肽化合物可以代表本发明的某些方面。例如，在一个实施方式中，本发明可以提供了一种寡肽化合物，所述寡肽化合 物能够与PCNA相互作用并且包含基序X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1, 独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而独立选自不带电荷的氨基酸
9组，优选非极性氨基酸，其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个⑴所述寡肽化合物包含至少11个氨基酸或等效亚基；GDx2F是苯丙氨酸；(iii)所述寡肽化合物包含至少一个D-氨基酸；(iv)所述寡肽化合物包含至少一条信号序列，S卩，将所述寡肽化合物导向特定 位置的序列，例如导向细胞中的序列(例如将所述寡肽化合物导入细胞的细胞穿透序列) 和/或导入特定细胞腔室的序列(例如将所述寡肽化合物导入核中的核定位信号)；和(iv)所述寡肽化合物包含基序[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID NO 27)。具体而言，在这个实施方式中，所述寡肽化合物包含核定位信号序列。在另一 个实施方式中，所述寡肽化合物包含细胞穿透序列(细胞穿透肽)。在另外一个实施方式 中，所述寡肽化合物包含细胞穿透序列和核定位序列。因此可见，在此类实施方式中，本发明的化合物可以采取含有(即包含)包含如 上所限定的PCNA相互作用基序和至少一个信号序列的寡肽化合物的构建体形式。因此 可见，在这个方面，本发明提供了一种构建体，所述构建体包含能够与PCNA相互作用 并且包含基序X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)以及至少一条信号序列的构建体，其中X1 和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不带电荷的氨 基酸组且优选非极性氨基酸。如上所述，已经确定本发明的新型基序介导含有所述基序的寡肽化合物(例如 肽)或蛋白与PCNA的相互作用。所述相互作用可以直接或间接地参与该基序与PCNA的直接结合，或者该基 序可以间接结合，例如结合可以由其他分子介导。因此，述及“PCNA相互作用”或
“PCNA结合”可以包括任意形式的相互作用，并且包括直接和间接结合。本文中任意述及“基序”的情况应当理解为是指此处所限定的X1X2X3X3, X1,。优选的是，XjPX1,独立选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、鸟氨酸 (Om)、甲基赖氨酸(MeK)和乙酰基赖氨酸(AcK)，更优选的是K、R和H，或者K和 R。X2优选为芳香族氨基酸，更优选的是，X2选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪 氨酸(Y)、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、叔丁基苯丙氨酸、联苯基丙氨酸和三叔丁基 色氨酸(在某些实施方式中，该列表可能排除F)，具体而言为F、W和Y，或者W和 Y，F和Y，或者F和W，或者在一些具体实施方式
中，X2可以是F、或W或Y。X3和X3,优选为脂肪族氨基酸，并且可以例如独立选自亮氨酸(L)、异亮氨酸 ⑴、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)和正亮氨酸(Nor)。优选的是，X3和X3,不同时为A，更优选的是，X3和X3,选自L、I、V和M， 进一步优选选自L、I和V。在某些实施方式中，所述基序与PCNA的结合在X2为W或Y时可以得到改善。 因此，在一个实施方式中，X2不是F。在其他一些实施方式中，如上所述，X2可以是 F。因此，本发明可以提供一种寡肽化合物，所述寡肽化合物包含基序[K/R]_[F/ Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R](SEQ ID NO 28)，其中所述寡肽化合物能够与PCNA相互作用。在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID NO 29)。在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID NO 30)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID NO 31)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID NO 32)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID NO 33)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID NO 34)；在另一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID NO 35)；在又一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-[Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID NO 36)；或在又一个实施方式中，所述基序限定如下[K/R]-F-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID NO 37)。所述寡肽化合物优选为经分离的化合物。在一个优选的实施方式中，所述化合物具有或包含序列RFLVK(SEQ ID NO: 2)。在其他优选实施方式中，所述寡肽化合物具有或包含选自以下序列的序 列KFLLR (SEQ ID NO 3)、KYLLR (SEQ ID NO 4)、KWLLR (SEQ ID NO
5)、KYILR (SEQ ID NO 6)、KYVLR (SEQ ID NO 7)
RYLLR (SEQ ID NO RYVLR (SEQ ID NO RWLMR (SEQ ID NO RWLVK (SEQ ID NO RWIVK (SEQ ID NO RYVVK (SEQ ID NO
.RFLLR (SEQ ID NO 8)、 RYILR (SEQ ID NO 11)、 RYLVR (SEQ ID NO 14) RYVIR (SEQ ID NO 17)、 RWLIK (SEQ ID NO 20)、 RWAVK (SEQ ID NO 23)、
9)、RWLLR (SEQ ID NO 10)、 12)、RFLIR (SEQ ID NO 13). 15)、RYVLR (SEQ ID NO 16)、 18)、RYLVK (SEQ ID NO 19)、 21)、RWVVK (SEQ ID NO 22)、
24)、RYLIK (SEQ ID NO 25)或 RYLMK (SEQ ID NO 26)。这
些具体序列通过举例方式列出，但是它们并非旨在限定本发明的范围。在一个优选的实施方式中，本发明寡肽化合物还包含将所述基序靶向特定细胞 类型、有助于该化合物进入细胞、和/或将所述化合物定位于特定的胞内腔室(优选为细 胞核)的信号序列。因此，所述信号序列可以被看作是任何起到将所述寡肽化合物定位或换言之导 向、转运或运输到任何所需位置(例如，任何所需的细胞位置或亚细胞位置)的作用的序 列。在一些优选的实施方式中，所需位置是细胞(即细胞内部)和/或细胞核。因此，所述信号序列可以是起到将所述寡肽化合物运输到细胞中或者跨越细胞 膜(即进入细胞内部)的作用的序列。因此，所述信号序列可以是一条所谓的“细胞穿
11透”序列(或者更具体地称为“细胞穿透肽”)，在本领域中也称为蛋白转导域(PTD) 或蛋白转导序列。因此，如上所述，本发明的一个优选的实施方式是一种构建体，所述构建体包 含G)包含如本文所限定的APIM基序(即PCNA相互作用基序)的寡肽化合物，和(ii) 细胞穿透序列(更具体而言是细胞穿透肽)。细胞穿透肽(CPP)技术在近10年发展很快，已知有很多细胞穿透肽并且在很 多文献中有描述，实际上，许多此类肽可以商购获得。细胞穿透肽在尺寸、序列和电荷 上、实际上是在它们的作用机制(对于一些肽目前还未知，而对于其它肽目前还没有充 分阐明)上可以有很大变化，但是都具有跨越细胞质膜并将所连接或联合的部分(所谓的
“货物”)输送到细胞质中、甚至在一些情况中输送至细胞核中的共同能力。因此，CPP 是基于肽的输送载体。CPP可以衍生自天然存在的能够转运跨越细胞膜的蛋白(例如果蝇同源异型框蛋 白触足蛋白(Anteraiapedia)(—种转录因子))、病毒蛋白(例如HIV-I转录因子TAT以及 来自HSV-I的衣壳蛋白VP22)，或者它们可以源自合成，例如来自嵌合蛋白或合成多肽 (例如多精氨酸)。如上所述，负责转导效应的机制不是单一的，因此CPP的设计可以 基于不同的结构和序列。细胞穿透肽可以参阅Jarver等，2006，Biochimica et Biophysica Actal758,第260-263页，并且下表2列出了各种代表性肽。US 6,645,501进一步描述了 各种可以使用的细胞穿透肽。表2
CPP序列参考文献Antp分类穿透素RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 38)Boltoii (2000) Eur. L Neuro. 12:287
1权利要求
1.一种在治疗中使用的寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作 用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3' Xi' (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
2.—种在希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗或者涉及细胞抑制治疗的治疗中使 用的寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子 包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3' Xi' (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
3.—种寡肽化合物或核酸分子在药物制备中的应用，所述寡肽化合物包含PCNA相 互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，所述药物用于希望抑制细 胞生长的病症或病况的治疗中或者用于涉及细胞抑制治疗的治疗中，其中，所述PCNA 相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸 组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
4.一种希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗方法或涉及细胞抑制治疗的治疗方 法，所述方法包括对需要治疗的受试对象施用寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物 包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述 PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨 基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个ω所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述 PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含寡肽化合物或核酸分子和至少一种药用可 接受的载剂或赋形剂，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编 码所述寡肽化合物的序列，其中PCNA结合基序是X1X2X3X3' Xi' (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个ω所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述 PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述药物组合物以适合于以下施用方式的形 式提供口服、肠胃外、局部、直肠、生殖器、皮下、经尿道、经皮、鼻内、腹腔内、 肌内和/或静脉内施用和/或吸入施用。
7.如权利要求1 6中任一项所述的寡肽化合物、应用、方法或药物组合物，其中所 述寡肽化合物为进一步包含核定位信号序列和/或细胞穿透信号序列的构建体形式。
8.如权利要求7所述的寡肽化合物、应用、方法或药物组合物，其中所述构建体包含 核定位信号序列和细胞穿透信号序列。
9.一种检测、诊断或监测希望抑制细胞生长的病症或病况的方法，所述方法包括检 测含有PCNA相互作用基序的蛋白的表达水平和/或位置，其中所述蛋白的异常水平和/ 或位置指征所述病症或病况，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO: 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
10.一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核 酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是 X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；和(ii)细胞抑制剂。
11.一种产品，所述产品包含作为联合制剂的如下物质(i)寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核 酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是 X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；和(ii)细胞抑制剂，所述联合制剂同时、依次或分开用于希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗或涉及 细胞抑制治疗的治疗。
12.—种寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物或核酸分子与细胞抑制剂在希望抑 制细胞生长的病症或病况的治疗或涉及细胞抑制治疗的治疗中联合使用，所述寡肽化合 物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列， 其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
13.一种寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物或核酸分子在放射性治疗、优选为 希望抑制细胞生长的病症或病症的治疗或涉及放射性治疗的治疗中用作敏化剂，所述寡 肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的 序列，其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
14.一种体外分析方法，所述方法包括对细胞或细胞培养物施用寡肽化合物或核酸分 子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互 作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
15.一种脂质体，所述脂质体包含(i)寡肽化合物，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序；和/或(ii)核酸分子，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列；其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
16.如权利要求1 15中任一项所述的寡肽化合物、应用、方法、药物组合物、试剂 盒、产品或脂质体，其中所述核酸分子包含在载体中。
17.—种能够与PCNA相互作用的寡肽化合物，所述化合物包含基序 X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨 基酸，而X3和X3,独立选自不带电荷的氨基酸组，其中所述寡肽化合物的进一步特征在 于以下至少一个ω所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述 PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)，并且所述寡肽化合物包含至少11个氨基酸或等效亚基。
18.—种核酸分子，所述核酸分子编码具有或包含PCNA相互作用基序的肽，所述 PCNA相互作用基序的序列为X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中X1和X1,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而,独立选自不 带电荷的氨基酸组；并且其中所述肽的进一步特征在于以下至少一个(i)所述肽包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA 相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]_[K/R] (SEQ ID N0.27)。
19.一种载体，所述载体包含权利要求18所述的核酸分子。
20.如权利要求1 19中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中，X2是芳香族氨 基酸和/或X3和X3,是脂肪族氨基酸。
21.如权利要求1 20中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中独立选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、鸟氨酸(Orn)、甲基赖氨 酸(MeK)和乙酰基赖氨酸(AcK)；和/或X2选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、叔 丁基苯丙氨酸、联苯基丙氨酸和三叔丁基色氨酸；和/或独立选自亮氨酸(L)、异亮氨酸⑴、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸 (M)和正亮氨酸(Nor)。
22.如权利要求1 21中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中，X2不是F。
23.如权利要求1 22中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中，所述PCNA相 互作用基序是[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID N0.28)； [K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID N0.29)； [K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A]-[L/V/A]-[K/R] (SEQ ID N0.30)； [K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID N0.31)； [K/R]-[F/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R] (SEQ ID N0.32)； [K/R]-[F/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R] (SEQ ID N0.33)； [K/R]-[F/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID N0.34)； [K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID N0.35)； [K/R]-[Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID N0.36)；或 [K/R]-F-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R] (SEQ ID N0.37)。
24.如权利要求1 23中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方 法或药物组合物，其中，所述PCNA相互作用基序具有如SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25 或 26所示的序列。
25.如权利要求1 6以及9 24中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、 应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物包含信号序 列。
26.如权利要求25所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、 试剂盒、产品或脂质体，其中，所述信号序列是核定位信号序列和/或细胞穿透信号序 列。
27.如权利要求7、8或26中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方 法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述细胞穿透信号序列是HIV-TAT或 穿透素或其片段或衍生物。
28.如权利要求1 27中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、 药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物和/或核酸分子与细胞抑 制剂联合、同时、分开或依次使用。
29.如权利要求1 28中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、 药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物是融合蛋白或适体的一部分。
30.如权利要求1 29中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、 药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物包含至少1、2、3、4或5 个D-氨基酸、至少1、2、3、4或5个非编码氨基酸、至少1、2、3、4或5个二氨基酸 和/或至少1、2、3、4或5个β-氨基酸。
31.如权利要求1 30中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、 药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物包含至少5个并且不超过 200个亚基。
32.如权利要求1 31中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含至少15个 核苷酸并且不超过 800、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、 150、100或50个核苷酸。
33.如权利要求10 16或20 32中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、 应用、方法、药物组合物、试剂盒或产品，其中，所述细胞抑制剂选自放线菌素D、 BCNU(卡莫司汀)、卡钼、CCNU、喜树碱(CPT)、斑蝥素、顺钼、环磷酰胺、阿糖胞 苷、达卡巴嗪、柔红霉素、多烯紫杉醇、阿霉素、DTIC、表阿霉素、依托泊苷、吉非 替尼、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、伊屋诺霉素、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素 C(MMC)、米托蒽醌、巯基嘌呤、奥沙利钼、紫杉醇(他克唑)、PARP-I抑制剂、泰 索帝、替莫唑胺(TZM)、替尼泊甙、托泊替康、曲奥舒凡、长春瑞滨、长春新碱、长春 碱、5-氮胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷和5-氟尿嘧啶。
34.如权利要求10 16或20 32中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、 应用、方法、药物组合物、试剂盒或产品，其中，所述细胞抑制剂是烷基化剂。
35.权利要求1 34中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药 物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其用于快速增生性病症的治疗或骨髓细胞清除术。
36.如权利要求35所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、 试剂盒、产品或脂质体，其中，所述快速增生性病症选自恶性、恶化前或非恶性的赘生 性疾病、炎症、自身免疫性病症、血液病、皮肤病、病毒诱导性快速增生性病症、骨髓 异变病症或骨髓增生性病症。
37.如权利要求36所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、 试剂盒、产品或脂质体，其中，所述快速增生性病症选自癌症、良性肿瘤、银屑病关节 炎、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、银屑病、瑞特综合征、毛发红糠疹、角质化病症 的快速增生性变型、再狭窄、糖尿病性肾病、甲状腺增生、格雷夫氏病、良性前列腺增 生、李-氟诺门提综合征、糖尿病性视网膜病变、周围性血管疾病、原位宫颈癌、家族 性结肠息肉病、口腔粘膜白斑病、组织细胞增多病、瘢痕疙瘩、血管瘤、快速增生性动 脉狭窄、炎性关节炎、表皮角化病、包括关节炎、疣和EBV诱导性疾病在内的丘疹鳞屑 性出疹、瘢痕形成、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE ；狼疮)、重症肌无力、非恶性 增生、肉芽肿、MGUS (重要性未知的单克隆丙种球蛋白病)、赘生性脑膜炎、真性红细 胞增多症、硬化性黏液水肿、疹性黏蛋白沉积症、淀粉样变性和韦格纳肉芽肿。
38.一种用于诊断希望抑制细胞生长的病症或病况的试剂盒，所述试剂盒包含对 PCNA相互作用基序具有特异性的抗体及其用于诊断所述病症或病况的使用说明书以及可选的检测底物，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3, X1, (SEQ ID NO 1)，其中,独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3,独立选自不 带电荷的氨基酸组。
全文摘要
本发明提供了一种在治疗中使用的寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO1)，其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)。特别是，所述治疗可以是其中希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的治疗，或者涉及细胞抑制治疗(例如骨髓细胞清除)的治疗。在某些方面，本发明的化合物就其性质可以用作细胞抑制剂。在本发明的其他方面，包含所述基序的寡肽化合物可以与细胞抑制剂联合使用，或者与放射性治疗联合使用。
文档编号A61K38/17GK102015758SQ200980114258
公开日2011年4月13日 申请日期2009年2月20日 优先权日2008年2月22日
发明者佩尔·阿恩·阿斯, 玛丽特·奥特雷, 艾玛道丁·菲兹 申请人:Apim治疗学公司
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